專利名稱：：一種丹參注射液中有效成分的定量測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種中藥制劑有效成分的定量測(cè)定方法，特別是涉及丹參注射液中有效成分的定量測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
：近年來，隨著我國(guó)人民生活水平的提高，期望壽命的延長(zhǎng)和膳食結(jié)構(gòu)的改變，冠心病的發(fā)病率和死亡率正呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。我國(guó)目前約有4000萬冠心病患者，每小時(shí)約有260例患者死于心腦血管疾病。冠心病發(fā)病率近年來在我國(guó)呈急劇上升的趨勢(shì)。世界衛(wèi)生組織有報(bào)告指出，即使從現(xiàn)在開始就采取有力的預(yù)防措施，我國(guó)心血管疾病發(fā)病率的上升趨勢(shì)也將持續(xù)到2020年左右。心腦血管用藥在藥品市場(chǎng)中的排名也上升至第二位，僅次于抗感染用藥。據(jù)了解，目前國(guó)內(nèi)心腦血管類藥物市場(chǎng)總的格局是中西藥各占一半。從醫(yī)院的用藥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，心腦血管類制劑目前還是由注射劑主導(dǎo)市場(chǎng)，而且，臨床實(shí)踐證明，中藥注射劑治療心腦血管疾病具有化學(xué)藥產(chǎn)品不可替代的獨(dú)特功效，也有中藥其他劑型難以具備的優(yōu)勢(shì)。丹參作為經(jīng)典的活血化瘀中藥，廣泛用于治療冠心病、心絞痛、缺血性腦中風(fēng)等心腦血管疾病，丹參制劑年銷售額約50億元人民幣，尤其是丹參注射液和復(fù)方丹參注射液，年銷售高達(dá)30億支?，F(xiàn)有的丹參注射液收錄于部頒中藥成方制劑第20冊(cè)p34，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為WS3-B-3766-98。功能與主治是活血化瘀，通脈養(yǎng)心。用于冠心病，心絞痛。用法與用量為肌內(nèi)注射，一次24ml，一日12次；靜脈注射，一次4ml(用50%葡萄糖注射液20ml稀釋后使用)，一日12次；靜脈滴注，一次1020ml(用5%葡萄糖注射液100500ml稀釋后使用)，一日l次?；蜃襻t(yī)囑。目前的部頒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅將原兒茶醛作為質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，用高效液相色譜法測(cè)定其含量每lml含原兒茶醛(C7H603)不得少于0.2mg。該標(biāo)準(zhǔn)收錄的丹參注射液制法為取丹參1500g，加水煎煮三次，第一次2小時(shí)，第二、三次各1.5小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至750ml。加乙醇沉淀二次，第一次使含醇量為75%，第二次使含醇量為85%，每次均冷藏放置后濾過，濾液回收乙醇，并濃縮至約250ml，加注射用水至400ml，混勻，冷藏放置，濾過，用10%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，煮沸半小時(shí)，濾過，加注射用水至1000ml，灌封，滅菌，即得。由于歷史的原因，目前的丹參注射劑也存在質(zhì)量和臨床安全性方面的問題。質(zhì)量方面的問題主要表現(xiàn)為目前的丹參注射液產(chǎn)品是經(jīng)傳統(tǒng)工藝制備的中藥材綜合成分的提取物，由于認(rèn)識(shí)的不到位以及制法、質(zhì)控方法不完善，存在有效成分不明確，質(zhì)量不穩(wěn)定，表現(xiàn)為臨床療效不穩(wěn)定，安全性可控性差，發(fā)生不良反應(yīng)多且難以查找原因，難于適應(yīng)中藥現(xiàn)代化和國(guó)際化的要求。目前的丹參注射液中未知的非定量成分占相當(dāng)?shù)谋壤灰恍┐蠓肿与s質(zhì)，如鞣質(zhì)等難以除去，放置一段時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)色澤變深、混濁、沉淀等現(xiàn)象，從而影響制劑的療效和安全性。鞣質(zhì)是影響注射液澄明度的主要因素，鞣質(zhì)是相對(duì)分子量大于iooo(—般3000-5000)的水溶性多酚類化合物，它能同生物堿、蛋白質(zhì)及藥物中的金屬離子作用生成沉淀。例如，它與蛋白質(zhì)分子、生物堿和多糖形成分子間氫鍵，生成不溶于水的沉淀物；因此必須將注射液中所含的鞣質(zhì)去除。一般來說，鞣質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)極易引起黃疸和肝壞死，肌注局部會(huì)發(fā)生硬結(jié)、疼痛，鞣質(zhì)是多元酚的衍生物，既溶于醇又溶于水?，F(xiàn)有的部頒標(biāo)準(zhǔn)中二次醇沉工藝技術(shù)除鞣質(zhì)技術(shù)效果差，所得產(chǎn)品很難合格，并且選擇性差，大量有效成分同時(shí)被除去。現(xiàn)有的技術(shù)還包括熱處理冷置法、水醇法、膠醇法、聚酰胺法和膠醇樹脂法等(詳見王凌等，華西藥學(xué)雜志，2003，No.18，p275;王健等，基層中藥雜志，2001，No.5，p51);水醇法為了除鞣質(zhì)率高，一般pH值調(diào)高至9-10，在如果高的ra下，大量的丹酚酸成分被沉淀除去；在只考慮原兒茶醛的情況下，膠醇樹脂法被最為看好，但事實(shí)上由于鞣質(zhì)與丹酚酸類成分的結(jié)構(gòu)相似性，大孔樹脂帶走了大量的主要有效成分。上述這些除去鞣質(zhì)的方法選擇性差，在除去鞣質(zhì)的同時(shí)，大量的丹酚酸類有效成分被除去；有些方法還弓I入其他雜質(zhì)，使產(chǎn)品的質(zhì)量降低。隨著對(duì)丹參成份認(rèn)識(shí)的不斷深入，近年的研究發(fā)現(xiàn)，丹參中以丹酚酸B和丹酚酸A為代表的水溶性丹酚酸類成分(一般相對(duì)分子量小于1000)心血管活性遠(yuǎn)比丹參素、原兒茶醛強(qiáng)，丹參水溶性酚酸類成分是丹參注射液的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)已得到學(xué)術(shù)界公認(rèn)。丹參酚酸類物質(zhì)對(duì)心血管系統(tǒng)具有廣泛而顯著的藥理活性，具有極強(qiáng)的抗氧化作用，能保護(hù)缺血及缺血再灌注引起的心肌損傷、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、促進(jìn)血管舒張并改善血液流變。令人關(guān)注的是，現(xiàn)有的部頒標(biāo)準(zhǔn)中的丹參注射液生產(chǎn)工藝中的關(guān)鍵工藝點(diǎn)未對(duì)細(xì)節(jié)進(jìn)行規(guī)定，特別是濃縮等環(huán)節(jié)未對(duì)溫度進(jìn)行控制，由于丹參中主要有效成分是熱敏性的水溶性成分，這些成分都不太穩(wěn)定，原有的整個(gè)生產(chǎn)方法對(duì)有效成分特別是丹酚酸A、丹酚酸B的破壞嚴(yán)重，丹酚酸A、丹酚酸B損失非常大，需要進(jìn)一步改進(jìn)和提高生產(chǎn)工藝。研究表明，丹酚酸B等丹參水溶性有效成分在溶液中均易降解不穩(wěn)定，張軍等人(中國(guó)中藥雜志vol.30，No.10，p789)曾對(duì)丹參水提液中的丹酚酸B穩(wěn)定性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，丹參水液IO(TC加熱1小時(shí)，丹酚酸B含量降低約30%，受熱9小時(shí)，丹酚酸B含量降低約95%;60°C加熱1小時(shí)，丹酚酸B含量降低約15%，受熱9小時(shí)，丹酚酸B含量降低約60%;5(TC加熱1小時(shí)，丹酚酸B含量降低約30%，受熱8小時(shí)，丹酚酸B含量降低約40%。另曲桂武等人(中草藥，2005，No.11，pl654)研究發(fā)現(xiàn)，丹參酚酸B的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)水溶液中的丹參酚酸B在低質(zhì)量濃度(<0.lmg/mL)下室溫過夜損失接近30%，其分解產(chǎn)物為丹參素、原兒茶醛等。岳喜典等人(中草藥，2005，No.2，p205)研究表明，要保持溶液中丹參酚酸B穩(wěn)定性，應(yīng)盡可能做到低溶液pH值、高丹參酚酸B質(zhì)量濃度、低溫，并且要盡量縮短溶液狀態(tài)的存放時(shí)間。鑒于現(xiàn)有的丹參注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅將原兒茶醛作為質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于丹參制劑實(shí)際質(zhì)量控制需要。近年來，為了提高對(duì)丹參注射液的有效成分的質(zhì)控水平，許多學(xué)者和機(jī)構(gòu)進(jìn)行了不懈的研究，潘海妮等人對(duì)以丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B為質(zhì)控指標(biāo)進(jìn)行了研究，建立了一種丹參注射液的質(zhì)量控制評(píng)價(jià)和分析方法；國(guó)家有關(guān)部門也即將實(shí)行一個(gè)新的結(jié)合指紋圖譜技術(shù)的丹參注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，主要質(zhì)控指標(biāo)主要有2個(gè)，一是按國(guó)家藥典會(huì)提供的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)評(píng)價(jià)，本品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜比較，相似度不得低于O.80;二是本品每lml含丹參素鈉(C9H905Na)不得少于0.60mg;含原兒茶醛(C7H603)不得少于0.20mg;含丹酚酸B(C36H3。016)不得少于0.25mg。近年的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在目前已知的水溶性丹酚酸類成分中，丹酚酸A為其中最強(qiáng)的有效成分，其藥效作用是目前主流丹參制劑質(zhì)控有效成分丹酚酸B的12倍左右。由于長(zhǎng)期以來獲得高含量的丹酚酸A的技術(shù)一直很難突破，丹酚酸A—直未能作為丹參制劑的質(zhì)控指標(biāo)。綜上，目前現(xiàn)有的丹參注射液生產(chǎn)技術(shù)的主要缺陷是制法不很合理，導(dǎo)致主要有效成分丹酚酸A、B損失非常大；缺乏對(duì)關(guān)鍵有效成分丹酚酸A的質(zhì)量控制，導(dǎo)致產(chǎn)品臨床療效不穩(wěn)定；鞣質(zhì)去除不完全，臨床應(yīng)用有較大的安全隱患。為克服現(xiàn)有的丹參注射液的制備方法中的缺陷，發(fā)明人已在申請(qǐng)?zhí)枮?00710143306.2的專利申請(qǐng)中對(duì)新的制備方法進(jìn)行了詳細(xì)的闡述。
發(fā)明內(nèi)容鑒于現(xiàn)有的中質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅將原兒茶醛作為質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)目前對(duì)丹參注射液有效成分的質(zhì)量控制和臨床用藥安全有效的要求，我們?cè)讷@得高含量丹酚酸A的生產(chǎn)技術(shù)(詳見中國(guó)專利申請(qǐng)200610165779.8)后，通過不斷努力，發(fā)明了同時(shí)測(cè)定多種丹參注射液中有效成分的液相測(cè)定方法，可被定量的有效成分為丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A。應(yīng)用本發(fā)明，申請(qǐng)人將上述4個(gè)質(zhì)控指標(biāo)的含量要求作為產(chǎn)品出廠檢驗(yàn)的檢驗(yàn)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，將丹參注射液的新生產(chǎn)工藝及檢測(cè)技術(shù)成功應(yīng)用于丹參注射液的生產(chǎn)檢驗(yàn)質(zhì)量控制，由于新增加丹酚酸類中藥效最強(qiáng)的丹酚酸A作為質(zhì)控指標(biāo)，與傳統(tǒng)工藝和質(zhì)控技術(shù)比較，所得丹參注射液產(chǎn)品質(zhì)量更為穩(wěn)定可靠，產(chǎn)品的有效性和安全性基本解決，真正達(dá)到安全有效，質(zhì)量可靠。應(yīng)用本發(fā)明，丹參注射液的質(zhì)量控制中含量測(cè)定可包括如下內(nèi)容它包括對(duì)丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A進(jìn)行定性和定量控制，在一定的色譜條件下測(cè)試供試液液相圖譜，本品要求每lml含丹參素鈉(C9H905Na)不得少于0.65mg;含原兒茶醛(C7H603)不得少于O.23mg;含丹酚酸B(C36H3。0j不得少于0.28mg，含丹酚酸A((^^(V)不得少于0.10mg。本發(fā)明所述的定量控制方法為使用梯度洗脫程序應(yīng)用反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定丹參注射液中4種水溶性成分丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A;本發(fā)明所使用的一定的色譜條件，包括如下因素色譜柱；Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)，AgilentZORBAX80AExtend-C18柱(4.6X250mm)，流動(dòng)相A:水-乙腈-甲酸(90:10:0.4，v/v)，流動(dòng)相B:乙月青;流速1.OmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，柱溫30。C，DAD掃描范圍190400nm。所用的線性梯度洗脫程序，具體條件如下表1:表1:線性梯度洗脫程序5Time(min)A%B%01000208515507525701585801585對(duì)照品溶液的制備取丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A對(duì)照品適量，精密稱定，加5X甲醇制成每lml含丹參素鈉0.32mg、原兒茶醛0.10mg、丹酚酸B0.12mg和丹酚酸AO.05mg的混合溶液，即得。供試品溶液的制備精密量取本品2ml，置10ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5iU，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。本發(fā)明的質(zhì)量控制4個(gè)含量控制指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品HPLC圖譜如圖1所示，由4個(gè)特征峰組成。所述的四個(gè)特征峰的保留時(shí)間^為從左到右依次為丹參素鈉tK=5.40min，原兒茶醛tK=9.60min，丹酚酸BtK=30.10min，丹酚酸AtK=34.30min。本發(fā)明方法可一次同時(shí)測(cè)定丹參注射液中的多個(gè)有效成分。通過對(duì)這4個(gè)丹參中主要有效成分的定量控制，可大大提高丹參注射液的安全性和有效性。本發(fā)明專利生產(chǎn)的丹參注射液制劑質(zhì)量穩(wěn)定、可控性強(qiáng)，且檢測(cè)方法先進(jìn)、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，適用于常規(guī)生產(chǎn)跟蹤質(zhì)量檢驗(yàn)，對(duì)控制丹參注射液的質(zhì)量有重要作用。丹參注射液分析方法建立及質(zhì)量穩(wěn)定性評(píng)價(jià)情況簡(jiǎn)單匯總?cè)缦聝x器AgilentllOO型高效液相色譜儀，配脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、紫外檢測(cè)器(Agilent公司)。試劑乙腈為色譜純(MERCK公司)，其余試劑均為分析純，水為純凈水。對(duì)照品丹參素鈉(中檢所，批號(hào)110855-200507)，原兒茶醛(中檢所，批號(hào)110809-200503)、丹酚酸B(中檢所，批號(hào):111562-200609)、丹酚酸A(自制，歸_化標(biāo)定含量98.8%)。色譜條件色譜柱Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)，AgilentZorbax80AExtend-C18柱(4.6乂250咖)，流動(dòng)相八水-乙腈-甲酸(90:10:0.4，v/v)，流動(dòng)相B:乙月青;流速1.OmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，柱溫30。C，DAD掃描范圍190400nm。所用的線性梯度洗脫程序Omin0%B，20min15%B，50min25%B，70min85%B，80min85B%。分離條件與檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇在上述色譜條件下，丹參注射液中4個(gè)定量指標(biāo)成分色譜峰與相鄰峰均達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱，保留時(shí)間適宜，丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A的^分別為丹參素鈉tK=5.40min，原兒茶醛tK=9.60min，丹酚酸Bt^=30.10min，丹酚酸At^=34.30min，確定樣品檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。線性關(guān)系考察精密吸取上述對(duì)照品溶液5ia，注入液相色譜儀，按前述色譜條件測(cè)定。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度X(g/L)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見6表2:線性關(guān)系表)。各指標(biāo)成分在測(cè)定質(zhì)量濃度內(nèi)，線性關(guān)系良好。表2:線性關(guān)系表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>精密度試驗(yàn)儀器精密度精密吸取上述混合對(duì)照品溶液51，注入液相色譜儀，按前述色譜條件測(cè)定。連續(xù)進(jìn)樣5次，以峰面積計(jì)算各指標(biāo)成分相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.88-1.47%。方法精密度取丹參注射液制劑平行配制5份供試液，各供試液連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定3次，以峰面積計(jì)算各指標(biāo)成分相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.08-1.46%。日間精密度取同一批丹參注射液樣品，連續(xù)6天測(cè)其含量，結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均〈1.5%，結(jié)果表明該方法日間精密度量符合要求。樣品穩(wěn)定性取丹參注射液供試品，分別在0hr，lhr，2hr，3hr，4hr，按前述色譜條件測(cè)定供試品溶液丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A含量，結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均<1.5%，結(jié)果表明供試品在4小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。回收率試驗(yàn)精密吸取已知含量的丹參注射液5ml，置10ml量瓶中，分別加入各對(duì)照品適量，每個(gè)對(duì)照品均配3個(gè)濃度，各對(duì)照品加入量依次為丹參素鈉(3.9mg，3.3mg，2.6mg)、原兒茶醛(1.4mg，1.2mg，0.9mg)、丹酚酸B(1.7mg，1.4mg，1.lmg)和丹酚酸A(O.6mg，0.5mg，0.4mg)對(duì)照品溶液lml，制成供試品溶液，按上述液相色譜條件測(cè)定，計(jì)算各質(zhì)控成分的平均回收率依次為丹參素鈉99.6%(RSD1.50%)、原兒茶醛100.1%(RSD1.37%)、丹酚酸B99.8%(RSDl.46%)、丹酚酸A99.5%(RSD1.41%)。經(jīng)過上述研究，本發(fā)明確定了如下的色譜條件色譜柱Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)，AgilentZORBAX80AExtend-C18柱(4.6X250mm)，流動(dòng)相A:水-乙月青-甲酸(90:10:0.4，v/v)，流動(dòng)相B:乙腈；流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，柱溫30。C，DAD掃描范圍190400nm。所用的線性梯度洗脫程序Omin0%B，20min15%B，50min25%B，70min85%B，80min85B%。使用儀器類型高效液相色譜儀器型號(hào)Agilent1100流動(dòng)相A:水_乙腈_甲酸(90:10:0.4，v/v)，流動(dòng)相B:乙腈;梯度方式Omin0%B，20min15%B，50min25%B，70min85%B，80min85B%，檢測(cè)器二極管陣列(DAD)檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)280nm柱溫3(TC柱型號(hào):ZORBAX80AExtend_C18柱(4.6X250mm)流速:1.OmL/min，積分方法面積歸一法圖14個(gè)含量控制指標(biāo)的混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品HPLC圖譜圖2實(shí)施例1制備的丹參注射液HPLC圖譜圖3實(shí)施例2制備的丹參注射液HPLC圖譜圖4實(shí)施例3制備的丹參注射液HPLC圖譜圖5實(shí)施例4制備的丹參注射液HPLC圖譜圖6實(shí)施例5制備的丹參注射液HPLC圖譜具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。如下實(shí)施例中對(duì)不同制備工藝的丹參注射液采用本發(fā)明的液相測(cè)定方法進(jìn)行定量測(cè)定。按照每1ml含丹參素鈉不得少于0.65mg;含原兒茶醛不得少于0.23mg;含丹酚酸B不得少于0.28mg，含丹酚酸A不得少于0.10mg的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量判斷。鞣質(zhì)檢驗(yàn)依據(jù)2005版藥典附錄注射劑項(xiàng)下鞣質(zhì)檢查法進(jìn)行。實(shí)施例1傳統(tǒng)工藝制備丹參注射液取丹參1500g，加水煎煮三次，第一次2小時(shí)，第二、三次各1.5小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至750ml。加乙醇沉淀二次，第一次使含醇量為75%，第二次使含醇量為85%，每次均冷藏放置后濾過，濾液回收乙醇，并濃縮至約250ml，加注射用水至400ml，混勻，冷藏放置，濾過，用10%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，煮沸半小時(shí)，濾過，加注射用水至lOOOml，灌封，滅菌，即得。按本發(fā)明的質(zhì)控方法進(jìn)行檢驗(yàn)，每1ml含丹參素鈉1.OOmg;含原兒茶醛0.90mg;含丹酚酸BO.10mg，含丹酚酸A0.05mg;鞣質(zhì)檢驗(yàn)有大量沉淀。結(jié)果判斷，按本發(fā)明質(zhì)控方法，除丹參素鈉和原兒茶醛符合要求外，鞣質(zhì)檢驗(yàn)和丹酚酸A、B均不合格。實(shí)施例2傳統(tǒng)工藝結(jié)合堿沉(傳統(tǒng)工藝，pH=9.0)制備丹參注射液與實(shí)施例1基本相同，所不同的是在第二次醇沉?xí)r，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，充分?jǐn)嚢?，靜置約1小時(shí)。冷藏，冷藏后的二次醇沉液過濾，減壓蒸餾回收乙醇。加注射用水至400ml，加1:1鹽酸調(diào)pH至6.8，煮沸半小時(shí)，濾過，加注射用水至lOOOml，灌封，滅菌，即得。按本發(fā)明的質(zhì)控方法進(jìn)行檢驗(yàn)，每1ml含丹參素鈉0.95mg;含原兒茶醛0.80mg;含丹酚酸BO.05mg，含丹酚酸AO.02mg;鞣質(zhì)檢驗(yàn)澄清。結(jié)果判斷，鞣質(zhì)檢驗(yàn)合格，但按本發(fā)明質(zhì)控方法，除丹參素鈉和原兒茶醛符合要求(均比實(shí)施例l低)夕卜，和丹酚酸A、B均不合格(均比實(shí)施例l低)。實(shí)施例3傳統(tǒng)工藝結(jié)合堿沉(傳統(tǒng)工藝，pH=8.0)制備丹參注射液與實(shí)施例2基本一樣，所不同的是在第二次醇沉?xí)r，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，其他均相同。按本發(fā)明的質(zhì)控方法進(jìn)行檢驗(yàn)，每1ml含丹參素鈉0.85mg;含原兒茶醛0.76mg;含丹酚酸BO.09mg，含丹酚酸AO.04mg;鞣質(zhì)檢驗(yàn)有少量沉淀。結(jié)果判斷，按本發(fā)明質(zhì)控方8法，除丹參素鈉和原兒茶醛符合要求外，鞣質(zhì)檢驗(yàn)和丹酚酸A、B均不合格。與實(shí)施例1相比，4個(gè)主要成分含量相差不大。實(shí)施例4本發(fā)明的低溫濃縮，超濾(分子量5000)復(fù)合除鞣工藝與實(shí)施例3基本一樣，所不同的是在提取后的濃縮和回收乙醇時(shí)控制低于6(TC進(jìn)行，另外在二次醇沉，pH=8.0堿沉后增加超濾除鞣。所用的超濾膜為Romicon中空纖維膜(5000分子量)。具體如下(1)煎煮取丹參1500g，加水煎煮三次，第一次2小時(shí)，第二、三次各1.5小時(shí)，每次煎畢放出藥液過濾(60目篩)，合并濾液。(2)濃縮將濾液低于6(TC減壓濃縮至750ml，冷卻。(3)醇沉濃縮液冷卻后，先加乙醇至含醇量75%，攪拌，靜置約1小時(shí)。取上清液，冷藏20-48小時(shí)，冰庫(kù)溫度控制在5t:以下。冷藏后過濾，低于6(TC減壓蒸餾回收乙醇?；厥找掖贾翝饪s液約300ml，放冷至室溫。(4)再加乙醇至含醇量85X，用40X氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，充分?jǐn)嚢?，靜置約1小時(shí)。冷藏40-68小時(shí)，冷藏后的二次醇沉液過濾，低于6(TC減壓蒸餾回收乙醇。回收乙醇至約250ml(每lml約含原生藥8.5-10g)。(5)超濾加注射用水至400ml，加10%鹽酸調(diào)pH至6.8，混勻，冷藏放置36-60小時(shí)，采用Romicon中空纖維膜(5000分子量)超濾，收集濾液。(6)加入適量注射用水，加熱煮沸30分鐘，放冷至6(TC，加入適量0.1%活性炭，保溫10分鐘，濾過，取藥液測(cè)得原始ra值，用10%的NaOH溶液調(diào)ra至6.8，用過濾后的注射用水補(bǔ)足至1000ml，并充分?jǐn)嚢杈鶆?。灌封，滅菌，即得。按本發(fā)明的質(zhì)控方法進(jìn)行檢驗(yàn)，每lml含丹參素鈉0.70mg;含原兒茶醛0.35mg;含丹酚酸BO.35mg，含丹酚酸A0.15mg;鞣質(zhì)檢驗(yàn)澄清。結(jié)果判斷，按本發(fā)明質(zhì)控方法，鞣質(zhì)檢驗(yàn)和4個(gè)主要成分含量質(zhì)控都符合要求。實(shí)施例5本發(fā)明的低溫濃縮，葡聚糖凝膠色譜技術(shù)復(fù)合除鞣工藝與實(shí)施例4基本一樣，所不同的是實(shí)施例4的步驟(5)中改用葡聚糖凝膠色譜技術(shù)，采用葡聚糖凝膠G15，步驟(4)所得藥液上葡聚糖凝膠柱，進(jìn)樣后收集從1/3-1/2柱體積開始的洗脫液(最初的洗脫液為大分子物質(zhì)，廢棄)，洗脫液采用適量純凈水。按本發(fā)明的質(zhì)控方法進(jìn)行檢驗(yàn)，每lml含丹參素鈉0.69mg;含原兒茶醛0.36mg;含丹酚酸BO.32mg，含丹酚酸AO.13mg;鞣質(zhì)檢驗(yàn)澄清。結(jié)果判斷，按本發(fā)明質(zhì)控方法，鞣質(zhì)檢驗(yàn)和4個(gè)主要成分含量質(zhì)控都符合要求。但葡聚糖凝膠G15處理量較少，不如實(shí)施例4的超濾法。實(shí)施例1-5的結(jié)果匯總?cè)缦?，詳見?:表3:實(shí)施例1-5的產(chǎn)品檢驗(yàn)結(jié)果匯總表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>本發(fā)明所要求保護(hù)的具體技術(shù)方案，不限于上述實(shí)施例所表達(dá)的技術(shù)方案的具體組合。權(quán)利要求一種丹參注射液中有效成分的定量測(cè)定方法，該方法可同時(shí)定量測(cè)定丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A這四種有效成分，其特征在于采用如下步驟1)對(duì)照品溶液的制備取丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A對(duì)照品適量，精密稱定，加5％甲醇制成每1ml含丹參素鈉0.32mg、原兒茶醛0.10mg、丹酚酸B0.12mg和丹酚酸A0.05mg的混合溶液，即得；2)供試品溶液的制備精密量取丹參注射液2ml，置10ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得；3)色譜條件色譜柱AgilentZorbaxSB-C18、XDB-C18或InertsilODS-3其中的一種；流動(dòng)相；流動(dòng)相A水-乙腈-甲酸(90∶10∶0.4，v/v)，流動(dòng)相B乙腈，采用線性梯度洗脫程序0min0％B，20min15％B，50min25％B，70min85％B，80min85B％；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm；柱溫30℃；DAD掃描范圍190～400nm4)測(cè)定分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。2.權(quán)利要求1所述的一種丹參注射液中有效成分的液相測(cè)定方法，所述色譜柱指的是AgilentZorbaxSB_C18。全文摘要本發(fā)明公開了一種丹參注射液中有效成分的定量測(cè)定方法。用于定量的有效成分為丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A，測(cè)定步驟包括對(duì)照品溶液的制備、供試品溶液的制備和液相測(cè)定；色譜條件為C18色譜柱，線性梯度洗脫程序，DAD掃描。該測(cè)定方法可用于丹參注射液的質(zhì)量控制，有效保證了丹參注射液的質(zhì)量。大規(guī)模市場(chǎng)應(yīng)用表明，本發(fā)明的丹參注射液不良反應(yīng)少、安全性高，療效確切，質(zhì)量可控。文檔編號(hào)G01N30/02GK101773547SQ20101011747公開日2010年7月14日申請(qǐng)日期2007年8月20日優(yōu)先權(quán)日2007年8月20日發(fā)明者張建兵,柴建國(guó),沈培強(qiáng),潘迎鋒,王木蘭,許正宇,黎豫杭申請(qǐng)人:正大青春寶藥業(yè)有限公司