專利名稱：：一次性測(cè)定生物體中十種氨基類生物活性物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)生物活性分子的測(cè)定，尤其是生物體中(如血液或腦組織)氨基類生物活性物質(zhì)的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
：中醫(yī)藥的整體調(diào)節(jié)作用與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)，而腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、五-羥色胺(5-HT)、組胺(HA)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、Y-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)和三碘甲狀腺原氨酸(T3)等十種氨基類生物活性物質(zhì)是對(duì)于研究神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)具有重要意義的因子。腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、五-羥色胺(5-HT)、組胺(HA)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、Y-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)和三碘甲狀腺原氨酸(T3)等十種氨基類生物活性物質(zhì)的分子式中均有氨基，丹酰氯能與氨基類化合物反應(yīng)形成具有熒光的衍生物，可用于微量活性物質(zhì)的測(cè)定。以丹酰氯為衍生試劑測(cè)定血液中某一個(gè)氨基或者某幾個(gè)氨基酸的文獻(xiàn)國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，但將血液中氨基酸類和單胺類遞質(zhì)一起，以丹酰氯為衍生試劑檢測(cè)的色譜條件國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道；將氨基酸類和單胺類遞質(zhì)、組胺、三碘甲狀腺原氨酸一起，以丹酰氯為衍生試劑檢測(cè)的色譜條件國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。將神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)中的腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、五-羥色胺(5-HT)、組胺(HA)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、Y-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)和三碘甲狀腺原氨酸(T3)等十種氨基3類生物活性物質(zhì)按照的常規(guī)檢測(cè)方法測(cè)定如高效液相色譜一電化學(xué)檢測(cè)腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)等兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)；用鄰苯二甲醛為熒光衍生試劑高效液相色譜熒光檢測(cè)法測(cè)定氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)；用放免法測(cè)定三碘甲狀腺原氨酸等，一方面由于方法各異，因此，需要被檢測(cè)的樣本量會(huì)比較大，增加實(shí)驗(yàn)成本；另一方面，由于不同的檢測(cè)方法，樣品前處理步驟不同，檢測(cè)的原理不同，會(huì)導(dǎo)致統(tǒng)一分析檢測(cè)指標(biāo)的變化時(shí)，實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)誤差增加。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種一次性測(cè)定生物體中十種氨基類生物活性物質(zhì)的方法。本發(fā)明采用丹酰氯為衍生試劑一次性測(cè)定腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、五-羥色胺(5-HT)、組胺(HA)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、Y-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)和三碘甲狀腺原氨酸(T3)等十種氨基類生物活性物質(zhì)，使生物體中腎上腺素等氨基類生物活性物質(zhì)的測(cè)定更加方便快速。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的一次性測(cè)定生物體中十種氨基類:生物活性物質(zhì)的方法，包括如下步驟將生物體液經(jīng)去蛋白處理后，加入KHC03溶液調(diào)PH值后，再加入和調(diào)PH后溶液體積相同的、濃度為2-10mg/ml的丹酰氯進(jìn)行衍生化反應(yīng)，反應(yīng)溫度為8(TC水浴，反應(yīng)時(shí)間為20分鐘；利用高效液相色譜儀和熒光檢測(cè)器完成對(duì)腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、五-羥色胺(5-HT)、組胺(HA)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、Y-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)和三碘甲狀腺原氨酸(T3)十種氨基類生物活性物質(zhì)的檢測(cè)，其中，色譜條件為色譜柱HypersilODS(C18)色譜柱，型號(hào)250X4.6mm，5um;流動(dòng)相流動(dòng)相B是甲醇乙腈=2:3;流動(dòng)相A是20mrno1/1的醋酸鹽緩沖液，其中加入3mmo1/1的辛垸磺酸鈉，0.lmmo1/1的Na-EDTA，并用氫氧化鈉調(diào)至pH值4.8，用0.45um微孔濾膜過(guò)濾；流速lmlmin—、柱溫30°C;熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)為350nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510nm。本發(fā)明中，液相色譜中采用梯度洗脫，梯度洗脫的條件如下表所列。時(shí)間流動(dòng)相B(%)流動(dòng)相A(%)010min1020—35459080—65551030min354565553040min35-45—75856555—25154050min758525155070min7585—85952515—1057080min8595155相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明方法將腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、五-羥色胺(5-HT)、組胺(HA)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、y-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)和二碘甲狀腺原氨酸(T\)這十種物質(zhì)在同一個(gè)色譜系統(tǒng)中在七十五分鐘內(nèi)檢測(cè)出來(lái)，大大降低了實(shí)驗(yàn)的成本，節(jié)約了人力和物力；本發(fā)明方法對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等生物樣本量較少的情況效果尤為明顯；本發(fā)明方法還減少了不同檢測(cè)方法造成的系統(tǒng)誤差。本發(fā)明方法可用于神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)中腎上腺素等十種氨基類生物活性物質(zhì)的分析研究，有助于闡明神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)中腎上腺素等十種氨基類生物活性物質(zhì)之間及其與中藥整體調(diào)節(jié)作用的關(guān)系。圖1是0-90min內(nèi)混合標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)后圖譜。圖2是0-90min內(nèi)血槳反應(yīng)后圖譜(45-90min圖譜放大)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例應(yīng)理解為僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發(fā)明權(quán)利要求所限定的范圍。本發(fā)明一較佳實(shí)施例提出的一次性測(cè)定生物體中十種氨基類生物活性物質(zhì)的方法，包括血液氨基類生物活性物質(zhì)的高效液相色譜分析方法的建立，并測(cè)定服用某一味中藥后對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)中這十個(gè)因子的影響。1試劑和器材。1.1儀器LC-20AB高效液相色譜儀(日本島津公司)；RF-10Axl熒光檢測(cè)器(日本島津公司)；LC色譜工作站(北京泰立)；GL-20B高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)1.2試劑腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、五-羥色胺(5-HT)、組胺(HA)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(A印)、Y-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺激素、4二羥基節(jié)胺標(biāo)準(zhǔn)品均為Sigma產(chǎn)品；丹酰氯、甲醇、乙腈等其他試劑均為色譜純；水為超純水。2樣品的制備2.l取血實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用昆明小鼠，清潔級(jí)。取空白對(duì)照組小鼠，麻醉下腹主動(dòng)脈采血。血液置含有抗凝劑的試管中，混合后，以3000rpm/min，離心10min使與血球分離，取淡黃色上清液即得血漿。血漿中加入30%的三氯乙酸后，10000rpm，2min，離心2次后取上清液，置于Effendorf管中，-20。C冷凍保存。2.2血漿的衍生化反應(yīng)取上清液100u1于離心管中，加入100u1(2mol/L)KHC03，200u1的濃度為5mg/ml的丹酰氯丙酮溶液，混勻置于80°C水浴下30min，取出后進(jìn)樣。3色譜條件色譜柱ThermoHypersil-KeystoneC18ODS(250X4.6，5Pm)流動(dòng)相流動(dòng)相B為甲醇乙腈=2:3;流動(dòng)相A為醋酸鹽緩沖液(20rnmo1/1)，其中加入辛垸磺酸鈉(3mmo1/1)，Na-EDTA(0.lmmo1/1)，用氫氧化鈉調(diào)至pH值4.8，用0.45um微孔濾膜過(guò)濾。流速lml/min;熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為350nm;發(fā)射波長(zhǎng)為510nm柱溫30°C;進(jìn)樣量50Ul。液相色譜中采用梯度洗脫，梯度洗脫的條件如表1所列。表l.梯度洗脫條件時(shí)間流動(dòng)相A(%)流動(dòng)相B(%)010min15—4085—601030min40603040min40—8060—204050min80205070min80—9020—107080min90100-90min內(nèi)混合標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)后的圖譜如圖1所示。0-90min內(nèi)血漿反應(yīng)后的圖譜如圖2所示。4方法性能指標(biāo)4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍和方法檢出限用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制成O-IO.Oug/ml的標(biāo)準(zhǔn)系列，經(jīng)熒光衍生化后，進(jìn)樣50ul，色譜分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)。以3倍基線噪聲所對(duì)應(yīng)的代測(cè)物濃度為方法的檢測(cè)限。曲線下面積和含量取對(duì)數(shù)后，進(jìn)行相關(guān)性分析，呈線性相關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程及檢測(cè)限見(jiàn)表2。其中Y代表曲線下面積的對(duì)數(shù)值，X代表含量(ng)的對(duì)數(shù)值。表2.方法標(biāo)準(zhǔn)回歸方程相關(guān)系數(shù)和檢出限測(cè)定物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程相關(guān)系數(shù)(r)檢出限(ng/ml)谷氨酸Y=3.74+0.92x0.9920.79天冬氨酸Y=3.90+0.90x0.9730.72甘氨酸Y=4.55+0.83x0.9940.22氨基丁酸Y=4.77+0.78x0.9700.07組胺Y=2.62+1.19x0.9790.925—HTY=3.94+0.65x0.9470.96T3Y=5.21+0.21x0.9550.003NEY=3.37+0.95x0.9910.80EY=4.09+0.73x0.9830.68DAY=4.00+0.76x0.9790.354.2方法準(zhǔn)確度和精密度。4.2.1準(zhǔn)確度在本實(shí)施例方法確定的實(shí)驗(yàn)條件下，計(jì)算根據(jù)峰面積計(jì)算出理論濃度，并與實(shí)際濃度的相比，得到準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)表3，由表3可見(jiàn)，本實(shí)施例方法的回收率范圍為86.8%-117.8%，其精密度滿足體內(nèi)含量分析的要求。4.2.2精密度在本實(shí)施例方法確定的實(shí)驗(yàn)條件下，混標(biāo)日內(nèi)和日間各測(cè)定5次，根據(jù)峰面積計(jì)算日內(nèi)和日間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，由表3可見(jiàn)，本實(shí)施例方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為0.2%-14.4%。其精密度滿足體內(nèi)含量分析的要求。表3.方法準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定物質(zhì)準(zhǔn)確度RECOVERY(%)精密度RSD(%)曰內(nèi)曰間谷氨酸101.17.911.6天冬氨酸89.010.014.4甘氨酸101.29.814.08<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>4.3舉例根據(jù)圖2中各物質(zhì)的曲線下面積，按照上述回歸方程計(jì)算小鼠血漿中各^標(biāo)測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表4。表4.小鼠血漿測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求1、一次性測(cè)定生物體中十種氨基類生物活性物質(zhì)的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟將生物體液經(jīng)去蛋白處理后，加入KHCO3溶液調(diào)PH值后，再加入和調(diào)PH后溶液體積相同的、濃度為2-10mg/ml的丹酰氯進(jìn)行衍生化反應(yīng)，反應(yīng)溫度為80℃水浴，反應(yīng)時(shí)間為20分鐘；利用高效液相色譜儀和熒光檢測(cè)器完成生物體液中腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺、五-羥色胺、組胺、谷氨酸、天冬氨酸、γ-氨基丁酸、甘氨酸和三碘甲狀腺原氨酸十種氨基類生物活性物質(zhì)的檢測(cè)，其中，色譜條件為色譜柱HypersilODS(C18)色譜柱，型號(hào)250×4.6mm，5μm；流動(dòng)相流動(dòng)相B是甲醇∶乙腈＝2∶3；流動(dòng)相A是20mmol/l的醋酸鹽緩沖液，其中加入3mmol/l的辛烷磺酸鈉，0.1mmol/l的Na-EDTA，并用氫氧化鈉調(diào)至pH值4.8，用0.45um微孔濾膜過(guò)濾；流速1ml·min-1；柱溫30℃；熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)為350nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510nm。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，液相色譜中采用梯度洗脫，梯度洗脫的條件如下表所列。<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>全文摘要本發(fā)明屬生物化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)生物活性分子的測(cè)定，尤其是生物體中(如血液或腦組織)氨基類生物活性物質(zhì)的測(cè)定方法。具體公開(kāi)了一種一次性測(cè)定生物體中十種氨基類生物活性物質(zhì)的方法，在75分鐘內(nèi)以丹酰氯為衍生試劑一次性測(cè)定生物體中腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、五-羥色胺(5-HT)、組胺(HA)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)和三碘甲狀腺原氨酸(T₃)十種氨基類生物活性物質(zhì)。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便快速，可靈敏地測(cè)定生物體液中這十種物質(zhì)的濃度，適用于需要全面分析生物體中這十種物質(zhì)的研究。文檔編號(hào)G01N30/34GK101581703SQ200810043369公開(kāi)日2009年11月18日申請(qǐng)日期2008年5月16日優(yōu)先權(quán)日2008年5月16日發(fā)明者俞仲毅,季曉慧,施鑫偉,勇金申請(qǐng)人:上海中醫(yī)藥大學(xué)