專利名稱：定量測定糖化蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥檢測領(lǐng)域，具體的說涉及一種定量測定糖化蛋白質(zhì)的方法。

背景技術(shù)：
一.臨床意義 糖尿病是一組病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明了的內(nèi)分泌代謝性疾病，目前發(fā)病率僅次于心腦血管疾病和腫瘤。在我國糖尿病發(fā)病率為2-3％，并以每千分之一的速度增長。目前臨床已廣泛開展檢測患者血糖工作。但血糖測定只代表即刻的血糖水平，提示患者當(dāng)時的身體狀況，并不能作為評價疾病控制程度的指標(biāo)。
糖尿病常會引起視網(wǎng)、腎、神經(jīng)等病變及各種并發(fā)癥。要徹底治愈是非常困難的，嚴(yán)格地控制血糖水平是治療糖尿病及預(yù)防其各種并發(fā)癥的有效手段。近年來糖化蛋白質(zhì)指標(biāo)正日益受到臨床的高度重視，其中，糖化血紅蛋白和糖化白蛋白尤其重要。糖化白蛋白、糖化血紅蛋白、和糖化蛋白一樣，被當(dāng)作用于血糖控制的指標(biāo)。糖化血紅蛋白反映過去1個月～2個月的血糖水平，而糖化白蛋白與糖化蛋白反映過去2周～3周的血糖水平。糖化白蛋白的檢測避免了血清白蛋白下降對測定結(jié)果的影響。因此在了解血糖短期水平時如妊娠、外傷、急性合并癥時具有優(yōu)勢。
糖化血紅蛋白是指血液中和葡萄糖結(jié)合了的那一部分血紅蛋白。當(dāng)血液中葡萄糖濃度較高時，人體所形成的糖化血紅蛋白含量也會相對較高。人體內(nèi)紅細(xì)胞的壽命一般為120天，在細(xì)胞死亡前，血液中糖化血紅蛋白含量也會保持相對不變。因些糖化血紅蛋白水平反映的是在檢測前120天內(nèi)的平均血糖水平，而與抽血時間，病人是否空腹，是否使用胰島素等因素?zé)o關(guān)。是判定糖尿病長期控制的良好指標(biāo)。
白蛋白是血液中含量最高的蛋白質(zhì)。糖化白蛋白形成于血糖及白蛋白之間的反應(yīng)。反應(yīng)是緩慢而持續(xù)的糖化白蛋白的升高，意味著前一時期血糖的持續(xù)升高。由于白蛋白在血液中的循環(huán)時間約兩星期，所以糖化白蛋白提供了測定前10-20天的監(jiān)測窗口。
糖化血紅蛋白和糖化白蛋白的測定結(jié)果都是以百分率表示，指的是和葡萄糖結(jié)合的血紅蛋白(白蛋白)占全部血紅蛋白(白蛋白)的比例。
非糖尿病患者的糖化血紅蛋白的水平為4-6％；許多研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者如能將糖化血紅蛋白水平降低至8％以下，糖尿病的并發(fā)癥將大大降低，如果糖化血紅蛋白＞9％，說明患者待續(xù)性高血糖，會發(fā)生糖尿病性腎病，動脈硬化，白內(nèi)障等并發(fā)癥，并有可能出現(xiàn)酮癥酸中毒等急性合并癥。因此，有關(guān)專家建議，如果糖尿病患者血糖控制已達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，并且血糖控制狀態(tài)較為了平穩(wěn)，每年至少應(yīng)該接受2次糖化血紅蛋白檢測；對于那些需要改變資料方案，或者血糖控制狀態(tài)不穩(wěn)定的患者，及正在進(jìn)行胰島素治療的患者，應(yīng)該每三個月進(jìn)行一次糖化血紅蛋白測定。
非糖尿病患者的糖化白蛋白的水平為12-17％。但測定方法不同，會有不一樣的結(jié)果，也有報導(dǎo)指出正常人的糖化白蛋白的水平在1.5％-15.0％之間。糖化白蛋白的結(jié)果能用于糖尿病的篩選，糖尿病患者糖化白蛋白水平明顯高于正常對照組，并與空腹血糖呈正相關(guān)。糖化白蛋白的測定不受進(jìn)食、膽紅素、尿酸、肌酐、血紅蛋白及維生素C的干擾，尤其是排除了肝腎疾病、溶血性貧血和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)異常對血漿蛋白量的影響。糖化白蛋白變化早于糖化血紅蛋白，對不穩(wěn)定的血糖變化，糖化白蛋白能及時監(jiān)測。糖化白蛋白可用作糖尿病妊娠與孕期高血糖的鑒別，糖尿病妊娠者糖化白蛋白高于孕期高血糖患者的水平。糖化白蛋白與糖化血紅蛋白有較好的相關(guān)性，但糖化血紅蛋白除糖尿病外其他疾病也可升高，如尿毒癥、甲亢、腎衰等，但這些疾病時糖化白蛋白正常；溶血性貧血、血紅蛋白異變體如HbS或HbC、高HbF血癥時，由于紅細(xì)胞壽命下降糖化血紅蛋白變化較大而糖化白蛋白不受干擾；因此糖化白蛋白與糖化血紅蛋白結(jié)合應(yīng)用提高檢測的準(zhǔn)確性。當(dāng)?shù)鞍诐舛劝l(fā)生變化時，對腎病綜合征、肝硬化、異常蛋白血癥或急性時相反應(yīng)之后的患者，病時糖化蛋白結(jié)果不可靠，而糖化白蛋白的測定不受蛋白變化的影響。蛋白經(jīng)糖化后可形成穩(wěn)定和不可逆的晚期糖基化終未產(chǎn)物(AGE)，從而使這些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，影響許多配體的親和力；低密度脂蛋白(LDL)糖化成LDL-AGE，經(jīng)過機(jī)體的免疫反應(yīng)，形成LDL-AGE免疫復(fù)合物，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的聚集、吞噬而積聚膽固醇脂，使其轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞，經(jīng)受體介導(dǎo)、激活、合成、釋放具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，最終使血管內(nèi)膜損傷、粥樣斑塊形成動脈粥樣硬化。同時體內(nèi)VI膠原AGE形成后，使分子內(nèi)共價健交聯(lián)增加，螺旋結(jié)構(gòu)減少，引起膠原彈性下降及變硬，在微血管基底膜上形成沉積造成底膜加厚，而IgG免疫復(fù)合物的自身免疫反應(yīng)又加重了組織損傷，導(dǎo)致視網(wǎng)膜和腎小球產(chǎn)生微血管病。因此糖化白蛋白測定又可估計(jì)組織蛋白的糖基化作用，了解其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展及并發(fā)癥的預(yù)測、預(yù)防。
二.相關(guān)測定方法 糖化蛋白質(zhì)檢測的方法很多，測定方法主要有色譜法、電泳法、化學(xué)法和免疫法。
目前，以離子交換層析為原理的高效液相色譜法(HPLC)，即糖化蛋白分析儀，已被廣泛用于測定血液中糖化蛋白％。雖然這種方法重復(fù)性非常好，但也存在著一些缺點(diǎn)，其中包括需要一個專門的高效液相色譜儀系統(tǒng)，測定容量有限，以及由不同形式血紅蛋白引進(jìn)的不準(zhǔn)確的結(jié)果。此外，它需要高度的技術(shù)維護(hù)。
US專利#4,269,605 U.S專利#5,284,777，講述了使用一種硼酸衍生物固定于瓊脂糖珠子的親和層析方法。
US專利#5,110,745介紹了將測定標(biāo)本與過剩量的硼酸化合物反應(yīng)，然后再用固化的糖化分子吸附剩余的硼酸化合物。最后測定沒有結(jié)合硼酸化合物的糖化分子的量。此方法操作步驟很多，還必須嚴(yán)格控制硼酸化合物的量。
日本專利#6,058,936，和歐洲專利#455225講述了將硼酸衍生物與一可探測標(biāo)簽偶聯(lián)(如熒光化合物，化學(xué)發(fā)光復(fù)合，同位素，酶或其他標(biāo)簽)然后與另一抗體一起測定糖化蛋白質(zhì)。
所有上述方法都是測定單一的糖化蛋白質(zhì)，而糖化蛋白質(zhì)通常是以與總蛋白質(zhì)量的百分比來表達(dá)的。所以還必需用另一種方法來測定總蛋白質(zhì)量。
WO#9840750推薦了一種方法用固化的硼酸與樣本中的糖化蛋白質(zhì)反應(yīng)。他的設(shè)計(jì)可以不用測定非糖化蛋白質(zhì)而得到糖化蛋白質(zhì)與總蛋白質(zhì)量的百分比的結(jié)果。但是由于硼酸和糖化蛋白質(zhì)的親和力有限，此方法的結(jié)果會受到溫度和孵育時間的影響。
近年來，免疫試劑由于它對糖化蛋白質(zhì)的高度特異性和親和力已顯示了它的特殊生命力。
歐洲專利#201187講述了制備特異性抗糖化血紅蛋白單克隆抗體的方法。
US專利#522392講述了制備特異性抗糖化白蛋白單克隆抗體的方法。
US專利#5470759講述了利用特異性抗糖化血紅蛋白單克隆抗體，建立免疫凝集試驗(yàn)和免疫濁度試驗(yàn)測定糖化血紅蛋白。
US專利#5206144講述了制備特異性抗糖化血紅蛋白單克隆抗體的方法以及用此抗體建立的酶免疫試驗(yàn)測定糖化血紅蛋白。此方法必須凈取標(biāo)本紅血球，溶血稀釋后包被在微孔板上。然后在與特異性抗糖化血紅蛋白單克隆抗體反應(yīng)后，再用酶標(biāo)第二抗體測定糖化血紅蛋白。此方法步驟很多。
US專利#5932480介紹了一步法測定糖化血紅蛋白百分比的方法。具體步驟是標(biāo)本，未包被的固相，特異抗體酶綴合物在一起同時孵育40分鐘，攝氏37度。洗凈后，再加底物測定酶活性，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品比較得到標(biāo)本糖化血紅蛋白的百分比。此方法的缺點(diǎn)是在特異抗體酶綴合物和未包被的固相同時孵育的過程中，本底肯定會升高。
由于血液中的血紅蛋白含量很高，很多測定糖化血紅蛋白的免疫方法，包括上述兩種，都把包被血紅蛋白作為其測定步驟的一部分。為使血紅蛋白包被效果更好，常常還必須加上一個變性處理步驟。其結(jié)果往往是測定時間延長，測定誤差增加。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種定量測定糖化蛋白質(zhì)的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷。
本發(fā)明所提供的定量測定糖化蛋白質(zhì)的方法，具體的包括如下步驟 ①A-B組合吸取5-50微升溶血稀釋液到抗體A包被的固相中，然后加100微升標(biāo)本稀釋液、100微升探測標(biāo)簽標(biāo)記的抗體B，充分搖勻后靜置室溫5-30分鐘； ②A-C組合吸取5-50微升溶血稀釋液到另一抗體A包被的固相中，然后加100微升標(biāo)本稀釋液、100微升探測標(biāo)簽標(biāo)記的抗體C，充分搖勻后靜置室溫5-30分鐘； ③A-B標(biāo)準(zhǔn)品組合分別吸取5-50微升糖化蛋白質(zhì)和非糖化蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品到不同的抗體A包被的固相中，然后分別加100微升標(biāo)本稀釋液、100微升探測標(biāo)簽標(biāo)記的抗體B，充分搖勻后靜置室溫5-30分鐘； ④A-C標(biāo)準(zhǔn)品組合分別吸取5-50微升糖化蛋白質(zhì)和非糖化蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品到不同的抗體A包被的固相中，然后分別加100微升標(biāo)本稀釋液、100微升探測標(biāo)簽標(biāo)記的抗體C，充分搖勻后靜置室溫5-30分鐘； ⑤傾去所有固相中的反應(yīng)液，然后用洗滌液300微升洗五次；拍干殘陳液滴； ⑥在每個固相微孔中加100微升標(biāo)記酶底物，靜置室溫5-30分鐘； ⑦在每個固相微孔中加100微升中止液，充分搖勻后在讀數(shù)儀上讀數(shù)； ⑧在A-B組合中得到的標(biāo)本數(shù)據(jù)，與A-B標(biāo)準(zhǔn)品組合比較，計(jì)算出糖化蛋白質(zhì)濃度； ⑨在A-C組合中得到的標(biāo)本數(shù)據(jù)，與A-C標(biāo)準(zhǔn)品組合比較，計(jì)算出總蛋白質(zhì)濃度； ⑩把糖化蛋白質(zhì)濃度除以總蛋白質(zhì)濃度即得到糖化蛋白質(zhì)百分比濃度； 其中所述的糖化蛋白質(zhì)為糖化白蛋白或糖化血紅蛋白； 其中抗體A對總蛋白質(zhì)特異；抗體B對糖化蛋白質(zhì)特異；抗體C對總蛋白質(zhì)特異。
抗體A-糖化蛋白質(zhì)-抗體B可形成夾心式的免疫復(fù)合物。
特異抗體A-總蛋白質(zhì)-抗體C可形成夾心式的免疫復(fù)合物。
其中所述的抗體A包被的固相為普通微孔板、發(fā)光微孔板、熒光微孔板、普通微顆?；虼蓬w粒。
其中所述的用于標(biāo)記抗體B、C的探測標(biāo)簽為標(biāo)記酶、同位素、熒光化合物或化學(xué)發(fā)光復(fù)合物；優(yōu)選的為過氧化氫酶、堿性磷酸酶或半乳糖苷酶。
其中步驟⑥中所述的標(biāo)記酶底物是3，3’5，5-四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫溶液、化學(xué)發(fā)光底物溶液或熒光底物溶液；其中優(yōu)選的為3，3’5，5-四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫溶液(TMB溶液)。當(dāng)標(biāo)記酶底物為化學(xué)發(fā)光底物溶液或熒光底物溶液時，步驟⑦中不需要加中止液。
其中步驟⑦中所述的讀數(shù)儀是酶標(biāo)讀數(shù)儀、化學(xué)發(fā)光讀數(shù)儀、熒光讀數(shù)儀或同位素計(jì)數(shù)儀 抗體A、B、C均為市售產(chǎn)品， 其中用于檢測糖化血紅蛋白的抗體A、B、C來自于美國Abcam公司； 抗體A鼠抗人血紅蛋白單克隆抗體 型號AB401 抗體B鼠抗人糖化血紅蛋白單克隆抗體 型號AB47149 抗體C鼠抗人血紅蛋白單克隆抗體 型號AB402 也可以是具有相同特性的其他來源的抗體。
其中用于檢測血清白蛋白的抗體A、B、C來自于美國Abcam公司和美國USBiologicai公司； 抗體A美國Abcam公司，名稱羊抗人血清白蛋白多克隆抗體，親和層析純，型號AB19180 抗體B美國USBiologicai公司，名稱鼠抗人血清糖化白蛋白單克隆抗體，型號A1327-55 抗體C美國Abcam公司，名稱鼠抗人血清白蛋白單克隆抗體，型號AB7793 也可以是具有相同特性的其他來源的抗體。
糖化蛋白質(zhì)和非糖化蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品來源USBiological公司。
其中溶血標(biāo)本是按照如下方法制備的采取1-2微升毛細(xì)血管全血，加到10毫升溶血緩沖液中，充分搖勻后靜置室溫20分鐘。
溶血緩沖液的制備0.1M琥珀酸緩沖液(pH 5.0)含0.1％Triton X-100，0.05％疊氮納。
其中標(biāo)本稀釋液為20mM TRIS-HCl緩沖液，pH 7.20。
其中洗滌液為10mM PBS，pH 7.40，0.05％ Tween-20。
其中TMB溶液3，3’5，5-四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫溶液(Sigma-Aldrich，T0440) 其中中止液為2N HCl溶液。
所有化學(xué)品的來源都是Sigma-Aldrich公司。
本發(fā)明的測定方法具有如下幾個特點(diǎn) 1.可以用同一方法，同時定量測定糖化蛋白質(zhì)和相應(yīng)的總蛋白質(zhì)。由此算出的糖化蛋白質(zhì)百分比更為客觀，準(zhǔn)確?？杀苊庥刹煌椒?，不同儀器，不同環(huán)境，不同操作人員而帶來的誤差干擾。
2.方法采用兩組抗體對子，一組對糖化蛋白質(zhì)特異，另一組對總蛋白質(zhì)特異?？贵w組的高度特異保證了試驗(yàn)的準(zhǔn)確度，抗體組的高親和力可以縮短試驗(yàn)時間。
3.由于測定結(jié)果是以糖化蛋白質(zhì)和相應(yīng)的總蛋白質(zhì)的比例來表達(dá)的，所以在一定范圍內(nèi)，取樣多少不會影響測定結(jié)果。
4.發(fā)明可用于多種模式，如傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫試驗(yàn)，化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)，熒光免疫試驗(yàn)，磁顆粒免疫試驗(yàn)等。
5.本發(fā)明還可用于免疫濁度試驗(yàn)，制備兩種不同的抗體微球，一對糖化蛋白質(zhì)特異，一對總蛋白質(zhì)特異。分別試驗(yàn)，然后算出的糖化蛋白質(zhì)百分比結(jié)果。
6.試驗(yàn)可采用毛細(xì)血管血，方便采樣，減少病人痛苦。
7.本發(fā)明的方法可以同時定量測定糖化蛋白質(zhì)和相應(yīng)的總蛋白質(zhì)，不需包被血紅蛋白，不需作變性處理，快速，簡便，準(zhǔn)確。



圖1、抗體A包被固相 圖2、標(biāo)記酶標(biāo)記的抗體B 圖3、標(biāo)記酶標(biāo)記的抗體C 圖4、標(biāo)記酶底物 圖5、A-B組合 圖6、A-C組合 圖7、血紅蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品曲線，其中X軸為血紅蛋白濃度；Y軸為吸光度 圖8、糖化血紅蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品曲線，其中X軸為糖化血紅蛋白濃度；Y軸為吸光度 圖9、白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品曲線，其中X軸為白蛋白濃度；Y軸為吸光度 圖10、糖化白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品曲線，其中X軸為糖化白蛋白濃度；Y軸為吸光度
具體實(shí)施例方式 下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1，糖化血紅蛋白的測定。
·固相抗體的制備 抗體A，鼠抗人血紅蛋白單克隆抗體，美國Abcam公司，型號AB401抗體A需包被在微孔板(Sigma-Aldrich，M0156)上，抗體濃度，在1.0微克/毫升到10.0微克/毫升之間，包被緩沖液，0.1M碳酸碳酸氫鈉緩沖液，pH 9.6.包被量200微升/微孔，室溫過夜。然后用封閉緩沖液(Sigma-Aldrich，C9483)300微升/微孔，室溫封閉過夜。甩干后，干燥保存?zhèn)溆谩?br> ·抗體-標(biāo)記酶綴合物的制備 抗體B，鼠抗人糖化血紅蛋白單克隆抗體，美國Abcam公司，型號AB47149，抗體C，鼠抗人血紅蛋白單克隆抗體，美國Abcam公司，型號AB402 抗體B和抗體C分別與辣根過氧化物酶(Sigma-Aldrich，P8415)綴合。成為抗體-標(biāo)記酶綴合物。綴合方法根據(jù)美國專利4,256,833，簡述如下辣根過氧化物酶溶解于0.1M碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH值8.5，5毫克酶每毫升。一滴一滴加入1％異硫氰酸苯酯(體積/體積無水乙醇)，同時在室溫下，不斷輕輕地攪拌酶溶液，直到有輕微混濁的出現(xiàn)。輕輕地在室溫下攪拌2小時。然后，一滴一滴加入0.06M過碘酸鈉溶液直至終濃度約0.03M。此時，酶的糖類成分中的氧化劑的鄰二羥基團(tuán)被氧化生成自由醛基。此基團(tuán)可與抗體中的自由氨基在0.1M碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH值9.5環(huán)境下，輕輕地在室溫下攪拌1小時形成希夫氏基團(tuán)，然后加入硼氫化鈉還原穩(wěn)定(通常，5毫克辣根過氧化物酶和7.5毫克抗體，大約需要0.8毫克硼氫化鈉)，進(jìn)一步純化去除未反應(yīng)的抗體和酶即成為抗體-標(biāo)記酶綴合物成品?？贵w-標(biāo)記酶綴合物成品可根據(jù)需要用BioStab酶穩(wěn)定劑(Sigma-Aldrich，95576)稀釋成綴合物應(yīng)用液。
·血紅蛋白和糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的制備 血紅蛋白(USBiological公司，H1850-18)用一生物分子儲存液(Sigma-Aldrich，92889)稀釋成一系列濃度0，20，100，200毫克/毫升。并分裝在小瓶子里備用。試驗(yàn)前吸取1微升到10毫升溶血緩沖液中，充分混勻。(正常人全血血紅蛋白的含量在110毫克/毫升到160毫克/毫升之間，此血紅蛋白的系列標(biāo)準(zhǔn)品涵蓋了這個鄰域)。
糖化血紅蛋白(USBiological公司，H1850-15)，用一生物分子儲存液(Sigma-Aldrich，92889)稀釋成一系列濃度0，2，20，50毫克/毫升。并分裝在小瓶子里備用。試驗(yàn)前吸取1微升到10毫升溶血緩沖液中，充分混勻。
·溶血緩沖液的制備0.1M琥珀酸緩沖液(pH 5.0)含0.1％Triton X-100，4mM EDTA，0.05％疊氮納。
·標(biāo)本稀釋液的制備20mM TRIS-HCl緩沖液，pH 7.20。
·血標(biāo)本的制備采取1微升毛細(xì)血管全血，加到10毫升溶血緩沖液中，充分搖勻后靜置室溫20分鐘。
·試驗(yàn)以下列方法進(jìn)行 1.為血紅蛋白的系列標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備4個抗體A包被的微孔。分別吸取20微升不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品到各個抗體A包被的微孔中去。然后加100微升標(biāo)本稀釋液、100微升過氧化物酶標(biāo)記的抗體C綴合物應(yīng)用液，充分搖勻后靜置室溫20分鐘； 2.為糖化血紅蛋白的系列標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備4個抗體A包被的微孔。分別吸取20微升不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品到各個抗體A包被的微孔中去。然后加100微升標(biāo)本稀釋液、100微升過氧化物酶標(biāo)記的抗體B，充分搖勻后靜置室溫20分鐘； 3.為每個標(biāo)本準(zhǔn)備2個抗體A包被的微孔。吸取20微升標(biāo)本到其中一個微孔中，然后加100微升標(biāo)本稀釋液、100微升過氧化物酶標(biāo)記的抗體B，充分搖勻后靜置室溫20分鐘；吸取20微升溶血標(biāo)本到另一抗體A包被的微孔中，然后加100微升標(biāo)本稀釋液、100微升過氧化物酶標(biāo)記的抗體C，充分搖勻后靜置室溫20分鐘。
4.傾去所有微孔中的反應(yīng)液，然后用洗滌液300微升洗五次；拍干殘陳液滴。
5.在每個微孔中加100微升3，3’5，5-四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫溶液，(TMB溶液，Sigma-Aldrich，T0440)，靜置室溫10分鐘。
6.在每個微孔中加100微升中止液，充分搖勻后在酶標(biāo)讀數(shù)儀上讀數(shù)。
7.下面的表1是實(shí)際操作中各標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本在微孔板上的位置以及在酶標(biāo)讀數(shù)儀上讀數(shù)的結(jié)果 表1
微孔A1血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品0毫克/毫升，A-C組合 微孔B1血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品20毫克/毫升，A-C組合 微孔C1血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品100毫克/毫升，A-C組合 微孔D1血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品200毫克/毫升，A-C組合 微孔E1正常標(biāo)本N1，A-C組合 微孔F1正常標(biāo)本N2，A-C組合 微孔G1糖尿病標(biāo)本D1，A-C組合 微孔H1糖尿病標(biāo)本D2，A-C組合 微孔A2糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品0毫克/毫升，A-B組合 微孔B2糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品2毫克/毫升，A-B組合 微孔C2糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品20毫克/毫升，A-B組合 微孔D2糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品50毫克/毫升，A-B組合 微孔E2正常標(biāo)本N1，A-B組合 微孔F2正常標(biāo)本N2，A-B組合 微孔G2糖尿病標(biāo)本D1，A-B組合 微孔H2糖尿病標(biāo)本D2，A-B組合 微孔A3，B3，C3，D3，試劑空白 8.在A-C組合中得到的標(biāo)本數(shù)據(jù)，與A-C標(biāo)準(zhǔn)品組合比較，計(jì)算出總血紅蛋白濃度；在A-B組合中得到的標(biāo)本數(shù)據(jù)，與A-B標(biāo)準(zhǔn)品組合比較，計(jì)算出糖化血紅蛋白濃度。
總血紅蛋白的計(jì)算結(jié)果見表2(A-C組合) 將上述數(shù)據(jù)進(jìn)行二次曲線擬合，得到圖7的標(biāo)準(zhǔn)品曲線。
糖化血紅蛋白的計(jì)算結(jié)果見表3(A-B組合) 將上述數(shù)據(jù)進(jìn)行二次曲線擬合，得到圖8的糖化血紅蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品曲線。
把糖化血紅蛋白濃度除以總血紅蛋白濃度即得到糖化血紅蛋白百分比濃度；實(shí)施例1測試了4個標(biāo)本，其中，2個正常人，(N1，N2)2個糖尿病患者。(D1，D2)計(jì)算結(jié)果見表4 表4正常人和糖尿病人的糖化血紅蛋白的檢測結(jié)果 實(shí)施例2，糖化白蛋白的測定。
·固相抗體的制備 抗體A，羊抗人血清白蛋白多克隆抗體，美國Abcam公司，型號AB19180，抗體A包被在微孔板(Sigma-Aldrich，MO156)上，制備方法與實(shí)施例1相同。
·抗體-標(biāo)記酶綴合物的制備 抗體B，鼠抗人血清糖化白蛋白單克隆抗體，美國USBiological公司，型號A1327-55；抗體C鼠抗人血清白蛋白單克隆抗體，美國Abcam公司，型號AB7793 抗體B和抗體C需分別與辣根過氧化物酶(Sigma-Aldrich，P8415)綴合。成為抗體-標(biāo)記酶綴合物。綴合方法制備方法與實(shí)施例1相同。
·人血清白蛋白和人血清糖化白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的制備 人血清白蛋白(USBiological公司，A1327-31)用一生物分子儲存液(Sigma-Aldrich，92889)稀釋成一系列濃度0，20，50，100毫克/毫升。并分裝在小瓶子里備用。試驗(yàn)前吸取2微升到10毫升血漿緩沖液中，充分混勻。(正常人血清白蛋白的含量在35毫克/毫升到50毫克/毫升之間，此人血清白蛋白的系列標(biāo)準(zhǔn)品涵蓋了這個鄰域)。
人血清糖化白蛋白(USBiological公司，A1327-53)，用一生物分子儲存液(Sigma-Aldrich，92889)稀釋成一系列濃度0，2，10，50毫克/毫升。并分裝在小瓶子里備用。試驗(yàn)前吸取2微升到10毫升血漿緩沖液中，充分混勻。
·血漿緩沖液的制備0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，4mM EDTA，0.05％疊氮納。
·標(biāo)本稀釋液的制備20mM TRIS-HCl緩沖液，pH 7.20。
·血標(biāo)本的制備采取2微升毛細(xì)血管全血，加到10毫升血漿緩沖液中，充分搖勻后靜置備用。
·試驗(yàn)順序，方法和結(jié)果試驗(yàn)順序，方法和實(shí)施例1相同。結(jié)果如下 各標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本在微孔板上的位置以及在酶標(biāo)讀數(shù)儀上讀數(shù)見表5
微孔A1人血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品0毫克/毫升，A-C組合 微孔B1人血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品20毫克/毫升，A-C組合 微孔C1人血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品50毫克/毫升，A-C組合 微孔D1人血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品100毫克/毫升，A-C組合 微孔E1正常標(biāo)本N1，A-C組合 微孔F1正常標(biāo)本N2，A-C組合 微孔G1正常標(biāo)本N3，A-C組合 微孔H1糖尿病標(biāo)本D1，A-C組合 微孔A2人血清糖化白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品0毫克/毫升，A-B組合 微孔B2人血清糖化白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品2毫克/毫升，A-B組合 微孔C2人血清糖化白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品10毫克/毫升，A-B組合 微孔D2人血清糖化白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品50毫克/毫升，A-B組合 微孔E2正常標(biāo)本N1，A-B組合 微孔F2正常標(biāo)本N2，A-B組合 微孔G2正常標(biāo)本N3，A-B組合 微孔H2糖尿病標(biāo)本D1，A-B組合 微孔A3，B3，C3，D3，試劑空白 ·在A-C組合中得到的標(biāo)本數(shù)據(jù)，與A-C標(biāo)準(zhǔn)品組合比較，計(jì)算出總?cè)搜灏椎鞍诐舛?；在A-B組合中得到的標(biāo)本數(shù)據(jù)，與A-B標(biāo)準(zhǔn)品組合比較，計(jì)算出人血清糖化白蛋白濃度。
總?cè)搜灏椎鞍椎挠?jì)算結(jié)果見表6(A-C組合) 將上述數(shù)據(jù)進(jìn)行二次曲線擬合得到圖9的人血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品曲線。
人血清糖化白蛋白的計(jì)算結(jié)果見表7(A-B組合) 將上述數(shù)據(jù)進(jìn)行二次曲線擬合得到圖10的人血清糖化白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品曲線。
把人血清糖化白蛋白濃度除以總?cè)搜灏椎鞍诐舛燃吹玫饺搜逄腔椎鞍装俜直葷舛龋粚?shí)施例2測試了4個標(biāo)本，其中，3個正常人，(N1，N2，N3)1個糖尿病患者(D1)。計(jì)算結(jié)果見表8
權(quán)利要求
1.一種定量測定糖化蛋白質(zhì)的方法，其特征在于該方法包括如下步驟
①A-B組合吸取5-50微升溶血稀釋液到抗體A包被的固相中，然后加100微升標(biāo)本稀釋液、100微升探測標(biāo)簽標(biāo)記的抗體B，充分搖勻后靜置室溫5-30分鐘；
②A-C組合吸取5-50微升溶血稀釋液到另一抗體A包被的固相中，然后加100微升標(biāo)本稀釋液、100微升探測標(biāo)簽標(biāo)記的抗體C，充分搖勻后靜置室溫5-30分鐘；
③A-B標(biāo)準(zhǔn)品組合分別吸取5-50微升糖化蛋白質(zhì)和非糖化蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品到不同的抗體A包被的固相中，然后分別加100微升標(biāo)本稀釋液、100微升探測標(biāo)簽標(biāo)記的抗體B，充分搖勻后靜置室溫5-30分鐘；
④A-C標(biāo)準(zhǔn)品組合分別吸取5-50微升糖化蛋白質(zhì)和非糖化蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品到不同的抗體A包被的固相中，然后分別加100微升標(biāo)本稀釋液、100微升探測標(biāo)簽標(biāo)記的抗體C，充分搖勻后靜置室溫5-30分鐘；
⑤傾去所有固相中的反應(yīng)液，然后用洗滌液300微升洗五次；拍干殘陳液滴；
⑥在每個固相微孔中加100微升標(biāo)記酶底物，靜置室溫5-30分鐘；
⑦在每個固相微孔中加100微升中止液，充分搖勻后在讀數(shù)儀上讀數(shù)；
⑧在A-B組合中得到的標(biāo)本數(shù)據(jù)，與A-B標(biāo)準(zhǔn)品組合比較，計(jì)算出糖化蛋白質(zhì)濃度；
⑨在A-C組合中得到的標(biāo)本數(shù)據(jù)，與A-C標(biāo)準(zhǔn)品組合比較，計(jì)算出總蛋白質(zhì)濃度；
⑩把糖化蛋白質(zhì)濃度除以總蛋白質(zhì)濃度即得到糖化蛋白質(zhì)百分比濃度；
其中所述的糖化蛋白質(zhì)為糖化白蛋白或糖化血紅蛋白；
其中抗體A對總蛋白質(zhì)特異；抗體B對糖化蛋白質(zhì)特異；抗體C對總蛋白質(zhì)特異。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的抗體A包被的固相為普通微孔板、發(fā)光微孔板、熒光微孔板、普通微顆?；虼蓬w粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的標(biāo)記抗體B、C的探測標(biāo)簽為標(biāo)記酶、同位素、熒光化合物或化學(xué)發(fā)光復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟⑥中所述的標(biāo)記酶底物是3，3’5，5-四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫溶液、化學(xué)發(fā)光底物溶液或熒光底物溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟⑦中所述的讀數(shù)儀是酶標(biāo)讀數(shù)儀、化學(xué)發(fā)光讀數(shù)儀、熒光讀數(shù)儀或同位素計(jì)數(shù)儀。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的標(biāo)記酶為過氧化氫酶、堿性磷酸酶或半乳糖苷酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的標(biāo)記酶底物為3，3’5，5-四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的標(biāo)記酶底物為化學(xué)發(fā)光底物溶液或熒光底物溶液時，不需要加中止液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種測定糖化特定蛋白質(zhì)的方法，該方法采用兩組抗體對子，一組對糖化蛋白質(zhì)特異，另一組對總蛋白質(zhì)特異，可以同時測定糖化特定蛋白質(zhì)和非糖化特定蛋白質(zhì)，由此算出他們的比例。抗體組的高度特異性和親和力保證了試驗(yàn)的準(zhǔn)確度，縮短了試驗(yàn)時間。
文檔編號G01N33/68GK101493467SQ20081003307
公開日2009年7月29日 申請日期2008年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日
發(fā)明者尤少方 申請人:上海伊思柏生物科技有限公司