專利名稱：：肽和蛋白的定量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及測定方法，其能夠高精度地和容易地定量以痕量包含的特定蛋白或肽，甚至不使用任何昂貴的試劑。
背景技術(shù)：
：作為定量以痕量包含在測定樣品中的特定蛋白的方法，使用特定蛋白的抗體的ELISA是已知的。然而，為了制備抗體，需要制備用作抗原的高純度的肽或蛋白，以及通過給藥該肽或蛋白至動(dòng)物來制備抗血清，因此該方法非常麻煩。此外，抗體可以與高度同源的蛋白反應(yīng)，因此需要檢查是否僅特定蛋白被測定。此外，由于熱變性等，蛋白與抗體的反應(yīng)性改變。因此，在滅菌產(chǎn)品例如食品中，即使通過上述ELISA測定特定蛋白，也不可能高精度地確定蛋白含量。近年來已經(jīng)快速發(fā)展的蛋白的定量分析方法，包括使用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)i脊(下文中稱為LC/MS/MS)的方法。已開發(fā)以下方法以用于鑒定蛋白，其包括通過二維電泳進(jìn)行分離包含許多種蛋白的樣品，以及通過LC/MS/MS測定通過酶處理所得的斑點(diǎn)獲得的肽。如果測定通過LC/MS/MS進(jìn)行，有以下優(yōu)點(diǎn)可以減少預(yù)處理的步驟，這是因?yàn)椴恍枰趥鹘y(tǒng)GC/MS中所需的衍生化，以及可以測定聚合物化合物例如蛋白或肽。在通過LC/MS/MS筌定蛋白的方法中，能夠通過以下鑒定蛋白通過第一MS,確定使用特定的蛋白酶從樣品蛋白中產(chǎn)生的肽片段的質(zhì)量；使所述肽片段化；進(jìn)行第二MS以預(yù)測肽的氨基酸序列；并且將所有預(yù)測的肽序列與數(shù)據(jù)庫比較。作為通過LC/MS/MS定量蛋白的方法，已經(jīng)報(bào)道了這樣的方法，其包括用氘標(biāo)記在目標(biāo)肽中的氨基酸和測定所述氨基酸(參見例如非專利文獻(xiàn)l)。然而，在該方法中，將氘標(biāo)記的氨基酸用作內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，由于氘標(biāo)記的氨基酸非常昂貴和稀少，使用該方法的肽合成限制其應(yīng)用。此外，7>開了通過LC/MS/MS^r測在復(fù)雜混合物中的動(dòng)物源蛋白的方法(參見例如專利文獻(xiàn)l)。然而，該方法在除去千護(hù)C物質(zhì)和將污染物水平維持在低水平上存在困難，并且還需要繁瑣的步驟。需要這樣的測量方法，其能夠高精度地和容易地定量以痕量包含的特定蛋白或肽，甚至不使用任何昂貴的試劑。[專利文南史l]JP2005-513481BDavidR.Barnidge等，AnalyticalChemistry,Vol.75,No.3,2003。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的目的在于提供測定方法，其能夠容易地和更高精度地定量蛋白或肽，而不使用任何昂貴的試劑。用于解決問題的方案本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)探求能夠更高精度地定量蛋白或肽的測定方法。結(jié)果，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以下方法。在測定蛋白A的情況下，首先，用酶分解蛋白A以產(chǎn)生肽B。肽B的部分氨基酸序列被取代以產(chǎn)生肽C,使用肽C作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行借助LC/MS/MS的測定。同時(shí)，在將蛋白A從測定樣品中分離然后用酶分解的情況下，為了校正分離操作中的回收率，需要將與蛋白A具有相似性質(zhì)的蛋白作為用于蛋白A的內(nèi)標(biāo)。因此，與蛋白A更相似但不是蛋白A的蛋白D可以通過用肽C的序列:f又代在蛋白A中的肽B的序列來獲得。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過使用蛋白D作為內(nèi)標(biāo)，可以以與^吏用肽C的情況相同的方式測定肽B。如上所述，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將通過改變在要測定的蛋白中特定肽的氨基酸序列中的部分氨基酸結(jié)合順序，而不改變原始肽的大部分性質(zhì)獲得的肽，用作內(nèi)標(biāo)，可以通過LC/MS/MS定量要測定的蛋白或肽，由此該發(fā)現(xiàn)引起本發(fā)明的完成o通過改變在要測定的蛋白的特定肽中的氨基酸序列中氨基酸的結(jié)合順序，在要測定的蛋白中的特定肽和內(nèi)標(biāo)肽在第一MS中表現(xiàn)為具有相同分子量的物質(zhì)，并且兩種肽能夠在第二MS中基于氨基酸序列的差異而分離?；谕ㄟ^第二MS確定的各肽的信號(hào)強(qiáng)度的比例，能夠定量要測定的蛋白的濃度。與一步MS相比，本發(fā)明的測定方法可以提高測定精度，因?yàn)榛谫|(zhì)量的選捧以兩步進(jìn)行。此外，該方法可以確保僅特定蛋白被測定，因?yàn)榭梢酝ㄟ^第二MS在任何時(shí)間獲得氨基酸序列的信息。同時(shí)，其中將包括氘標(biāo)記的氨基酸的肽用作內(nèi)標(biāo)的傳統(tǒng)方法在第一MS中切換目標(biāo)肽的測定和內(nèi)標(biāo)肽的測定的狀態(tài)下進(jìn)行，導(dǎo)致測定中精度的降低。另一方面，本發(fā)明的方法能夠高精度地進(jìn)行，因?yàn)槟繕?biāo)肽的分子量與內(nèi)標(biāo)肽的相同。如上所述。本發(fā)明的方法可以僅改變在氨基酸序列中的氨基酸的結(jié)合順序來進(jìn)行，因而分析方法簡單。此外，測定可以不使用任何昂貴的試劑來進(jìn)行。此外，內(nèi)標(biāo)肽可以使用已有的肽合成儀制備，因而本發(fā)明的方法在成本方面優(yōu)于傳統(tǒng)測定方法。根據(jù)基因技術(shù)的發(fā)展，通過取代氨基酸序列獲得的蛋白非常容易地通過在基因水平上取代序列來制備。如果在氨基酸序列中的氨基酸的結(jié)合順序上具有改變的蛋白能夠用作內(nèi)標(biāo)，可以實(shí)現(xiàn)高精度地測定，因?yàn)樗龅鞍滓耘c要測定的蛋白幾乎相同的方式表it見為內(nèi)標(biāo)。本發(fā)明涉及通過使用在要測定的肽的氨基酸序列中氨基酸的結(jié)合順序上具有改變的肽作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，通過LC/MS/MS定量要測定的肽的方法；通過使用在要測定的蛋白的氨基酸序列中氨基酸的結(jié)合順序上具有改變的肽作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，通過LC/MS/MS定量要測定的蛋白的方法；以及通過使用在要測定的蛋白的氨基酸序列中氨基酸的結(jié)合順序上具有改變的蛋白作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，通過LC/MS/MS定量要測定的蛋白的方法。在本發(fā)明中，將不能用酶裂解的氨基酸聚合物例如在測定中所用的胰島素定義為肽。同時(shí)，在本發(fā)明中，將能夠用酶裂解的氨基酸聚合物定義為蛋白。因此，本發(fā)明包括以下構(gòu)成。(1)通過LC/MS/MS定量肽的方法，包括將在要測定的肽(2)通過LC/MS/MS定量蛋白的方法，包括將在要測定的(3)通過LC/MS/MS定量蛋白的方法，包括將在要測定的蛋白的氨基酸序列的順序上具有改變的蛋白用作內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。(4)根據(jù)權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)所述的定量蛋白的方法，其中要測定的蛋白為牛乳鐵蛋白、牛乳過氧化物酶、牛血管生成素和牛半胱氨酸蛋白酶抑制劑C中的任一種。發(fā)明的效果在氨基酸序列中氨基酸的結(jié)合順序上具有改變的蛋白或肽可以非常容易地通過在基因水平上改變結(jié)合順序來制備。認(rèn)為作為內(nèi)標(biāo)的在氨基酸的結(jié)合順序上具有改變的蛋白或肽以與要測定的蛋白幾乎相同的方式表現(xiàn)，從而能夠更高精度地實(shí)現(xiàn)測定。在本發(fā)明方法中，與單步MS相比，能夠改進(jìn)精度和特異性，這是因?yàn)榛谫|(zhì)量的篩選以兩步進(jìn)行。此外，該方法能夠確保僅特定蛋白被測定，這是因?yàn)樵诎被嵝蛄猩系男畔⒖梢酝ㄟ^第二MS在任何時(shí)間獲得。同時(shí)，在其中將包括氘標(biāo)記的氨基酸的肽用作內(nèi)標(biāo)的傳統(tǒng)方法中，在切換目標(biāo)肽的測定和內(nèi)標(biāo)肽的測定的狀態(tài)下，進(jìn)行第二MS,導(dǎo)致測定的精度降低。另一方面，在本發(fā)明方法中，能夠進(jìn)行高精確地測定，這是因?yàn)槟繕?biāo)肽的質(zhì)量與內(nèi)標(biāo)肽的相同。如上所述。本發(fā)明的方法可以僅改變在氨基酸序列中氨基酸的結(jié)合順序來進(jìn)行，因而分析方法簡單。此外，測定可以不使用任何昂貴和稀少的試劑來進(jìn)行。此外，內(nèi)標(biāo)肽可以使用已有的肽合成儀制備，因而本發(fā)明的方法在成本方面<尤于傳統(tǒng)測定方法。圖l描述了要測定的肽(LFP01)與內(nèi)標(biāo)肽(LFP02)之間的濃度比和此時(shí)的面積比(實(shí)施例6)之間的關(guān)系。具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及通過使用在要測定的肽的氨基酸序列中氨基酸的結(jié)合順序上具有改變的肽作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，通過LC/MS/MS定量要測定的肽的方法；通過使用在要測定的蛋白的氨基酸序列中氨基酸的結(jié)合順序具有上改變的肽作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，通過LC/MS/MS定量要測定的蛋白的方法；以及通過使用在要測定的蛋白的氨基酸序列中氨基酸的結(jié)合順序上具有改變的蛋白作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，通過LC/MS/MS定量要測定的蛋白的方法。在本發(fā)明方法中，首先，確定在要測定的肽的氨基酸序列中氨基酸的結(jié)合順序上具有改變的內(nèi)標(biāo)肽，以及制備確定的肽。在確定要用作內(nèi)標(biāo)的肽時(shí)，滿足以下條件的肽是合適的。(1)該肽通過以下產(chǎn)生用能夠使蛋白酶促反應(yīng)的變性劑溶解蛋白，用對特定氨基酸具有高度特異性的肽鏈內(nèi)切酶，優(yōu)選例如胰島素或賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶(lysylendopeptidase)分解蛋白。具有高度特異性的肽酶是期望的，這是因?yàn)槿绻趶?fù)雜的樣品系統(tǒng)中蛋白用具有低特異性的肽酶分解，反應(yīng)效率的改變可能引起要測定的肽的產(chǎn)量的改變。(2)可以使用以上項(xiàng)目(1)中的任何肽，只要該肽通過LC/MS離子化。在通過裂解蛋白獲得的肽中，優(yōu)選當(dāng)通過LC/MS檢測時(shí)顯示高離子化效率和高檢測靈敏性的肽。這是因?yàn)?，如果將測定目標(biāo)限定為以最高靈敏性檢測的肽，存在該肽不能滿足以下條件(3)的擔(dān)心，因此將所有能夠被檢測的肽當(dāng)作目標(biāo)。(3)此外，為了將肽用作內(nèi)標(biāo)，可以4吏用任何肽，只要其在如上項(xiàng)目(2)所述的肽的氨基酸序列中的部分氨基酸上具有改變即可。理想地，優(yōu)選在通過LC/MS的分離中在相同保留時(shí)間洗脫的月太。這是因?yàn)?，通?？梢允褂镁哂胁煌Ａ魰r(shí)間的物質(zhì)或完全不同的物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行測定，因此保留時(shí)間可以不必然相同，但是在MS/MS中的離子化和片段化優(yōu)選在相同時(shí)間進(jìn)行。在確定要用作內(nèi)標(biāo)的肽時(shí)，除了期望滿足上述條件以外，還期望滿足以下條件的肽。.該肽未磷酸化或未通過糖鏈改性。.該肽不包含半胱氨酸。-該肽在色譜中在開始后和緊挨終點(diǎn)前不立即洗脫。.該肽難以產(chǎn)生多價(jià)離子。此外，測定優(yōu)選在滿足以下注意事項(xiàng)的情況下進(jìn)行。(A)測定更優(yōu)選使用具有部分序列與以上項(xiàng)目(3)所述的肽的部分序列相同的要測定的蛋白作為內(nèi)標(biāo)來進(jìn)行。這是因?yàn)樵诓糠中蛄猩暇哂懈淖兊牡鞍拙哂邢嗤姆肿恿浚⑶以诰哂懈叻蛛x能力的電泳中顯示幾乎相同的行為等，由于在復(fù)雜系統(tǒng)中的測定可能經(jīng)常需要提取步驟等，但是100%的回收率實(shí)際上是不困難的。注意對于要測定的蛋白和用作內(nèi)標(biāo)蛋白優(yōu)選在酶促處理等的效果上不優(yōu)選不同。(B)通過MS/MS產(chǎn)生的肽為測定的目標(biāo)。測定目標(biāo)優(yōu)選能夠以更高靈敏性被檢測且與要測定的肽具有不同分子量的肽。確定在要測定的肽的氨基酸序列中氨基酸的結(jié)合順序上具有改變的內(nèi)標(biāo)肽之后，制備內(nèi)標(biāo)肽。該肽通過通用方法例如固相肽合成等制備。此外，已有的肽合成儀例如ABI431A(Boc固相合成法)、ABI433A(Fmoc固相合成法)等可以用于肽制備。肽合成方法可以為當(dāng)4吏用肽合成儀合成肽時(shí)通常進(jìn)行的方法。通過改變在要測定的蛋白中特定肽的氨基酸序列中氨基酸的結(jié)合順序，在要測定的蛋白中的特定肽和內(nèi)標(biāo)肽在第一MS中表現(xiàn)為具有相同的分子量的物質(zhì)，在第二MS中基于氨基酸序列上的差異將肽分離?；谠诘诙﨧S中依賴于各肽的信號(hào)強(qiáng)度的比，定量要測定的蛋白的濃度。在本發(fā)明中，如下進(jìn)行通過LC/MS/MS的定量。然而，當(dāng)使用LC/MS/MS時(shí)該方法為通用方法，并不是進(jìn)行本發(fā)明的特定方法。通過使用HPLC系統(tǒng)梯度洗脫進(jìn)行肽的分離。使用具有柱的MAGIC2002HPLC系統(tǒng)(裝備有5卞L肽捕集器(0.2mmIDx50mm)的MAGICC18)以2^L/min的流速分離肽。使用溶液A(2。/o乙腈-0.05。/o甲酸)和溶液B(90。/o乙腈-0.05Q/o曱酸)，溶液B范圍從2%至65%,進(jìn)行梯度洗脫20分鐘。要測定的離子為母離子m/z853.8,MS/MS目標(biāo)離子m/z876.4;以及內(nèi)標(biāo)目標(biāo)離子m/z862.4,MS/MS的目標(biāo)范圍為860.9至877.9。使用LCQAd飄tage進(jìn)行MS。下文中，通過實(shí)施例和測試實(shí)施例更具體i也描述本發(fā)明。然而，描述僅僅是示例性的，本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。注意在實(shí)施例中描述的內(nèi)標(biāo)肽中帶有下劃線的氨基酸為取代的氨基酸。在實(shí)施例中描述的術(shù)語"SRM(選擇反應(yīng)監(jiān)測)"是作為目標(biāo)通過LC/MS/MS產(chǎn)生的二次離子的測定，并且與術(shù)語"SIM(選擇離子監(jiān)測)，，形成一對，其指作為目標(biāo)通過LC/MS產(chǎn)生的一次離子的測定。術(shù)語"SRM目標(biāo)"是指實(shí)際上測定的肽。在第一MS中檢測通過酶裂解的肽，在第二MS中通過電能在具有特定長度的特定長度位置使該肽分離。測定所得的肽以計(jì)算值。在SRM目標(biāo)中具有單下劃線的序列代表作為要測定的目標(biāo)產(chǎn)生的二次離子被測定的氨基酸序列部分。值"m/z"通過用在LC/MS檢測器中實(shí)際上觀察到的離子的質(zhì)量(m)除以其電荷數(shù)(z)來計(jì)算。雖然在MS設(shè)備中各肽的帶電狀態(tài)不同，肽的實(shí)際質(zhì)量(分子量M)通過以下數(shù)學(xué)表達(dá)式計(jì)算M=((m/z)-l)承z注意術(shù)語"單，，是指單同位素質(zhì)量(分子量)，其通過從最大豐度天然出現(xiàn)的同位素的同位素質(zhì)量計(jì)算組成式(compositionalformula)獲得。實(shí)施例1(牛乳鐵蛋白內(nèi)標(biāo)肽的制備)在定量牛乳鐵蛋白時(shí)，測定在肽的氨基酸序列中氨基酸的10結(jié)合順序上具有改變的內(nèi)標(biāo)肽，然后使用肽合成儀如下制備內(nèi)標(biāo)肽(Fmoc固相合成法(ABI433A))。測定目才示月太(LFP01);MW1305.645(單)；m/z653.83單+2;GluThrThrValPheGluAsnLeuProGluLys式(1)SRM目標(biāo)；m/z876.4單+1GluThrThrValPheGluAsnLeuProGluLvs式(l)保留時(shí)間(min);10.29內(nèi)標(biāo)肽(LFP02);MW1305.645(單)，m/z653.83單+2GluThrThrL^HPheGluAsnYMProGluLys式(2)SRM目標(biāo)；m/z876.4單+1GluThrThrPheGluAsnValProGluLvs式(2)j呆留時(shí)間(min);10.28。實(shí)施例2(牛乳過氧化物酶內(nèi)標(biāo)肽的制備l)在定量牛乳過氧化物酶時(shí)，確定在肽的氨基酸序列中氨基酸的結(jié)合順序具有改變的內(nèi)標(biāo)肽，然后使用肽合成儀如下制備內(nèi)標(biāo)肽(Fmoc固相合成法(ABI433A))。觀寸定目才示月太l;MW1497.765(單)；m/z749.89單+2;SerTrpGluValGlyCysGlyAlaProValProLeuValLys式(3)SRM目標(biāo)；m/z652.4單+1SerTrpGluValGlyCysGlyAlaProValProLeuValLys式(3)保留時(shí)間(min);12.10內(nèi)標(biāo)肽1SerTrpGluGlyCysGlyAlaProValPro:MValLys式(4)SRM目標(biāo)；m/z638.4單+1SerTrpGluLeuGlyCysGlyAlaProValProValValLysj呆留時(shí)間(min):12.15實(shí)施例3式(4)(牛乳過氧化物酶內(nèi)標(biāo)肽的制備2)在定量牛乳過氧化物酶時(shí)，確定在肽的氨基酸序列中氨基酸的結(jié)合順序具有改變的內(nèi)標(biāo)肽，然后使用肽合成儀如下制備內(nèi)標(biāo)肽(Fmoc固相合成法(ABI433A))。觀寸定目才示月太2;MW1466.799(單)；m/z734.408單+2lieHisGlyPheAspLeuAlaAlalieAsnLeuGlnArg式(5)S固目標(biāo)；m/z754.4單+1lieHisGlvPheAspLeuAlaAlalieAsnLeuGlnArg式(5)保留時(shí)間(min);11.42內(nèi)標(biāo)肽2;MW1466.799(單)，m/z734.408單+2lieHisAlaPheAspLeuAlaGlvlieAsnLeuGlnArg式(6)SRM目標(biāo)；m/z768.4單+1lieHisAlaPheAspLeuAlaGlylieAsnLeuGlnArg式(6)保留時(shí)間(min);11.36實(shí)施例4(牛血管生成素內(nèi)標(biāo)肽的制備)在定量牛血管生成素時(shí)，確定在肽的氨基酸序列中的氨基酸的結(jié)合順序上具有改變的內(nèi)標(biāo)肽，然后使用肽合成儀如下制備內(nèi)標(biāo)肽(Fmoc固相合成法(ABI433A))。觀'J定目才示月太；MW1534.757(單)；m/z768.386單+2TyrlieHisPheLeuThrGinHisTyrAspAlaLys式(7)SRM目標(biāo)；m/z1122.6單+1TyrlieHisPheLeuThrGinHisTyrAspAlaLys式(7)保留時(shí)間(min);9.99內(nèi)標(biāo)肽；MW1534.757(單)，m/z768.386單+2TyrAlaHisPheLeuThrGinHisTyrAspIi￡Lys式(8)SRM目標(biāo)；m/z1164.6單+1TyrAlaHisPheLeuThrGinHisTyrAsplieLvs式(8)保留時(shí)間(min);9.94實(shí)施例5(牛半胱氨酸蛋白酶抑制劑C內(nèi)標(biāo)肽的制備)在定量牛半胱氨酸蛋白酶抑制劑C時(shí)，確定包括在肽的氨基酸序列中氨基酸的結(jié)合順序具有改變的氨基酸序列的內(nèi)標(biāo)肽，然后使用肽合成儀如下制備內(nèi)標(biāo)肽(Fmoc固相合成法(ABI433A))。測定目才示月太；1825.903(單)；m/z913.96單+2GinValValSerGlyMetAsnTyrPheLeuAspValGluLeuGlyArg式(9)SRM目標(biāo)；m/z948.5單+1GinValValSerGlyMetAsnTyrPheLeuAspValGluLeuGlvArg式(9)保留時(shí)間(min)11.60內(nèi)標(biāo)肽；MW1825.903(單)，m/z913.96單+2Gln幽ValSerGlyMetAsnTyrPheLeuAspValGluLeuYaiArg式(10)SRM目標(biāo)；m/z990.6單+1Gin幽ValSerGlyMetAsnTyrPheLeuAspValGluLeuValArg式(10)保留時(shí)間(min);11.58實(shí)施例6(肽的定量)通過在0.25至500fmol/VL的范圍內(nèi)改變在實(shí)施例l中使用的要測定的牛乳鐵蛋白肽(LFP01)的濃度，以及使用牛乳鐵蛋白內(nèi)標(biāo)肽(LFP02)(10fmol/|iL),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定方法如下。將每種肽溶解于0.1%曱酸、0.02。/o三氟乙酸(TFA)、和2%乙腈的水溶液，以達(dá)到預(yù)定的濃度，通過LC/MS/MS對2pL各溶液進(jìn)行分析。LC/MS/MS的條件如下。使用具有柱(裝備有5卞L肽捕集器(0.2mmIDx50mm,MichromBioresources,Inc.，USA)的MAGICCI8)的MAGIC2002HPLC系統(tǒng)(MichromBioresources,Inc.,USA)以2(iL/min的流速分離各月太。用溶、液八(2%乙腈-0.05%曱酸)和溶液8(90%乙腈-0.05%甲酸)進(jìn)行梯度洗脫20分鐘，同時(shí)乂人2%至65%改變?nèi)芤?的比例。要測定的離子為MS離子m/z653.8,MS/MS目標(biāo)離子m/z876.4,內(nèi)標(biāo)目標(biāo)離子m/z862.4，MS/MS的目標(biāo)范圍為860.9至877.9。使用LCQAdvantage(ThermoElectronCo.，USA)進(jìn)行MS。各肽的峰面積從所得的色鐠計(jì)算，計(jì)算各肽的面積的比。表l示出了面積的比。此外，要測定的肽(LFP01)和內(nèi)標(biāo)肽(LFP02)的濃度比和此時(shí)的面積比示于圖1。14在圖l中，水平軸表示要測定的肽(LFP01)和內(nèi)標(biāo)肽(LFP02)的摩爾比，縱軸表示通過LC/MS/MS確定的各肽的比。結(jié)果顯示在2,000倍的范圍內(nèi)維持線性。此外，計(jì)算斜率為約l。從上述結(jié)果，發(fā)現(xiàn)要測定的肽和內(nèi)標(biāo)肽在離子化后的反應(yīng)中顯示幾乎相同的行為，即，發(fā)現(xiàn)要測定的肽和內(nèi)標(biāo)肽具有幾乎相同的離子化率和片段產(chǎn)率。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例7(在脫脂乳中乳鐵蛋白的測定)一天稱量脫脂乳5次以制備要測定的樣品。制備包含13至15mg/ml脫脂乳的水溶液，以1/1，000的量向其添加甲酸以制備樣品溶液。干燥各溶液(10fil)，然后溶于包含8M尿素和lmM三(羧乙基)膦(TCEP)的20fi1O.IM的碳酸氫銨中，并在56。C下加熱30分鐘。使該溶液回到室溫，添力口5pl100mM的碘乙酰胺溶液，在遮光條件下反應(yīng)30分鐘。添加超純水(54pi),添力口lO[il0.1fig/ml的胰島素和10|il0.1(ig/ml賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶，混合溶液在37。C下反應(yīng)16小時(shí)。添加甲酸(ljil)以終止反應(yīng)，將所得的溶液用作要測定的樣品的肽溶液。各樣品溶液用10fmol/nl內(nèi)標(biāo)肽(LFP02)(包含0.1。/。甲酸，0.02%三氟乙酸(TFA)，和2%乙腈)稀釋6倍，通過LC/MS/MS分析2.5pl稀釋的溶液。各肽的峰面積從所得的色譜計(jì)算，并且確定各肽的面積的比。從面積比，基于圖l中所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定各肽的摩爾比。當(dāng)通過LC/MS/MS測定時(shí)LFP02的濃度為通過用5/6乘以10fmol/pl來計(jì)算的值。在酶處理步驟將脫脂乳樣品稀釋10倍和用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋6倍。因此，目標(biāo)肽的濃度通過以下表達(dá)式計(jì)算目標(biāo)肽的濃度=各肽的摩爾比乂5/6x10x60。如果將乳鐵蛋白的分子量限定為80,000,可以基于目標(biāo)的摩爾濃度確定重量濃度。在脫脂乳中的乳鐵蛋白含量可以基于稱量的脫脂乳的量確定。測定結(jié)果示于表2。術(shù)語"CV"為用通過以下計(jì)算的變化系數(shù)用標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)除以平均值，然后將所得的值轉(zhuǎn)化成百分比，并且表示分析精度。如在表2中所示，CV值為約8.9Q/0,其是令人滿意程度的變化率。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實(shí)施例8(在脫脂乳中的乳鐵蛋白的測定)稱量脫脂乳五次以制備要測定的樣品。制備包括與實(shí)施例l中使用的牛乳鐵蛋白內(nèi)標(biāo)肽(LFP02)相同的序列的突變型牛乳鐵蛋白。將突變型牛乳鐵蛋白用作內(nèi)標(biāo)以測定在脫脂乳中要測定的乳鐵蛋白。如下進(jìn)行該方法。制備15至16mg/ml脫脂乳的水溶液，以1/1,OOO的量向其添加曱酸以制備樣品溶液。向10pl各樣品溶液中添加10pl30ing/ml的突變型牛乳鐵蛋白，將所得的溶液干燥，然后溶于包含8M尿素和lmM三(羧乙基)膦(TCEP)的20(il0.1M碳酸氫銨中。將全體在56。C下加熱30分鐘。4吏溶液回到室溫，向其添加5ji1100mM碘乙酰胺的溶液，在遮光條件下反應(yīng)30分鐘。向所得物添加超純水(54(il)，向其添加10pl0.1ixg/ml的胰島素和10)il0.1fig/ml賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶，使混合溶液在37。C下反應(yīng)16小時(shí)。添加甲酸(l!il)以終止反應(yīng)，將所得的溶液用作要測定的樣品的肽溶液。各樣品溶液用0.1%甲酸，0.02%三氟乙酸(TFA),和2%乙腈的水溶液稀釋10倍，通過LC/MS/MS分析2.5pl的稀釋液。使用包括柱(裝備有5卞L肽捕集器(0.2mmIDx50mm,)的MAGICC18)的MAGIC2002HPLC系統(tǒng)以2fiL/min的流速分離各肽。用溶液八(2%乙腈-0.05%曱酸)和溶液B(90。/o乙腈-0.05o/o甲酸)進(jìn)行梯度洗脫20分鐘，同時(shí)從2%至65%改變?nèi)芤?的比。要測定的離子為母離子m/z853.8,MS/MS目標(biāo)離子m/z876.4，內(nèi)標(biāo)目標(biāo)離子m/z862.4，MS/MS的目標(biāo)范圍為860.9至877.9。使用LCQAdvantage(ThermoElectronCo.,USA)進(jìn)行MS。各肽的峰面積從所得的色譜計(jì)算，并且計(jì)算各肽的面積的比。從基于圖1中所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線的面積比計(jì)算各肽的摩爾比。突變型牛乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白具有相同的分子量，添加的突變型牛乳鐵蛋白的濃度為30jig/ml。因此，在脫脂乳溶液中的乳鐵蛋白的濃度通過使各肽的摩爾比乘以30來計(jì)算。在脫脂乳中的乳鐵蛋白基于稱重的脫脂乳的量來計(jì)算。測定結(jié)果示于表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>結(jié)果，在脫脂乳中的乳鐵蛋白為106.5mg/100g-脫脂乳。權(quán)利要求1.一種通過LC/MS/MS定量肽的方法，包括將在要測定的肽的氨基酸序列的順序上具有改變的肽用作內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。2.—種通過LC/MS/MS定量蛋白的方法，包括將在要測3.—種通過LC/MS/MS定量蛋白的方法，包括將在要測定的蛋白的氨基酸序列的順序上具有改變的蛋白用作內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。4.根據(jù)權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)所述的定量蛋白的方法，其中所述要測定的蛋白為牛乳鐵蛋白、牛乳過氧化物酶、牛血管生成素和牛半胱氨酸蛋白酶抑制劑C中的任一種。全文摘要公開了一種測定方法，其能夠高精度地和以簡單的方式定量以痕量包含的特定蛋白或肽，而不需要使用任何昂貴的試劑。目標(biāo)蛋白或肽可以通過LC/MS/MS通過使用蛋白或肽作為內(nèi)標(biāo)來定量，所述蛋白或肽包括在目標(biāo)蛋白或肽的氨基酸序列中氨基酸殘基的結(jié)合順序重組的氨基酸序列。文檔編號(hào)G01N30/88GK101600959SQ20078004827公開日2009年12月9日申請日期2007年12月27日優(yōu)先權(quán)日2006年12月28日發(fā)明者小野愛子,川上浩,森田如一,芹澤篤申請人:雪印乳業(yè)株式會(huì)社