專利名稱：用于診斷和治療應(yīng)用的不同類型的血型抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 一般涉及用于治療或預(yù)防抗體-調(diào)節(jié)的移才直排斥的組 合物和方法，更具體地，涉及包括血型決定簇的組合物，所述血 型決定簇能夠有效的除去抗血型抗原的抗體。
背景技術(shù)：
早在移植的前期就發(fā)現(xiàn)穿過ABO血型屏障的腎移植會導(dǎo)致 大范圍的不發(fā)生作用的移才直，因此，遵守傳統(tǒng)的用于l命血的蘭斯 坦納法則一皮認(rèn)為是異體移4直的先決條件。受贈者預(yù)先形成的抗A / B同種凝集素造成針對ABO血型-不相容移植物超急性排斥反_抗體同種免疫病人體內(nèi)觀察到的反應(yīng)相似。第 一個(gè)5爭越ABO血 型屏障的移植手術(shù)在二十世紀(jì)七十年代開始，是將A2血型的尸 體腎臟移植到O型血的受贈者體內(nèi)、在二十世紀(jì)八十年代，使 用Ai和B型血捐獻(xiàn)者進(jìn)行第一組的ABO血型不相容的活體捐贈 者(LD)腎移才直，且存活下來的移才直受贈者與ABO血型相容的 情況相似。這種免疫抑制草案包括前期進(jìn)4于血漿除去法除去抗A / B抗體、捐贈者血小4反輸血、脾切除術(shù)和用抗'淋巴細(xì)胞/胸胨_ 細(xì)胞球蛋白進(jìn)行的誘導(dǎo)治療、注射從豬胃中萃取出的A或B血型 的物質(zhì)和環(huán)孢霉素-硝基咪唑錄^嘌呤-強(qiáng)的松。從那以后，在世界 范圍內(nèi)報(bào)道了超過500個(gè)ABO血型不相容活體捐贈者腎移植手 術(shù)，主要是日本報(bào)道(參見。，有很多文件證明了移植之前減 少受贈者抗A/B抗體水平從而避免排異性的重要性。"這一組移植手術(shù)幸存者情況比較好(大約85%的Al和B型捐贈者的移 植存活期是1年)但是由于單個(gè)案例發(fā)生嚴(yán)重的抗A/B抗體調(diào) 節(jié)的排異作用4'5,因此這一'lt況略遜于ABO血型相容的移植術(shù)。使用抗CD20抗體(Rituximab )與除去抗體相結(jié)合進(jìn)行ABO 血型不相容的腎移植，在這方面最近的數(shù)據(jù)顯示了更好的移植存 活情況6' 7。在器官嚴(yán)重不足的情況下，增加使用來自ABO血型不相容 的捐贈者中的移植物能夠進(jìn)行更多的活體捐獻(xiàn)者腎移植。另外， 在此方面獲得的經(jīng)—驗(yàn)還可以用在人體白細(xì)胞抗原-致:敏病人的預(yù) 處理和后移一直處理8。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明部分地以用于從血漿中除去血型抗原抗體的改進(jìn)的 纟且合物和方法，以及血型鑒定方法為基礎(chǔ)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明纟是供了一種組合物，這種組合 物包含至少兩種血型抗原，每種血型抗原在不同核心糖化物鏈?zhǔn)?上表達(dá)。^尤選的纟且合物包含2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11 或更多的血型A/B 4元原。在另一個(gè)方面，通過4是供不同子類型的耀J茲i朱確定(例如血 型測定)來自主體的樣品中血型抗體的存在，其中每個(gè)子類型都 包覆有不同的血型抗原，并將來自主體的樣品加入到微磁珠中。 將樣品和微磁珠培養(yǎng)足夠長的時(shí)間使樣品中抗血型抗體與血型 抗原在微磁珠上相結(jié)合，形成一種抗血型抗體-微磁珠復(fù)合物。 培養(yǎng)這種復(fù)合物，例如，與至少一種標(biāo)記物標(biāo)記過的更具體地說 能夠結(jié)合所述抗血型抗體的配位體相4妄觸培養(yǎng)，所述抗血型抗體能夠與血型抗原相結(jié)合， 一僉測是否存在這種結(jié)合抗血型抗體的標(biāo) 記過的配位體可以確定所述反應(yīng)性抗體的存在。這種配位體可以 是，例如， 一種抗體或其片段。這種抗體是一種單^f介抗體片,殳，例如Fab或Fab'片,殳。例如，F(xiàn)ab或Fab'片段可以是一種抗Fc抗 體片4史、 一種抗kappa輕《連抗體片,殳、 一種抗X輕鏈抗體片萃殳、 和單鏈抗體片^殳。所述標(biāo)記物例如一種熒光標(biāo)記物。通過本領(lǐng)域 移才直的方法，例如流式細(xì)l包計(jì)或luminex液態(tài)芯片(蛋白分析系 統(tǒng))可以測定標(biāo)"i己的配<立體。通過提供大量不同子類型的微f茲珠除去樣品中的血型反應(yīng) 性抗體，其中，所述不同子類型的凝J茲珠上包^隻有不同的血型抗 原。將樣品和這些微f茲珠相接觸并培養(yǎng)足夠長的時(shí)間，使樣品中 的抗血型抗體與血型抗原相結(jié)合。樣U茲i朱與樣品分離，乂人而/人樣 品中除去血型反應(yīng)性抗體。血型抗原包纟舌A型纟元原、B型纟元原和H型纟元原。核心4唐〗匕物 4連類型包括1型、2型、3型和4型。血型抗原不含有糖化物(在這 里是指ABO血型4氐聚糖或任選的，血型抗原在粘蛋白多肽上表 達(dá)。這里的粘蛋白多肽是粘蛋白免疫球融合蛋白質(zhì)(在這里是指 ABO融合蛋白質(zhì)或多肽)的一部分。任選的，ABO低聚糖或ABO融合蛋白質(zhì)與一種固體支持物， 例如樣O茲J朱相連，例如共《介相連或非共i^介相連。例如，孩"茲珠可 以是橡膠的。通過不同的子類型的樣U茲J朱是指凝J茲珠的大小、顏 色不同，或者大小及顏色都不同。微磁珠的直徑在大約2微米到 大約15微米的范圍內(nèi)。優(yōu)選的，所述微磁珠直徑大約為5微米。 最優(yōu)選的，所述微磁珠直徑大約為5微米。所述才羊品可以是，例如，全血、血清或血漿。在一些方面，該組合物被配制成吸收劑用于從全血或血漿中 除去血型抗體。本發(fā)明還提供了許多不同子類型的微磁珠，其中 每個(gè)子類型上都包覆有不同的血型抗原。例如，所述樣W茲^朱包含至少2、3、 4、 5、 6、 7、8、9 、 10、20、25、30、 40、50或更多種不同子類型的微磁珠。除非另有定義，這里使用的所有技術(shù)與科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所 屬領(lǐng)域普通4支術(shù)人員通常所理解的含義相同。盡管與這里描述的適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧显谙旅孢M(jìn)行了描述。在這里提到的所有出版 物、專利申請、專利及其他參考文獻(xiàn)通過引i正在此全部并入本文。 如果有矛盾的話，以本申請的說明書，包括定義的解釋為準(zhǔn)。另 外，這里的材料、方法和實(shí)施例只起到實(shí)例性作用，并不起到限 制的目的。通過下面的詳細(xì)介紹和所付權(quán)利要求書，本發(fā)明其他的特點(diǎn) 和優(yōu)勢會變得顯而易見。


圖1是一種用于生產(chǎn)傳送血型抗原的載體的示意圖。圖2是一種顯示PSGL - 1 / mlgG 2b細(xì)胞定位的照片，所述 PSGL - 1 / mlgG 2b細(xì)胞定位通過間接免疫熒光法測定。使用 FITC -結(jié)合的山羊抗老鼠免疫免疫球蛋白G Fc抗體(Sigma^^司購 得)在封閉緩沖液中按1:200稀釋后的溶液測定PSGL - 1 / mlgG2b 蛋白質(zhì)。使用4, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對細(xì)胞核染色。圖3是蛋白質(zhì)印記試驗(yàn)的照片，顯示了各種外核鏈傳送的血 型A決定I美。頁圖4是在不同聚糖前體上產(chǎn)生ABO融合肽的ABH轉(zhuǎn)染方案的 示意圖。圖5是圖表，顯示了5種不同大小、不同顏色強(qiáng)度的磁i朱所產(chǎn) 生的流式細(xì)胞計(jì)計(jì)數(shù)，該圖表清楚的顯示了可以使用許多大小-顏色結(jié)合的磁珠。使用上述大小和顏色的結(jié)合，可以制成最多25 中不同的磁珠，每個(gè)都代表一種獨(dú)特的血型抗原。圖6是一種血型抗原外核結(jié)構(gòu)的示意圖。圖7是血型ABH抗原的示意圖。圖8是識別血清中抗血型抗體的流式細(xì)胞計(jì)結(jié)果的圖解表示。圖9是一系列散布圖，顯示了在來源于A型、B型和O型個(gè) 體血清中免疫免疫3求蛋白G和免疫免疫^求蛋白M血型A抗體。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明部分地以 一種發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，該發(fā)現(xiàn)是血型抗原決定蔟 可以在高密度條件下通過不同的核心4唐化物鏈(例如1型、2型、 3型或4型核心糖化物鏈)上專一的表達(dá)，所述核心糖化物鏈或者 是游離糖化物或者在粘蛋白型蛋白質(zhì)骨架上的糖化物。已經(jīng)發(fā) 現(xiàn)，在移植之前，使用不同的核心糖化物鏈攜帶的血型抗原相結(jié) 合，能夠更有效的乂人血液中除去抗血型抗體。另外，本發(fā)明的組 合物在診斷和預(yù)兆疾病方面是有效的，可以測定主體體內(nèi)血型反 應(yīng)性抗體的存在。在一個(gè)方面，本發(fā)明^是供了一種包含至少兩種不同的血型拍二 原(即，低聚糖)的組合物，其中，每種血型抗原在不同的核心糖化物鏈(即，聚糖前體)上表達(dá)。這些低聚糖在這里被稱為"ABO 血型低聚糖"。所述血型抗原是游離糖化物。估文為選才奪，所述血 型抗原在粘蛋白多肽上表達(dá)。例如，所述血型抗原在粘蛋白免疫 球蛋白融合蛋白質(zhì)(在這里被稱作"ABO血型融合蛋白質(zhì)")中 表達(dá)。所述ABO血型融合蛋白質(zhì)攜帶對血型決定簇具有專一性 的抗原決定簇。例如，ABO血型融合蛋白質(zhì)攜帶A型抗原決定 蔟、B型抗原決定簇或H型抗原決定簇。做為選擇，ABO血型 融合蛋白質(zhì)攜帶用于血型抗原的兩種抗原決定蔟。例如，ABO 血型融合蛋白質(zhì)攜帶A型和B型抗原決定簇。在一些方面，ABO 血型融合蛋白質(zhì)攜帶所有的三種抗原決定簇(即，A型抗原決定 蔟、B型抗原決定簇和H型抗原決定簇)。本發(fā)明的ABO血型 融合蛋白質(zhì)在不同的聚糖前體上表達(dá)A型抗原決定簇、B型抗原 決定簇或H型抗原決定簇，所述不同的聚糖前體例如1型前體《連、 2型前體鏈或者3型前體鏈。任選的，ABO血型低聚糖或者ABO血型融合蛋白質(zhì)與 一種固 體支持物相連，乂人而使血型抗原從血液中分離出來。因此，在例如，ABO血型不相容的器官移植、骨髓移植之前 或者為了產(chǎn)生萬能供血者血漿時(shí)，ABO血型低聚糖和ABO血型融 合蛋白質(zhì)在乂人受贈者血液或者血漿中除去抗血型ABO抗體方面 是有效的。ABO血型低聚糖或者ABO血型融合蛋白質(zhì)從受贈者血 液或者血漿中吸收50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 98%或 者100%的抗t血液基團(tuán)ABO抗體。與在單一核心糖化物4連上表達(dá)的血型低聚糖相比，ABO血型 j氐聚糖在石友水化合物摩爾分子量基礎(chǔ)上在除去或結(jié)合抗血型抗 體方面是更有效的。與"等量的在單一核心^唐化物鏈上表達(dá)的游 離并唐化物"相比，ABO血型i氐聚津唐結(jié)合2、 4、 10、 20、 50、 80、 100或更多倍的大量4元血型4元體。相似地，與野生型AB決定簇的游離^t化物相比，ABO血型 融合肽在石灰水化合物摩爾分子量基礎(chǔ)上在除去或者結(jié)合抗血型 抗體方面更為有效。與相等數(shù)量的野生型AB決定簇的游離糖化 物相比，ABO血型融合肽結(jié)合2、 4、 10、 20、 50、 80、 IOO或更 多倍的大量抗血型抗體。ABO血型低聚糖和ABO血型融合蛋白質(zhì)還可以有效的用于 血型測定的方法中。本發(fā)明的方法與現(xiàn)有的血型測定方法相比更 優(yōu)越的地方在于本發(fā)明方法能夠定量評〗介不同的種類和亞種類 的血型抗體。特別是，本發(fā)明方法還考慮到鏈?zhǔn)教禺愋钥贵w的枱r 測。這具有臨床相關(guān)性，因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)可以特異性的應(yīng)答在不同 核心鏈上的血型抗原。此夕卜，血型抗原不同的核心鏈上以一種細(xì) 胞和組織特異性方式一皮表達(dá)。因此，通過4企測鏈特異性抗體可以交叉配血，從而減少過急性排異作用。ABH組織血型抗原在ABH抗原在幾乎所有的人體細(xì)月包中都有發(fā)現(xiàn)，〗旦是如果 他們起到 一些作用的話，他們的生理作用還存在一些未確定的問 題。他們具有碳水化合物的性質(zhì)，且通過不同的糖基轉(zhuǎn)移酶建成， 所述糖基轉(zhuǎn)移酶即以連續(xù)的方式在生長的低聚糖鏈的非還原末 端加入單糖單元的酶。低聚糖可以通過蛋白質(zhì)或者脂類攜帶，或 者可以在體液(例如人類乳汁)中游離存在9。才艮據(jù)線性核心糖基鏈，ABH抗原可以凈皮分為不同的亞基團(tuán)。 作為一種實(shí)施例，A、 B和H抗原在1型鏈(Gaipi, 3GIcNAc )、 2型鏈(Gal卩l(xiāng),4GlcNAc)、 3型鏈(Gal卩l(xiāng), 3GalN Aca )和4型《連(GaipL 3GalNAcP)上表達(dá)。4型《連ABH抗原只被發(fā)現(xiàn)結(jié)合脂類。通過 在加入海藻糖可以制備H型抗原，所述海藻糖通過a1,2連接體與不同的包含末端半乳糖的核心鏈相連。A型抗原和B型抗原都是 從H型子類型中通過加入N-乙酰半乳糖胺(A型)或半乳糖(B 型)產(chǎn)生的，所述N-乙酰半乳糖胺或半乳凈唐與末端半乳并唐以al,3 連4妄體形式相連。負(fù)責(zé)A型和B型抗原生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶 需要al,2-海藻糖的存在，從而分別加入末端N-乙酰半乳糖胺和 半乳糖。兩種在結(jié)構(gòu)上有差別的al，2 -海藻糖基轉(zhuǎn)移酶能夠使H型抗 原的生物合成按照Oriol.1Q所述的方法開始進(jìn)4亍。其中 一個(gè)通過H 位點(diǎn)(FUT -I)編碼，另 一個(gè)通過分泌器官(Se )位點(diǎn)(FUT -II) 編碼。FUT -I基因產(chǎn)物導(dǎo)致紅血細(xì)胞H型抗原表達(dá)并在2型鏈上 起到突出的作用，同時(shí)也顯示了相對1型鏈的活性。相反，F(xiàn)UT -II基因產(chǎn)物通過唾液腙A袈泡細(xì)i包以及排列在胃腸道、繁殖系統(tǒng)和 肺部區(qū)域的分泌薄壁細(xì)胞表達(dá)，主要作用與1型鏈，可能也作用 于3禾口 4型鏈。負(fù)責(zé)A型抗原和B型抗原表達(dá)的基因產(chǎn)物已經(jīng)表明具有公共 的來源。與B型編石馬的基因產(chǎn)物相比，導(dǎo)致A型四個(gè)氨基酸殘 基替換的突變作用造成捐贈者糖核苷酸的變化，優(yōu)選的該變化是 從二磷酸尿嘧咬-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)變?yōu)槎姿崮蜞奏?半乳糖。 由于原始A型等位基因中框架位移的突變作用，血清學(xué)命名的O 表現(xiàn)型缺少的東西這兩個(gè)基因產(chǎn)物的表達(dá)，由此也不表達(dá)A型或 B型決定簇。11 A型血型已經(jīng)根據(jù)血清學(xué)被分成不同的群，最 常見的子群是Al和A2。 12通過兩種不同的a1，3 -N-乙酰氨基半 乳糖轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)這些A型子類型， 一種優(yōu)選H型3和4抗原 (Al ),另 一種4尤選H型1和2 ( A2 ) 4元原。多化合價(jià)的重要性蛋白質(zhì)-碳水化合物的相互作用通常以低的結(jié)合親合力為特征。盡管這看起來是不合理的，但是這為快速開/關(guān)速率提供了基 礎(chǔ)，而快速開/關(guān)速度在生理情況下是必須的，從而能夠允許快速、 高度可變的、在細(xì)月包受體、抗體及其他石灰水化合物結(jié)合蛋白和4也 們的糖基化的配體之間產(chǎn)生的相互作用。必要時(shí)，通過利用多化 合<介自然可以實(shí)現(xiàn)4交高的親合力。在一個(gè)生物體上的幾個(gè)受體與 在另 一個(gè)生物體上的幾個(gè)石友水化合物配位體的結(jié)合可以一使親和力增加io- 10 000倍。多^介相互作用的實(shí)施例包括孩i生物(病毒、細(xì)菌或者細(xì)菌毒素)與細(xì)胞表面的結(jié)合、細(xì)胞-細(xì)胞結(jié)合和多價(jià) 分子，例如抗體與細(xì)胞表面的結(jié)合。13多價(jià)抑制劑與單價(jià)抑制劑 相互作用的抑制通常是無效的，及時(shí)所述抑制劑的結(jié)合活性已經(jīng)在結(jié)構(gòu)上^皮最優(yōu)化。因此；許多不同的分子(例如聚丙烯酰胺、 肽、牛血清白蛋白、樹枝狀聚合物和環(huán)糊精)已經(jīng)被用作主要成 分，用于試圖使相應(yīng)受體產(chǎn)生多價(jià)結(jié)合作用的單糖和低聚糖的多 目標(biāo)顯示。13—種選擇性的方法包括配位體與脂質(zhì)體、薄膜或者 其他表面頭部基團(tuán)非共價(jià)的結(jié)合。13這種糖連接物的成果是變化 的， <旦親合力與單<介相互作用相比，通常能夠增加10到1000 4咅。 在一些情況下，通過最優(yōu)化配位體外觀(即配位體結(jié)構(gòu)、化合價(jià) 程度、主鏈結(jié)構(gòu)和內(nèi)部/內(nèi)配位體距離)，也就是說，通過盡可能 詳細(xì)的模仿碳水化合物呈遞的天然線路，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了納摩活性最 常見的特征生理蛋白質(zhì)-石友水化合物相互作用。帶有適當(dāng)聚糖-取代作用的重組細(xì)胞粘蛋白作為抗碳水化合 凈勿#元體有歲文的吸jj丈體。粘蛋白型蛋白質(zhì)通常發(fā)現(xiàn)在粘膜表面，它的特點(diǎn)在于其具有 大量的O-聚糖耳又代作用(每兩到三個(gè)氨基酸)。超過50%的分 子量是由于所述碳水化合物取代作用。通過將各式各樣的糖基轉(zhuǎn) 移酶互補(bǔ)DNA與所述粘蛋白-免疫球蛋白的共同表達(dá)，可以測定 其O聚糖的結(jié)構(gòu)，從而攜帶幾個(gè)生物學(xué)上重要的碳水化合物決定簇的拷貝。這樣，可以制得粘蛋白傳送的血型A型決定簇，這種 血型A型決定簇表現(xiàn)出高效率的抗血型A型吸收體結(jié)合活性。1 事實(shí)上，抗血型A型抗體以粘蛋白為基礎(chǔ)的吸收體與血型A型 三并唐通過間隔物直才妄與瓊脂4唐^茲J朱(Glucosorb )相連所4尋的吸 收體相比其結(jié)合抗A型抗體效力提高了大約100倍(通過計(jì)算血 型A型決定簇的tt目)。這可以通過一種現(xiàn)象來解釋，即A型 決定簇的幾個(gè)拷貝在粘蛋白型載體蛋白1上以Ab -結(jié)合最佳的間 隔被表達(dá)。同樣；重組細(xì)胞粘蛋白傳送的石灰水化合物抗原決定簇， Galal，3Gal ( a-Gal)已經(jīng)被證明是一種非常有效的抗Gal抗體的 吸收體，也是組織豬-向人異種移植的主要障礙15"7。因此，粘蛋 白是非常有效的支架用于具有生理活性的石友水化合物的最佳顯 示。血型抗原子類型的重要性如上所述，血型ABH決定簇可以^皮不同的核心糖化物鏈攜 帶。他們在人體中具有細(xì)胞-特異性和組織-特異性的分布狀態(tài)， 且個(gè)體ABH抗原作為把向分子用于抗血型ABH抗體的重要性是 未知的。相似地，所述抗血型ABH抗體的全部4支能是否是異質(zhì)ABH抗原子類型以及是否實(shí)際上比末端三糖需要更多的鏈用于 結(jié)合是未知的。 一些數(shù)據(jù)表明，只使用A或B三糖來吸附所有 對血型A或B抗原分別具有特異性的抗體是足夠的，表明這對才企 測抗體也是正確的19—2Q。然而，本發(fā)明的數(shù)據(jù)顯示使用ABH血 型抗原不同的子類型(即不同的核心糖化物鏈攜帶的子類型)來 獲得更有效的抗體吸附和檢測是可能的。具有合適的核心糖化物鏈的^氐聚糖可以作為有效的抗石友水 化合物抗體吸收體。從以上的討論得出，粘蛋白型融合蛋白質(zhì)或者低聚糖在不同的核心糖化物鏈上傳送的ABH決定蔟(乂人而獲得結(jié)構(gòu)多相性) 的混合物能夠吸附更寬范圍的抗A型/ B型抗體。4吏用不同的糖 基轉(zhuǎn)移酶基因的結(jié)合，可以設(shè)計(jì)粘蛋白-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì) 用-見定的內(nèi)部和外部核心壽唐化物鏈來傳送幾個(gè)拷貝的O -連j妄的 聚糖。這可以;故ABH決定簇進(jìn)一步地^立長。因此，重組細(xì)月包才支 術(shù)可一皮用來產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多變的血型A或B粘蛋白，這種粘蛋白可用 于p及附更大范圍的4元A型或者B型4元體。血型抗原低聚糖在多種方面，本發(fā)明提供了血型抗原低聚糖。血型抗原包括 A型、B型以及O(H)型。所述血型抗原對所有的血型子類型都具 有特異性。血型抗原子類型是指所述血型抗原在不同的核心糖化 物《連型上表達(dá)。核心糖化物鏈類型包括l型、2型、3型以及4型聚 糖前體。示范性的血型抗原低聚糖包括如下所示 1-4型的血型A 4元原1型GalNAcal，3(F腦l，2)Gal!31，2GlcNAcpl國R 2型GalNAcal,3(Fucal,2)G孝，4GlcNAc(31-R 3型GalNAcal，3(F涯l，2)G,，3GalNAc込l國R 4型GalNAcal,3(Fucal，2)Gaipi,3GalNAc￡l-R 1-4型的血型B纟元原Bl型Galcd,3(Fucod,2)Gaipi，2GlcNAcpi畫R B 2型Galal,3(Fucal,2)Gal|31,4GlcNAcpl-R B 3型 Galal,3(F謹(jǐn)l，2)Gaipi,3GalNAc込l-RB 4型 Galal,3(Fucal,2)Gal(31,3GalNAc￡l-R其中當(dāng)血型抗原被攜帶在融合蛋白質(zhì)上時(shí)，R代表粘蛋白； 當(dāng)?shù)途厶桥c固體支持物相連時(shí)，R代表連結(jié)點(diǎn)，或者當(dāng)?shù)途厶鞘?游離糖化物時(shí)，R什么也不代表。融合多肽在各種方面，本發(fā)明提供了包括第一多肽的融合蛋白質(zhì)，所 述第一多肽包含至少一部分糖蛋白，例如，可4乘作的與第二多肽 連接的粘蛋白多肽。如在這里使用的，"融合蛋白質(zhì)"或者"嵌合蛋 白質(zhì)"包括至少 一部分粘蛋白多肽，該可#:作的與非粘蛋白多肽 連4妾。"粘蛋白多肽"涉及一種具有粘蛋白區(qū)域結(jié)構(gòu)的多肽。所述 粘蛋白多肽具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、五個(gè)、十個(gè)、二十或更多的 粘蛋白區(qū)域結(jié)構(gòu)。所述粘蛋白多肽可以是任意一種糖蛋白，其特 征在于其氨基酸序列被O-聚糖所取代。例如，粘蛋白多肽每兩個(gè) 或三個(gè)氨基酸是絲氨酸或者蘇氨酸。粘蛋白多肽是一種分泌蛋白 質(zhì)。做為選擇，粘蛋白多肽是細(xì)胞表面蛋白。粘蛋白區(qū)域結(jié)構(gòu)富含蘇氨酸、絲氨酸和脯氨酸，其中，低聚 糖通過N-乙酰半乳糖胺與羥基氨基酸相連(O-聚糖)。粘蛋白 區(qū)域結(jié)構(gòu)包括O -連接的糖基化作用位點(diǎn)，或者作為選擇，粘蛋 白區(qū)域結(jié)構(gòu)由O -連接的糖基化作用位點(diǎn)組成。粘蛋白區(qū)域結(jié)構(gòu) 具有1、 2、 3、 5、 10、 20、 50、 100或更多的O -連4妄的#唐基^匕作用位點(diǎn)。做為選擇，粘蛋白區(qū)域結(jié)構(gòu)包括N連接的糖基化作用 位點(diǎn)，或者做為選擇粘蛋白區(qū)域結(jié)構(gòu)由N -連接的糖基化作用位 點(diǎn)纟且成。粘蛋白多肽重量的50%、 60%、 80%、 90%、 95%或者 100%是由聚糖產(chǎn)生的。粘蛋白多肽可以是任何一種MUC基因 (例如，MUC1、 MUC2、 MUC3等等)編碼的多肽。估支為選擇， 粘蛋白多肽是P -選凝素糖蛋白配位體l( PSGL - I )、CD34、CD43、 CD45、 CD96、 GlyCAM畫1 、 MAdCAM或者紅血3求血型凈唐蛋白。 優(yōu)選的，所述粘蛋白是P -選凝素糖蛋白配位體1。然而"非粘蛋 白多肽"涉及一種多肽，該多肽中少于40%的質(zhì)量是由于聚糖引 起的。在本發(fā)明ABO血型融合蛋白質(zhì)內(nèi)部，粘蛋白多肽可以相當(dāng)于 所有的粘蛋白蛋白質(zhì)或者粘蛋白蛋白質(zhì)的一部分。在一個(gè)實(shí)施方 案中，ABO血型融合蛋白質(zhì)包括至少一部分粘蛋白蛋白質(zhì)。"至 少 一 部分"是指粘蛋白多肽包含至少 一 個(gè)粘蛋白區(qū)域結(jié)構(gòu)(例如，O-連接的糖基化作用位點(diǎn))。在一個(gè)實(shí)施方案中，粘蛋白蛋白質(zhì) 包括所述多肽的細(xì)胞外部分。例如，所述粘蛋白多肽包括PSGL-I的細(xì)l包外部分。第一多肽通過一個(gè)或一個(gè)以上血型轉(zhuǎn)移酶糖基化。第一多肽 通過2個(gè)、3個(gè)、5個(gè)或更多的血型轉(zhuǎn)移酶^f唐基化。糖基化作用 是連續(xù)的或者聯(lián)貫的。做為選擇，糖基化作用是同時(shí)發(fā)生的或者 隨才幾發(fā)生的，例如，以不特定的方式進(jìn)4于。例如第一多肽通過otl，2 海藻糖基轉(zhuǎn)移酶糖基化，所述a1，2海藻^f唐基轉(zhuǎn)移酶例如H-或者 Se-基因編碼的a1,2海藻糖基轉(zhuǎn)移酶。實(shí)例性的a1,2海藻糖基轉(zhuǎn) 移酶是FUT1(基因庫編號Q10984; 010983; 010981; AT455028 和NM00148 )和FUT2 (基因庫編號P19526; BAA11638; D82933和A56098 )。估文為選才奪，第 一多肽通過1，3N-乙酰半乳 糖胺基轉(zhuǎn)移酶或者al，3氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶被糖基化。在一些方面，第一多肽通過otl,2海藻糖基轉(zhuǎn)移酶和1,3N-乙酰半乳沖唐胺基 轉(zhuǎn)移酶或者al，3氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶被糖基化。在所述融合蛋白中，術(shù)語"可操作的連接"是用來說明，第一 和第二多肽是化學(xué)連接的(最具代表性的，通過一種共價(jià)4建，例 如肽鍵連接)，其連接方式允許第一多肽的O -連接的糖基化作用。 當(dāng)應(yīng)用涉及核酸編碼的融合多肽時(shí)，術(shù)語"可操作的連接"是指編 碼核酸編碼的粘蛋白多肽和非粘蛋白多肽在沖匡架結(jié)構(gòu)中4皮此融 合。所述非粘蛋白多肽可以在粘蛋白多肽的N -末端或者C -末端 融合。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述ABO血型融合蛋白質(zhì)可以與 一個(gè)或一個(gè)以上其他的基團(tuán)相連，例如，ABO血型融合蛋白質(zhì) 可能另外與GST融合蛋白質(zhì)相連，其中，ABO血型融合蛋白質(zhì) 與GST(例如，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)序列的C-末端融合。這種 融合蛋白質(zhì)可以促進(jìn)ABO血型融合蛋白質(zhì)的純化。啦文為選擇， ABO血型融合蛋白質(zhì)可以另外與一種固體支持物相連。本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員已知多種不同的固體支持物。這種組合物可以促進(jìn) 抗血型抗體的除去。例如，ABO血型融合蛋白質(zhì)與一種顆粒相 連，所述顆粒由例如金屬化合物、硅、橡膠、聚合材料、微量滴 定板、硝化纖維或者聚酰胺纖維或者其結(jié)合組成。與固體支持物 相連的ABO血型融合蛋白質(zhì)可以4皮用作一種吸收體，,人生物才羊 品中除去抗血型抗體，所述生物樣品例如血液或者血漿。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合蛋白質(zhì)在它的N -末端包括 一種異源信號順序(即， 一種在粘蛋白核酸編碼的多肽中不應(yīng)該 存在的多肽序列)。例如，天然粘蛋白信號序列可以;陂刪除或?qū)て?來自另外一種蛋白質(zhì)的信號序列所取代。在某些寄主細(xì)胞(例如， 哺乳動(dòng)物寄主細(xì)^J中，可以通過4吏用異源信號序列增加多肽的 表達(dá)和/或分泌。本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)或者融合蛋白質(zhì)可以通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)。例如，使用傳統(tǒng)方法，例如，使用粗糙末端或者 交4晉末端捆綁、限制酶消化提供適當(dāng)?shù)哪┒?、適合的粘性末端;真 充、；咸性-粦酸酶處理避免不需要的連4妻、和酶催化捆綁等方法， 被編碼用于不同多肽序列的DNA片段在框架中捆綁在一起。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合基因可以通過傳統(tǒng)方法合成，所述傳 統(tǒng)方法包括自動(dòng)化的DNA合成。做為選擇，可以使用固定引物進(jìn) 行基因片段的P CR擴(kuò)增，所述引物能夠在兩個(gè)連續(xù)的基因片段之 間產(chǎn)生互補(bǔ)的凸起，隨后，這兩個(gè)連續(xù)的基因片賴j皮退火并再擴(kuò) 增產(chǎn)生一種嵌合基因序列(參見，例如，Ausubel等人的文獻(xiàn)(編 輯)，分子生物學(xué)方面的if見有方案，John Wiley & Sons, 1992)。 此外，許多編碼融合基團(tuán)(例如，免疫球蛋白重鏈Fc區(qū)域)的表 達(dá)載體是可以商業(yè)購得的。糖蛋白Iba編碼的核酸可以;故克隆進(jìn) 入這種表達(dá)載體中，從而使該融合基團(tuán)在框架內(nèi)與免疫球蛋白蛋 白質(zhì)連接。ABO血型融合多肽可以作為4氐聚物存在，例如，作為二聚物、 三聚物或者五聚物存在。優(yōu)選的，所述ABO血型融合多肽^皮一 種二聚物?？梢証吏用本4頁:威內(nèi)已知的粘蛋白編碼序列構(gòu)建第一多肽和/ 或核酸編碼的第一多肽。粘蛋白多肽和核酸編碼的粘蛋白多肽的 適當(dāng)?shù)膩碓窗ɑ蜚y行登記號分另'J為NP663625和 NM145650， CAD10625和AJ417815, XP140694和XM140694, XP006867和XM006867和NP00331777和NM009151,他們在這里 通過引"i正全部并入本文。在一些實(shí)施方案中，粘蛋白多肽基團(tuán)作為一種粘蛋白多肽變 體被提供，所述粘蛋白多肽變體在天然存在的粘蛋白序列(野生 型)中具有一種突變，導(dǎo)致碳水化合物含量的增加(相對于未突變的序列)。例如，與野生型粘蛋白相比，所述粘蛋白多肽變體包括另外的o-連接的糖基化作用位點(diǎn)。做為選才奪，粘蛋白多肽變體與野生型粘蛋白多肽相比，包括能夠?qū)е陆z氨酸、蘇氨酸或 者脯氨酸殘基數(shù)量增加的氨基酸順序突變。這些增加的碳水化合 物含量可以-使用本4頁域普通^支術(shù)人員已知的方法通過測定蛋白 質(zhì)比粘蛋白的碳水化合物比率來估價(jià)。在一些實(shí)施方案中，粘蛋白多肽基團(tuán)作為一種粘蛋白多肽變 體被提供，所述粘蛋白多肽變體在天然存在的粘蛋白序列(野生 型)中具有一種突變，這種突變會使粘蛋白序列對蛋白水解作用 具有更強(qiáng)的抵抗力(相對于未突變序列)。在一些實(shí)施方案中，第一多肽包括全長的PSGL - I。啦夂為選 擇，第一多肽包括小于全長的PSGL-I多肽，例如PSGL-I的纟田胞 外部分。例如第一多肽的長度小于400個(gè)氨基酸，例如，長度小 于或等于300個(gè)氨基酸、250個(gè)氨基酸、150個(gè)氨基酸、IOO個(gè)氨基 酸、50個(gè)氨基酸或者25個(gè)氨基酸。示范性的PSGL - I多肽和核酸 序歹'J包4舌基因4艮4亍登i己號XP006867; XM006867; XP140694和 XM140694的序列。第二多肽優(yōu)選是可溶的。在一些實(shí)施方案中，第二多肽包括 能夠促進(jìn)ABO血型融合多肽與第二粘蛋白多肽結(jié)合的序列。在 優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二多肽包4舌至少一種免疫王求蛋白多肽區(qū) 域。"至少一種區(qū)域"是指包括免疫球蛋白分子的任何部分，例如 輕鏈區(qū)域、重鏈區(qū)域、FC區(qū)域、Fab區(qū)域、Fv區(qū)域或者其任一 片段。免疫球蛋白融合多肽在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，在例如美國專 矛J第5,516,964號；第5,225,538號；第5,428,130號；第5,514,582 號和第5,455,165號中有所描述。在一些實(shí)施方案中，第二多肽包括全長免疫球蛋白多肽。做為選擇，第二多肽包括小于全長的免疫球蛋白多肽，例如重鏈、輕鏈、Fab、 Fab2、 Fv、或者Fc區(qū)i或。優(yōu)選的，第二多肽包4舌一 種免疫球蛋白多肽的重鏈。更優(yōu)選的第二多肽包括一種免疫球蛋 白多肽的Fc區(qū)域。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，第二多肽與野生型免疫球蛋白重4連 Fc區(qū)域的效應(yīng)子作用相比具有l(wèi)交少的效應(yīng)子作用。Fc效應(yīng)子作 用包括例如，F(xiàn)c受體結(jié)合作用、補(bǔ)體固定作用和T細(xì)胞消耗活 性，(參見美國專利第6,136,310號的實(shí)施例)。測定T細(xì)J包消 耗活性、Fc效應(yīng)子作用、和抗體穩(wěn)定性的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知 的。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二多肽對Fc受體具有較低的親合力 或完全沒有親合力。在一種選擇性的實(shí)施方案中，第二多肽對互 補(bǔ)蛋白質(zhì)CIq具有4交低的親合力或完全沒有親合力。本發(fā)明的另一個(gè)方面與載體有關(guān)，優(yōu)選的與表達(dá)載體有關(guān)， 所述載體包含核酸編碼的粘蛋白多肽、或者其衍生物、片段、類 似物或者同源物質(zhì)。在許多方面，所述載體包含核酸編碼的粘蛋 白多肽，該粘蛋白多肽可才喿作的與一種核酸編碼的免疫^求蛋白多 肽或者其4汙生物、片,殳類似物或者同源物質(zhì)連4妄。另外，該載體 包括一種核酸編碼的血型轉(zhuǎn)移酶，例如a1,2海藻糖基轉(zhuǎn)移酶、a1，3 N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶、a1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶或者其任意結(jié) 合。所述血型轉(zhuǎn)移酶能夠促進(jìn)血型決定簇在ABO血型融合蛋白 質(zhì)粘蛋白部分肽骨架上的加入。如這里使用的術(shù)語"載體"是指能 夠運(yùn)輸它所連接的其他核酸的核酸分子。載體的 一個(gè)類型是"質(zhì) 斗立"，質(zhì)并立是指一種環(huán);|大又又鏈脫氧4亥凈唐4亥酉吏環(huán)，其中可以捆綁另 外的DNA片段。載體的另一種類型是病毒載體，其中，額外的 DNA部分可以被捆綁進(jìn)入病毒基因組中。載體能夠在他們被引 入的寄主細(xì)胞中自動(dòng)復(fù)制(例如，來源于細(xì)菌的細(xì)菌載體的復(fù)制 和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其他的載體(例如，非附加型哺乳動(dòng)物載體)通過引入寄主細(xì)胞被整合入宿主細(xì)胞基因組中，并因此 隨著宿主基因組的復(fù)制而復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與他們 可操作的連接著的基因表達(dá)。這種載體在這里被稱為"表達(dá)載體"。通常，在重組DNA技術(shù)中使用的表達(dá)載體經(jīng)常以質(zhì)粒形式存 在。在本說明書中，"質(zhì)粒"和"載體"能可交換地被使用，因?yàn)橘|(zhì) 粒通常以載體的形式一皮-使用。然而，也可用來包4舌其他形式的表 達(dá)載體，例如起到相同作用的病毒載體(例如，有復(fù)制缺陷的反 向病毒、！^病毒和l^病毒4目關(guān)病毒)。本發(fā)明的重組細(xì)胞表達(dá)載體包括本發(fā)明的核酸，本發(fā)明的核 酸以一種適合于核酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)的形式存在，這意味著所 述重組細(xì)J包表達(dá)載體包括一個(gè)或一個(gè)以上調(diào)節(jié)序列，這些調(diào)節(jié)序 列根據(jù)用來表達(dá)的宿主細(xì)胞選擇，可操作的與一皮表達(dá)的核酸序列 連接。在重組細(xì)胞表達(dá)載體內(nèi)部，"可操作的連接"是指所關(guān)心的 核苷酸序列與所述調(diào)節(jié)序列以允許核普酸序列表達(dá)的方式連接 (例如，當(dāng)載體被引入所述宿主細(xì)胞時(shí)，在一種體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系 統(tǒng)中或在宿主細(xì)月包中)。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"是指包括促進(jìn)劑、增強(qiáng)劑及其他表達(dá)控制元 素(例如，聚A泉甘酸化信號)。這種調(diào)節(jié)序列纟皮描述在例如Goeddel 等人的文獻(xiàn)GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY(基因表達(dá)4支術(shù)酶學(xué)方法)185, Academic Press (學(xué)術(shù)出版社)，SanDiego (圣地亞哥)，Calif.(加利福尼亞) (1990)中。調(diào)節(jié)序列包括能夠指導(dǎo)核苷酸序列在許多類型的寄主 細(xì)胞中表達(dá)的序列和能夠指導(dǎo)核苦酸序列只在確定的宿主細(xì)胞 中表達(dá)的序列(例如，組織-特異性調(diào)節(jié)序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以理解表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以依賴與 一些因素，例如被轉(zhuǎn)化的 寄主細(xì)胞的選擇，期望的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，等等。本發(fā)明的表 達(dá)載體被引入宿主細(xì)胞,人而生產(chǎn)蛋白質(zhì)或者肽，所述蛋白質(zhì)或者肽包括這里所述的通過核酸編碼的融合蛋白質(zhì)或者肽(例如，ABO血型融合多肽、由ABO血型融合多肽形成的突變體，等等)。本發(fā)明的重組細(xì)胞表達(dá)載體可以4皮設(shè)計(jì)用于ABO血型融合 多肽在原核生物細(xì)月包或者真核生物細(xì)月包中表達(dá)。例如，ABO血 型融合多肽可以在細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌中表達(dá)，可以在昆蟲 細(xì)胞H吏用桿狀病毒表達(dá)載體)酵母細(xì)月包或者哺乳動(dòng)物細(xì)月包中表 達(dá)。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞進(jìn)一步的描述在Goeddel等人的文獻(xiàn)GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY (基因表達(dá)^支術(shù)酶學(xué)方法)185, Academic Press(學(xué)術(shù)出版j土 )， San Diego (圣地亞哥)，Calif.(加利福尼亞)(1990)中。做為 選擇，重組細(xì)胞表達(dá)載體可以被體外轉(zhuǎn)錄和翻;奪，例如4吏用T7 促進(jìn)劑調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和翻譯。進(jìn)行，所述載體包含固有促進(jìn)劑或誘導(dǎo)促進(jìn)劑，指導(dǎo)融合蛋白質(zhì) 或非融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。融合載體向其編碼的蛋白質(zhì)中，通常向 重組細(xì)胞蛋白質(zhì)的氨基末端加入很多氨基酸。這種融合載體一4殳 起到三個(gè)目的(i)增加重組蛋白質(zhì)的表達(dá)；(ii)增加重組蛋 白質(zhì)的溶解度；和(iii)通過在親合純化中起到配位體的作用幫 助重組蛋白質(zhì)純化。通常在融合表達(dá)載體中，在融合基團(tuán)和重組 蛋白質(zhì)接合點(diǎn)引入一種蛋白水解分裂位點(diǎn)，從而使重組蛋白質(zhì)在 融合蛋白質(zhì)純化之后從融合基團(tuán)上分裂。這種酶和他們的同源的 識別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達(dá)載體 包4舌pGEX ( Pharmacia生物4支術(shù)7〉司；Smith和Johnson, 1988. 基因67 : 31 - 40)、 pMAL(新英才各蘭生物實(shí)-驗(yàn)室，Beverly, Mass) 和pRIT5 ( Pharmacia, Piscataway， NJ )這些載體分別4夸谷月光甘 肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白、或者蛋白質(zhì)A融合 到耙向重組蛋白質(zhì)中。適當(dāng)?shù)膇秀導(dǎo)的未融合大腸桿菌表達(dá)載體的實(shí)施例包4舌pTrc (Amrann等人，(1988 )基因69:301 - 315 )和pET Hd ( Studier 等人，GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY(基因表達(dá)才支術(shù)酶學(xué)方法)185, Academic Press (學(xué)術(shù)出X反牙土 ) ， San Diego (圣J也亞哥)，Calif.(力口矛H畐尼亞) (1990) 60 - 89 )。在大腸桿菌中最大化重組蛋白質(zhì)表達(dá)的一個(gè)策略是將蛋白 質(zhì)在具有減少容量的細(xì)菌宿主中表達(dá)，乂人而蛋白水解所述重組蛋 白質(zhì)。參見，例如Gottesman等人的文獻(xiàn)GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY(基因表達(dá)才支術(shù) 酶學(xué)方法)185, Academic Press (學(xué)術(shù)出版3土 ) ， San Diego (圣 i也亞哥)，Calif.(力口禾'H畐尼亞)(1990) 119 - 128。另一個(gè)策略 是改變4皮插入表達(dá)載體中的核酸序列以至于不同氨基酸各自的 密碼子分別優(yōu)選的在大腸4干菌中祐 使用(參見，例如，Wada, et al.， 1992. Nucl. Acids Res. 20 : 2111 - 2118)。可以通過標(biāo)準(zhǔn)DNA合成 4支術(shù)進(jìn)4亍本發(fā)明核酸序列的改變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ABO血型融合多肽表達(dá)載體是一種酵 母表達(dá)載體。用于在釀酒酵母中表達(dá)的載體的實(shí)施例包括 pYepSecl ( Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6 : 229 - 234 ) 、 pMFa (Kurjan and Herskowitz, 1982. Cell 30 : 933 - 943)、 pJRY88 (Schultz et al" 1987. Gene 54 : 113畫123)、 pYES2 (Invitrogen公 司，圣i也亞哥，力口利福尼亞)和picZ (InVitrogen7^司，圣;也亞哥， 力口矛H畐7^亞)。做為選擇，ABO血型融合多肽可以使用桿狀病毒表達(dá)載體在 昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。能夠在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(例如，SF9細(xì)胞)中 有效的表達(dá)蛋白質(zhì)的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol 3 : 2156國2165)和pVL系列(Lucklow禾口Summers, 1989. Virology 170 : 31 - 39)。在依舊另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸j吏用哺乳動(dòng)物表達(dá) 載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的實(shí)施例包括 pCDM8 (參見，1987. Nature 329 : 840)和pMT2PC ( Kaufman, etal, 1987. EMBOJ. 6: 187 - 195)。當(dāng)被用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，經(jīng) 常通過病毒調(diào)節(jié)因素提供表達(dá)載體的控制功能。例如，通常使用 的促進(jìn)劑纟汙生自多形瘤、l泉病毒2、巨細(xì)月包病毒和猿f吳病毒40。見，例如，Sambrook等人編輯的《分子克隆 一種實(shí)-驗(yàn)手冊》 第二版的第16、 17章，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory出片反牙土出片反，Cold Spring Harbor, N.Y., 19。本發(fā)明的另一個(gè)方面與宿主細(xì)月包有關(guān)，在此宿主細(xì)月包中已經(jīng) 引入本發(fā)明的一種重組表達(dá)載體。術(shù)語"宿主細(xì)胞"和"重組宿主細(xì) 胞"在這里是可交換j吏用的。應(yīng)當(dāng)理解，這種術(shù)語不只涉及特定 的主體細(xì)胞而且涉及這種細(xì)胞的后代或者潛在的后代。由于突變 作用或環(huán)境影響，在隨后的繁殖過程中可能發(fā)生某些修飾，因此， 事實(shí)上，這些后代可能與母代細(xì)胞不相同，但是盡管如此，這些 后代也^皮包括在這里所^吏用的術(shù)語所包括的范圍內(nèi)。宿主細(xì)胞可以是任何一種原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞。例如糖蛋 白Iba融合多肽可以在例如大腸桿菌的細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵 母細(xì)胞或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如人、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO) 或者COS細(xì)胞)中表達(dá)。其他適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。載體DNA可以通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染技術(shù)被引入原核細(xì)胞 或真核細(xì)胞中。如這里使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)染"是指用于將 夕卜源核酸(例如，DNA)引入宿主細(xì)胞的各種本領(lǐng)域已知的技術(shù)， 包括磷酸4丐或者氯化4丐共同沉淀、二乙基氨基乙醇-右族:糖酐-調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、或者電穿孔。用于轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染宿主細(xì)月包的適當(dāng)?shù)姆椒梢园l(fā)J見在 Sambrook等人的文獻(xiàn) (MOLECULAR CLONING (分子克隆)ALABORATORY MANUAL.(實(shí)驗(yàn)手冊)第二版，Cold Spring Cold Spring Harbor 實(shí)驗(yàn)室Cold Spring Harbor實(shí)驗(yàn)室出版社，Cold Spring Harbor, N. Y., 1989)及其他實(shí)驗(yàn)手冊中。眾所周知，為了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，根據(jù)使用的不同 的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，只有一'■!、部分的細(xì)胞可以整合外源DNA 進(jìn)入他們的基因組。為了識別和選擇這些成分，通常在引入所關(guān) 心的基因的同時(shí)，向宿主細(xì)胞中引入 一 種能夠編輯可選擇的標(biāo)記 物(例如，對抗生素的4氐抗性)的基因。各種可選4奪的標(biāo)i己物包 括能夠j陚予藥物抗藥性的標(biāo)記物，例如G418、勻潮霉素和氨曱 蝶呤。編碼可選擇的標(biāo)記物的核酸可以被引入宿主細(xì)胞，在此過 程中使用的載體可以與編碼糖蛋白Iba融合多肽的核酸時(shí)l吏用的 載體是相同的載體，或者可以被引入單獨(dú)的載體中。通過藥物篩 選可以識別出能夠穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染帶有引入核酸的細(xì)胞(例如，已經(jīng) 整合入可選擇的標(biāo)志基因的細(xì)胞將會繼續(xù)存在，而其他的細(xì)胞會 死亡)。一種本發(fā)明的宿主細(xì)胞，例如在培養(yǎng)基中的原核宿主細(xì)胞或 者真核宿主細(xì)胞可以被用于產(chǎn)生(即，表達(dá)表達(dá))ABO血型融 合多肽。因此，本發(fā)明進(jìn)一步才是供了^吏用本發(fā)明宿主細(xì)胞生產(chǎn) ABO血型融合多肽的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包4舌在 適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(其中已經(jīng)引入能夠編碼 ABO血型融合多肽的重組表達(dá)載體)，/人而生產(chǎn)ABO血型融合 多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括乂人所述培養(yǎng)基或 者宿主細(xì)月包中分離ABO血型多肽。所述ABO血型融合多肽可以4艮據(jù)常頭見技術(shù)進(jìn)行分離和純化，例如，提耳又、沉淀、色i普法、親和色i普法、電泳等等。例如，通過將溶液穿過包含固定化蛋白質(zhì)A或者蛋白質(zhì)G的色譜柱，固 定化蛋白質(zhì)A或者蛋白質(zhì)G有選擇地結(jié)合融合蛋白質(zhì)的Fc部分， 從而將所述免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)純化。參見，例如Reis, K. J. et al., J. Immunol. 132:3098國3102 ( 1984 ) ; PCT申^青/>開號W087 / 00329。通過用帶有離液序列高的鹽處理洗-提融合多肽或者通過 含水乙酸(1M)洗^是所述融合多肽。估文為選4奪，本發(fā)明的ABO血型融合多肽可以通過本領(lǐng)域已 知的方法化學(xué)合成。例如，多肽的化學(xué)合成已經(jīng)4皮描述，例如， 各種蛋白質(zhì)合成方法是本領(lǐng)域常用的方法，包括使用肽合成器進(jìn) 行合成。參見，例如，肽化學(xué)作用， 一種實(shí)用教科書，Bodasnsky 版本，Springer - Verlag, 1988; Merrifield, Science 232 : 241 - 247(1986) ; Barany, et al, Intl. J. Peptide Protein Res. 30 : 705 - 739(1987) ; Kent, Ann. Rev. Biochem. 57:957畫989 ( 1988),和Kaiser, et al, Science 243 : 187國198 ( 1989)。使用標(biāo)準(zhǔn)肽純化技術(shù)將所述 多肽進(jìn)4亍純化^f吏他們基本上不含有化學(xué)前體或者其他的化學(xué)試 劑。術(shù)語"基本上不含化學(xué)前體或者其他的化學(xué)試劑"包括肽的制 備，其中肽/人其合成過程4吏用的到的化學(xué)前體或者其他的化學(xué)試 劑中分離。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)i吾"基本上不含有化學(xué)前體或 者其他的化學(xué)試劑"包括制備具有小于大約30% (干重)的化學(xué) 前體或者非肽化學(xué)試劑的肽，更優(yōu)選的制備具有小于大約20%化 學(xué)前體或者非肽化學(xué)試劑的肽，更優(yōu)選制備具有小于大約10%化 學(xué)前體或者非肽化學(xué)試劑的肽，和制備具有最優(yōu)選小于大約5% 化學(xué)前體或者非肽化學(xué)試劑的肽。多肽的化學(xué)合成促進(jìn)修飾或者非自然氨基酸的整合，所述修 飾的或非自然氨基酸包括D -氨基酸及其他小有機(jī)分子。用相應(yīng) 的D-氨基酸同種型置換一種或一種以上肽中的L-氨基酸，這種 置4奐可以;陂用來增加肽只于酶^H匕水解的^^元力，且可以用于增加生物學(xué)活性肽一個(gè)或一個(gè)以上性質(zhì)，即，受體結(jié)合、官能效力或者作用持續(xù)時(shí)間。參見，例如，Doherty， et al, 1993. J. Med. Chem. 36 : 2585 - 2594; Ki勿，et al, 1993. J. Med. Chem. 36:3802 - 3808; Morita, et al, 1994. FEBS Lett. 353 : 84 - 88; Wang， et al, 1993. Int. J. Pept. Protein Res. 42 : 392 - 399; Fauchere and Thiunieau, 1992. Adv. Drug Res. 23 : 127 - 159。向一種肽序列中引入共價(jià)交聯(lián)4建可以從構(gòu)象上和地形上束 縛多肽骨架。這一方法可以被用來發(fā)展帶有增加的效力、增加的 選擇性和穩(wěn)定性的融合多肽的肽類似物。由于環(huán)狀肽的構(gòu)象熵比它直線型乂于應(yīng)物的構(gòu)象熵要j氐，因此〗吏用 一種特定構(gòu)象可能4吏環(huán) 狀類似物的熵比非環(huán)形類似物的熵下降的程度小，乂人而得到用于 更好結(jié)合的自由能。往往通過在肽N-和C-末端之間形成一種酰 胺鍵、在側(cè)鏈和N畫或者C-末端(例如，在plK直為8.5時(shí)帶有 K3Fe(CN)0) (Samson et al" Endocrinology, 137 : 5182 - 5185 (1996))之間形成一種酰胺4建、或者在兩個(gè)氨基酸側(cè)鏈之間形成一 種酰胺4建來完成大環(huán)化作用。參見，例如，DeGrado, Adv Protein Chem, 39 : 51 - 124 ( 1988)。同時(shí)，將二碌"建引入線性序列來減少 4也們的靈活'f生。參見，例長口， Rose, et al., Adv Protein Chem, 37 : 1 -109 ( 1985); Mosberg et al， Biochem Biophys Res Commun, 106 : 505 - 512 ( 1982)。此外，帶有青霉胺(Pen, 3-巰基-(D)纈氨酸) 的半胱氨酸剩余物的取代已經(jīng)被用于增加某些鴉片樣物質(zhì)-受體 相互作用的選擇性。Lipkowski和Carr的《肽合成、結(jié)構(gòu)和應(yīng) 用》，Gutte片反本，學(xué)術(shù)出X反-土出X反，第287 - 320 ( 1995)。組合物和試劑盒本發(fā)明還包4舌一種組合物，這種組合物包含至少兩種血型抗 原(例如，ABO血型低聚糖)，且其中每種血型抗原在不同的核 心4唐化物《連類型上表達(dá)。所述血型抗原是一種A型抗原、 一種B型抗原或者一種H型抗原。所述核心糖化物鏈類型可以是l型、2 型、3型或者4型。所述組合物包含2、 3、 4、 5、 6、 7、 8或更多 不同的血型抗原。示范性的血型抗原包括上面所描述的。任選的，ABO血型低聚糖或者ABO血型融合蛋白質(zhì)與一種固 體支持物相連。所述連接4建是共價(jià)的。估文為選l奪，所述連接4建是 非共價(jià)的。所述固體支持物可以是，例如，》茲珠、樹脂、薄膜或者平圓 形物、或者任何一種適合于本發(fā)明方法的固體支持物材料。優(yōu)選 的，該固體支持物是^茲珠，例如，獨(dú)W茲5朱。所述石茲主朱的尺寸不重 要。通常，所述》茲J朱的直徑至少為1到50樣吏米，顆粒大小為1 到IO微米是優(yōu)選的。最優(yōu)選的所述磁珠具有大約4-IO微米的直 徑。例如，具有2, 3， 4， 5, 10， 15, 20, 25, 30， 40或50微米的直徑。所述磁珠可以由金屬化合物、硅、橡膠、聚合材料或者涂有 金屬金屬化合物的硅、橡膠或者聚合物核。所述固體支持物可以傳送官能團(tuán)，例如羥基基團(tuán)、羧基基團(tuán) 醛基團(tuán)或者氨基基團(tuán)。所述支持物可以帶有正電荷、帶有負(fù)電荷 或者是疏水性的。本發(fā)明使用的功能化的被涂布的支持物可以通 過支持物的修飾作用來制備。例如用帶有一個(gè)或者更多這種官能 團(tuán)的聚合物處理未涂布的支持物，例如聚氨基曱酸酯和聚二醇一 起提供羥基或者通過纖維素衍生物提供羥基，丙烯酸或者曱基丙 烯酸的聚合物或者共聚物能夠提供羧基，或者氨烷基化的聚合物 能夠提供氨基基團(tuán)。美國專利第4,654,267號描述了許多表面涂層 的引入。優(yōu)選的每種不同的ABO血型低聚糖或者ABO血型融合蛋白 質(zhì)位于不同子類型的微磁珠上。子類型是指每種孩W茲珠是有顯著 區(qū)別的，例如，具有不同的大小或者具有可區(qū)別的標(biāo)記。不同大 小的微磁珠或者帶有例如熒光團(tuán)標(biāo)記的微磁珠使這些不同的磁 珠能夠被識別和/或分離，例如通過流式細(xì)胞計(jì)進(jìn)行識別和/或分 離。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種試劑盒，使用本發(fā)明所述的方法， 該試劑盒用于從樣品中分離或鑒定血液基團(tuán)反應(yīng)性抗體。所述試 劑盒包含許多各種子類型的微磁珠，每種子類型都涂布有不同的 ABO血型低聚糖或者ABO血型融合蛋白質(zhì)。任選的，所述試劑 盒至少包含一種打開的帶有標(biāo)記的配位體，所述配位體能夠特異 性的結(jié)合抗血型抗原抗體。例如，所述配位體是一種抗體或其片 段，例如，F(xiàn)ab、 Fab-和F(ab-)2片段。"特異性結(jié)合"或者"與… 發(fā)生免疫反應(yīng)"是指所述抗體與一個(gè)或一個(gè)以上期望抗原的抗原 決定簇反應(yīng)，且不與其他多肽反應(yīng)(即，結(jié)合)或者與其他的多 肽以很低的親合力(Kd>10 6)結(jié)合。所述抗體是單1^介抗體。所述標(biāo)記物可以是任一f可一種用于促進(jìn)輩巴分子識別和/或定量 的物質(zhì)。標(biāo)i己物既可以;波直4妻，見察或測量，又可以^皮間^妄i也只見察 或測量。標(biāo)記物包括但不僅限于，可以使用放射計(jì)數(shù)裝置測量的 ;改射性同位素；顏沖+、染沖?；蛘咂渌梢?見覺7見察到或用分光光 度計(jì)測定的生色團(tuán)；可以通過自旋標(biāo)記物分析器測定的自旋標(biāo)記 物；和熒光基團(tuán)，其中適當(dāng)?shù)姆肿蛹雍衔锏募ぐl(fā)作用能夠產(chǎn)生輸 出信號，且可以通過^皮染料吸收的燈的激發(fā)作用顯象，或者可以 4吏用例如標(biāo)準(zhǔn)熒光測定計(jì)或成^f象系統(tǒng)測定。所述標(biāo)i己物可以是一 種發(fā)光物質(zhì)，例如，是磷光體或熒光團(tuán)； 一種生物發(fā)光物質(zhì)；一 種化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，其中，通過信號化合物的化學(xué)修飾產(chǎn)生輸出信號； 一種包含金屬的物質(zhì)；或者一種酶，其中，這里存在一種酶 依賴型的第二代信號，例如從無色的底物中形成的帶有顏色的產(chǎn)一種惰性顆粒，包括但不僅限于膠體金、微球體、量子點(diǎn)、或無 才幾晶體，所述無才幾晶體例如納米晶體或-粦光體(參見，例如，Beverloo, et ah, Anal. Biochem. 203, 326 - 34 ( 1992))。術(shù)語"標(biāo)記 物"還可以^皮稱作"標(biāo)記"或可以有選擇地結(jié)合標(biāo)記分子的半抗原， 從而隨后加入的標(biāo)記分子可以被用于產(chǎn)生可4全測信號。舉例來 i兌， 一方面可以4吏用生物素、亞氨生物素或脫好u生物素4乍為標(biāo)i己， 隨后使用一種抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素與辣根過氧化酶(HRP)的結(jié)合物與標(biāo)記相連，隨后，使用一種顯色底物(例如， 四甲基對二氨基聯(lián)苯)或 一 種熒光底物來檢測辣根過氧化酶(HRP)的存在，其中，焚光底物例3口 Amplex纟工或Amplex金 黃(Molecular Probes />司)。相似地，所述標(biāo)i己可以是一種半 抗原或抗原(例如，異羥洋地黃毒香配基)，且一種酶催化的、 熒光的或》文射性標(biāo)記的抗體可用于與標(biāo)記物結(jié)合。i午多標(biāo)"i己物對 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的，這些標(biāo)記物包括，但不僅限于， 顆粒、熒光染料、半抗原、酶及其產(chǎn)色底物、熒光底物和化學(xué)發(fā) 光底物，其他的標(biāo)記物描述在Richard P.Haugland編輯的《熒光 探針的分子探針手冊和化學(xué)試劑研究》第6版(1996)中，和隨 后的分別在1999年十一月和2001年五月出片反CDX反的第7和第 8版本，其內(nèi)容和其他的出版物通過引證在此全部并入本文。熒光團(tuán)可以是4壬<可一種能夠在280納米之上顯示出最大吸收 的化學(xué)基團(tuán)，且當(dāng)共價(jià)附著于標(biāo)記試劑上時(shí)，能夠保持其光譜性 質(zhì)。熒光團(tuán)包括，但不僅限于一種嵌二萘(包括美國專利第 5,132,432號7>開的<壬<可一種相應(yīng)的書亍生化合物)、 一種蒽、 一種萘、 一種吖啶、1-2-二苯乙烯、吲哚或者苯并吲哚、惡唑或者苯 并惡唑、p塞唑或者苯并p塞唑、4國氨基-7-硝基苯并畫2畫氧雜-1,3國二唑(NBD)、 一種花青素戒(包括美國系列號09 / 968,401和 09 /969,853所7^開的^f壬-f可一種相應(yīng)^f匕合物)、 一種,炭花青(包括 美國系歹'J號09 / 557,275; 09 / 969,853禾口 09 / 968,401;美國專矛J 第4，981，977號；第5,268,486號；第5,569,587號；第5,569,766 號；第5,486,616號；第5,627,027號；第5,808,044號；第 5,877,310號；第6,002,003號；第6,004,536號；第6,008,373號； 第6,043,025號；第6,127,134號；第6， 130,094號；第6,133,445 號；和公開號WO 02 /26891、 WO 97/40104、 WO 99 /51702、 WO 01 / 21624; EP 1 065 250 Al中聲斤4笛述的4壬4可一種才目應(yīng)4匕合 物)、 一種carboslyryl、 一種卟啉、 一種鄰羥基苯曱酸鹽、 一種 氨基苯曱酸鹽、 一種甘菊環(huán)烴、 一種二萘嵌苯、 一種吡啶、 一種喹啉、 一種硼化聚氮雜吲丹烯(包括美國專利第4，774，339號； 第5,187,288號；第5,248,782號；第5,274,1 13號；和第5,433,896 號中公開的任何一種相應(yīng)化合物)、 一種夾氧雜蒽(包括在美國 專矛J第6, 162,931號；第6,130,101號5第6，229，055號^第 6,339,392號；第5,451,343號和美國系歹'J號09 / 922,333中公開 的任何一種相應(yīng)化合物)、一種噁、秦(包括在美國專利第4,714,763 號中/>開的任何一種相應(yīng)化合物)或者一種苯并惡。秦、 一種卡巴 。秦包括在美國專利第4,810,636號中公開的任何一種相應(yīng)化合 物)、 一種次聯(lián)苯曱酮、 一種香豆素(包括在美國專利第5,696,157 號；第5,459,276號；第5,501,980號和第5,830,912號中公開的 相應(yīng)化合物)、 一種苯并吹喃包括在美國專利第4,603,209號和 第4,849,362號中公開的相應(yīng)化合物)和苯并次聯(lián)苯甲酮(包括 在美國專利第4，812，409號中公開的任何一種相應(yīng)化合物)及其 衍生物。如這里使用的，噁。秦包括9-羥基-3-異吩惡唑酮(包括 在專利5,242,805號中公開的任何相應(yīng)化合物)、氨基。秦酮、二 氨基嗪及其與苯有關(guān)的取代的類似物。任選的，所述試劑盒包含陽性參照或陰性參照或者兩種都包括、用于4吏用該試劑盒的說明書(例如，書面記載的、,茲帶錄制的、VCR形式、CD-ROM形式等等)、樣品收集途徑。才羊品收 集途徑對本領(lǐng)域:技術(shù)人員來將是已知的。例如，才羊品收集途徑是 一種CPT真空采才羊管。所述試劑^皮包裝在單獨(dú)的容器中，例如，ABO血型低聚4唐或 者ABO血型融合蛋白質(zhì)(或者與固體基質(zhì)結(jié)合或者分別與用于 將他們結(jié)合在基質(zhì)上的試劑包裝在一起)、 一種對照試劑(陽性 和/或陰性的對照試劑)、和/或一種標(biāo)記的配位體。治療或預(yù)防抗體調(diào)節(jié)的移植排異的方法治療或者預(yù)防抗體調(diào)節(jié)的移4直排異(AMR),例如，器官移 才直的方法同樣包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這種移才直包括〃f旦不^又限于 腎移植、肝移植、皮膚移植、胰腺移植、角膜移植或者心臟移植。 抗體調(diào)節(jié)的移植排異AMR包括受贈者產(chǎn)生的任何一種抗體調(diào)節(jié) 的移植排斥。所述方法包括將來自主體的生物樣品與本發(fā)明的 ABO血型低聚糖或者ABO血型融合肽相接觸。所述生物樣品是， 例如血液，即，全血或者血漿。該樣品已知包括一種抗體，或者 懷4是包^"一種抗體，例如， 一種抗血型抗體。在某些方面，所述 生物樣品在與ABO血型低聚糖或者ABO血型融合多肽接觸之前 從主體體內(nèi)取出。在允許ABO血型低聚糖或者ABO血型融合肽 -抗血型抗體復(fù)合物形成的條件下將ABO血型低聚糖或者ABO 血型融合肽與生物樣品相接觸。如果存在的話，所述ABO血型 低聚糖或者ABO血型融合肽-復(fù)合物從生物樣品中分離出來，從 而除去抗血型抗體并將生物樣品重新融入主體體內(nèi)?？贵w調(diào)節(jié)的移植排異(AMR)還可以通過向主體給藥本發(fā)明 的ABO血型融合多肽進(jìn)行治療或預(yù)防。所述主體可以是例如，任何一種哺乳動(dòng)物，例如，人、靈長 類動(dòng)物、老鼠、鼠、狗、貓、母牛、馬、豬。所述治療在患者4妻受ABO血型不相容的移植之前給藥。做為選擇，述治療在患者接 受ABO血型不相容的移才直之后給藥。將所述生物樣品和ABO血型低聚糖或者ABO血型融合蛋白 質(zhì)通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法相4妻觸。例如，血漿除去法或者體外 免疫吸收法?；旧?，4壬<可一種病因上與抗體調(diào)節(jié)的反應(yīng)有關(guān)的病癥都可 以-故預(yù)防或者治療。器官移才直的存活率大于未通過本發(fā)明方法治 療的器官移植的存活率時(shí)，抗體調(diào)節(jié)的移植排異(AMR)被有效 的治療或預(yù)防了 。移植的存活率是指移植被受贈者排斥之前的時(shí) 間。例如，當(dāng)移植存活至少1星期、2星期、4星期或者8星期 之后進(jìn)行抗體調(diào)節(jié)的移植排異(AMR )的治療或者預(yù)防。優(yōu)選的， 移植存活時(shí)間為3個(gè)月、6個(gè)月、13個(gè)月。更優(yōu)選的，移植存活 2年、3年、5年或更多年。從樣品中除去抗血型抗體的方法本發(fā)明還包括乂人才羊品中除去或者減少抗血型抗體的方法。所 述樣品是一種生物液體，例如，血液或者血漿。樣品是一種生物 組織，例如心臟組織、肝組織、皮膚、或者腎組織。本方法包括 將樣品與本發(fā)明的ABO血型低聚糖或者ABO血型融合肽相接觸。 在允許ABO血型低聚糖或者ABO血型融合肽-抗血型抗體復(fù)合物品相接觸。所述ABO血型融合肽抗體復(fù)合物如果存在的話，則從 生物才羊品中分離，/人而除去或者減少抗血型抗體。本方法可以有效地用于生產(chǎn)萬能供血者血漿,血型鑒定方法本發(fā)明還包括主體血型測定的方法。通過將取自主體的才羊 品，例如，血漿或者全血與不同子類型的微磁珠相接觸。每種子 類型包含不同的血型抗原。所述血型抗原在不同的核心#唐4匕物鏈 類型上表達(dá)。所述微磁珠和樣品相互接觸，例如， 一起培養(yǎng)足夠 長的時(shí)間，從而允許存在于樣品中的抗血型抗體結(jié)合，例如，形 成一種血型抗原抗體復(fù)合物，/人而將血型抗原捆綁在孩"茲^朱上。在復(fù)合物形成之后，任選地將4羊品洗滌一次或 一次以上乂人而 除去非結(jié)合的血漿成分。做為選擇，非結(jié)合的血漿成分通過進(jìn)行 分離步驟從微磁珠上除去，在分離步驟中，微磁珠從樣品中除去。 4吏用本領(lǐng)域普通4支術(shù)人員已知的方法進(jìn)行分離，所屬本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員已知的方法例如，離心作用。所述孩"茲珠進(jìn)一步地與一 種標(biāo)記試劑相接觸，該標(biāo)記試劑能夠特異性結(jié)合與微》茲珠相連的 抗血型抗體。任選地將孩L磁珠洗滌一次或 一次以上從而除去非結(jié) 合的標(biāo)記試劑。隨后通過測定標(biāo)記試劑確定樣品中是否存在抗血 型抗體。4吏用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行4企測，例如，通過;危式細(xì)月包"i十或者luminex液態(tài)芯片方、;去。本發(fā)明還提供了用于才企測才羊品中多^f咅抗血型抗體的方法。多 倍抗血型抗體不只意p未著對每種血型(即，ABH)具有特異性的 抗體，還指對不同的低聚糖核心鏈型的血型抗原具有特異性的抗 體。通過將生物樣品與額外的4企測試劑相接觸來識別不同的靶分 子，隨后〗吏用如上所述的方法，將生物樣品與額外的標(biāo)記試劑相 4妻觸，所述額外的標(biāo)記試劑對額外的^r測試劑具有特異性。例如， 用不同的血型抗原制備孩^U茲珠的子集，例如， -使用具有不同核心 低聚糖鏈類型的血型抗原。然后將所述微磁珠子集加入到包含控 制比例的生物;洋品中。在作為替換的方法中，用不同的標(biāo)記物，例如具有不同發(fā)射 光譜的熒光團(tuán)制備標(biāo)記試劑子集，例如， 一種發(fā)出綠色光譜，另 一種發(fā)出紅色光譜。然后將所述標(biāo)記試劑子集加入到包含控制比 例的4全測試劑-輩巴分子復(fù)合物的生物樣品中，例如，每〗分輩巴分子 結(jié)合抗體中包括兩份一種標(biāo)記試劑(例如，發(fā)出綠色光譜的)和 一份另一種標(biāo)記試劑(例如，發(fā)出紅色光譜的)。這樣，所述免 疫標(biāo)記的復(fù)合物可以用于才企測輩巴分子。如果向沖羊品中加入另一種 免疫標(biāo)記的復(fù)合物，則原始靶分子與隨后4企測出的靶分子是不同 的。任選的，在樣品中4全測出2, 3, 4, 5, 6, 7， 8, 9, IO或更多種血型抗原。所述樣品包括任何一種能夠包含血型抗原的材料。 一般地， 所述々羊品是全血、血清或者血漿。本發(fā)明方法在現(xiàn)有血型測定技術(shù)的基礎(chǔ)上纟是供了 一種重要 的優(yōu)點(diǎn)。具體而言，該方法允許血型抗原子類型的4企測。此外， 本方法允許樣品中不同的血型抗原子類型的檢測。所述檢測試劑是一種化合物，該化合物能夠特異性的結(jié)合與 微磁珠相連的血型抗體。根據(jù)希望的靶分子選擇所述檢測試劑。 該才全測試劑是，例如， 一種多肽，例如一種耙向特異性抗體或者 其片段。如這里使用的，術(shù)語"抗體"是指免疫球蛋白分子和具有 免疫活性部分的免疫球蛋白(Ig)分子，那就是說，包含抗原結(jié) 合部位的分子，所述抗原結(jié)合部位特異性的結(jié)合抗原(與抗原發(fā) 生免疫反應(yīng))。這種抗體包括多克隆的、單克隆的、嵌合的、單 鏈、Fab、 Fab'和F (ab')2片革殳，和一種Fab表達(dá)文庫。"4爭異性 結(jié)合"或者"與。。。發(fā)生免疫反應(yīng)"是指抗體與一個(gè)或一個(gè)以上期 望抗原的抗原決定簇發(fā)生反應(yīng)而且不與其他多肽發(fā)生反應(yīng)(即，結(jié)合)或者與其他的多肽以低得多的親合力(Kd〉 10"結(jié)合。常，單克隆抗體比多克隆抗體更壽l感的且更具有特異性，多克隆 抗體依賴于產(chǎn)生所述抗體的動(dòng)物的壽命，與此不同，單克隆抗體 的供應(yīng)是不確定的。然而，當(dāng)必須4吏用具有多倍同種型的抗體時(shí)， 多克隆抗體是有效的，最常見的單克隆抗體是IgG亞類。如這里使用的，術(shù)語"免疫結(jié)合"和"免疫結(jié)合性質(zhì)"是指免疫 球蛋白分子和與此免疫球蛋白具有特異性的抗原之間存在的非 共1^介相互作用類型。免疫結(jié)合相互作用的強(qiáng)度或者親合力可以用 相互作用術(shù)語"電離常數(shù)(Kd )"表示，其中較小的電離常數(shù)(Kd ) 代表較大的親合力。使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法確定所選4奪多肽的 免疫結(jié)合性質(zhì)。 一種方法需要測量抗原結(jié)合簇/抗原復(fù)合物形成 和分解的速率，其中所述速率取決于復(fù)合物成分的濃度，相互作用的親合力和幾何參凄t同樣影響形成和分離速率。因此，"連4妄 速率常數(shù)"(Kon)和"解離速率常數(shù)"(KOff)可以通過計(jì)算濃度 和結(jié)合以及分離的實(shí)際速率計(jì)算確定。(參見1993年發(fā)表在 Nature (《自然》)上361:186 - 87頁的文獻(xiàn))。Koff/Kon的比 率能夠消除所有與親合力無關(guān)的參數(shù)，因此等于電離常數(shù)IQ (通 常參見Davies等人1990年發(fā)表在Annual Rev Biochem 59:439 -473頁的文獻(xiàn))。通過下面非限制性的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步"i兌明實(shí)施例1.表達(dá)載體的構(gòu)建修飾傳送P -選凝素糖蛋白配位體-1 /老鼠IgG2b ( PSGL - 1 / mIgG2b)互補(bǔ)DNA的表達(dá)載體4吏之包含一種腸激酶(EK)分裂位點(diǎn)。該位點(diǎn)在下游分離老鼠IgG2b部分時(shí)會Y吏用到。所述人血型A基因用聚合酶連鎖反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，以總RNA中制得的 互補(bǔ)DNA為基礎(chǔ)，所述總RNA乂人MKN - 45細(xì)胞株中分離出來， 且血型B基因進(jìn)行聚合酶連鎖反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，以總RNA中 制得的互補(bǔ)DNA為基礎(chǔ)，所述總RNA 乂人HuTu80細(xì)月包才朱中分離 出來。用于產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子的表達(dá)載體是雙向作用的，參見示意 圖。所述PSGL - 1 / mlgG2b表達(dá)載體具有聚合物連4妄劑的EFla 促進(jìn)劑上游、 一種拼接捐獻(xiàn)位點(diǎn)和受體位點(diǎn)、和SV40的雙向作 用聚(A)附加信號。相反，在轉(zhuǎn)錄方向，使用相反方向的聚(A) 信號，該第二轉(zhuǎn)錄單元由HSVTK促進(jìn)劑組成，隨后是編碼嘌P令 霉素轉(zhuǎn)乙酰酶(PAC)的序列。相似地，所述(31，6GIcNAcT (核 心2酶)表達(dá)載體包含EFkx促進(jìn)劑和編碼新鏈絲菌素抗性基因(Neo)的序列。所述FUT2 ( Se-基因)表達(dá)載體包含相同載體 骨架，但是具有CMV促進(jìn)劑和新鏈絲菌素抗性基因。GaINAcT(A-基因)和GaIT ( B-基因)表達(dá)載體包含CMV促進(jìn)劑和 blasictidin抗性基因(Bsd) ， FUT1 ( H-基因)和卩l(xiāng),3GlcNAcT6(核心3酶)包含CMV促進(jìn)劑和zeocin抗性基因，GaITS表達(dá) 載體包含CMV促進(jìn)劑和鳥嘌呤核苷轉(zhuǎn)^粦酸核糖基酶基因(GPT)。通過自動(dòng)測序方法測定表達(dá)載體的DNA序列。實(shí)施例2.使用蛋白印跡和間接免疫熒光法測定PSGL- 1 /MIGG2B的表達(dá)4吏用十二烷基石黃酸鈉聚丙烯酰胺凝月交電泳和蛋白印跡方法 測定PSGL畫1 / mlgG2b在細(xì)月包:t咅養(yǎng)上清液中的表達(dá)。所述才羊品在 MES緩沖液(購于Invitrogen公司)中穿過4 - 12%濃度梯度的 凝膠柱(購于Invitrogen公司)，且將分離的蛋白質(zhì)電泳滲透在 硝化纖維薄膜(購于Invitrogen公司)上。在含有3%牛血清白蛋 白(BSA) 、 0.2%吐溫20的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中結(jié)合1小時(shí)，隨后，該薄膜在室溫下用在封閉緩沖液按1:4.000的比例 稀釋后的過氧化物酶-結(jié)合的山羊抗老鼠IgG Fc抗體(購于Sigma 公司)進(jìn)行探針試驗(yàn)。之后用包含0.2%吐溫20的磷酸緩沖液洗 滌薄膜三次，按照廠家的"i兌明書，通過使用ECL試劑盒(購于 Amerham生物科學(xué)/^司)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光對結(jié)合的抗體顯象。通過間接免疫熒光確定PSGL - 1 / mlgG2b的細(xì)胞定位。按照 廠家i兌明書用PSGL - 1 / mlgGib表達(dá)載體脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 (購于Invitrogen7^司)瞬時(shí)4爭染4妄種在六孑l^反蓋3皮片上的 CHO-Kl細(xì)胞。轉(zhuǎn)染四十八小時(shí)工作的后，用石粦酸緩沖液洗滌細(xì) 胞并固定在30%丙酮/甲醇中。在含有1% BSA的磷酸緩沖液中 封閉30分鐘之后，使用在封閉緩沖液中按1:200的比例稀釋的 FITC -結(jié)合的山羊抗老鼠IgG Fc抗體(購自Sigma^^司)測定PSGL -1/mlgG2b蛋白質(zhì)。用4，6 -二脒基2畫苯基吲哚(DAPI)對細(xì)胞核 進(jìn)行染色。用Vectashield固定介質(zhì)(載體實(shí)驗(yàn)室)將蓋玻片固定 在滑片上。用DMRXA顯微鏡(Leica公司)檢驗(yàn)該滑片，并用 Hamamatsu C4880 - 40 CCD攝像機(jī)(Hamamatsu Photonics Norden AB ) Openlab程序包(Improvision )和Adobe Photoshop軟件(參 見附圖)進(jìn)行數(shù)字成像。實(shí)施例3 : CHO -細(xì)胞對不含血清的培養(yǎng)基的適應(yīng)性根據(jù)廠家i兌明書CHO畫Kl細(xì)胞株(ATCC CCL畫61 )適合于 不含血清的培養(yǎng)基，Ex-細(xì)胞302 (購自JHR生物科學(xué)公司)。實(shí)施例4: DNA4爭染和克隆篩選適合于不含血清的培養(yǎng)基的CHO - Kl纟田胞接種到75平方厘 米的燒并瓦中并用脂質(zhì)體Lipofectamine 200 CD (購自Invitrogen />司)和一種不含有動(dòng)物源物質(zhì)的制劑，^換照廠家的i兌明書^f吏用PSGL - 1 / mlgG2b表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染之后四十八小時(shí)，細(xì)胞凈皮 培養(yǎng)在包含嘌呤霉素的選擇培養(yǎng)基中(6微克/毫升)。選擇的培 養(yǎng)基每三天改變一次。大約2星期之后，按照廠家說明書，使用 死亡細(xì)月包除去孩t,茲珠(Miltenyi生物技術(shù))除去死亡細(xì)J包。在96 孔壽反中對活細(xì)月包進(jìn)4亍單細(xì)月包克隆，并延伸進(jìn)選擇i咅養(yǎng)基中大約2 周。收集細(xì)胞^咅養(yǎng)上清液，Y吏用一種山羊抗老鼠IgG Fc抗體 (Sigma公司)通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)估價(jià)hPSGL - 1 / mlgG2b的濃度，方案如下所示。選擇具有最高h(yuǎn)PSGL - 1 / mIgG2b 表達(dá)的細(xì)胞克隆體進(jìn)4于進(jìn)一步擴(kuò)展。實(shí)施例5:使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA )定量評價(jià)PSGL -1 /MIGG2B在上清液中的濃度將細(xì)胞接種到25平方厘米的燒瓶中(1 lxl0"田胞/毫升)。 4天后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。用酶聯(lián)免疫吸附試-瞼(ELISA)評 定通過細(xì)胞克隆生產(chǎn)的PSGL - 1 / mlgG2b濃度。用濃度為10凝: 克/毫升的親合-凈化的山羊抗mlgG Fc抗體(Sigma公司)涂布 九十六孔酶聯(lián)免疫吸附試-驗(yàn)(ELISA )平板(Costar 3590, Corning 公司)2小時(shí)。用含有1。/。BSA的磷酸緩沖液封閉該平板2小時(shí)。 在封閉液中，包含PSGL - 1 / mIgG2b的上清液^皮逐次^希釋并祐:i咅 養(yǎng)2小時(shí)。隨后洗滌，將該平4反與在封閉緩沖液中按1:4.000的 比例稀釋后的過氧化物酶-結(jié)合的山羊抗老鼠IgG Fc抗體 (Sigma) —起培養(yǎng)2小時(shí)。用3，3'，5, 5'-四曱基對二氨基聯(lián)苯 二氫氯化物(Sigma公司)對連接上的過氧化物酶-結(jié)合的抗體顯 象。用2M的硫酸終止反應(yīng)，在自動(dòng)微板閱讀器(Bio-Tek儀器) 中在450納米下閱讀該平4反。4吏用經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)稀釋系列的純凈的 mlgG Fc片革爻(Sigma 乂>司)i十算PSGL國1 / mIgG2b ;農(nóng)度。選擇 具有最高產(chǎn)量的細(xì)胞克隆林(大約25微克/毫升)進(jìn)行進(jìn)一步轉(zhuǎn) 染，如下所述。實(shí)施例6:用血型A/B型3型抗原取代的PSGL- 1 / MIGG^的產(chǎn)生使用FUT2 (Se -基因)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染具有最高PSGL - 1 / mlgG2b表達(dá)量的穩(wěn)定CHO - Kl細(xì)胞抹，如上所述，并在包含G418 的培養(yǎng)基(400微克/毫升)中進(jìn)行選擇。用GaINAcT (A-基因) 或者GaIT ( B -基因)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染在PSGL - 1 / mlgG2b上具有 最高血型H型3型抗原相對lt目的細(xì)力包克隆4朱，并在包含 blasticidine的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇，乂人而產(chǎn)生一種細(xì)胞系，這種細(xì) 胞系能夠在PSGL -1 / mlgG2b上分別生產(chǎn)血型A和B型3型抗原 (參見轉(zhuǎn)染方案)。實(shí)施例7 :用血型A/B型2型抗原取代的PSGLr 1 / MIGG^的產(chǎn)生使用P1，6G1cNAcT1 (核心2酶)和FUT1 (H-基因)表達(dá)載體 轉(zhuǎn)染具有最高PSGL -1 / mlgG2b表達(dá)量的穩(wěn)定CHO - Kl細(xì)胞抹，并 在包含G418 ( 400微克/毫升)的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇。用al，3 GaINAcT ( A-基因)或者al,3GalT ( B-基因)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染在 PSGL - 1 / mlgG2b上具有最高血型H型2型抗原相對數(shù)目的細(xì)胞克 隆林，并在包含blasticidine的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇，從而產(chǎn)生一種 細(xì)胞系，這種細(xì)胞系能夠在PSGL - 1 / mlgG2b上分別生產(chǎn)血型A和 B型2型抗原(參見轉(zhuǎn)染方案)。實(shí)施例8:用血型A/B型1型抗原耳又代的PSGL - 1/MIGG^的產(chǎn)生用pi,3GIcNAcT(核心3酶)和GalT5表達(dá)載體轉(zhuǎn)染在PSGL -1 / mlgG2b上具有最高血型H型3型抗原相對數(shù)目的細(xì)胞克隆 林，并在包含zeocin的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇。用al，3GalNAcT ( A畫基因)或者ccl,3GalT ( B -基因)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染在PSGL - 1 / mlgG2b上具有最高血型H型1型抗原相對數(shù)目的克隆抹，并在 包含blasticidine的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇，從而產(chǎn)生一種細(xì)胞系，這 種細(xì)l包系能夠在PSGL-l/mlgG2b上分別生產(chǎn)血型A和B型1型 抗原(參見轉(zhuǎn)染方案)。實(shí)施例9:重組HPSGL - 1 / EK / M GG^的純化通過離心作用除去細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并通過包含山羊抗老鼠 IgG (整體分子)瓊脂糖柱(Sigma公司)。用磷酸緩沖液洗滌 之后，用3M NaSCN洗4是結(jié)合的hPSGL - 1 / EK / mIgG2b，并用 蒸餾水透析。為了除去低分子量污染物，進(jìn)一步通過凝膠過濾法 在HiPrep 16/60 Sephacryl S - 200 HR 4主(Amersham生物^牛學(xué)) 上純化hPSGL - 1 / EK / mIgG2b。與瓊脂糖凝膠和柱填充物的共價(jià)偶聯(lián)4吏用標(biāo)準(zhǔn)生物結(jié)合化學(xué)作用蔣純化的血型A和B粘蛋白共 <介 的與瓊脂糖快速流動(dòng)的磁珠連在一起。連接之后，瓊脂糖凝膠被包裝在塑料容器中形成實(shí)際的色譜柱。 測試原型柱的吸附效力和生物適合't"生通過標(biāo)準(zhǔn)血庫技術(shù)，包括血球凝集作用和間接的抗球蛋白試 驗(yàn)評定集中控制的血型O血漿吸附之前和之后的抗血型ABO抗體 滴定度。通過標(biāo)準(zhǔn)基數(shù)測定血漿蛋白，所述血漿蛋白包括免疫球 蛋白(IgG、 IgM和IgA)、互補(bǔ)因子/片段(C3、 C3a、 C3d、 C4 和sC5b-9)、免疫復(fù)合物、和;疑血因子(FVIII、法是血酶原、纖 維蛋白原、纖維蛋白降解產(chǎn)物)。使用重組粘蛋白攜帶的在確定 的核心糖化物鏈上的血型A/B型抗原通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA),或者通過薄色層分離法為基礎(chǔ)的覆蓋試驗(yàn)測定^皮吸 附和洗提的ABO抗體、以及未吸附的ABO抗體的專一'1"生，其中薄 色層分離法為基礎(chǔ)的覆蓋試-瞼中使用純化的且結(jié)構(gòu)確定的血型A 和B糖月旨。實(shí)施例10:用于確定抗體滴度的不同的大小和顏色的》茲^朱的德、國羅斯4乇克的micromod Partikeltechnologie有卩艮^>司生產(chǎn) 了不同大小和顏色的,茲珠，并能結(jié)合不同類型的血型抗原。通過 流式細(xì)月包計(jì)分片斤,茲珠，該》茲^朱在大'J 、且顏色方面都顯示出良好的 分辨率(參見圖5)。使用這個(gè)方法，使使用多種磁珠的混合物 稱為可能，結(jié)合的》茲珠具有不同的大小-顏色強(qiáng)度組合，代表其 特異性核心組織上表達(dá)一種特異性血型抗原。實(shí)施例ll:血型^t體的^r測在含有0.5%人白蛋白的磷酸緩沖液中按1:10的比例稀釋血 清樣品，并與攜帶血型抗原低聚糖的橡膠孩"茲珠(4.6孩t米；18 微克干重)混合。血清和孩W茲珠在室溫下培養(yǎng)30分鐘，并用0.5% HAS / PBS洗滌。向洗滌后的孩U茲珠中加入FITC標(biāo)記的抗人IgM 和PE標(biāo)記的IgG，并用流式細(xì)胞計(jì)分析。參考文獻(xiàn)1) L Rydberg Transfus Med 2001;11:325-3422) Kl Welsh, M van Dam, CG Koffman Transplant Proc 1987; 19:4565-4567 3) K Tanabe, K Takahashi, T Agislii, H Toma， K Ota Transfus Sci 1996; 17: 455-4624) K Takahashi Acomodatioii in ABO-incompatible kidney transplantation: Elsevier, Amsterdam; 2004.5) MD Stegall, PG Dean, JM Gloor Transplantation 2004; 78: 635-6406) CJ 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G Tyden, G Kumlien, H Genberg, J Sandberg,T Lundgren,I Fehrman Am J Transplant. 2005; S: 145-8.其J也的實(shí)施方案盡管本發(fā)明已經(jīng)連同其詳細(xì)的說明書進(jìn)行了介紹，但是前面 的說明只起到解釋的效果，并不限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范 圍由所附權(quán)利要求書的范圍定義。其他的方面、優(yōu)點(diǎn)和改進(jìn)也包 括在下述外又利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種組合物，包括至少兩種血型抗原，其中，每種血型抗原表達(dá)在不同的核心糖化物鏈類型上。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，型4元原、B型^L原或H型纟元原。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物， 體支持物相連。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物， 是1型、2型、3型或者4型。其中所述血型抗原是一種A其中所述血型抗原與 一種固 其中所述核心糖化物《連類型
5. —種吸收劑，包括權(quán)利要求3所述的組合物。
6. —種測定主體血清中血型反應(yīng)性抗體存在的方法，所述方法 包括a)提供不同子類型的微磁珠，其中每種子類型用不 同的血型抗原涂布，b)向凝J茲珠中加入所述來自主體的血 清；C)培養(yǎng)所述血清和微磁珠足夠長的時(shí)間，使血清中的 抗血型抗體與所屬血型抗原相結(jié)合；d)與至少一種能夠特 異性結(jié)合所述抗血型抗體的標(biāo)記配位體培養(yǎng)，所述抗血型抗 體結(jié)合有所述血型抗原；和e) 4企測結(jié)合所屬抗血型抗體的 標(biāo)記配位體的存在，乂人而確定所述反應(yīng)性抗體是存在還是不 存在。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述血型抗原由不同的核 心糖化物鏈類型所攜帶。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述才全測時(shí)通過流式細(xì)胞 i十或luminex液態(tài)芯片蛋白分才斤系纟克。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述微磁珠中包括8種不 同的血型A/B #元原。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中微磁珠是乳膠制成的。
11. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中由于選擇了不同的直徑或 不同的顏色，至少 一種血型抗原子類型的孩^U茲5朱與至少 一種 另外的血型子類型的樣U茲多朱不同。
12. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中由于用不同的標(biāo)記物進(jìn)行 了標(biāo)記，至少 一種血型抗原子類型的樣U茲;朱與至少 一種另外 的血型子類型的凝J茲5朱不同。
13. 才艮寺居4又利要求11所述的方法，其中標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中微磁珠的直徑大約是5微米。
15. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中凝bf茲珠的直徑范圍在大約 2樣i米到大約15樣i米之間。
16. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，進(jìn)一步包括在進(jìn)行步驟(d) 之前除去所述血清成分的步驟，所述血清成分不特異性的結(jié) 合存在于所述微磁珠上的所述血型抗體。
17. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，進(jìn)一步包括在進(jìn)行步驟(e) 之前除去標(biāo)記的配位體的步驟，所述標(biāo)記的配位體不結(jié)合所 述抗血型抗體。
18. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述配位體是一種抗體或 其片段。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述抗體是一種一價(jià)抗 體片段。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述一價(jià)抗體片段是Fab 或者Fab，片l殳。
21. 才艮據(jù)4又利要求19所述的方法，其中所述Fab或者Fab，片賴二 選自由一種抗Fc抗體片^爻、 一種抗K輕鏈抗體片^殳、 一種 抗入輕鏈抗體片,殳和一種單一鏈抗體片,殳所組成的組中。
22. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中，所述鏈類型是l型前 體物、2型前體物或者3型前體物。
23. 不同子類型的微磁珠集合，其中每種子類型用不同的血型抗 原涂布。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的孩W茲珠集合，其中所述血型抗原由 不同的核心糖基化鏈類型攜帶。
25. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的微磁珠集合，其中所述血型抗原在 重組粘液素上表達(dá)。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的微磁珠集合，其中所述血型抗原表 達(dá)是多化合價(jià)的。
27. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物，其中所述核心糖化物鏈類 型是l型前體物、2型前體物或者3型前體物。
28. —種除去血清中血型反應(yīng)性抗體的方法，所述方法包4舌a) 提供具有不同子類型的微磁珠集合，其中每種子類型用不同 的血型抗原涂布，b)將所述微不茲珠與所述血清相接觸；c) 將所述微磁珠與血清一起培養(yǎng)足夠長的時(shí)間使血清中的抗 血型抗體與所述血型抗原相結(jié)合；d)將所述微磁珠與所述 血清相分離，因此從血清中除去所述反應(yīng)性抗體。
29. 才艮據(jù)4又利要求28所述的方法，其中所述血型抗原在不同的 核心糖化物鏈類型上表達(dá)。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述核心糖化物鏈類型 是1型、2型、3型或者4型。
31. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述血型抗原表達(dá)在一 種重纟且粘液素上。
32. 才艮據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述血型抗原表達(dá)是多 化合價(jià)的。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防抗體介導(dǎo)的移植排異和血液類型的組合物和方法。
文檔編號G01N33/58GK101405603SQ200780010334
公開日2009年4月8日 申請日期2007年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月23日
發(fā)明者J·劉, J·霍格爾森, L·布喬恩斯特羅姆, P·格魯夫曼 申請人:阿布桑伯Ab公司