專利名稱::使用與多孔膜偶聯(lián)的分析物傳感分子測定分析物濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及測定樣品中分析物濃度的方法,其依靠檢測分析物和分析物傳感分子之間的復(fù)合物,其中所述分析物傳感分子附著到固體多孔支持物上。本發(fā)明還涉及測定分析物與分析物傳感分子實時結(jié)合動力學(xué)的方法,其通過測定分析物與分析物傳感分子的結(jié)合效率,其中所述分析物傳感分子附著到固體多孔支持物上。
背景技術(shù):
:分子相互作用的檢測構(gòu)成了許多診斷測試以及一般測試程序中的核心要素之一。因此,通常通過檢測分析物和分析物傳感分子之間的相互作用測定含有多種組分的樣品中特異分析物的存在,其中已知所述分析物傳感分子僅對該分析物是特異性的。同時,對高通量測試檢驗有濃厚的興趣,其能夠平行地檢測樣品中的多種分析物。使用所謂的微陣列,這種高通量測試是可能的,所述微陣列是已經(jīng)在多種化學(xué)和生物化學(xué)應(yīng)用中使用的微型檢測裝置。最初,開發(fā)微陣列技術(shù)用于檢測特異性核酸-核酸相互作用。核酸比例如蛋白質(zhì)和抗體要容易處理得多,這個事實解釋了優(yōu)先使用微陣列用于檢測基于核酸的相互作用。然而,同時,已經(jīng)開發(fā)了微陣列格式,其也是針對能夠高通量平行測試蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或者蛋白質(zhì)-DNA相互作用。在大多數(shù)基于微陣列的測試系統(tǒng)中,通常分析物傳感分子(捕獲分子)被固定在陣列上的規(guī)定位置處,隨后將陣列與含有待檢測分析物的樣品溫育。在某些處理步驟之后,通過例如使用熒光標(biāo)記物顯示分析物與各自分析物傳感分子之間的相互作用。通常,微陣列基質(zhì)使用蓋玻片,因為它們能夠容易固定核苷酸序列。然而,考慮到蛋白質(zhì)復(fù)雜三維構(gòu)型的確認(rèn)以及它們變化的疏水或親水特征,蓋玻片與其他固體基質(zhì)對于蛋白質(zhì)固定化不是理想的。通常玻璃載玻片已經(jīng)被涂覆,以便它們能夠固定核酸和/或蛋白質(zhì)。此外,分析物傳感蛋白質(zhì)和分析物之間的有效相互作用受到傳統(tǒng)的微陣列基質(zhì)的阻礙,因為結(jié)合主要依靠在溶液中擴散到陣列的各自點上。為了解決這些問題,最近開發(fā)了所謂的流通式(flow-through)微陣列芯片。在這種途徑中,基于DNA或蛋白質(zhì)的探針被固定在例如化學(xué)修飾的多孔硅晶片上,接著與樣品進(jìn)行溫育。由于基質(zhì)的多孔特征,能夠更容易除去多余的樣品以及任選的清洗溶液。這種流通式裝置的例子被描述在例如國際專利申請WO03/005013中?,F(xiàn)有技術(shù)同樣仍然主要描述了檢測樣品中分析物存在的方法,沒有關(guān)注例如測定樣品中分析物的濃度,或者分析物與分析物傳感分子的結(jié)合動力學(xué)。發(fā)明目的和概述本發(fā)明的一個目的是提供測定待測試的樣品中至少一種分析物濃度的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種方法,其能夠測定樣品中分析物與分析物傳感分子之間的實時結(jié)合動力學(xué)。為了達(dá)到上述目的,提供了如在獨立權(quán)利要求1中所限定的檢測方法。根據(jù)本發(fā)明的一個示范性實施方式,提供了檢測至少一種樣品中至少一種分析物的方法,該方法包括下列步驟a)提供至少一種固體多孔支持物,其上被布置了至少一種分析物傳感分子;b)將所述支持物與至少一種含有至少一種分析物的樣品接觸;c)任選地使用溶液清洗所述至少一種支持物,其中所述溶液能夠除去與所述支持物和/或所述分析物傳感分子非特異性結(jié)合的樣品組分;d)檢測所述至少一種分析物傳感分子與至少一種分析物之間的特異性相互作用;4e)測定所述至少一種樣品中所述至少一種分析物的濃度。在本發(fā)明的另一個示范性實施方式中,可以隨時間變化測定濃度。在后面的實施方式中,在檢測分析物與分析物傳感分子之間的特異性相互作用時隨時間變化所產(chǎn)生的信號的發(fā)展,可以用于測量所述分析物與所述分析物傳感分子的實時結(jié)合動力學(xué)。根據(jù)分析物和分析物傳感分子的性質(zhì),該實施方式能夠例如鑒定和辨別化合物庫的小分子與基于治療性蛋白質(zhì)的耙之間的^口口o在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中,固體多孔基質(zhì)可以是選自包括由例如尼龍、硝酸纖維素、PVDF或聚醚砜所制成的膜的組的膜。本發(fā)明一個特別令人感興趣的方面涉及一種實施方式,其中前面所提到的步驟b)-d)或者這些步驟中的任何步驟被重復(fù)多次。此外,上述方法的這種重復(fù)操作具有下列優(yōu)點能夠比使用之前已知的程序更快和更高可靠性地測定分析物分子的濃度。如果以重復(fù)方式將本發(fā)明的該實施方式用于測定分析物與分析物傳感分子的實時結(jié)合動力學(xué),則也具有該優(yōu)點。本發(fā)明的另一個實施方式涉及使用上述的固體多孔基質(zhì)進(jìn)行該方法,其中將大量分析物傳感分子以微陣列的形式布置在所述多孔基質(zhì)上。所述固體多孔基質(zhì)上已知分析物傳感分子的有序配置以及后續(xù)與樣品的溫育能夠平行地測定大量不同分析物的濃度,這進(jìn)一步有助于本發(fā)明方法的速度和效率。同樣,測定實時動力學(xué)也一樣。也可以通過重復(fù)步驟b)-d)多次以重復(fù)的方式-運行本發(fā)明的該實施方式。在本發(fā)明的某些實施方式中,分析物傳感分子將是基于蛋白質(zhì)的化合物例如抗體、肽、半抗原、適體、蛋白質(zhì)或(細(xì)胞表面)受體。在本發(fā)明的另一個實施方式中,可以使用與至少一種分析物連接和/或與至少一種分析物傳感分子連接的可檢測標(biāo)記物進(jìn)行該方法,以檢測分析物與分析物傳感分子之間的相互作用。如果可檢測標(biāo)記物是例如熒光標(biāo)記物,則這也會有助于所要求保護的測定樣品中分析物的濃度和/或?qū)崟r結(jié)合動力學(xué)的方法的容易、效率和速度。在本發(fā)明的一個實施方式中,分析物傳感分子可以通過化學(xué)連接劑共價連接到支持物上。圖l顯示印制要求的示意布置圖,用于將抗體印制為分析物傳感分子。將大量不同的抗體印制在硝酸纖維素膜上。將這些抗體通過物理吸附而吸附到膜上。含有Cy5標(biāo)記的抗體的點作為內(nèi)部校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn),并用于固定網(wǎng)格。圖2顯示測量圖1所示意描述的微陣列的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)。在剛剛印制之后拍照??梢跃?xì)調(diào)節(jié)軟件的兩個變量以得到最佳的圖像,即電流和閃光長度(flashlength)。在這種情況中,電流是變化的。在50mA的電流下,低濃度的內(nèi)部校準(zhǔn)是不可見的,這說明輸出低信號。然而,當(dāng)電流提高到127.5mA時,可以見到低濃度的內(nèi)部校準(zhǔn),這說明該電流是可以使用的。圖3顯示在圖2所描述的微陣列與含有100nM兔抗小鼠Cy5標(biāo)記的抗體進(jìn)行溫育的實驗的照片。不同的照片代表經(jīng)膜循環(huán)樣品(1-8次)之后所獲得的信號。圖4涉及與圖2和3相同的實驗。不同的照片代表在循環(huán)5、6、7和8之后的信號。圖5涉及與圖2、3和4相同的實驗。上圖顯示在循環(huán)8之后沒有清洗微陣列所獲得的信號。下圖顯示相同微陣列在使用PBS.7.4,0.05%吐溫20清洗后的信號。圖6顯示另一個微陣列印制布置圖,其在實驗2中被用于監(jiān)控抗原C-反應(yīng)性蛋白(CRP)與腫瘤壞死因子a(TNFa)的結(jié)合。圖7顯示在印制捕獲抗體之后實驗2的微陣列。圖8顯示濃度為100nM的所檢測抗原CRP的信號強度。循環(huán)數(shù)指重復(fù)施加"新鮮"鏈霉素標(biāo)記Cy5。"10+w"代表在最后的循環(huán)之后包括清洗步驟。圖9顯示沒有加入抗原的對照的結(jié)果。圖10顯示在圖8的基礎(chǔ)上所計算的信噪比。圖11顯示在實驗3中所使用的另一個微陣列印制布置圖。圖12顯示在印制捕獲抗體之后實驗3的微陣列。圖13顯示CRP和標(biāo)記物Alexa647和Cy5的經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的強度。圖14顯示TNFa和標(biāo)記物Alexa647和Cy5的經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的強度。圖15顯示依賴重復(fù)循環(huán)的CRP動力學(xué)檢測。圖16顯示依賴重復(fù)循環(huán)的TNFa動力學(xué)檢測。圖17顯示實驗4的檢測原理。圖18顯示在實驗4中使用的另一個微陣列印制布置圖。圖19顯示實驗4的分析物結(jié)合經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的信號強度。發(fā)明詳述在一個實施方式中,本發(fā)明涉及檢測至少一種樣品中至少一種分析物的方法,該方法包括下列步驟a)提供至少一種固體多孔支持物,其上被布置了至少一種分析物傳感分子;b)將所述支持物與至少一種含有至少一種分析物的樣品接觸;c)任選地使用溶液清洗所述至少一種支持物,其中所述溶液能夠除去與所述支持物和/或所述分析物傳感分子非特異性結(jié)合的樣品組分;d)檢測所述至少一種分析物傳感分子與所述至少一種分析物之間的特異性相互作用;e)測定所述至少一種樣品中所述至少一種分析物的濃度。過去,測定樣品中分析物的方法主要針對能夠決定是否在樣品中存在某種化合物。然而,沒有公開下列方法,即結(jié)合到固體多孔支持物上的分析物傳感分子與樣品接觸,以檢測分析物傳感分子與樣品中分析物之間的特異性相互作用,以后續(xù)使用指示分析傳感分子和分析物之間相互作用的信號,測定樣品中分析物的濃度。可以用于本發(fā)明的支持物是固體和多孔的。用于本發(fā)明目的術(shù)語"多孔"的意思是基質(zhì)對流體具有充分的可透過性以使流體可以通過所述基質(zhì)。在優(yōu)選的實施方式中,基質(zhì)是多孔的,其能夠通過施加低到中度超壓而使流體從其通過。流體可以包括溶液,分散液,懸浮液,乳化液,體液例如血液、血漿、尿等。流體或流體樣品還可以包括例如來自海洋、湖泊、河流等的環(huán)境樣品。為了使得流體能夠通過膜內(nèi)的孔,為了本發(fā)明的目的,術(shù)語"多孔"因此通常涉及包含直徑為0.1-lpm0.2-0.8^im、優(yōu)選0.3-0.7miti和0.4-0.6|am(平均)的孔的基質(zhì)。特別優(yōu)選的孔度為0.45jxm。此外,根據(jù)本發(fā)明,固體多孔基質(zhì)不僅具有前述功能的孔,而且通常尺寸顯示了孔隙度數(shù)值即開孔體積和膜材料之間的比例為20-80%之間。當(dāng)然,可以用于本發(fā)明目的基質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解其中這些基質(zhì)可以從聚合物材料、天然或人工纖維、硅樹脂、過濾材料、膜和其復(fù)合材料制成。根據(jù)本發(fā)明的固體多孔基質(zhì)不可以是由氧化鋁形成。當(dāng)然,可以將固體支持物制成各種形狀和尺寸,這取決于特定的應(yīng)用。例子包括平板、薄片、盤、薄膜、線、點等。優(yōu)選但不是必須的形狀是具有平坦的平面例如優(yōu)選能夠通過自動診斷系統(tǒng)處理的膜、過濾器或微孔板。優(yōu)選的實施方式將使用多孔膜作為固體支持物。這些膜可以是由尼龍、硝酸纖維素、PVDF或聚醚砜所制成的。這些膜可以是根據(jù)商品名Protran、Ultrabind、Immunodyne、Hybond和Biodyne通過商業(yè)渠道獲得的。可從Pall得到的由尼龍加固的硝酸纖維素構(gòu)成的Protran膜是特別優(yōu)選的。尺度可以變化,但是在一個實施方式中,厚度在0.1-15mm之間,在0.2-12mm之間,在0.33-llmm之間,在0.4-10mm之間,在l-10mm之間,在4-9mm之間或大約8mm和/或孔度為0.1-lpm,在0.2和0.8|im之間,0.3和0.7pm之間,以及0.4-0.6^im是優(yōu)選的。如果膜是例如前述帶負(fù)電荷的尼龍膜之一,則也是可以利用的。在本發(fā)明中可以使用的分析物傳感分子是能夠以確立功能的方式被布置在固體多孔支持物上,這意味著在被布置在基質(zhì)上時,分析物傳感分子保持特異地與通常被指定為分析物的靶結(jié)構(gòu)相互作用的能力。如果含有各種分析物的樣品與分析物傳感分子溫育,則優(yōu)選分析物傳感分子將與分析物相互作用,這是特異性的以便并且因此導(dǎo)致能夠后續(xù)被檢測的特異性相互作用。可以用于本發(fā)明目的的分析物傳感分子,可以是蛋白質(zhì)、酶、受體、配體、抗原、半抗原、細(xì)胞、細(xì)胞片段、小分子、適體和抗體。分析傳感分子不可以是核酸。在優(yōu)選的實施方式中,本發(fā)明的分析物傳感分子是基于蛋白質(zhì)的分析物傳感分子。這些優(yōu)選的分析物傳感分子包括蛋白質(zhì)、受體、抗體等。在一個實施方式中,分析物傳感分子是已知與各自抗原分析物特異性結(jié)合的抗體。用作分析物傳感分子的抗體可以是任何來源的,包括小鼠、人、大鼠、雞、綿羊、山羊等,并包括本領(lǐng)域中公知的所有抗體類型例如單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、F(ab)、camel抗體、納米抗體(nanobodies)等。其中在Harlow禾卩Lane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1988(例如第17頁)中可以得到能夠使用的不同類型的抗體的縱覽。另外,可以使用所有類型的抗體亞類例如前面所提到的IgA、IgE、IgM、IgG、IgD等。關(guān)于此內(nèi)容再次參考Harlow和Lane(見上)。通過與支持物的共價或非共價連接,可以分析物傳感分子布置在任何前述固體多孔支持物的至少一部分之上或其內(nèi)。在優(yōu)選的實施方式中,將抗體噴墨印刷到硝酸纖維素膜上,并使其進(jìn)行物理吸附。經(jīng)印刷的膜干燥過夜。優(yōu)選使用PBSpH7.4中的5。/。BSA對經(jīng)印刷的膜在室溫下進(jìn)行封閉1小時,接著進(jìn)行檢驗。支持物和分析物傳感分子之間的共價連接意味著形成化學(xué)鍵。為了共價連接的目的,固體多孔支持物可以被官能化,以提供化學(xué)官能團,其使得能夠在支持物和分析物傳感分子之間形成化學(xué)連接。因此,如果例如抗體被用作分析物傳感分子,并且應(yīng)當(dāng)被共價偶聯(lián)到膜上,則可以使用提供官能團(例如羧基、氨基、羥基、巰基等)的膜。接著,這些基團可以被直接或者使用連接劑交聯(lián)到抗體,其中所述連接劑可以是同雙功能的或異雙功能的。因此,可以激活支持物用于提供與分析物傳感分子的化學(xué)連接,通過例如使用聚合物涂覆惰性固體多孔基質(zhì),其中所述聚合物具有例如酰基氟官能團。其它共價結(jié)合化學(xué)物質(zhì)也是可以利用的,而且不限于酐、環(huán)氧化物、醛、酰肼、?;B氮化物、芳基疊氮化物、重氮化合物、二苯酮、碳化二亞胺、亞氨酯、異硫氰酸酯、NHS酯、CNBr、馬來酰亞胺、甲苯磺酸酯、三氟代9乙垸磺酰氯(tresylchloride)、馬來酸酐和羰基二咪唑。在一個實施方式中,碳化二亞胺官能團可以用于建立固體多孔支持物和分析物傳感分子例如抗體之間的連接。為了該目的,帶負(fù)電荷的尼龍膜例如包含COOH基團的BiodyneC膜,可以被連接劑例如EDAC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N,-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽)預(yù)處理。接著,這種活性中間物與分析物傳感分子例如抗體的氨基發(fā)生反應(yīng)。通過使用低濃度的EDAC可以發(fā)生抗體或蛋白質(zhì)的連接。典型地,EDAC的這些濃度將在0-25重量%的EDAC之間變化,其中0.5-10重量%、0.5-8重量%、0.5-4重量%、0.5-2重量°/。、特別1重量%是優(yōu)選的。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠完全了解在將分析物傳感分子例如抗體與固體多孔支持物接觸時,以及在將分析物傳感分子例如抗體與樣品接觸時所采用的反應(yīng)條件。典型的反應(yīng)條件取決于一定的緩沖液、溫度、pH條件等。然而,這些條件將取決于樣品、分析物和分析物傳感分子的類型,以及取決于在分析物傳感分子與固體支持物的共價連接情況中所使用的化學(xué)官能團,并且通??梢詮奈墨I(xiàn)中知道,或者由例如化學(xué)交聯(lián)劑的制造商提供。在本發(fā)明的一個實施方式中,可以使用這樣一種支持物進(jìn)行該方法,該支持物僅包含均勻分布在至少一部分支持物上或其內(nèi)的一類分析物傳感分子。然而,在本發(fā)明特別優(yōu)選的另一個實施方式中,使用這樣一種支持物進(jìn)行該方法,其中以建立通常被稱作"陣列"的支持物樣式的空間有序和隔離的模式,將分析物傳感分子分布在至少一部分固體支持物基質(zhì)之上或其內(nèi)。通過以陣列的形式,將分析物傳感分子布置在支持物上的一個優(yōu)點是可以將不同類型的分析物傳感分子以及地不同的己知方向和分布布置在陣列上。這種方向?qū)⒃试S平行檢測樣品中的多種分析物。典型的,這些陣列是由點構(gòu)成的,點代表特異的分析物傳感分子。由于點中分析物傳感分子的特性是已知的,所以能夠建立復(fù)雜的陣列。根據(jù)工業(yè)標(biāo)準(zhǔn),陣列格式將具有密度,意味著點的數(shù)量范圍是10-100000、50-50000、100-10000,或者點的數(shù)量是1000、2000、3000、4000、或5000。當(dāng)然,本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠完全理解對于陣列的某個點,可以在其上布置固定數(shù)目的分析物傳感分子。因此,根據(jù)本發(fā)明可以提供微陣列形式的固體多孔支持物,其中微陣列的點各自包含不同量的分析物傳感分子。如果該方法用于測定分析物與分析物傳感分子實時動力學(xué)行為的結(jié)合,則提供其點包含不同量的各種分析物傳感分子的微陣列可以是特別感興趣的(同樣參見下面)。因此,陣列是分析物傳感分子的排列,特別是在固體多孔基質(zhì)上可設(shè)定地址的位置上的生物大分子例如多肽和抗體。微陣列,是被微型化的陣列,以便需要最少量的分析物傳感分子和樣品進(jìn)行評估。在陣列內(nèi),每個陣列分子都是可設(shè)定地址的,在陣列表面的至少兩個維度內(nèi)能夠被可靠地和始終如一地測定。因此,在有序的陣列中,每個分析物傳感分子的位置在被點在陣列表面時,被分配給分析物傳感分子,并通常是對應(yīng)每個位置所提供的鑰匙。通常有序的陣列被排列成對稱的網(wǎng)格模式,但是樣品可以以其他模式進(jìn)行排列(例如以放射狀分布的線或有序的束)。分析傳感分子或"點"的應(yīng)用形狀本質(zhì)上對于本發(fā)明的性質(zhì)是不重要的。因此,分析物傳感分子的微陣列通常是指局部沉積分析物靶向多肽,并且不限于圓形或基本上圓形的區(qū)域。例如,本發(fā)明的陣列可以使用基本上正方形的多肽區(qū)域,以及可以是基本上長方形(例如狹縫印跡應(yīng)用)或者三角形、橢圓形或不規(guī)則的。點本身的尺寸(將整個點圍繞于其內(nèi)的圓形面積的直徑)對于本發(fā)明是不重要的,盡管通常在0.1mm-0.5mm之間。陣列本身的形狀對于本發(fā)明也是不重要的,盡管通常是基本平面的,并且整體形狀可以是長方形或正方形的。微陣列的制備是指不同組分析物傳感分子以大約0.05mm-大約10mm之間或更多,優(yōu)選大約0.1mm-lmm之間的點與點之間(中心與中心間隔)排列??梢杂糜诒景l(fā)明的陣列儀(Arrayer)也稱為陣列點樣儀(arrayspotter)是目前可以從不同公司獲得的。根據(jù)不同點樣技術(shù),它們可以被分成接觸式和非接觸式(噴墨)陣列儀。接觸式陣列儀包括Affymetrix,AmershamiiPharmacia,BioRobot〖cs和GeneMachine所制造的,例如使用筆頭在筆頭接觸基質(zhì)時分配樣品。PackardBioscience(目前是PerkinElmer)所制造的BioChipArrayer代表的非接觸式陣列儀采用壓電晶體控制頭在基質(zhì)之上大約400pm分配預(yù)先吸取的樣品。本發(fā)明使用陣列的實施方式的優(yōu)點是可以開發(fā)微型支持物平臺,其能夠使用較小的尺寸樣品和反應(yīng)體積,這實現(xiàn)了規(guī)模經(jīng)濟并節(jié)省時間。另外,這些分析儀能夠達(dá)到與傳統(tǒng)微陣列模式相當(dāng)或更大的靈敏度。為本發(fā)明目的,術(shù)語"分析物"涉及被前述分析物傳感分子所特異識別的分子。因此,分析物可以選自包括蛋白質(zhì)、抗原、半抗原、小分子、脂質(zhì)等所組成的組。最優(yōu)選的,分析物是蛋白質(zhì)或各種蛋白質(zhì)的組合。如上所述,將固體多孔支持物與至少一種樣品接觸可以通過將含有分析物的樣品與固體支持物在典型的溫度和條件下進(jìn)行溫育,其中在所述支持物上優(yōu)選被以微陣列的形式布置分析物傳感分子。正如上面所提出的,期望人們?nèi)芜x地使用溶液清洗支持物,該溶液能夠除去未與支持物和/或分析物傳感分子特異性結(jié)合的樣品組分。公知的是,在分析物例如蛋白質(zhì)檢測過程中,待測試的樣品組分與檢測裝置可能發(fā)生非特異性結(jié)合。這種非特異性結(jié)合可能發(fā)生于支持物和/或分析物傳感分子。在本發(fā)明的一個實施方式中,人們可以通過在將檢測裝置與樣品接觸后,使用所謂用于除去非特異性結(jié)合組分的清洗溶液除去非特異性結(jié)合的組分,而解決這種非特異性結(jié)合。此外,本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的一個實施方式中,期望使用能夠降低和/或除去和/或防止與支持物和/或分析物傳感分子非特異性結(jié)合的溶液或液體處理支持物。通常將這類溶液或液體稱作封閉溶液。能夠降低和/或防止樣品組分與前述支持物組分非特異性結(jié)合的封閉組分通常依賴支持物和/或分析物傳感分子的性質(zhì)和量。封閉組分可以包括去污劑例如SDS、TritonX100、TritonX80、NP-40、吐溫-80、吐溫20等。在另一個實施方式中,封閉溶液的封閉組分可以是BSA、FSA、HSA、酪蛋白或Fc尾。當(dāng)然,也可以使用上述封閉劑的組合。后者封閉組分即BSA、HAS、FSA,特別是酪蛋白是優(yōu)選的。通常,以溶液或液體例如封閉緩沖液的形式施加封閉溶液。例如封閉緩沖液的其他封閉組分可以是鹽、酸等,這依賴具體的應(yīng)用。典型的封閉緩沖液將是PBSpH7.4,其含有任何前述組分濃度為1重量%、2重量%、3重量%、4重量%、5重量%、6重量%、7重量%、8重量%、9重量%、10重量%,最高達(dá)到15。/?;?0重量。/。的BSA、FSA、HAS或酪蛋白。如果組分例如酪蛋白、BSA、HAS被用作封閉溶液中的組分時,通常它們的濃度將在1%和15%之間,2%和10%之間,優(yōu)選5%和10%之間。這些濃度是以重量百分比表示的。封閉的時間點可以不同。因此,在分析物傳感分子例如抗體結(jié)合支持物之前,支持物例如膜可以被預(yù)先封閉。支持物也可以在分析物傳感分子已經(jīng)偶聯(lián)或布置在膜上之后被封閉。優(yōu)選期望如果分析物傳感抗體被吸附到膜例如上述尼龍膜上。在將樣品和檢測裝置接觸使得樣品中的至少一種分析物與支持物上的分析物傳感分子特異性相互反應(yīng)之后,可以任選地包括上述所謂的清洗步驟,該步驟的目的是除去和/或降低分析物樣品的非特異性結(jié)合組分,所述組分與基質(zhì)和/或分析物傳感分子非特異性結(jié)合。在該清洗步驟之后,或者如果省去清洗步驟,將發(fā)生對分析物傳感分子和至少一種樣品的分析物之間特異性相互作用的檢測。上面對步驟d)已經(jīng)提出在使支持物與樣品接觸后,分析物傳感分子和分析物之間的特異性相互作用將可以被檢測。有各種手段檢測樣品中分析物與分析物傳感分子之間的特異性相互作用。其例子是作為分析物傳感分子的抗體和樣品的組分例如蛋白質(zhì)或被抗體特異性識別的典型化學(xué)化合物之間相互作用。然而,這些解釋并不以任何方式被本發(fā)明的這些示范性實施方式所限制。檢測分析物傳感分子例如抗體與分析物之間的相互作用,可以通過使用可檢測標(biāo)記物修飾分析物而發(fā)生。使用可檢測標(biāo)記物修飾分析物可以發(fā)生在檢測裝置和樣品接觸之前,檢測裝置和樣品接觸的過程中,或者在分析物傳感分子和分析物之間已經(jīng)發(fā)生特異性相互作用之后。通過使用例如熒光組分例如Cy5、Cy3、TexasRed、FITC、Attodye、Cydye、Alexa647等、放射性基團等的修飾,可以使用可檢測標(biāo)記物對分析物進(jìn)行修飾。如果分析物傳感分子例如抗體和例如Cy5標(biāo)記的分析物之間發(fā)生相互作用,則任何其他標(biāo)記的樣品組分可以被清洗步驟除去,并且可以根據(jù)與分析物傳感分子的相互作用,檢測樣品中特異性分析物的存在,例如通過分析物傳感分子與在檢測裝置上所保留的分析物之間的相互作用所產(chǎn)生的熒光信號。其他的方法例如誘導(dǎo)銀染色可以用于檢測。其他可檢測標(biāo)記物依賴產(chǎn)生染色的酶反應(yīng),例如辣根過氧化酶可以與樣品中的分析物偶聯(lián),之后,通過提供相應(yīng)的底物可以啟動反應(yīng),引發(fā)在被辣根過氧化酶修飾的分析物與分析物傳感分子之間相互作用的位置的染色。這些酶連接物還可以含有堿性磷酸酶或化學(xué)發(fā)光物系統(tǒng)。也可以被稱作報告分子的可檢測標(biāo)記物的其它例子包括但不限于染料、化學(xué)發(fā)光化合物、金屬復(fù)合物、磁性顆粒、生物素、半抗原、射頻發(fā)射器和放射性發(fā)光化合物。也可以使用其它檢測分析物和分析物傳感分子之間相互作用的方法。例如,如果分析物傳感分子是抗體,則分析物可以從樣品中特異性地結(jié)合該抗體。接著,如果使用清洗步驟用于除去任何未結(jié)合或非特異性結(jié)合的所施加樣品組分,則可以加入其它對于分析物的另一部分也具有特異性的抗體。該抗體可以例如被連接到可檢測標(biāo)記物。這種可檢測標(biāo)記物可以是熒光標(biāo)記物例如Cy5;然而,這種標(biāo)記物也可以使例如已知序列的寡聚核苷酸。如果在所謂二抗與通過捕獲抗體被保持在支持物上的分析物相互作用之后,該寡聚核苷酸被用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),則可以檢測在樣品中分析物的存在。這種所i胃的免疫PCR是非常敏感的,并且能夠用于可靠地檢測溶液中微量的分析物。上述檢測方法依賴第二分析物傳感分子例如抗體,也被稱作"三明治式檢驗"。本領(lǐng)域技術(shù)人員非常了解這種檢驗。在另一個優(yōu)選的途徑中,第二(檢測抗體)偶聯(lián)到例如生物素上。在進(jìn)一步的步驟中,分析物傳感分子-分析物-二抗復(fù)合物與鏈霉素標(biāo)記物的可檢測標(biāo)記物例如熒光標(biāo)記物接觸。接著,熒光標(biāo)記物可以通過鏈霉素與生物素標(biāo)記的二抗相互作用。當(dāng)然可能存在該途徑的其它替代。例如,分析物傳感分子例如捕獲抗體14可以通過噴膜印刷機被印制在多孔膜上。隨后,可以對所印制的膜進(jìn)行封閉使得非特異性結(jié)合最小化。接著,含有例如作為分析物的靶蛋白的樣品在該情況中將被直接標(biāo)記。標(biāo)記可以是熒光團、金珠、酶或半抗原例如上面所述的。使用下面所描述的流通配置,標(biāo)記的樣品將被抽吸通過膜數(shù)次,以使得抗體-抗原結(jié)合。通過額外任選的清洗步驟,將除去過多的標(biāo)記。在另一個實施方式中,使用噴膜印刷機將可以是靶蛋白的分析物印制在多孔膜上。封閉所印制的膜以使非特異性結(jié)合最小化。接著將也含有靶蛋白的樣品與多種任選被標(biāo)記的能結(jié)合分析物的抗體混合。標(biāo)記可以是例如熒光團。任選地,接著進(jìn)行清洗步驟,以從膜上除去非特異性結(jié)合的抗體或標(biāo)記。同樣,任選地,可以進(jìn)行與耙向所結(jié)合抗體的第二標(biāo)記抗體的溫育步驟。前述任選的替代也可以進(jìn)行組合。抗原-抗體1或抗原-抗體1-抗體2結(jié)合將接著通過檢測設(shè)置而顯示,例如該檢測設(shè)置能夠檢測熒光信號,并使用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對復(fù)合物的定量(參見下面)。后者實施方式實際上是競爭檢驗。輸入樣品中高濃度的靶蛋白將在膜上提供低信號。此外,第一捕獲抗體的量需要被仔細(xì)優(yōu)化以便與樣品中靶蛋白的量相比不會過剩。當(dāng)然,分析物傳感分子和分析物之間的特異性相互作用也可以不使用標(biāo)記物而檢測,即所謂的"無標(biāo)記"檢測。例如,這可以使用Biacore系統(tǒng)完成。如上所述,如果分析物傳感分子被以陣列格式布置在支持物上,則根據(jù)本發(fā)明的方法可以被用于實現(xiàn)在一種或者多種樣品中平行處理樣品和平行檢測多種分析物。因為每個檢測點可以對應(yīng)不同的對某種分析物特異性的分析物傳感分子,因此在固體多孔支持物與樣品溫育并以上述方式處理之后,從這類檢測點產(chǎn)生的信號將指示在樣品中存在分析物。在根據(jù)本發(fā)明的方法最后步驟e)中,測定樣品中分析物的濃度。濃度的測定主要依賴在如上對步驟d)中所描述的檢測分析物傳感分子和分析物之間特異性相互作用所產(chǎn)生的信號。典型地,首先將之上被布置分析物傳感分子的支持物與樣品接觸,其中樣品包含能夠特異性結(jié)合支持物上分析物傳感分子的分析物,其中分析物傳感分子的濃度是已知的。通過使用具有已知但不同濃度的該特異性分析物,以及例如使用具有不同量分析物傳感分子的微陣列以及例如偶聯(lián)到分析物的熒光標(biāo)記,可以建立所謂的校準(zhǔn)或標(biāo)準(zhǔn)曲線,在該曲線中一定的熒光信號強度與樣品中已知的分析物濃度相關(guān)聯(lián)。在作為實際測量的第二步驟中,采用含有濃度未知的分析物的樣品。如上所述的根據(jù)本發(fā)明的方法處理這些樣品,例如如果分析物也被與已經(jīng)用于建立校準(zhǔn)曲線相同強度的熒光標(biāo)記物所標(biāo)記,則記錄熒光信號。接著,通過與前述的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較,將這種熒光信號與樣品的濃度進(jìn)行關(guān)聯(lián)。當(dāng)然,本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠知道熒光信號會發(fā)生飽和效應(yīng),例如如果將樣品與支持物接觸,其中樣品含有比支持物上可以利用于相互作用的分析物傳感分子多的分析物。在這些情況中,將逐步對分析物樣品進(jìn)行稀釋,直到達(dá)到獲得非飽和熒光信號的狀態(tài)。測定樣品中分析物濃度的其它實施方式是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如,如果將化學(xué)反應(yīng)或酶反應(yīng)用于檢測分析物和分析物傳感分子之間的相互作用,也可以通過比色反應(yīng),并用分析物濃度已知的樣品建立校準(zhǔn)或標(biāo)準(zhǔn)曲線。之后,根據(jù)如上所述本發(fā)明的方法可以進(jìn)行,并從所獲得的比色值計算濃度。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會了解,需要確保只有這些被考慮的比色信號還沒有達(dá)到飽和水平。上面所述用于測定樣品中分析物濃度的方法的優(yōu)點之一是樣品與多孔支持物結(jié)合。因為支持物是多孔的,樣品可以通過支持物,這能夠快速和有效地除去所有非特異性結(jié)合的樣品組分,導(dǎo)致一旦檢測分析物與分析物傳感分子之間特異性相互作用時,信噪音比整體增強。此外,使用多孔膜能夠得到有利和優(yōu)選的本發(fā)明實施方式,即通過重復(fù)步驟b)-d)多次而以重復(fù)模式進(jìn)行上述方法。優(yōu)選,步驟b)-d)被重復(fù)至少2、3、4、5、6、7、8、9、10次,最高達(dá)到30次。特別優(yōu)選的循環(huán)次數(shù)是大約8-12個循環(huán)。通過例如在循環(huán)中經(jīng)所述固休多孔支持物抽吸樣品,可以促進(jìn)重復(fù)接觸,任選地清洗和檢測分析物傳感分子和分析物之間的相互作用。也可以通過抽吸之外還采用真空,或者采用真空替代抽吸,來促進(jìn)循環(huán)。當(dāng)然,本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何改造孔徑用于不斷地經(jīng)所述支持物抽吸樣品,例如如果包括清洗步驟的話。例如,16這可以通過使用能夠被閥門切換到不同來源(例如樣品和清洗緩沖液源)的管線完成。在檢測分析物傳感分子與分析物之間的相互作用時,重復(fù)將樣品施加到支持物上引起顯著增強的信噪比。在以至少20秒,至少30秒,至少40秒,至少50秒,至少60秒,至少2分鐘,至少3分鐘或至少5分鐘的接觸或溫育時間打斷重復(fù)循環(huán)時,這是尤其正確的??梢圆捎蒙厦嫠薅ǖ难h(huán)次數(shù)。重復(fù)應(yīng)用樣品可以包括重復(fù)加入新鮮的樣品和/或已經(jīng)經(jīng)膜通過一次的樣品即首次通過的"流通物"術(shù)語"重復(fù)循環(huán)"可以不僅指一起重復(fù)所有步驟b)-d)。代替的是,術(shù)語"重復(fù)循環(huán)"也可以指任何這些步驟b)-d)或者甚至其子步驟。例如,替代經(jīng)多孔膜多次循環(huán)樣品的是,也可以只重復(fù)施加,即循環(huán)經(jīng)膜的清洗溶液。類似地,可以在支持物上重復(fù)循環(huán)可檢測標(biāo)記物。例如,這可以是優(yōu)選的情況,如果鏈霉素標(biāo)記的熒光標(biāo)記物被用于檢測生物素標(biāo)記的二抗。當(dāng)然,也可以使用前述循環(huán)的步驟即循環(huán)樣品、清洗溶液和/或檢測標(biāo)記物的組合。不希望囿于理論,采取重復(fù)循環(huán)優(yōu)選被前述溫育時間所中斷,會提高在檢測分析物傳感分子和分析物之間的相互作用時的信噪比,因為重復(fù)分析物和分析物傳感分子之間反應(yīng)的開和關(guān)會導(dǎo)致樣品非特異性結(jié)合組分的有效除去,并有利于特異性相互作用的選擇壓力。此外,樣品與支持物的重復(fù)接觸似乎是下列事實的原因與不進(jìn)行重復(fù)循環(huán)而只包括一次溫育和任選的清洗步驟的情況相比,有效檢測所需的整體溫育時間被顯著降低。因此,本發(fā)明在以上述重復(fù)模式進(jìn)行時,具有下列優(yōu)點時間例如檢測抗體和抗原之間免疫反應(yīng)所需要的時間可以比傳統(tǒng)的持續(xù)時間降低,傳統(tǒng)上可以持續(xù)最高達(dá)到3.5小時,例如沒有進(jìn)行膜上溫育的話最低達(dá)到15分鐘。如果包括溫育步驟的話,5個抽吸循環(huán)的總檢驗時間可以是大約45分鐘??梢酝ㄟ^各種使用抽吸和/或真空手段的手段,完成根據(jù)本發(fā)明方法的重復(fù)操作,其中抽吸和/或真空手段是優(yōu)選的,因為他們能夠允許樣品和任選的清洗溶液可控和穩(wěn)定地在固體支持物上流動和通過。本發(fā)明的另一個實施方式涉及隨時間變化測定樣品中分析物的濃度的情況。隨時間變化測定所結(jié)合的成分能夠檢測分析物與其分析物傳感分子結(jié)合的實時動力學(xué)。當(dāng)測定分析物與分析物傳感分子的實時結(jié)合動力學(xué)時,能夠?qū)⑿盘栟D(zhuǎn)化成分析物的濃度。根據(jù)結(jié)合曲線的類型,需要知道結(jié)合速度常數(shù),解離速度常數(shù)以及分析物傳感分子密度(即分析物傳感分子的數(shù)目/表面面積)。可以分別測定結(jié)合和解離常數(shù)??梢詮乃贾玫臐舛群腕w積以及點的直徑測定捕獲分子的密度。或者,在與已知濃度的分析物分子溫育時,可以測定結(jié)合或解離速度常數(shù)。為了檢測特異性的相互作用,也需要依賴前述的可檢測標(biāo)記物例如熒光分子。一旦已經(jīng)建立了反映分析物與分析物傳感分子結(jié)合動力學(xué)的結(jié)合曲線,含有未知濃度的分析物的樣品可以與固體支持物接觸,并也可以監(jiān)控隨時間變化的分析物和分析物傳感分子之間的特異性相互作用。通過利用已經(jīng)從不同但已知濃度的樣品獲得的各種標(biāo)準(zhǔn)曲線,測定未知濃度的樣品的曲線形狀,可以估計不僅分析物與分析物傳感分子結(jié)合的結(jié)合動力學(xué)參數(shù),而且還可以估計樣品中分析物的濃度。并且如果步驟b)-d)或這些步驟中的任何步驟被重復(fù)多次,則分析物與分析物傳感分子之間實時結(jié)合動力學(xué)的測定可以被顯著改進(jìn),并且減少了檢測所需的時間。在本文中,參照如上所述根據(jù)本發(fā)明的方法的重復(fù)操作。當(dāng)然,方法的重復(fù)操作可以被如上所述的溫育和接觸時間所打斷。本發(fā)明有多種有用的應(yīng)用。因此,上述的方法可以用于免疫反應(yīng),這可以檢測例如在血液樣品中的某些抗原。因此,上述方法可以用于診斷目的。上述方法特別的優(yōu)點是不僅能夠檢測樣品中某種分析物的存在,而且可以在相對短時間內(nèi)測定其濃度。而且,上述方法可以用于測定分析物與分析物傳感分子的實吋結(jié)合動力學(xué)。因此,上述方法可以不僅用于檢測例如化合物庫中能夠與治療上感興趣目標(biāo)如細(xì)胞受體相互作用的小分子化合物,而且能夠用于測定小分子與其靶蛋白之間相互作用的結(jié)合動力學(xué)。因此,本發(fā)明可以用于利用從不同來源例如環(huán)境來源、血液、淋巴等獲得樣品測定樣品內(nèi)分析物的存在和濃度。額外地和/或可替代地,通過依賴本發(fā)明涉及測定分析物傳感分子和分析物分子之間相互作用的實時動力學(xué)的實施方式,本發(fā)明的方法可以用于測定樣品中分析物的存在,以及與分析物傳感分子的結(jié)合行為。在本發(fā)明可替代的實施方式中,檢測至少一種樣品中至少一種分析物的方法包括歩驟a)提供至少一種固體多孔支持物,其上被布置了至少一種分析物傳感分子;b)將所述支持物與至少一種含有至少一種分析物的樣品接觸;c)任選地使用溶液清洗所述至少一種支持物,其中所述溶液能夠除去與所述支持物和/或所述分析物傳感分子非特異性結(jié)合的樣品組分;d)檢測所述至少一種分析物傳感分子與至少一種分析物之間的特異性相互作用;e)測定所述至少一種樣品中所述至少一種分析物的濃度。如上所述,如果例如步驟b)-d)(或者這些步驟中的任何步驟)被再次重復(fù)多次,以及如果任選的溫育時間被保持充分短,則樣品中存在的分析物可能不會立即與過剩存在的分析物傳感分子完全反應(yīng)。在這種情況中,即如果以重復(fù)模式操作該方法,則可以記錄在每個循環(huán)之后檢測分析物和分析物傳感分子特異性相互作用的隨時間變化的信號。在經(jīng)過重復(fù)循環(huán)之后,由于越來越多的分析物結(jié)合到分析物傳感分子上,因此將觀察到信號強度的提高,一旦分析物與分析物傳感分子的結(jié)合達(dá)到飽和,則這將達(dá)到保持水平。如果現(xiàn)在以這種重復(fù)模式進(jìn)行該方法,并且采用均具有不同已知濃度特異性分析物的不同樣品,可以計算校準(zhǔn)或標(biāo)準(zhǔn)曲線,這反映不同量的分析物與分析物傳感分子隨時間變化的結(jié)合動力學(xué)。如果現(xiàn)在使用含有未知濃度樣品的樣品在相同的條件下重復(fù)該方法,即相同的重復(fù)循環(huán)次數(shù)以及任選的溫育和清洗時間,也會獲得信號相對于時間的曲線,這反映隨著時間的變化,分析物與分析物傳感分子的結(jié)合行為。因此,可以監(jiān)控樣品內(nèi)未知濃度的分析物的結(jié)合動力學(xué),并可以同時測定分析物的濃度。下面根據(jù)某些實驗實施例舉例說明本發(fā)明。然而這些實施例不以任何方法用于限制本發(fā)明的范圍,而是為了通過其某些示范性實施方式舉例說明本發(fā)明。實驗實驗l制備印制抗體的膜為了獲得微陣列格式的固體多孔支持物,使用硝酸纖維素膜。使用噴膜印刷機在該膜上布置不同的抗體。在圖1中,顯示了所獲得微陣列的示意圖。含有熒光標(biāo)記如Cy5的抗體將在適當(dāng)激發(fā)之后產(chǎn)生熒光信號,而與是否結(jié)合分析物無關(guān)。這些分析物傳感分子用于確定微陣列的邊緣和拐角,并且用于提供測量所得到的熒光的檢測裝置校準(zhǔn)的內(nèi)標(biāo)。在微陣列上檢測分析物后面,接著使用在PBSpH7.4中無蛋白酶的5重量。/。BSA對前述的微陣列封閉過夜。隨后,拍攝圖2所示的照片。127.5mA和50mA的數(shù)值表示以不同電流驅(qū)動光學(xué)系統(tǒng)LED所拍攝的照片。在第二步驟中,300pl100nM兔抗小鼠Cy5標(biāo)記的抗體被加入到第一室中的微陣列。將該微陣列與樣品溫育大約1分鐘。之后,經(jīng)所述微陣列抽吸樣品多次,而沒有中間的清洗步驟。在每次溫育步驟之后,通過在使用Philips開發(fā)的LED設(shè)置(波長ex/em:650/670nM)激發(fā)后拍照來監(jiān)控樣品中的分析物即兔抗小鼠Cy5標(biāo)記的抗體與分析物傳感分子即山羊抗兔抗體之間的相互作用。每個循環(huán)的溫育時間為大約1分鐘。圖3顯示在經(jīng)過循環(huán)1、2和4之后的照片。圖4顯示在循環(huán)5、6、7和8之后的所記錄的照片。圖5的下圖顯示如果在最后循環(huán)(循環(huán)8)之后使用PBS.7.4,0.05重量%吐溫20清洗微陣列3次后所獲得的結(jié)果。圖5的上圖顯示沒有清洗的相同照片。從最后的照片,可以清楚地看出兔抗小鼠Cy5標(biāo)記的抗體和山羊抗兔抗20體之間發(fā)生了相互作用。此外,能夠清楚看到在微陣列上布置較多山羊抗兔抗體的情況中的信號比在微陣列上布置較少量的情況具有更強的信號。實驗2在該實施例中,測試了重復(fù)循環(huán)可檢測標(biāo)記物對信號強度的影響。微陣列印制布置圖使用在圖6中所示的微陣列印制布置圖。如上所述產(chǎn)生該微陣列。Cy5標(biāo)記的抗體再次代表內(nèi)標(biāo)。實驗設(shè)置使用下面的捕獲抗體(分析物傳感分子)、抗原(分析物)和檢測二抗。鏈霉素標(biāo)記Cy5被用于檢測。PBS—直指PBSpH7.4。PBST—直指PBSpH7.4,0.0%吐溫20。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>以下列濃度使用組分:捕獲抗體小鼠抗人CRP700nM3.5^1儲液+296.5pl具有5%甘油的PBS小鼠抗人TNFa700nM63pl儲液+237pl具有5%甘油的PBS驢抗山羊Cy5標(biāo)記的700nM21^1儲液+279pl具有5%甘油的PBS200nM6^1儲液+294pl具有5%甘油的PBS抗原CRP/TNFa抗原100nM8.2plCRP儲液+34(ilTNFa+l957.8^1具有1。/。BSAp.f.的PBS100pM2^1的100nM溶液+1998(^1具有1。/。BSAp.f.的PBS空白具有P/。BSAp.f.的PBS檢測抗體全部以生物素進(jìn)行標(biāo)記檢測系統(tǒng)鏈霉素Cy5標(biāo)記的1:10001Ojxl儲液+9990plPBS溫育微陣列和檢測相互作用的程序如下。實驗進(jìn)行兩次在膜上印制陣列拍攝陣列照片使用100(HilPBS+5。/。BSA封閉陣列1小時(室溫(RT),黑暗)拍攝陣列照片以測定回收向陣列加入500ial抗原溶液打開真空并等待直到完全除去流體再重復(fù)4次通過吸移(pipetting)500plPBS清洗陣列打開真空并等待直到完全除去流體再重復(fù)2次向陣列加入50(^1檢測抗體溶液打開真空并等待直到完全除去流體再重復(fù)4次如前使用PBS-T清洗陣列3次拍攝陣列照片向陣列加入500^1鏈霉素-Cy5溶液打開真空并等待直到完全除去流體拍攝所有陣列的照片根據(jù)需要重復(fù)最后3個步驟多次圖7顯示在印制之后的陣列。下表中顯示捕獲抗體的回收率值,這是在200nM和700nM驢抗山羊Cy5標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)的基礎(chǔ)上計算的。_<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>結(jié)果圖8和9顯示在重復(fù)循環(huán)(即10次,包括最后清洗步驟)后下列經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化的強度結(jié)合的C-反應(yīng)性蛋白(CRP);不同濃度的腫瘤壞死因子a(TNFa);以及空白。圖10顯示在圖8和9的基礎(chǔ)上所測定的CRP和TNFa信噪(S/N)比。實驗顯示可以在15分鐘內(nèi)有效進(jìn)行該檢驗。實驗3在該實施例中,研究可檢測標(biāo)記物的影響。進(jìn)一步研究抽吸的影響以及流通物通過微陣列的循環(huán)。微陣列印制布置圖使用在圖11中所顯示的微陣列印制布置圖。如上所述產(chǎn)生該微陣列。Cy5標(biāo)記的抗體仍代表內(nèi)標(biāo)。實驗設(shè)置使用下面的捕獲抗體(分析物傳感分子)、抗原(分析物)和檢測二抗。鏈霉素標(biāo)記的Cy5被用于檢測。PBS—直指PBSpH7.4。PBST—直指PBSpH7.4,0.0%吐溫20。名稱濃度貨號公司CRP捕獲抗體9mg/ml4C28HytestLtd.CRP-6抗原2.8mg/ml1707-2004BiotrendCRP檢測抗體1.7mg/ml4C28BHytestLtd.TNFa捕獲抗體0.5mg/ml14_7348_81eBioscience人重組TNFa0.1mg/ml14-8329-63sBioscisncsTNFa檢測抗體0.5mg/ml13-7349-816Bioscisncs驢抗綿羊Cy51.5mg/ml713-175-003JacksonImmuno以下列濃度使用組分:捕獲抗體小鼠抗人CRP8儲液+180plPBS小鼠抗人TNFa3.33(iM未稀釋的儲液驢抗山羊Cy5標(biāo)記的200nM6^1儲液+294pl具有5%甘油的PBS24500nM15^1儲液+285pl具有5%甘油的PBS700nM21^1儲液+279pl具有5%甘油的PBS抗原,檢測二抗100nM8.2^1CRP儲液+34plTNFa儲液+1906.1pl具有1%BSA的PBSlOOpM1.9^1上述溶液+1946.3pl具有1%BSA的PBS100M1.9(il上述溶液+1946.3pl具有1%BSA的PBS空白1948.2|J具有1%BSA的PBS接著加入到所有溶液66.7nM11.8|_ilCRP檢測抗體儲液66.7nM40^1TNFa檢測抗體儲液所有檢測抗體都以生物素進(jìn)行標(biāo)記檢測系統(tǒng)1:100010^1儲液鏈霉素-Cy5+1990jxlPBS1:100010pl儲液鏈霉素-A647+1990plPBS溫育微陣列和檢測相互作用的程序如下。實驗進(jìn)行兩次-印制陣列拍攝陣列照片對于該實驗使用尼龍膜M吏用50(^1PBS/孔+5Q/。BSA封閉陣列1小時在PBDT中清洗陣列3+5分鐘,并拍攝照片確定回收率將其他陣列與不同濃度的抗原和檢測抗體500W溫育持續(xù)5分鐘。接著,應(yīng)用真空直到膜干燥。接著溫育鏈霉素染料2分鐘。再次應(yīng)用真空直到膜干燥。拍攝所有膜的照片。溫育流通物5分鐘。之后,應(yīng)用真空直到膜干燥并拍照。再重復(fù)3個步驟。溫育新鮮的鏈霉素染料溶液5分鐘。之后,應(yīng)用真空直到膜干燥。拍昭。"、、o*通過吸移500^1PBS-T清洗膜,應(yīng)用真空直到膜干燥。重復(fù)兩次,接著拍照。因此,這些循環(huán)總結(jié)如下循環(huán)l:5分鐘抗原+檢測抗體,接著2分鐘鏈霉素-染料循環(huán)2-4:5分鐘流通物循環(huán)5:5分鐘新鮮鏈霉素-染料循環(huán)5+w:3次PBS-T(沒有在膜上的溫育)圖11顯示在印制后的陣列。在下表中,顯示了在200nM、500nM和700nM驢抗山羊Cy5標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)的基礎(chǔ)上計算的捕獲抗體的回i!夂率值。溶液則后回收率200nM0.0431o馬o13.8%500nM0.13760.022416.3%700nM0.20900.030814.7%平均=15.0%結(jié)果圖12顯示在封閉后拍攝的用于測定回收率的微陣列照片。圖13和14顯示以不同濃度和染料的CRP和TNFa經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的強度。圖15和16顯示依賴各種循環(huán)的CRP和TNFa檢測動力學(xué)。結(jié)果明確顯示可以在短時間內(nèi)進(jìn)行免疫檢驗,并且抽吸、應(yīng)用真空和重復(fù)某些操作步驟能夠影響所測量的信號強度。實驗4在該實施例中,將700nM山羊抗兔抗體印制在尼龍膜上。將該膜與100nM兔抗小鼠Cy5進(jìn)行溫育(參見圖17)。為了溫育,將分析物溶液經(jīng)膜抽吸5次。進(jìn)行該實驗3次。微陣列印制布置圖使用圖18中所示的微陣印制列布置圖。如上所述生產(chǎn)微陣列。Cy5標(biāo)記的抗體仍代表內(nèi)標(biāo)。26結(jié)果圖19顯示通過重復(fù)分析物溶液的循環(huán),經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的信號強度會提高。從上述實驗?zāi)軌虻贸鋈齻€主要的結(jié)論首先,通過經(jīng)微陣列快速循環(huán)樣品,能夠顯著降低有效檢測分析物與分析物傳感分子之間相互作用所需的時間。在上述實驗l中,如果不在膜上進(jìn)行溫育的話,檢測信號的總時間花費大約10分鐘。這與現(xiàn)有技術(shù)中這種應(yīng)用所需能夠花費最高達(dá)到3.5小時不同。第二,通過將例如圖5所獲得的信號與之前已經(jīng)建立的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較,可以測定兔抗小鼠Cy5標(biāo)記的抗體的濃度。相應(yīng)地,這也應(yīng)用于其他實驗。第三,通過監(jiān)控隨著每個循環(huán)即隨時間變化信號強度的發(fā)展,能夠?qū)嶋H測定分析物的結(jié)合動力學(xué),在實驗1中是兔抗小鼠Cy5標(biāo)記的抗體與其捕獲抗體,前提是實驗l中的捕獲抗體是山羊抗兔抗體已經(jīng)被以不同的濃度布置在微咗別卜.這沐7^固的時間占?^生了不固的<畝號力度知強麼2權(quán)利要求1.檢測至少一種樣品中至少一種分析物的方法,該方法包括下列步驟a)提供至少一種固體多孔支持物,其上被布置了至少一種分析物傳感分子;b)將所述支持物與至少一種含有至少一種分析物的樣品接觸;c)任選地使用溶液清洗所述至少一種支持物,其中所述溶液能夠除去與所述支持物和/或所述分析物傳感分子非特異性結(jié)合的樣品組分;d)檢測所述至少一種分析物傳感分子與所述至少一種分析物之間的特異性相互作用;e)測定所述至少一種樣品中所述至少一種分析物的濃度。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中隨時間變化測定濃度,以測量所述分析物與所述分析物傳感分子的實時結(jié)合動力學(xué)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述基質(zhì)的孔隙度允許流體從其流過。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其中所述基質(zhì)是選自包括由尼龍、硝酸纖維素、PVDF或聚醚砜所制成的膜的組的膜。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中多次重復(fù)步驟b)-d)或者這些步驟中的任何步驟。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中大量分析物傳感分子被以微陣列的形式布置在所述支持物上。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述至少一種分析物傳感分子是對分析物具有特異性的抗體。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述至少一種樣品的所述至少一種分析物被至少一種可檢測標(biāo)記物修飾。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法,其中所述至少一種可檢測標(biāo)記物選自包括熒光團、酶、染料、化學(xué)發(fā)光化合物、放射性同位素、金屬復(fù)合物、磁性顆粒、生物素、半抗原、射頻發(fā)射器和放射發(fā)光化合物的組。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述分析物是蛋白質(zhì)。全文摘要本發(fā)明涉及測定樣品中分析物濃度和/或分析物與分析物傳感分子的結(jié)合動力學(xué)的方法。為此目的,本發(fā)明依靠檢測分析物與分析物傳感分子的相互作用,其中所述分析物傳感分子以微陣列形式物理吸附到固體多孔支持物上。在優(yōu)選的實施方式中,該方法可以重復(fù)循環(huán)運行。文檔編號G01N33/557GK101501499SQ200780028864公開日2009年8月5日申請日期2007年8月1日優(yōu)先權(quán)日2006年8月2日發(fā)明者G·H·P·K·C·普亞迪拉,H·R·施塔伯特申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司