專利名稱：：分離和測(cè)定鹽酸帕洛諾司瓊及其光學(xué)異構(gòu)體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種分離和測(cè)定鹽酸帕洛諾司瓊及其光學(xué)異構(gòu)體的方法，具體涉及用高效液相色譜法對(duì)鹽酸帕洛諾司瓊及它的另三個(gè)光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行分離和含量測(cè)定的方法。
背景技術(shù)：
：鹽酸帕洛諾司瓊(化學(xué)名(3aS)-2-[(S)-l-氮雜雙環(huán)[2.2.2]辛-3-基]-2，3,3a,4,5，6_六氫-l-氧-lH-苯并[de]異喹啉鹽酸鹽)是一種藥物，對(duì)5-HT3受體有更強(qiáng)的結(jié)合力，臨床上用于預(yù)防在實(shí)施中度或高度致嘔吐性化療方案時(shí)所引起的急性和遲發(fā)性嘔吐。由于鹽酸帕洛諾司瓊含有兩個(gè)手性中心，除(3aS,S型)鹽酸帕洛諾司瓊外，還存在其他三個(gè)光學(xué)異構(gòu)體(3aR，S)、(3aS，R)、(3aR，R)，而此三個(gè)異構(gòu)體無上述藥物活性。所以，鹽酸帕洛諾司瓊與其他三個(gè)光學(xué)異構(gòu)體的分離，對(duì)鹽酸帕洛諾司瓊質(zhì)量的控制具有非常重要的意義。而且在制藥的實(shí)踐中，往往還需要測(cè)定鹽酸帕洛諾司瓊原料藥和制劑中有效成分的含量，或者需要測(cè)定作為雜質(zhì)的其它三種異構(gòu)體的含量。而使用常用填料色譜柱的色譜方法不能將鹽酸帕洛諾司瓊與異構(gòu)體(3aS，S)分離，因色譜峰完全重疊不能分離；常用填料色譜柱也不能在其它異構(gòu)體間進(jìn)行分離，如異構(gòu)體(3aS，R)和(3aR，S)色譜峰也完全重疊，不能分離。更不可能分別測(cè)定幾種異構(gòu)體的含量。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)鹽酸帕洛諾司瓊光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行分離的方法。本發(fā)明另一目的是提供對(duì)鹽酸帕洛諾司瓊及它的三種光學(xué)異構(gòu)體含量測(cè)定的方法。本發(fā)明提供了一種用高效液相色譜法對(duì)鹽酸帕洛諾司瓊光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行分離和含量測(cè)定的方法，其特征在于高效液相色譜法中使用的色譜柱填料是大環(huán)糖肽替考拉寧(Teicoplanin)鍵合硅膠，流動(dòng)相由三乙胺水溶液和有機(jī)溶劑組成，所述有機(jī)溶劑是低級(jí)醇、低級(jí)腈或雜環(huán)化合物，優(yōu)選甲醇、乙腈、乙醇、丙醇或四氫呋喃中的一種或多種。所述的三乙胺水溶液中三乙胺的濃度為0.1%~2%，優(yōu)選濃度為0.1%—0.5%。所述三乙胺水溶液和有機(jī)溶劑的比例(V/V)為20%40%:60%80%。3所述三乙胺水溶液優(yōu)選pH為3.5~4.5?？捎孟∷嵴{(diào)節(jié)pH，可選用的稀酸調(diào)節(jié)劑可以是有機(jī)酸或無機(jī)酸，其中有機(jī)酸的PKa小于6.0，無機(jī)酸指中強(qiáng)酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，用大環(huán)糖肽替考拉寧(Teicoplanin)鍵合硅膠為填充劑(色譜柱CHIROBIOTICT4.6X250mm5pm);以0.3%三乙胺(冰醋酸調(diào)節(jié)pH4.0)-甲醇(30:70)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為249nm。取(3aS,S)，GaR,S)，(3aS,R),(3aR，R)混旋體適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋成每lml約0.2mg的溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣2(Hd，記錄色譜圖。按出峰順序，峰l為(3aS,S)、峰2為(3aR，S)、峰3和峰4為(3aS,R),(3aR,R)混旋體的兩個(gè)組分。理論板數(shù)按(3aS，S)計(jì)算不低于4000，鹽酸帕洛諾司瓊峰和相鄰異構(gòu)體的分離度應(yīng)不低于1.0。用本發(fā)明的方法不僅可將鹽酸帕洛諾司瓊與其它光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行分離，還能夠定量測(cè)定鹽酸帕洛諾司瓊(3aS，S)的含量，以及其它三種光學(xué)異構(gòu)體(3aR，S)、GaS，R)和(3aR，R)的含量。實(shí)施例l給出了有效成分鹽酸帕洛諾司瓊(3aS，S)及三種光學(xué)異構(gòu)體分離的研究，并對(duì)這4種光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行定性。其中(3aR,S)、(3aS，R)、(3aR，R)三種光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)，作為雜質(zhì)整體進(jìn)行計(jì)算，即計(jì)算出鹽酸帕洛諾司瓊中其它光學(xué)異構(gòu)體含量總和。圖1是(3aS，S)構(gòu)型的高效液相色譜圖圖2是(3aS，S)，(3aR，S)混旋體的高效液相色譜圖圖3是(3aS，R)，(3aR，R)混旋體的高效液相色譜圖圖4是(3aS，S)，(3aR,S)，(3aS，R)，(3aR，R)混合的高效液相色譜圖圖5是收集組分一的高效液相色譜圖圖6是收集組分二的高效液相色譜圖圖7是組分一MS圖圖8是組分二MS圖圖9是組分一MS2圖圖10是組分二MS2圖圖11是該色譜系統(tǒng)對(duì)本品檢測(cè)限的高效液相色譜圖具體實(shí)施例方式下面以示例進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例中所使用的色譜分離的流動(dòng)相、流動(dòng)相的組成和使用的色譜分離柱及色譜分離柱的填料。實(shí)施例1四種光學(xué)異構(gòu)體的色譜、質(zhì)譜和檢測(cè)限基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)儀器和條件a、HPLC(高效液相色譜)條件儀器SHIMADZULC-2010AHT(日本島津)檢測(cè)器UV流動(dòng)相0.3%三乙胺(冰醋酸調(diào)節(jié)pH4.0)-甲醇(30:70)色譜柱CHIROBIOTICT4.6X250mm5um流速1,0ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)249nm色譜工作站LCsolutionb、MS(質(zhì)譜)條件MS儀器API3000(美國(guó)生物應(yīng)用工程公司)IonSource:TurboSprayIonSourceGasl(GSl):4.0Curtaingas:10.0IonSourceGas2(GS2):0.0DP:60.0EP:12.0IS:5500.00方法研究a、LC定性取已經(jīng)過結(jié)構(gòu)確證的(3aS,S)適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋成每lml約含0.1mg的溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣20yl，記錄色譜圖(圖l)。取(3aS，S),(3aR,S)混旋體適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋成每lml約0.2mg的溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣20ul，記錄色譜圖(圖2)。取(3aS,R),GaR,R)混旋體適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋成每lml約0.2mg的溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣20ul，記錄色譜圖(圖3)。另取(3aS,S),(3aR,S)，(3aS，R),(3aR,R)混旋體適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋成每lml約0.2mg的溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣20ul，記錄色譜圖(圖4)。由上述色譜圖可知，在該色譜系統(tǒng)中(3aS,S)鹽酸帕洛諾司瓊和其他三個(gè)異構(gòu)體分離良好。出峰位置分別是峰l為(3aS,S)峰、峰2為(3aR,S)峰、峰3和峰4為(3aS，R),(3aR,R)混旋體的兩個(gè)組分峰。b、MS定性用質(zhì)譜對(duì)(3aS,R)和(3aR,R)異構(gòu)體進(jìn)行定性。取(3aS,R),(3aR,R)混旋體適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋成每lml約含本品0.5mg的溶液，按上述HPLC條件進(jìn)樣50ul，分別收集兩組分峰，將兩組分峰溶液分別濃縮后按上述相同的HPLC條件進(jìn)樣50ul，記錄色譜圖(圖5，6)。與圖3比較可知，收集到的溶液在該色譜系統(tǒng)中出峰位置與(3aS,R)、(3aR,R)混旋體的兩個(gè)出峰位置一致。與圖譜4比較可知收集的溶液在該色譜系統(tǒng)中出峰位置與圖中峰3、峰4位置一致。分別取收集的兩組分溶液按上述質(zhì)譜條件進(jìn)行MS分析(圖7、8)，兩圖中均有與(3aS,S)鹽酸帕洛諾司瓊相同的[M+1]峰。為了使專一性更強(qiáng)，取該兩組分的溶液作了MS2分析(圖9、10)，MS2圖均與(3aS,S)鹽酸帕洛諾司瓊MS2圖相同。說明該兩組分均有與(3aS，S)鹽酸帕洛諾司瓊相同分子量的物質(zhì)，可確定該兩組分為(3aS，R)和(3aR，R)兩個(gè)光學(xué)異構(gòu)體。c、檢測(cè)限取鹽酸帕洛諾司瓊對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成供試液，按上述色譜條件取20nl進(jìn)樣，連續(xù)5次。經(jīng)試驗(yàn)，當(dāng)濃度為3.0X10—〒gtel時(shí)，信噪比為3:1，即為檢測(cè)限(圖ll)，詳見表l。表l，色譜系統(tǒng)對(duì)鹽酸帕洛諾司瓊的檢測(cè)限次數(shù)12345平均值樣品峰峰高s254251298281289274.6噪音峰高N817891969287.6信噪比(S/N)3.13.23.32.93.13.1在該色譜系統(tǒng)中鹽酸帕洛諾司瓊的檢測(cè)限是3.0X10-7g/ml，0.15%的異構(gòu)體雜質(zhì)均能見到。實(shí)施例2鹽酸帕洛諾司瓊原料藥中其它光學(xué)異構(gòu)體含量測(cè)定a，測(cè)定方法用大環(huán)糖肽替考拉寧(Teicoplanin)鍵合硅膠為填充劑(CHIROBIOTICT4.6X250mm5(im);以0.3%三乙胺(冰醋酸調(diào)節(jié)pH4.0)-甲醇(30:70)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為249nm。6取(3aS,S),GaR,S)，(3aS，R),(3aR，R)混旋體適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋成每lml約0.2mg的溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣20[il，記錄色譜圖。按出峰順序，峰l為(3aS,S)、峰2為(3aR,S)、峰3和峰4為(3aS,R),(3aR,R)混旋體的兩個(gè)組分。理論板數(shù)按(3aS，S)計(jì)算不低于4000，鹽酸帕洛諾司瓊峰和相鄰異構(gòu)體的分離度應(yīng)不低于1.0取鹽酸帕洛諾司瓊適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每lml約含0.2mg的溶液，搖勻，精密取20nl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，并峰面積歸一化。(3aR,S)、(3aS,R)、GaR,R)峰面積之和除以(3aS,S)、(3aR,S)、(3aS，R)、(3aR,R)峰面積之和，可以得到鹽酸帕洛諾司瓊其它光學(xué)異構(gòu)體的含量。b，檢測(cè)限取鹽酸帕洛諾司瓊對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成供試液，按上述色譜條件取20pl進(jìn)樣，連續(xù)5次。經(jīng)試驗(yàn)，當(dāng)濃度為3.0XKfgtel時(shí)，信噪比為3:1，即為檢測(cè)限，詳見表l。0.15%的異構(gòu)體雜質(zhì)均能見到。C，樣品檢測(cè)取鹽酸帕洛諾司瓊連續(xù)三批粗品及相應(yīng)的三批成品適量，分別加流動(dòng)相溶解并稀釋成每lml約含0.2mg的溶液，按上述方法進(jìn)樣20P1，記錄色譜圖。其它光學(xué)異構(gòu)體含量檢測(cè)數(shù)據(jù)見表2:表2鹽酸帕洛諾司瓊中其它光學(xué)異構(gòu)體含量(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例3鹽酸帕洛諾司瓊注射劑中其它光學(xué)異構(gòu)體含量測(cè)定a，測(cè)定方法用大環(huán)糖肽替考拉寧(Teicoplanin)鍵合硅膠為填充劑(CHIROBIOTICT4.6X250mm5nm);以0.3%三乙胺(冰醋酸調(diào)節(jié)pH4.0)-甲醇(30:70)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為249nm。取(3aS,S),(3aR，S),(3aS，R)，(3aR，R)混旋體適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋成每lml約0.2mg的溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣2(^1，記錄色譜圖。按出峰順序，峰l為(3aS，S)、峰2為(3aR,S)、峰3和峰4為(3aS,R),(3aR,R)混旋體的兩個(gè)組分。理論板數(shù)按GaS，S)計(jì)算不低于4000，鹽酸帕洛諾司瓊峰和相鄰異構(gòu)體的分離度應(yīng)不低于1.0精密量取鹽酸帕洛諾司瓊注射液(規(guī)格為0.25mg/5ml)80nl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，并峰面積歸一化。(3aR,S)、(3aS,R)、(3aR,R)峰面積之和除以(3aS,S)、(3aR,S)、(3aS，R)、(3aR,R)峰面積之和，可以得到鹽酸帕洛諾司瓊注射液中光學(xué)異構(gòu)體的含量。b，檢測(cè)限取鹽酸帕洛諾司瓊對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成供試液，按上述色譜條件取20pl進(jìn)樣，連續(xù)5次。經(jīng)試驗(yàn)，當(dāng)濃度為3.0Xl(fgtol時(shí)，信噪比為3:1，即為檢測(cè)限，詳見表l。0.15%的異構(gòu)體雜質(zhì)均能見到。C，樣品檢測(cè)取連續(xù)三批鹽酸帕洛諾司瓊注射液成品，按上述方法進(jìn)樣80ul，記錄色譜圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表3:表3鹽酸帕洛諾司瓊注射液其它光學(xué)異構(gòu)體含量(％)200404012004040120040401注射液中光學(xué)異構(gòu)體含量0.000.000.00實(shí)施例4鹽酸帕洛諾司瓊原料藥中有效成分鹽酸帕洛諾司瓊(3aS，S)含量測(cè)定a，測(cè)定方法用大環(huán)糖肽替考拉寧(Teicoplanin)鍵合硅膠為填充劑(CHIROBIOTICT4.6X250mm5pm);以0.3%三乙胺(冰醋酸調(diào)節(jié)pH4.0)-甲醇(30:70)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為249nm。取(3aS,S),(3aR,S)，(3aS,R)，(3aR,R)混旋體適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋成每lml約0.2mg的溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣20^1，記錄色譜圖。按出峰順序，峰l為(3aS,S)、峰2為(3aR，S)、峰3和峰4為(3aS,R),(3aR，R)混旋體的兩個(gè)組分。理論板數(shù)按(3aS，S)計(jì)算不低于4000，鹽酸帕洛諾司瓊峰和相鄰異構(gòu)體的分離度應(yīng)不低于1.0取鹽酸帕洛諾司瓊適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每lml約含0.2mg的溶液，搖勻，精密取20|al注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取(3aS,S)峰面積；另取在105'C干燥2小時(shí)的鹽酸帕洛諾司瓊對(duì)照品適量，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得鹽酸帕洛諾司瓊的含量。b，線性范圍精密稱取鹽酸帕洛諾司瓊對(duì)照品0.1g于100ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液，分別精密量取貯備液l.O，1.5，2.0，2.5，3.0ml分別置于5個(gè)10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣20pl。記錄主峰面積，并進(jìn)行線性回歸。得到回歸方程為Y=30046X-14406r=0.9999(n=5)，結(jié)果表明鹽酸帕洛諾司瓊在0.1mg/m10.3mg/ml范圍內(nèi)，峰面積與濃度關(guān)系線性良好。c，回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量的鹽酸帕洛諾司瓊樣品30mg(3份)，分別置于3個(gè)50ml量瓶中，再分別加入對(duì)照品10mg，20mg，30mg，加適量流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別精密移取5ml置25ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，分別測(cè)定，計(jì)算回收率，得平均回收率為100.1%.RSD=0.24%，說明準(zhǔn)確度良好，見表4。表4回收率測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>d樣品檢測(cè)分別稱取鹽酸帕洛諾司瓊連續(xù)三批樣品,分別加流動(dòng)相溶解并稀釋成每lml約含0.2mg的溶液，搖勻，精密取20nl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取主峰面積；另取在105"C干燥2小時(shí)的鹽酸帕洛諾司瓊對(duì)照品適量，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。見表5。表5三批鹽酸帕洛諾司瓊有效成分含量測(cè)定結(jié)果(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例5鹽酸帕洛諾司瓊注射劑中有效成分鹽酸帕洛諾司瓊(3aS，S)的含量測(cè)定a，測(cè)定方法用大環(huán)糖肽替考拉寧(Teicoplanin)鍵合硅膠為填充劑(CHIROBIOTICT4.6X250mm5nm);以0.3%三乙胺(冰醋酸調(diào)節(jié)pH4.0)-甲醇(30:70)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為249nm。取(3aS,S),(3aR，S)，(3aS,R)，(3aR,R)混旋體適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋成每lml約0.2mg的溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣20pl，記錄色譜圖。按出峰順序，峰l為(3aS，S)、峰2為(3aR,S)、峰3和峰4為(3aS,R),(3aR,R)混旋體的兩個(gè)組分。理論板數(shù)按GaS，S)計(jì)算不低于4000，鹽酸帕洛諾司瓊峰和相鄰異構(gòu)體的分離度應(yīng)不低于1.0精密量取鹽酸帕洛諾司瓊注射液(規(guī)格為0.25mg/5ml)注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取(3aS,S)峰面積；另取在105i:干燥2小時(shí)的鹽酸帕洛諾司瓊對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋成每lml約0.05mg的溶液，搖勻，精密量取8(^1注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取(3aS,S)峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。b，線性范圍精密稱取鹽酸帕洛諾司瓊對(duì)照品0.1g于100ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液，分別精密量取貯備液l.O，1.5，2.0，2.5，3.0ml分別置于5個(gè)10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣20pl。記錄主峰面積，并進(jìn)行線性回歸。得到回歸方程為Y=30046X-14406r=0.9999(n=5)，結(jié)果表明鹽酸帕洛諾司瓊在0.1mg/m10.3mg/ml范圍內(nèi)，峰面積與濃度關(guān)系線性良好。c，回收率試驗(yàn)精密稱取鹽酸帕洛諾司瓊對(duì)照品25mg，50mg，75mg，分別置于3個(gè)100ml量瓶中，再分別加入加適量注射液空白基質(zhì)溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別精密移取5ml置50ml量瓶中，加注射液空白基質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，分別測(cè)定，計(jì)算回收率，得平均回收率為％，RSD=0.0%，說明準(zhǔn)確度良好，見表6。10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>取鹽酸帕洛諾司瓊注射液連續(xù)三批樣品,精密取80pl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取主峰面積；另取在105'C干燥2小時(shí)的鹽酸帕洛諾司瓊對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋成每lml約0.05mg的溶液，搖勻，精密量取80pl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取主峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算標(biāo)示含量。見表7。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求1.一種用高效液相色譜法對(duì)鹽酸帕洛諾司瓊及其光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行分離和含量測(cè)定的方法，其特征在于，色譜柱使用的填料是大環(huán)糖肽替考拉寧鍵合硅膠，流動(dòng)相由三乙胺水溶液和有機(jī)溶劑組成；所述有機(jī)溶劑是低級(jí)醇、低級(jí)腈或雜環(huán)化合物。2.權(quán)利要求1所述的方法，所述的三乙胺水溶液中三乙胺的濃度為0.1%2%。3.權(quán)利要求1或2所述的方法，所述三乙胺水溶液和有機(jī)溶劑的比例(V/V)為20%40%:60%80%。4.權(quán)利要求1或2所述的方法，所述三乙胺水溶液pH為3.5~4.5。5.權(quán)利要求1或2所述的方法，所述有機(jī)溶劑選自甲醇、乙腈、乙醇、丙醇或四氫呋喃中的一種或多種。6.權(quán)利要求1所述的方法，所述鹽酸帕洛諾司瓊光學(xué)異構(gòu)體是(3aR，S)、(3aS，R)和GaR，R)型。全文摘要本發(fā)明涉及一種用高效液相色譜法對(duì)鹽酸帕洛諾司瓊及其光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行分離和含量測(cè)定的方法，其特征在于，高效液相色譜法中使用的色譜柱填料是大環(huán)糖肽替考拉寧鍵合硅膠，流動(dòng)相由三乙胺水溶液和有機(jī)溶劑組成。文檔編號(hào)G01N30/02GK101661019SQ20081011882公開日2010年3月3日申請(qǐng)日期2008年8月25日優(yōu)先權(quán)日2008年8月25日發(fā)明者平楊申請(qǐng)人:重慶華邦制藥股份有限公司