專利名稱：：作為肺癌標志物的apex的制作方法作為肺癌標志物的APEX本發(fā)明涉及幫助評估肺部癌癥或肺癌(=LC)、特別是幫助評估非小細胞肺癌(NSCLC)的方法。它公開了AP核酸內(nèi)切酶(-APEX)作為LC、特別是NSCLC的標志物的用途。此外，它特別涉及通過測量來自個體的液體樣品中的APEX從所述樣品評估肺癌的方法。例如，APEX的測量可以用于肺癌的早期檢測，或用于經(jīng)歷手術(shù)的患者的監(jiān)護。盡管在檢測和治療方面有進展，癌癥仍然是主要的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。在各種類型的癌中。LC是西方世界常見的癌癥，是癌癥相關(guān)死亡的最常見的原因之一。這很大部分由于疾病的早期檢測的診斷缺口。LC在它的早期主要是無癥狀的。所有肺癌的大部分在晚期被檢出，此時疾病已經(jīng)變得不能手術(shù)。大部分LC肺瘤可以分成小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)。SCLC占所有肺癌病例的約20-25%。SCLC是LC的侵襲性的神經(jīng)內(nèi)分泌的類型，具有非常差的預(yù)后，即使在早期被檢出。SCLC很少能通過切除術(shù)來洽愈性地治療。由于疾病進展的速度，SCLC—般僅用兩期來分類即，有限的和大范圍的疾病，而不用更復(fù)雜的TNM分期系統(tǒng)(見下文)。約75-80%的LC病例被分類到NSCLC的類別中，包括鱗狀細胞癌(癌-CA)、腺CA(包括腺泡CA、乳頭狀CA、支氣管肺泡肺瘤、實體腫瘤和混合亞型的亞類)，以及大細胞癌(包括巨細胞瘤、透明細胞CA、腺鱗CA和未分化的CA的亞類)。如果在晚期測出，NSCLC也具有非常差的預(yù)后。癌癥的分期是就程度、進展、細胞類型和腫瘤級別而言的疾病的分類。它將癌癥患者分組，從而關(guān)于預(yù)后和治療選擇可以進行普遍化。當今，TNM系統(tǒng)是根據(jù)癌癥的解剖學(xué)程度最廣泛使用的分類系統(tǒng)。它代表了國際公認的、統(tǒng)一的分期系統(tǒng)。其中有三種基本變量T(原發(fā)腫瘤的程度)、N(區(qū)域性淋巴結(jié)的狀態(tài))和M(遠距離轉(zhuǎn)移的存在或不存在)。由UICC(國際抗癌聯(lián)合會)公開了TNM指標、1997版(Sobin,L.H.,和Fleming,I.D.，TNM80(1997)1803-4)。原發(fā)腫瘤的外科切除術(shù)作為早期NSCLC的選擇治療是廣泛接受的。隨著NSCLC進展，更具體地，從IIIa期(T3N1M0、T1N2M0、T2N2M0、T3N2M0)到IIIb期(T4N0M0、T4N1M0、T4N2M0)的轉(zhuǎn)變，出現(xiàn)了醫(yī)師的方法方面的顯著變化。然而，如果癌癥在更早期被檢出(Ia-IIIa;優(yōu)選的最多到T3N1M0期)，五年存活率在35%和80%之間。在Ia期((T1N0M0);小肺瘤大小，無轉(zhuǎn)移)檢出具有明顯最好的預(yù)后，五年存活率最高達80%。如果有的話，手術(shù)很少用于NSCLC的IIIb-IV期的處理。IV期相應(yīng)于遠距離轉(zhuǎn)移，即疾病散布超過肺和局部的'淋巴結(jié)。在后面的III和IV期五年存活率分別^失至低于15%和1%之間。特別重要的是，NSCLC的早期診斷翻譯為好得多的預(yù)后。在早至Ia(T腦MO)、Ib(T2N0M0)、IIa(T1N1M0)、lib(T3N0M0)和IIIa(T3N1M0)期診斷的患者，如果適當?shù)刂委煟哂性\斷后最高達80%的5年存活率。這必須與一旦已存在遠距離轉(zhuǎn)移診斷的患者低于1%的5年存活率相比較。在本發(fā)明的意義上，LC的早期評估是指如上文定義的Ia和IIIa之間的胂瘤階l殳的評估。優(yōu)選的是，LC在Ia和IIIa之間的階段被評估。大多數(shù)肺癌在它們變得有癥狀時被檢出。當前的檢測方法包括胸部X射線、螺旋式計算機斷層攝影術(shù)、痰細胞學(xué)和支氣管鏡檢(bronchioscopy)。然而，對于這些方法用于大規(guī)4莫篩查的適用性存在論爭。許多肺癌的血清腫瘤標志物處于臨床使用之中。細胞角蛋白(cytoceratin)19的可溶性30kDa片段(CYFRA21-1)、癌胚發(fā)生抗原(CEA)、神經(jīng)元特異的烯醇酶(NSE)和鱗狀細胞癌抗原(SCC)是最常見的重要LC標志物。然而，它們都不能滿足篩查工具所需的敏感性和特異性的指標(Thomas,L.,LaborundDiagnose(2000)THBooksVerlagsgesellschaft,Frankfurt/Main，Germany)。為了具有臨床實用性，作為單一標志物的新的it斷標志物應(yīng)當至少與本領(lǐng)域已知的其他標志物可比較，或更好?；蛘?，新的標志物應(yīng)當產(chǎn)生診斷敏感性和/或特異性方面的進展，如果分別地單獨使用或與一種或更多種其他標志物組合使用。測試的診斷敏感性和/或特異性通過它的接受者工作特征來最好地評定，其將在下文詳細描述。全血、血清或血漿是在臨床常規(guī)實驗中最廣泛使用的樣品來源。將幫助可靠的癌癥檢測或提供早期預(yù)后信息的早期LC肺瘤標志物的鑒定可以產(chǎn)生將大大地幫助這種疾病的診斷和管理的方法。因而，存在著急迫的臨床需求來改善LC的體外評估。改善LC的早期診斷是特別重要的，因為與在疾病的進展期診斷的那些患者相比，早期診斷的患者存活機會要高得多。近來已經(jīng)綜述了生物化學(xué)標志物在肺癌中的臨床實用性(Duffy，M.J.,CriticalReviewsinClinicalLaboratorySciences38(2001)'225-262)。CYFRA21-1當前被認為是目前已知的最好的肺癌肺瘤標志物。雖然沒有器官特異性，它主要地在肺組織中存在。在針對其他良性肺部疾病95%的特異性下，CYFRA21-1對于肺癌的敏感性被描述為在46-61%之間。CYFRA21-1的提高的血清水平還與顯著的良性肝臟疾病、腎機能不全和侵入性膀胱癌相關(guān)。CYFRA21-1測試被推薦用于手術(shù)后的治療監(jiān)護。CEA屬于癌胚抗原的類別，通常在胚胎發(fā)生期間產(chǎn)生。CEA不具有器官特異性，主要用于結(jié)腸直腸癌癥的監(jiān)測。除了惡性腫瘤之外，還有幾種良性的疾病例如肝硬化、支氣管炎、胰腺炎和自體免疫疾病與提高的CEA血清水平相關(guān)。在針對良性的肺部疾病95%的特異性下，它對肺癌的敏感性被報告為29-44%。CEA的優(yōu)選的用途是肺癌的治療監(jiān)護。NSE是SCLC的腫瘤標志物。一般地，提高的NSE血清水平被發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)外胚層和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤相關(guān)。提高的血清水平還被發(fā)現(xiàn)于患有良性的肺部疾病和腦部疾病，例如腦膜炎或腦部的其他炎癥性疾病，以及對頭部的外傷性損傷，的患者中。雖然在95%特異性下對SCLC的敏感性被報告為60-87%,NSE測試對于NSCLC的性能是不良的(7-25%的敏感性)。NSE被推薦用于SCLC的治療監(jiān)護。ProGRP是腫瘤標志物，在SCLC的檢測和監(jiān)測中有用。提高的血清水平還在患有非惡性肺部/胸膜疾病，例如特發(fā)性肺纖維化或餘節(jié)病的患者中發(fā)現(xiàn)。而在SCLC的領(lǐng)域中proGRP的壽丈感性(在95%的特異性下)被報告為47-86%,proGRP測試在NSCLC領(lǐng)域的性能是不良的，因為敏感性被報告低于10%。SCC最初在宮頸的鱗狀細胞CA中鑒定。SCC對LC的敏感性一般是低的(18-27%)。因而，SCC測試被認為不適合于篩查。然而，由于對鱗狀細胞CA的更高敏感性，SCC優(yōu)選的用途是治療監(jiān)護，雖然CYFRA21-1—般表現(xiàn)得更好。對于標志物分布和針對改善的肺癌診斷，公開了一種方法(Schneider,J.等Int.J.Clin.Oncol.7(2002)145-151),利用基于模糊邏輯的分類算法來組合CYFRA21-1、NSE和作為一般炎癥標志物的C-反應(yīng)性蛋白(CRP)的血清水平。作者報告了在95%的特異性下92%的敏感性。然而在這項研究中，例如CYFRA21-1作為單一腫瘤標志物的敏感性被報告為在95%特異性下72%，其顯著高于許多其寸也的才艮道的研究。Duffy,M丄，inCriticalReviewsinClinicalLaboratorySciences38(2001)225-262報道了46%和61%之間的敏感性。Schneider等人實現(xiàn)的異乎尋常的高性能引起了一些懷疑，可能是由于幾個事實。首先，對照患者的集體似乎比患者集體年輕，即，組不是良好地年齡匹配的，患者集體包含了許多的晚期。第二和更為關(guān)鍵的，算法的性能是對于訓(xùn)練集(trainingset)的樣品檢查的，所述訓(xùn)練集的樣品被用于模糊邏輯合格者的確定。因此，這些合格者嚴格來說是對這個集合"修整得到的"，不能應(yīng)用于獨立的驗證集。在正常的情況下，要預(yù)期的是，同樣的算法用于更大的、獨立的以及良好平衡的驗證集將產(chǎn)生顯著降低的總體性能。本發(fā)明的任務(wù)是研究是否可以鑒定出可以在評估LC中使用的生物化學(xué)標志物。令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)的是，標志物APEX的使用可以至少部分地克服當前本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)已知的標志物的一些難題。本發(fā)明涉及體外評估肺癌的方法，包括測量樣品中APEX的存在和/或濃度，以及將所述測量結(jié)果，特別是所測定的濃度用于肺癌的評估。本發(fā)明還涉及通過生物化學(xué)標志物體外評估LC的方法，包括測量樣品中APEX以及一種或更多種其他LC標志物的存在和/或濃度，以及將所述測量結(jié)果，特別是所測定的濃度用于LC的評估。優(yōu)選的是，所述一種或更多種其他LC標志物選自CYFRA21-1、CEA、NSE、proGRP和SCC。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明還涉及至少包含APEX和CYFRA21-1的標志物組在LC的評估中的用途。本發(fā)明還涉及至少包含APEX和CEA的標志物組在LC的評估中的用途。本發(fā)明還涉及至少包含APEX和SCC的標志物組在LC的評估中的用途。本發(fā)明還提供了進行根據(jù)本發(fā)明的方法的試劑盒，至少包含分別特異性地測量APEX和CYFRA21-1所需的試劑，以及任選用于進行所述測量的輔助試劑。本發(fā)明還提供了進行根據(jù)本發(fā)明的方法的試劑盒，至少包含分別特異性地測量APEX和CEA所需的試劑，以及任選用于進行所述測量的輔助試劑。本發(fā)明還提供了進行根據(jù)本發(fā)明的方法的試劑盒，至少包含分別特異性地測量APEX和SCC所需的試劑，以及任選用于進行所述測量的輔助試劑。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及體外評估肺癌的方法，包括測量樣品中a)APEX,和b)任選一種或更多種其他肺癌標志物的存在和/或濃度，以及c)將所述測量結(jié)果，特別是步驟(a)和任選步驟(b)中測定的濃度用于肺癌的評估。術(shù)語"測量"包括樣品中APEX的定性的或定量的測量。在優(yōu)選的實施方式中，所述測量是定性的或半定量的測量，即，它測定了APEX是存在還是缺乏，或它測定了APEX的濃度是高于還是低于截止值。熟練的技術(shù)人員將理解，在是-(存在)或否-(缺乏)分析中，分析敏感性通常被設(shè)置為匹配所述截止值。例如，截止值可以從一組健康個體的測試來確定。優(yōu)選的，所述截止被設(shè)置為產(chǎn)生90%的特異性，還優(yōu)選的是所述截止被設(shè)置為產(chǎn)生95%的特異性，或還優(yōu)選的是所述截止被設(shè)置為產(chǎn)生98%的特異性。例如，存在或高于截止值的值是存在肺癌的指示。在進一步優(yōu)選的實施方式中，所述測量是定量測量。在這個實施方式中，APEX的濃度與基礎(chǔ)的診斷問題如疾病的分期、疾病進展或?qū)χ委煹姆磻?yīng)相關(guān)。AP核酸內(nèi)切酶APEX(Swiss-Prot.P27695)的特點在于SEQIDNO:l中給出的序列。未加工的前體分子由318個氨基酸組成，具有35.6kDa的分子量。APEX涉及DNA修復(fù)并切割DNA鏈的無。票呤或無嘧啶位點。這樣的無堿基位點相對頻繁地自發(fā)地或通過化學(xué)試劑、或通過移動特定異常堿基的DNA糖基化酶來產(chǎn)生。AP位點是誘變前的病變，其可以阻止正常DNA復(fù)制，因此細胞含有鑒定和修復(fù)這種位點的系統(tǒng)。("G〃5ara7a乂/awD.州'c^yo",7995,歷oe^a"/7"S,;/7/3-779。3D結(jié)構(gòu)被闡明了，鑒定了涉及核酸內(nèi)切酶活性的氨基酸("5fln'zz7a;;G.爭，7995,7V^"reWra"wra/2("7j,戶/56/-567，'爭'7997,五7l/SO/owrwa/，/6廣2/jSeerm7^尸.^1，2007,J.Sz'o/.307,。APEX也是各種轉(zhuǎn)錄因子例如c-Fos、c-Jun、NF-KB和HIF-1的氧化還原調(diào)節(jié)物。這種活性似乎與核酸內(nèi)切酶活性無關(guān)。兩種功能位于蛋白質(zhì)的不同結(jié)構(gòu)i或上(Gz75arz//a_y,D.if/cfoo",7995,5/o&^a;^/7"S,;^773-7/9)。APEX被蛋白激酶C磷酸化提高了氧化還原活性，而未磷酸化的形式涉及DNA修復(fù)("racoi^A爭"997//仏57,j^W57-59J。一個磷酸化位點Y261(根據(jù)Swissprot序列)被RushJ.等，("2005,A^"^re5z'c^cA,23〃994-/0/)鑒定。還觀察到APEX活化p53DNA結(jié)合活性(/a，rama"L爭，"97,Ge"^Z)ev.,("5,p55S-70,。Gaiddon等人研究了APEX對p53的體內(nèi)調(diào)節(jié)(7999,五M50/owma/，5606-5627)。p53在胂瘤發(fā)生中的作用是明確確立的。W097/47971公開了脫。票呤/脫嘧咬核酸內(nèi)切酶作為鑒定惡變前或惡性狀況的標志物的用途。實施例描述了在子宮頸癌癥和前列腺癌癥組織中的APEX染色。沒有描述組織提取物或體液中APEX的測定。進一步的，該文獻不含有APEX可能是與肺癌相關(guān)的標志物的任何數(shù)據(jù)。WO02/076280公開了測定受試者發(fā)展癌癥的風險的方法，其中受試者的組織中DNA修復(fù)/損傷防止酶的活性水平的指示性參數(shù)的水平被測定，根據(jù)所述水平，確定受試者發(fā)展癌癥的風險。所述DNA損傷防止酶可以是APEX。所述鑒定涉及OGG活性DNA修復(fù)測試，其中所述DNA修復(fù)活性利用合成的寡核普酸底物來測試。所述樣品是從人類外周血淋巴細胞制備的蛋白質(zhì)提取物。由于DNA修復(fù)是復(fù)雜的過程，OGG活性不能與APEX嚴格地相關(guān)。發(fā)現(xiàn)的是低OGG活性是肺癌中的風險因素。然而沒有描述APEX與肺癌的直接相關(guān)性。WO2006/091734描述了在自身抗體分布的檢測中利用肽微陣列，以及利用這樣的自身抗體分布來得到診斷或預(yù)后信息?？偣擦谐隽?480個表位，包括來自APEX的4個肽序列。該文獻沒有描述APEX與肺癌的任何相關(guān)性。Duguid等人(CancerRes.55(1995)，6097-6102)描述了通過在不同組織，例如腦部和肝臟中APEX的免疫染色、細胞質(zhì)和核染色，人類APEX的差異性細胞和亞細胞表達的確定。Tanner等人(GynecologicOncol.92(2004),568-577)描述了核APEX表達的提高與卵巢癌的進展。Kakolyris等人(J.Pathol.189(1999),351-357)描述了人類APEX的核定位與早期可手術(shù)的NSCLC的預(yù)后相關(guān)。在正常的肺中，APEX的染色被發(fā)現(xiàn)在肺泡的肺細胞中的核和細胞質(zhì)中。支氣管上皮的淺表纖毛細胞顯示了細胞質(zhì)的染色，而對基底細胞的染色主要是核的。支氣管腺細胞表現(xiàn)了混合的核和細胞質(zhì)的染色。肺癌顯示了APEX的所有表達模式。在鱗狀癌中，觀察到顯著的間接相關(guān)，即，APEX的提高的(陽性)核染色與降低的(陰性)p53染色是平行的。作者斷定，核的APEX定位可能與它作為DNA修復(fù)蛋白質(zhì)和/或作為野生型p53的活化物的作用相關(guān)，因而與在患者的亞群中所見更好的后果相關(guān)。Puglisi等人(AnticancerRes.21(2001),4041-4050描述了亞細胞APEX定位作為患有NSCLC的患者中的預(yù)后指示物的潛在作用。特別是，該蛋白質(zhì)的細胞質(zhì)的定位看起來與患者亞群中純預(yù)后相關(guān)。有趣地，上述文件都沒有暗示組織提取物和體液中APEX的鑒定將容許評估肺癌。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，僅僅APEX的亞細胞染色將容許癌癥評估。令人驚訝地，在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的是，在組織溶胞產(chǎn)物樣品和/或體液中APEX的存在和/或數(shù)量的測定，而不用亞細月包分析、特別是不用測定亞細胞定位，容許肺癌的評估。再更令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)的是，APEX的提高存在和/或濃度與肺癌相關(guān)。如在此使用的，以下每一個術(shù)語具有與在本節(jié)中的它相關(guān)的含義。在此使用的冠詞"一"是指冠詞的一或超過一(即，至少一)的語法賓語。舉例來說，"一種標志物"是指一種標志物或超過一種標志物。術(shù)語"至少"被用于表明任選可以存在一個或更多個進一步的賓語。舉例來說，至少包含(標志物)APEX和CYFRA21-1的標志物組可以任選包含一種或更多種其他標志物。表述"一或更多"表示1到50，優(yōu)選的1到20，還優(yōu)選的2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或15。在此使用的術(shù)語"標志物"或"生物化學(xué)標志物，，是指用作目標用于分析患者的測試樣品的分子。在一個實施方式中，這樣的分子目標的實例是蛋白質(zhì)或多肽。用作本發(fā)明中的標志物的蛋白或多肽預(yù)期包括所述蛋白的天然存在的變體以及所述蛋白或所述變體的片段，特別是免疫學(xué)可檢測的片段。免疫學(xué)可檢測的片段優(yōu)選的包含所述標志物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20個連續(xù)的氨基酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到，例如，在炎癥期間由細胞釋放的或細胞外基質(zhì)中存在的蛋白質(zhì)可能損傷，并可能被降解或裂解成這樣的片段。某些標志物以無活性的形式合成，其隨后可以通過蛋白水解作用活化。熟練技術(shù)人員將理解，蛋白或其片段也可以作為復(fù)合物的部分存在。這種復(fù)合物也可以用作本發(fā)明意義上的標志物。標志物多肽的變體由相同的基因編碼，^f旦是例如作為可選擇的mRNA或前mRNA加工的結(jié)果，在它們的等電點(=PI)或分子量(=MW)、或這兩者方面可以不同。變體的氨基酸序列將95%或更高地相同于相應(yīng)的標志物序列。此外，在可選擇的標志物多肽或其變體中可以帶有翻譯后的修飾。優(yōu)選的翻譯后修飾是糖基化、?；?或磷酸化。優(yōu)選的，所述標志物APEX是通過使用特異結(jié)合試劑從樣品中特異性地測量的。特異結(jié)合試劑是，例如，APEX的受體、結(jié)合APEX的凝集素或APEX的抗體。特異結(jié)合試劑對它相應(yīng)的目標分子具有至少1071/mol的親和力。特異結(jié)合試劑優(yōu)選的對它的目標分子具有108l/mol、或還優(yōu)選的1091/mol的親和力。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，術(shù)語"特異"被用于指示樣品中存在的其他生物分子不顯著地結(jié)合所述特異于APEX的結(jié)合試劑。優(yōu)選的，結(jié)合除目標分子以外的生物分子的水平產(chǎn)生了結(jié)合親和力，其是與目標分子的親和力的最多僅10%或更低、僅5%或更低、僅2%或更低、或僅1%或更低。優(yōu)選的特異結(jié)合試劑將滿足親和力以及特異性的上述兩種最小指標。特異結(jié)合試劑優(yōu)選的是與APEX反應(yīng)的抗體。術(shù)語抗體是指多克隆抗體、單克隆抗體、這些抗體的抗原結(jié)合片段、單鏈抗體以及包含抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的遺傳構(gòu)建體。可以使用保持了特異結(jié)合試劑的上述指標的任何抗體片段?？贵w通過現(xiàn)有技術(shù)的操作產(chǎn)生，例如，Tijssen(Tijssen,P.,Practiceandtheoryofenzymeimmunoassays,11，ElsevierSciencePublishersB.V.，Amsterdam,全書，特別是43-78頁)中所描述的。此外，熟練的技術(shù)人員都知道基于免疫吸附劑的方法，其可以用于抗體的特異性分離。通過這些方法，多克隆抗體的質(zhì)量以及由此它們在免疫分析中的性能可以被增強。(Tijssen,P.,上文，pages108-115).對于在本發(fā)明中公開的成果，可以使用兔子中產(chǎn)生的多克隆抗體。然而，明顯的是，還可以使用來自不同物種，例如大鼠或豚鼠的多克隆抗體，以及單克隆抗體。由于單克隆抗體可以以恒定的性能以任何所需的數(shù)量產(chǎn)生，它們代表了臨床的常規(guī)分析的開發(fā)中的理想工具。在#^居本發(fā)明的方法中針對APEX的單克隆抗體的產(chǎn)生和用途分別代表了其他優(yōu)選的實施方式。熟練的技術(shù)人員現(xiàn)在將理解，APEX已經(jīng)被筌定為在肺癌的評估中有用的標志物，各種免疫診斷操作可以用于實現(xiàn)與本發(fā)明的成果可比較的結(jié)果。例如，可以使用可選擇的策略來產(chǎn)生抗體。這些策略包括代表了APEX的表位的合成肽用于免疫的使用，等等。做為選擇，可以〗吏用DNA免疫，也稱為DNA疫苗4妻種。對于測量，從個體獲得的樣品可以在適合于結(jié)合試劑APEX復(fù)合物的形成的條件下與APEX的特異結(jié)合試劑孵育。這樣的條件不必指定，因為熟練的技術(shù)人員無需任何創(chuàng)造性的工作可以容易地鑒定這種合適的孵育條件。測量結(jié)合試劑APEX-復(fù)合物的數(shù)量并用于肺癌的評估中。熟練的技術(shù)人員將理解，存在著許多方法來測量特異結(jié)合試劑APEX復(fù)合物的數(shù)量，所有都在相關(guān)的教科書中詳細描述了(參見例如TijssenP.，上文,或Diamandis，E.P.andChristopoulos,T.K.(eds.),,Immunoassay,AcademicPress,Boston(1996))。優(yōu)選的，APEX在夾層式分析形式中檢測。在這樣的分析中，第一特異結(jié)合試劑被用于將APEX捕獲在一側(cè)，被標記以被直接或間接檢測的第二特異性結(jié)合試劑被用于另一側(cè)。在本發(fā)明的意義上的"肺癌的標志物"是任何標志物,其如果與標志物APEX組合添加了LC評估中的相關(guān)信息。對于LC的評估，如果在給定特異性下的敏感性，或如果在給定的敏感性下的特異性分別可以通過將所述標志物包括到已經(jīng)包含了標志物APEX的標志物組合中來改善，該信息被認為是相關(guān)的或具有附加價值。優(yōu)選的，分別在敏感性或特異性方面的改善在p=.05、.02、.Ol或更低的顯著性水平上是統(tǒng)計學(xué)上顯著的。優(yōu)選的，所述一種或更多種其他LC標志物選自CYFRA21-1、CEA、NSE、proGRP和SCC。在此使用的術(shù)語"樣品"是指為了體外評估的目的獲得的生物樣品。在本發(fā)明的方法中，樣品或患者樣品優(yōu)選地可以包含任何體液或組織提取物。優(yōu)選的測試樣品包括血液、血清、血漿、痰和支氣管灌洗液。優(yōu)選的樣品是全血、血清、血漿、支氣管灌洗液或痰，血漿或血清是最優(yōu)選的。術(shù)語"評估肺癌"被用于表明，例如，根據(jù)本發(fā)明的方法將(單獨地或與其他標志物或變量如UICC闡述的指標(參見上文)一起)，例如，幫助醫(yī)師確定或確認LC的不存在或存在，或在預(yù)后、復(fù)發(fā)的檢測(手術(shù)后患者的跟蹤)和/或治療、特別是化療的監(jiān)測方面幫助醫(yī)師。熟練技術(shù)人員將理解，任何這樣的評定是在體外進行的?；颊邩悠泛髞肀粊G棄?；颊邩悠穬H僅用于本發(fā)明的體外診斷方法，患者樣品的材料不轉(zhuǎn)移回患者體內(nèi)。一般地，所述樣品是液體樣品，例如全血、血清或血漿。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及通過生物化學(xué)標志物體外評估LC的方法，包括測量樣品中APEX的濃度并將所測定的濃度用于LC的評估。本發(fā)明的發(fā)明人令人驚訝地能夠在顯著百分比的來自患有LC的患者的樣品中檢測標志物APEX。再更令人驚訝的，他們已經(jīng)能夠證明，在從個體獲得的這種樣品中APEX的存在和/或濃度可以用于肺癌的評估。診斷的理想情況將是一種情況，其中單獨的事件或過程將引起相應(yīng)的疾病，例如在傳染性疾病中。在所有其他情況下，正確的i貪斷結(jié)論將是非常困難的，特別是當疾病的病因不被完全理解時，如LC的情況。熟練的技術(shù)人員將理解，對于給定的多因素疾病，例如LC，沒有生物化學(xué)標志物是具有100%特異性同時具有100%敏感性的診斷性的。然而，生物化學(xué)標志物，例如CYFRA21-1、CEA、NSE、proGRP、SCC或在此顯示的APEX可以用于以某些可能性或預(yù)測價值評估，例如，疾病的存在、缺乏或嚴重度。因而在常規(guī)臨床診斷中，一般地各種臨床癥狀和生物標志物在隱晦的疾病(underlyingdisease)的it斷、治療和管理中一起考慮。生物化學(xué)標志物可以分別地測定，或在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，它們可以使用基于芯片或珠子的陣列技術(shù)同時地測定。然后為每個標志物使用單獨的截斷值獨立地解釋生物標志物的濃度，或組合它們用于解釋。在進一步優(yōu)選的實施方式中，才艮據(jù)本發(fā)明的LC評估以一方法進行，包括測量樣品中a)APEX和b)—種或更多種其他肺癌標志物的存在和/或濃度，以及c)將所述測量結(jié)果，例如步驟(a)和步驟(b)中分別測定的濃度用于肺癌的評估。在LC的評估中，標志物APEX將在一個或更多個以下方面中有利篩查、診斷輔助、預(yù)后、療法例如化學(xué)治療、放射治療和免疫治療的監(jiān)測。、篩查篩查凈皮定義為測試的系統(tǒng)性應(yīng)用，來鑒定個體，例如有風險的個體的疾病的指示物，例如肺癌的存在。優(yōu)選的，篩查群體由已知具有比肺癌的平均風險更高風險的個體組成，如吸煙者、戒煙者、以及暴露于鈾、石英或石棉的工作者。在一個優(yōu)選的實施方式中，痰被用作肺癌的篩查中的樣品。對于許多疾病，在循環(huán)中總是沒有單一的生物化學(xué)標志物滿足篩查目的所需的敏感性和特異性指標。這看起來對于肺癌也是成立的。要預(yù)計的是，包含復(fù)數(shù)種標志物的標志物組將用于LC篩查中。本發(fā)明中確定的數(shù)據(jù)表明，標志物APEX將形成適合于篩查目的的標志物組的不可缺的部分。因而本發(fā)明涉及APEX作為LC標志物組的一種標志物的用途，即，包含APEX和一種或更多種其他用于LC篩查目的的標志物的標志物組。當前的數(shù)據(jù)進一步表明，標志物的某些組合將在LC的篩查中是有益的。因而，本發(fā)明還涉及了包含APEX和CYFRA21-1的標志物組、或包含APEX和CEA的標志物組、或包含APEX和NSE的標志物組、或包含APEX和SCC的標志物組、或包含APEX和proGRP的標志物組、或包含APEX和選自CYFRA21-1、CEA、NSE、proGRP和SCC的兩種或更多種標志物的標志物組，用于LC篩查目的的用途。診斷輔助標志物可以幫助特定器官中良性對惡性疾病的鑒別診斷，幫助區(qū)分腫瘤的不同組織學(xué)類型、或建立手術(shù)前的基線標志物值。今天，在肺癌的檢測中使用的重要方法是放射學(xué)和/或計算機斷層攝影(CT)掃描。小的結(jié)節(jié)，即，疑似組織的小的區(qū)域可以通過這些方法顯現(xiàn)。然而，這些結(jié)節(jié)中的許多，CT超過90%，代表了良性的組織改變，^又少數(shù)結(jié)節(jié)代表癌性組織。標志物APEX的^f吏用可以幫助良性和惡性結(jié)節(jié)的區(qū)分。在優(yōu)選的實施方式中，標志物APEX纟皮用于免疫組織學(xué)方法以建立或確認LC的不同的組織學(xué)類型。由于APEX作為單一標志物可能優(yōu)于其他LC標志物如CEA或NSE，預(yù)計的是APEX將用作診斷輔助，特別是通過建立手術(shù)之前的基準值。因而本發(fā)明還涉及APEX用于在LC手術(shù)之前確定基準值的用途。預(yù)后預(yù)后指示物可以定義為癌癥患者和他們的胂瘤的臨床的、病理的、或生物化學(xué)的特征，其以某些可能性預(yù)測疾病結(jié)局。它們主要作用是幫助合理地規(guī)劃病人管理，即，分別避免侵襲性疾病(aggressivedisease)的處理不足和無痛疾病(indolentdisease)的過度處理。MolinaR.等，TumorBiol.(2003)24:209-218評估了NSCLC中CEA、CA125、CYFRA21-1、SSC和NSE的預(yù)后價值。在他們的研究中，標志物NSE、CEA和LDH(乳酸脫氫酶)的異常血清水平看起來指示了更短的存活。由于單獨的APEX顯著地有助于LC患者與健康對照的區(qū)分，預(yù)計的是，它將幫助評估患有LC的患者的預(yù)后。手術(shù)前APEX的水平將最可能地與一種或更多種其他LC標志物和/或TNM分期系統(tǒng)組合。在優(yōu)選的實施方式中，APEX被用于患有LC的患者的預(yù)后。化療的監(jiān)測Merle,P.等，Int.J.ofBiologicalMarkers(2004)19:310-315評估了用誘導(dǎo)化療治療的患有局部晚期NSCLC的患者中CYFRA21-1血清水平變化。他們斷定，CYFRA21-1血清水平的早期監(jiān)測是III期NSCLC患者中肺瘤反應(yīng)和存活的有用的預(yù)后工具。此外，有報道描述了CEA在監(jiān)測患有LC的患者的治療方面的用途(FukasawaT.等，Cancer&Chemotherapy(1986)13:1862-1867)。大多數(shù)這些研究是回顧性的、非隨機的，并含有少量的患者。在用CYFRA21-1研究的情況下，CEA研究認為a)當接受化學(xué)治療時具有CEA水平降低的患者，比CEA水平未能降低的患者具有更好的結(jié)局，和(b)對于幾乎所有患者，CEA水平的提高與疾病進展相關(guān)。預(yù)計的是，對于化學(xué)治療的監(jiān)測，APEX將是至少分別與CYFRA21-1或CEA—樣好的標志物。因而本發(fā)明還涉及APEX在化療的LC患者的監(jiān)測中的用途。跟蹤經(jīng)歷了目的在于癌組織的完全去除的外科切除術(shù)的大部分LC患者，以后發(fā)展出復(fù)發(fā)性的或轉(zhuǎn)移性的疾病(Wagner,H.,Chest(2000)117:110-118;Buccheri,G.等，Ann.Thome.Surg.(2003)75:973-980)。大多數(shù)這些復(fù)發(fā)發(fā)生在手術(shù)后前2-3年。因為如果檢測太晚復(fù)發(fā)性/轉(zhuǎn)移性疾病總是致死的，相當多的研究已經(jīng)集中于在早期并因而是潛在可治療階段時的LC復(fù)發(fā)。因此，許多LC患者經(jīng)歷了手術(shù)后的監(jiān)護計劃，其常常包括CEA的常規(guī)監(jiān)測。外科切除術(shù)之后一年的CEA連續(xù)監(jiān)測已經(jīng)顯示了在大約97%的特異性下以大約29%的敏感性檢出早期術(shù)后復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移性疾病，甚至在沒有懷疑的癥狀或病征的情況下(Buccheri，G.等，Ann.Thorac.Surg.(2003)75:973-980)。因而，患有LC的患者在手術(shù)后的跟蹤是合適的生物化學(xué)標志物的用途的最重要的領(lǐng)域之一。由于APEX在所研究的LC患者中的高度敏感性，很可能的是，單獨的APEX或與一種或更多種其他標志物組合將大大幫助LC患者的跟蹤，特別是手術(shù)后的LC患者。包含APEX和一種或更多種其他LC標志物的標志物組在LC患者的跟蹤方面的使用代表了本發(fā)明的進一步優(yōu)選的實施方式。本發(fā)明在優(yōu)選的實施方式中涉及了分別在LC的診斷領(lǐng)域或在LC的評估中APEX的用途。在又進一步的實施方式中，本發(fā)明涉及與一種或更多種肺癌標志物分子組合的APEX作為肺癌的標志物分子在獲自個體的液體樣品的肺癌評估中的用途?？梢耘cAPEX的測量組合的優(yōu)選的其他選定LC標志物是CYFRA21-1、CEA、NSE、proGRP和/或SCC。再進一步優(yōu)選的，在LC的評估中使用的標志物組包含APEX和選自CYFRA21-1和CEA的至少一種其他標志物分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，存在著許多方法來使用兩種或更多種標志物的測量以改善在研究中的診斷問題。在十分簡單的、但盡管如此常常有效的方法中，如果樣品對于研究的至少一種標志物是陽性的，假定陽性結(jié)果。例如，當診斷傳染性疾病如AIDS時，這是這種情況。然而，經(jīng)常地，評估標志物的組合。優(yōu)選的，對標志物組的標志物，例如對于APEX和CYFRA21-1測量的值被數(shù)學(xué)地組合，組合的值與基礎(chǔ)的診斷問題相關(guān)聯(lián)?？梢酝ㄟ^任何適合的本領(lǐng)域的數(shù)學(xué)方法組合標志物值。將標志物組合與疾病相關(guān)聯(lián)的公知的數(shù)學(xué)方法采用了一些方法，如，辨別分析(DA)(即，線性的、二次的、正少見化的(regularized)DA)、核(Kernel)方法(即，SVM)、非參數(shù)方法(即，k-最近鄰分類法)、PLS(偏最小二乘方)、基于樹的方法(即，邏輯回歸，CART,隨才幾森林法，Boosting/Bagging方法)、一般化的線性模型(即，邏輯回歸)、基于主分量的方法(即，SIMCA)、一般化的加法模型、基于模糊邏輯的方法、基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法的方面將沒有困難。優(yōu)選的，在將本發(fā)明的標志物組合與例如LC的不存在或存在相關(guān)聯(lián)中使用的方法選自DA(即，線性的、二次的、正規(guī)化的辨別分析)、核(Kernel)方法(即，SVM)、非參數(shù)方法(即，k-最近鄰分類法)、PLS(偏最小二乘方)、基于樹的方法(即，邏輯回歸，CART,隨機森林法，Boosting/Bagging方法)或一般化的線性模型(即，邏輯回歸)。關(guān)于這些統(tǒng)計方法的細節(jié)在以下參考文獻中找到Ruczinski，I.，等,J.ofComputationalandGraphicalStatistics,12(2003)475-511;Friedman,J.H.,J.oftheAmericanStatisticalAssociation84(1989)165-175;Hastie,Trevor，Tibshirani，Robert,Friedman,Jerome，TheElementsofStatisticalLearning,SpringerSeriesinStatistics,2001;Breiman,L.,Friedman,J,H.,Olshen,R.A.,Stone,C.J.(1984)Classificationandregressiontrees,California:Wadsworth;Breiman,L.，RandomForests,MachineLearning,45(2001)5-32;Pepe，M.S.,TheStatisticalEvaluationofMedicalTestsforClassificationandPrediction,OxfordStatisticalScienceSeries，28(2003);andDuda,R.O.,Hart，P.E.,Stork,D.G.,PatternClassification,WileyInterscience,2ndEdition(2001)。優(yōu)化的多元截止，以及辨別狀態(tài)A與狀態(tài)B,例如患病與健康。在這種類型的分析中，標志物不再是獨立的，而是形成標志物組。通過診斷方法的接受者工作特征(ROC)最好地描述了診斷方法的精確性(特別參見Zweig,M.H.,andCampbell,G.,Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC圖表是在所觀察數(shù)據(jù)的整個范圍上連續(xù)改實驗室測試的臨床性能取決于它的診斷精確性，或正確地將受試者分類到臨床上相關(guān)的亞群中的能力。診斷精確性衡量了所述測試正確地區(qū)分被研究受試者的兩種不同狀況的能力。這些狀況例如健康和患病，或者良性對惡性疾病。在每種情況下，通過在判定閾值的完整范圍上標繪出敏感性對1-特異性，ROC標繪圖描繪了兩種分布之間的重疊。在Y軸上是敏感性，或者真陽性分數(shù)[定義為(真陽性測試結(jié)果的數(shù)量)/(真陽性的數(shù)量+假陰性測試結(jié)果的數(shù)量)]。這也被稱作存在疾病或狀況的陽性。它單獨地從受影響的亞群中計算。在X軸上是假陽性分數(shù)，或l-特異性[定義為(假陽性結(jié)果的數(shù)量)/(真陰性的數(shù)量+假陽性結(jié)果的數(shù)量)]。它是特異性的指數(shù)，完全從未受影響的亞群中計算。因為使用來自兩個不同亞群的測試結(jié)果完全獨立地計算真陽性和^fF支陽性分數(shù)，ROC標繪獨立于樣品中的疾病患病率。在ROC標繪圖上的每個點代表了相應(yīng)于特定的判斷閾值的敏感性/1-特異性配對。具有理想辨別力(在結(jié)果的兩個分布中沒有重疊)的測試具有穿過左上角的ROC標繪線，其中真陽性分數(shù)是l.O，或100%(理想的敏感性)、假陽性分數(shù)是0(理想的特異性)。沒有辨別力的測試的理論標繪圖(兩個組的結(jié)果分布相同)是從左下角到右上角的45。對角線。大多數(shù)標繪圖落入這兩個極端之間。(如果ROC繪圖完全落入45°對角線以下，這容易通過將"陽性"的指標從"大于"轉(zhuǎn)換成"小于"來補救，或反之亦然。)定性地，標繪圖越靠近左上角，試驗的總體精確度越高。定量實驗室測試的診斷精確性的一個優(yōu)選的途徑是通過單個數(shù)字表示它的性能。例如，這種總體參數(shù)是所謂的"總誤差"或作為選擇"曲線下面積AUC"。最常見的全局度量是ROC標繪圖下的面積。按照慣例，這個面積永遠20.5(如果不是，人們可以反轉(zhuǎn)判斷規(guī)則使它這樣)。值在1.0(兩個組的測試值的理想分離)和0.5(在測試值的兩個組之間沒有明顯的分布差異)之間。該面積不僅取決于標繪圖的特定部分，例如最靠近對角線的點或在90%特異性下的敏感性，還取決于整個標繪圖。這是ROC標繪圖多么接近理想標繪圖(面積=1.0)的定量的、描述性的表述。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及改善相對于健康對照的LC診斷精確度的方法，通過分別測量樣品中至少APEX和CYFRA21-1的濃度，以及任選地CEA、proGRP、NSE和/或SCC的濃度，并且將所測定的濃度與LC的存在或不存在相關(guān)聯(lián)，與基于任何單獨的研究的標志物的分類法相比，所述改善使得更多的患者被正確地分類為患有LC對健康對照。在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的方法中，分別測定至少生物標志物APEX和CYFRA21-1的濃度，標志物組合用于LC的評估。在根據(jù)本發(fā)明的進一步優(yōu)選的方法中，分別測定至少生物標志物APEX和CEA的濃度，標志物組合用于LC的評估。在根據(jù)本發(fā)明的進一步優(yōu)選的方法中，分別測定至少生物標志物APEX、CYFRA21-1和CEA的濃度，標志物組合用于LC的評估。在根據(jù)本發(fā)明的進一步優(yōu)選的方法中，分別測定至少生物標志物APEX、CYFRA21-1和proGRP的濃度，標志物組合用于LC的評估。在根據(jù)本發(fā)明的再進一步優(yōu)選的方法中，分別測定至少生物標志物APEX、CYFRA21-1和SCC的濃度，標志物組合用于LC的評估。提供以下的實施例和附圖來幫助理解本發(fā)明，它們的真實范圍在附隨的權(quán)利要求中闡述。要理解的是，可以在所列的步驟中進行修改而不背離本發(fā)明的精神。附圖1附圖l顯示了與獲自30位明顯健康個體和30位表面上健康的吸煙者的60個對照樣品比較，獲自LC患者的60個樣品的評估的接受者工作特征(ROC)的標繪圖。附圖2附圖2顯示了肺癌組織溶胞產(chǎn)物的Western印跡分析。20個肺癌組織溶胞產(chǎn)物(10個&iCA和10個鱗狀細力包CA)的5pg總蛋白和匹配的對照組織溶胞產(chǎn)物如實施例5中描述的進行分析。M=分子量標記；T=肺瘤組織溶胞產(chǎn)物；N=匹配的對照組織溶胞產(chǎn)物；PP=來自健康供體的血漿庫(約60kD范圍內(nèi)的條帶推測起來是由于非特異性背景反應(yīng))rec.AG=重組產(chǎn)生的APEX(每泳道10、3或lng);箭頭指出APEX的位置。實施例1APEX作為肺癌標志物的鑒定組織的來源為了鑒定作為肺癌的診斷標志物的肺瘤特異性蛋白質(zhì)，進行了利用蛋白質(zhì)組方法的兩種不同類型組織的分析?？偣卜治隽藖碜?1位患有肺癌的患者的組織樣本。從每個患者中，從治療性切除術(shù)采集兩種不同的組織類型肺瘤組織(>80%腫瘤)(T)和鄰近的健康組織(N)。后者充當匹配的健康對照樣品。組織在切除術(shù)后立即速凍(snapfrozen)，處理之前保存在-80。C。腫瘤通過組織病理學(xué)指標來診斷。組織制備0.8-1.2g冷凍組織切成小塊，轉(zhuǎn)移到混合器球磨的冷卻的研磨缸中，通過液氮完全冷凍。組織在球磨中粉碎，溶于10倍體積(w/v)的裂解緩沖液中(40mM檸檬酸鈉、5mMMgCl2、1%GenapolX-080、0.02%疊氮化鈉、CompleteEDTA-free[RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany,Cat.No.1873580])，隨后在Wheaton⑧玻璃勻漿器(20x松配合，20x密配合)中勻化。勻漿物進行離心(5，000xg10，),上清液轉(zhuǎn)移到另一個小瓶中，再次進行離心(20,000xgl5')。產(chǎn)生的上清液含有可溶的蛋白質(zhì)，用于進一步的分析。用于LC-ESI-MSMS分析的樣品制備可溶蛋白質(zhì)部分的蛋白質(zhì)濃度使用Bio-Rad蛋白質(zhì)分析氣Cat.No.500-0006;Bio-RadLaboratoriesGmbH,MCJnchen，Germany)根據(jù)供應(yīng)商手冊的指導(dǎo)來測定。向相應(yīng)于200蛋白質(zhì)的體積中添加4mL還原緩沖液(9M尿素、2mMDTT、100mMKH2P04、NaOHpH8.2),孵育1小時。這個溶液在AmiconUltra設(shè)備(MilliporeGmbH,Schwalbach,Germany)中濃縮到50pi,為了烷基化轉(zhuǎn)移到0.5ml樣品緩沖液(9M尿素、4mM石典乙酰胺、100mMKH2P04、NaOHpH8.2)中，并孵育6小時。在烷基化之后，溶液在AmiconUltra設(shè)備中濃縮到50pi,添加0.5ml9M尿素10mMKH2P04、NaOHpH8.2,溶液再次濃縮到50nl。這個4喿作重復(fù)兩次。隨后，最終的50|11用4lag胰蛋白酶(蛋白質(zhì)纟且級另'J,RocheDiagnosticsGmbH，Mannheim,Germany)在水中稀釋到990pi并消化過夜。LC-ESI-MSMS分析胰蛋白酶的消化(lOOpl)在Nano-LC系統(tǒng)(Ultimate,Famos,Switchos;LCPackings,Idstein，Germany)上通過二維HPLC(MudPIT)來分離。使用自身包裝的二維柱(Fusedsilica:PicoFrit75pm，NewObjective;RP:ProntoSil120-5-C18AQ+，Bischoff;SCX:Partisil10,Whatman)進行分離。11個SCX部份通過連續(xù)地提高NH4AC的數(shù)量(O到1500mM)的洗脫步驟產(chǎn)生。它們進一步在柱的RP部分上分離，利用ESI-MS離子阱的數(shù)據(jù)依賴性掃描在線分析(LCQdecaXP;ThermoElectron,Massachusetts,USA;參數(shù)參見表1)。對每個樣品進行三個運行。原始數(shù)據(jù)用非商業(yè)的Roche自有數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)，利用Sequest作為基礎(chǔ)算法(參數(shù)參見表1)來加工。組合來自重復(fù)運行的鑒定的肽和蛋白質(zhì)的得到的列表。蛋白質(zhì)APEX通過所鑒定的序列的幫助被鑒定出，在表2中給出。APEX作為肺癌標志物的#r測對于每個患者，來自肺瘤樣品的鑒定的蛋白質(zhì)和相應(yīng)的肽的數(shù)量與來自鄰近正常組織的一致性結(jié)果相比較。通過這種方法，蛋白質(zhì)APEX被發(fā)現(xiàn)特異性地存在于、或強烈富含于腫瘤組織中，并且在健康對照組織中是不可4全測的或剛剛可檢測的。表l:MSMS數(shù)據(jù)獲取和數(shù)據(jù)庫檢索參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>蛋白質(zhì)APEX在來自患有肺癌的患者的腫瘤組織中強烈地過量呈現(xiàn)。蛋白質(zhì)APEX的以下肽序列通過腫瘤組織中的數(shù)據(jù)庫檢索形式LCQ-MS、數(shù)據(jù)被鑒定出來自APEX的以下序列利用以上描述的方法被鑒定出。表2:ESI-MSMS鑒定的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>APEX可以在來自患有肺腺癌的8位患者的5位的腫瘤組織溶胞產(chǎn)物樣品中鑒定出。在正常的組織溶胞產(chǎn)物中，APEX不能被鑒定出。實施例2肺癌標志物蛋白質(zhì)APEX的抗體的產(chǎn)生產(chǎn)生肺癌標志物蛋白質(zhì)APEX的多克隆抗體，用于在通過免疫檢測分析，例如Western印跡和ELISA的APEX血清和血漿和血液水平測量中進一步使用。在大腸桿菌(五.co//)中重組蛋白質(zhì)的表達為了產(chǎn)生針對APEX的抗體，在大腸桿菌中產(chǎn)生重組抗原因此，APEX編碼區(qū)域從獲自德國基因組研究資源中心(RZPD,Berlin,Germany)的全長cDNA克隆IRATp970H075D利用以下引物PCR擴增正向引物LC38for-五coRI:5'ACGTACGTGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACATTGAAGGCCGTCCGAAGCGTGGGAAAAAGG(SEQIDNO:2/EcoRI-位點下劃線，起始密碼子下劃線)，反向引物LC38rev-SamHI:5'CGTACGTGGATCCTCATTACAGTGCTAGGTATAGGGTGATAGG(SEQIDNO:3ASamHI-位點下劃線)。正向引物特征在于(除了五coRI克隆和核糖體結(jié)合位點之外)編碼按閱讀框?qū)階PEX多肽的N-末端MRGSHHHHHHIEGR肽延伸(SEQIDNO:4)的寡核普酸。五coRI/5amHI消化的PCR片段連接到相應(yīng)的pQE-30(Qiagen，Hilden,Germany)載體片段，其隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌-XLl-blue感受態(tài)細胞中。在序列分析之后，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，用于根據(jù)廠家的說明書在pQE載體系列的IPTG-可誘導(dǎo)T5啟動子之下的表達。對于MRGSHHHHHHIEGR-APEX融合蛋白的純化，1L過夜誘導(dǎo)的細菌培養(yǎng)物通過離心來丸粒化，細胞丸粒重懸浮在含lmg/ml溶菌酶和CompleteTMEDTA-free蛋白酶抑制物片的pH7.4的20mM磷酸鈉緩沖液，500mM氯化鈉中。細胞通過超聲破碎來破壞，不溶性物質(zhì)通過離心丸?；?，上清液施加于Ni-氨三乙酸(Ni-NTA)金屬親和層析柱用幾倍柱床體積的裂解緩沖液洗滌，隨后用20mM磷酸鈉緩沖液、500mM氯化鈉、20mM咪唑，pH7.4洗滌。最后，結(jié)合的抗原用在20mM磷酸鈉緩沖液、500mM氯化鈉、pH7.4中從20到500mM的咪唑梯度洗脫，并保存在4。C、75mMHEPES-緩沖液，pH7.5、100mM氯化鈉、1mMEDTA、6.5%蔗糖中。多克隆抗體的產(chǎn)生a)免疫為了免疫，制備1:1比例的蛋白質(zhì)溶液(100嗎/ml蛋白質(zhì)APEX)和完全弗氏佐劑的新鮮乳劑。在第1、7、14和30、60和90天用lmL乳劑免疫每只兔子。抽取血液，產(chǎn)生的抗APEX血清如下文描述的使用。b)通過用辛酸和硫酸銨連續(xù)沉淀從兔血清純化IgG(免疫球蛋白G)一倍體積的兔血清用4倍體積的醋酸鹽緩沖液(60mM,pH4.0)稀釋。pH值用2MTris-堿調(diào)節(jié)到4.5。辛酸(25(al/ml稀釋的樣品)在強烈攪拌下滴加。在30分鐘后，離心樣品(13000xg,30分鐘，4。C),棄去丸粒，采集上清液。上清液的pH值通過添加2MTris-堿調(diào)節(jié)到7.5。上清液中的免疫球蛋白通過滴加4M石克酸銨溶液到2M的終濃度在強烈攪拌下沉淀。沉淀的免疫球蛋白通過離心收集(8000xg,15分鐘，4°C)。丟棄上清液。丸粒溶于10mMNaH2P04/NaOH、pH7.5、30mMNaCl中，并徹底地透析。透析液進行離心(13000xg,15分鐘，4°C)并過濾(0.2。c)多克隆兔IgG的生物素化多克隆兔IgG在10mMNaH2P04/NaOH、pH7.5、30mMNaCl中達到10mg/ml。每mlIgG溶液添加50(al生物素-N-羥基琥珀酰亞胺(DMSO中3.6mg/ml)。在室溫下30分鐘后，樣品在Superdex200上層析(10mMNaH2P04/NaOH，pH7.5,30mMNaCl)。采集含有生物素化的IgG的部分。d)多克隆兔IgG的免疫吸附對于APEX免疫吸附，#4居廠家的方案，10mg純化的重組APEX與lmlCNBr活化的Sepharose4B(GEHealthcare,GermanyCatalogNo.17-04-30-01)偶聯(lián)。這個親和柱用PBS、0.05%Tween20中的100mg多克隆兔IgG加載，隨后用a)PBS，b)0.5M氯化鈉、0.05%Tween20，c)30mM氯化鈉洗滌。結(jié)合的部份用用鹽酸調(diào)節(jié)到pH2.1的0.5M甘氨酸、150mM氯化鈉洗脫，立即通過添加1MTris-堿變?yōu)橹行詐H值。洗脫物濃縮到10mg/ml,并在PBS中在TSK-GelG3000SW凝膠過濾柱(Sigma-Aldrich，Germany,catalogueNo.815103)上層析。采集含有IgG單體的部分。實施例3用于測量人類血清和血漿樣品中的APEX的ELISA為了檢測人類血清或血漿中的APEX,開發(fā)了夾心ELISA。對于抗原的捕獲，抗APEX多克隆抗體(參見實施例2)被免疫吸附，并且為了抗原的檢測，抗APEX多克隆抗體與生物素結(jié)合。96孔孩i量滴定板與以150mM碳酸二鈉、350mM石友酸氫鈉中5jag/ml的100pl免疫吸附的抗APEX多克隆抗體孵育60分鐘。隨后，平板用PBS、0.05%Tween20洗滌三次。然后用重組蛋白質(zhì)的連續(xù)稀釋物(參見實施例2)作為標準抗原或用來自患者的稀釋的血漿樣品與5fig/ml生物素化的抗APEX多克隆抗體一起孵育孔2小時。孵育是在10mM磷酸鹽、pH7.4、1%BSA、0.9%NaCl和0.1%Tween20中。此后，洗滌平板三次來除去未結(jié)合的成分。在下一步中，孔與20mU/mL抗生物素-POD結(jié)合物在10mM磷酸鹽、pH7.4、1%BSA、0.9。/。NaCl和0.1%Tween20中醉育60分鐘。隨后用相同的緩沖液洗滌平板三次。對于結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物的檢測，孔與100|alABTS溶液(RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany,CatalogNo.11685767)孵育，在30-60分鐘之后用ELISA讀取器在405nm測量OD。實施例4研究群體使用了來自用表3中給出的UICC分類法良好表征的60位NSCLC患者(30位腺CA,30位鱗狀細胞CA)的樣，表3:研究群體'品，<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>與獲自30位明顯健康的個體和30位沒有任何已知惡性肺部疾病的表面上健康的吸煙者(=對照群組)相比，評估表3的LC樣品中APEX的水平。與對照樣品中的APEX水平相比，表3的LC樣品中APEX的水平提高了。根據(jù)Zweig，M.H.和Campbell的上文進行ROC分析。如通過曲線下面積所測量的，區(qū)分LC組中的患者與健康個體的判別能力被發(fā)現(xiàn)對于LC對健康對照為92%(附圖1)。在95%的特異性下，所有LC樣品的敏感性是70%,對于腺癌67%，對于鱗狀細胞癌73%。利用實施例2中產(chǎn)生的多克隆抗體檢測人類肺癌組織中的APEX的Western印跡來自腫瘤樣品和健康對照樣品的組織溶胞產(chǎn)物如實施例l"組織制備"中描述的制備。SDS-PAGE和Western印跡4吏用Invitrogen,Karlsruhe,Germany的試劑和設(shè)備進行。對于測試的每種組織樣品，15嗎的組織溶胞產(chǎn)物在還原NuPAGE(Invitrogen)SDS樣品緩沖液中稀釋，在95。C加熱10分鐘。樣品在MES運行緩沖系統(tǒng)中在4-12%NuPAGE⑧凝膠(Tris-甘氨酸)上運行。使用InvitrogenXCellIIBlotModule(Invitrogen)和NuPAGE⑧轉(zhuǎn)移緩沖系統(tǒng)，凝膠分離的蛋白質(zhì)混合物在硝化纖維膜上印跡。膜在PBS/0.05%Tween-20中洗滌3次，用Roti-Block封閉緩沖液(A151.1;CarlRothGmbH，Karlsruhe,Germany)封閉2小時。第一抗體，多克隆兔抗APEX血清(實施例2中描述的產(chǎn)生)在Roti⑧-Block封閉緩沖液中1:10,000稀釋，與膜孵育1小時。膜在PBS/0.05%Tween-20中洗滌6次。特異性結(jié)合的第一兔抗體用POD結(jié)合的多克隆綿羊抗兔IgG抗體標記，在0.5xRoti-Block封閉緩沖液中稀釋到10mU/ml。在孵育1小時之后，膜在PBS/0.05%Tween-20中洗滌6次。對于結(jié)合的POD結(jié)合的抗兔抗體的檢測，膜與Lumi-LightPLUSWestern印跡底物(Order-No.2015196,RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany)孵育，并暴露于放射自顯影底片。APEX的信號強度在從20位不同LC患者獲得的20個肺瘤組織溶胞產(chǎn)物中的16個中提高(附圖2)。表達水平〉600ng/mg。因而，如實施例1中的MALDI檢出的肺癌組織中APEX的提高的豐度通過Western印跡分析^皮確i^。權(quán)利要求1.一種體外評估肺癌的方法，包括測量樣品中以下的存在和/或濃度(a)選自組織提取物和體液的樣品中的AP核酸內(nèi)切酶(APEX)，(b)任選一種或更多種其他肺癌標志物，以及(c)將步驟(a)和任選步驟(b)的測量結(jié)果用于肺癌的評估，其中APEX的檢測是肺癌的指示。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或更多種其他標志物選自CYFRA21-1、CEA、NSE、proGRP和SCC。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述一種或更多種其他標志物是CYFRA21-1。4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述一種或更多種其他標志物是CEA。5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述一種或更多種其他標志物是scc。6.APEX在選自組織^是取物和體液的樣品中體外評估肺癌中的用途，其中APEX的檢測是肺癌的指示。7.包含APEX和一種或更多種其他肺癌標志物的標志物組在選自組織提取物和體液的樣品中體外評估肺癌中的用途，其中APEX的檢測是肺癌的指示。8.根據(jù)權(quán)利要求7的標志物組的用途，其中所述一種或更多種其他標志物選自CYFRA21-1、CEA、NSE和SCC。9.根據(jù)權(quán)利要求8的標志物組的用途，所述標志物組至少包含APEX和CYFRA21隱1。10.—種用于進行根據(jù)權(quán)利要求2的方法的試劑盒，包括特異性地測量APEX和一種或更多種其他肺癌標志物所需的試劑。全文摘要本發(fā)明涉及肺癌的評估。它公開了蛋白質(zhì)APEX在肺癌的評估中的用途。此外，它還涉及通過測量樣品中的APEX利用從個體得到的液體樣品體外評估肺癌的方法。例如，APEX的測量可以用于肺癌患者的早期檢測或跟蹤。文檔編號G01N33/574GK101641599SQ200880009504公開日2010年2月3日申請日期2008年3月19日優(yōu)先權(quán)日2007年3月23日發(fā)明者J·克洛克納,J·卡爾,M·-L·哈格曼,M·塔克,M·羅斯勒,M·蒂羅爾夫申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司