專利名稱：人細(xì)胞膜抗原的保存方法及磁性粒子包被人細(xì)胞膜抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及細(xì)胞膜的保存方法。
背景技術(shù)：
對(duì)人體細(xì)胞膜抗原及其特異性抗體的研究和檢測(cè)是生物科學(xué)、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)研究和臨床檢測(cè)的最基本內(nèi)容之一。如對(duì)人體細(xì)胞膜HLA抗原、CD標(biāo)記物的研究是人類免疫學(xué)最基本的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究之一，對(duì)人ABO和Rh血型抗原和抗體檢測(cè)是臨床常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。一些人體細(xì)胞膜抗原的生物特征，如抗原性依賴于細(xì)胞的活性，往往細(xì)胞死亡，溶解，抗原性即消失，如紅細(xì)胞死亡，Rh血型抗原抗原性消失，人體內(nèi)也不存在可溶性Rh血型抗原。Rh血型抗原也不能被提純，因?yàn)樗鼈兪羌t細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)蛋白，脫離了細(xì)胞膜其抗原性也消失。因此，對(duì)Rh血型抗體的檢測(cè)，必須應(yīng)用有活力的紅細(xì)胞。對(duì)人ABO血型抗體的檢測(cè)，也稱之為ABO血型反定型，在全世界各國至今都是應(yīng)用新鮮紅細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)抗原，而新鮮紅細(xì)胞保存期很短，最長保存期3至6個(gè)月，而且在此期間，抗原性也遞減。保存紅細(xì)胞活性，即保持其抗原性，長期以來是生命科學(xué)、免疫學(xué)未能很好解決的問題，至今一些保存紅細(xì)胞方法，如低溫冷凍(在低溫冰箱和液氮中)，很難大量凍存，只能由此類方法保存的少量標(biāo)本，如對(duì)稀有紅細(xì)胞血型的紅細(xì)胞保存。細(xì)胞凍存時(shí)間愈長，其抗原性愈弱，愈易消失。凍干紅細(xì)胞與紅細(xì)胞液態(tài)低溫保存比較，理論上應(yīng)該是凍干紅細(xì)胞抗原性保持時(shí)間要長，即使有少數(shù)研究紅細(xì)胞凍干的報(bào)告文章，但至今還未能夠得到實(shí)際應(yīng)用。
由上所述，人體細(xì)胞膜抗原的抗原性長期保持的問題，以及對(duì)其有效應(yīng)用至今都未能解決。而這些問題表現(xiàn)為細(xì)胞膜抗原的抗原性依賴于細(xì)胞本身的活性，即存活的細(xì)胞有抗原性，死亡的細(xì)胞，細(xì)胞膜抗原性消失。至今最為常用的是低溫(冰箱和液氮)保存方式，也只是在一定時(shí)期內(nèi)，維持細(xì)胞膜的抗原性，僅適用于對(duì)少量特別珍貴的細(xì)胞標(biāo)本的保存。
技術(shù)內(nèi)容
本發(fā)明提供一種使細(xì)胞膜抗原在不依賴細(xì)胞的活性條件下，完整地保持其抗原性的人細(xì)胞膜抗原的保存方法及磁性粒子包被人細(xì)胞膜抗原。
本發(fā)明的具體過程是
一、紅細(xì)胞抗原的制備
①取新鮮紅細(xì)胞，離心去上清。取壓積紅細(xì)胞進(jìn)入下一步處理；
②在壓積紅細(xì)胞中加入SDS置于室溫狀態(tài)；
③然后進(jìn)行離心去上清，留沉淀物加入蒸餾水；
二、磁性粒子的制備
①金屬鹽的溶解，將FeCL2及FeCL3加入蒸餾水中進(jìn)行溶解；
②金屬鹽的水解，在劇烈攪拌的狀態(tài)下，將氫氧化鈉加入到上述金屬鹽溶液中，使其水解為金屬復(fù)合氧化物，也就是鐵顆粒溶液；
三、細(xì)胞膜抗原包被磁性粒子
將步驟一獲得的紅細(xì)胞膜抗原加入到步驟二獲得的鐵顆粒溶液中，再加入聚乙二醇，進(jìn)行孵育，離心后棄上清，留沉淀，再在沉淀物中加入低滲磷酸緩沖液，即得包被了磁性粒子的細(xì)胞膜抗原。
本發(fā)明由上述保存方法所獲得的包被了磁性粒子的細(xì)胞膜抗原。
本發(fā)明是使細(xì)胞膜抗原在不依賴細(xì)胞的活性條件下，完整地保持其抗原性，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是即應(yīng)用四氧化三鐵顆粒取代人體細(xì)胞膜內(nèi)容物，而保持細(xì)胞膜抗原的抗原性。包被細(xì)胞膜抗原的四氧化三鐵顆粒具有磁性，在磁場(chǎng)作用下，在反應(yīng)介質(zhì)中與相應(yīng)抗體發(fā)生了特異性免疫反應(yīng)的細(xì)胞膜抗原抗體復(fù)合物被分離出來，進(jìn)而可以通過免疫凝集反應(yīng)技術(shù)，或者通過免疫標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)(包括酶聯(lián)免疫分析技術(shù)、免疫熒光分析技術(shù)、同位素免疫分析技術(shù)、免疫發(fā)光技術(shù)等)，用肉眼或儀器設(shè)備進(jìn)行分析判斷細(xì)胞膜抗原和抗體免疫反應(yīng)。
本發(fā)明以磁性粒子改造活的人體細(xì)胞為無活性細(xì)胞，但保持了細(xì)胞膜抗原的抗原性。無限期保存的該磁性粒子具有原人體細(xì)胞膜抗原的抗原性，包括紅細(xì)胞、血小板、白細(xì)胞等人體細(xì)胞膜抗原。同時(shí)對(duì)于分離和分析液體介質(zhì)中顆粒性抗原抗體反應(yīng)比常規(guī)離心技術(shù)要簡單，易于操作和觀察結(jié)果，更有效率。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明具體過程是
一、紅細(xì)胞抗原的制備
①取新鮮紅細(xì)胞，離心去上清。取壓積紅細(xì)胞進(jìn)入下一步處理；
②在壓積紅細(xì)胞中加入SDS置于室溫狀態(tài)；
③然后進(jìn)行離心去上清，留沉淀物加入蒸餾水；
二、磁性粒子的制備
①金屬鹽的溶解，將FeCL2及FeCL3加入蒸餾水中進(jìn)行溶解；
②金屬鹽的水解，在劇烈攪拌的狀態(tài)下，將氫氧化鈉加入到上述金屬鹽溶液中，使其水解為金屬復(fù)合氧化物，也就是鐵顆粒溶液；
三、細(xì)胞膜抗原包被磁性粒子
將步驟一獲得的紅細(xì)胞膜抗原加入到步驟二獲得的鐵顆粒溶液中，再加入聚乙二醇，進(jìn)行孵育，離心后棄上清，留沉淀，再在沉淀物中加入低滲磷酸緩沖液，即得包被了磁性粒子的細(xì)胞膜抗原。
由上述保存方法所獲得的包被了磁性粒子的細(xì)胞膜抗原。
1.包被磁性粒子保存完整性紅細(xì)胞膜血型抗原
1.1.紅細(xì)胞膜抗原的制備
(1)取3人份人新鮮紅細(xì)胞，每人3ml，共9ml，離心3000轉(zhuǎn)/分鐘，去上清，取壓積紅細(xì)胞5ml，留樣0.5ml，將4.5ml進(jìn)入下步處理。
(2)壓積紅細(xì)胞中加入1％SDS40ml，置室溫30分鐘。
(3)離心，2000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘，去上清，留沉淀，加入10ml蒸餾水。
1.2.磁性粒子的制備
1.2.1金屬鹽的溶解
將適量的FeCL2及FeCL3加入上述蒸餾水中，溶解。
1.2.2.金屬鹽的水解
劇烈攪拌下，向上述金屬鹽溶液中加入適量的氫氧化鈉，使上述金屬鹽溶解水解為金屬復(fù)合氧化物。
1.3.細(xì)胞膜抗原包被磁性粒子
(1)將步驟1制備的紅細(xì)胞膜10ml中加入鐵顆粒溶液3ml。
(2)加入聚乙二醇(分子量4000，濃度50％)1ml。
(3)56℃孵育1小時(shí)。
(4)離心3000轉(zhuǎn)/分鐘，棄上清，留沉淀。
(5)沉淀中加入低滲磷酸緩沖液10ml，(PB PH7.4)。
(6)分裝上述溶液。
(7)凍干細(xì)胞膜包被的鐵顆粒。凍干后置4℃保存。
1.4.檢測(cè)包被磁性顆粒后保存紅細(xì)胞膜血型抗原的完整性。
材料1抗A、抗B、抗D、抗C、抗c、抗E、抗e單克隆血型抗體試劑。
材料21.1(1)步留下的新鮮紅細(xì)胞，做為對(duì)照。
材料3凍干的紅細(xì)胞膜包被的鐵顆粒。
材料4磷酸鹽緩沖液(0.15M，PH7.4)。
方法試管血凝試驗(yàn)
①應(yīng)用磷酸鹽緩沖液3ml將凍干的磁性顆粒紅細(xì)胞膜溶解。
②應(yīng)用磷酸鹽緩沖液將新鮮紅細(xì)胞配成2％濃度懸液。
③取抗A、抗B、抗D、抗C、抗c、抗E、抗e單克隆血型抗體試劑。
④以2％新鮮紅細(xì)胞懸液與抗A、抗B、抗D、抗C、抗c、抗E、抗e單克隆抗體反應(yīng)，作為對(duì)照。
⑤將磁性顆粒0.10ml分別與不同稀釋倍數(shù)的抗A、抗B、抗D、抗C、抗c、抗E、抗e單克隆抗體0.05ml滴入試管中。
⑥置室溫20分鐘，離心1000rpm/轉(zhuǎn)，觀察結(jié)果。
合格標(biāo)準(zhǔn)見下表
2.應(yīng)用
2.1、以96孔U型板凝集試驗(yàn)ABO血型為反定型為例說明其對(duì)完全抗體的檢測(cè)。。
(1)液體試劑直接使用；凍干試劑需復(fù)蘇1ml蒸餾水加入凍干磁性粒子粉劑中。
(2)取96孔U型板，每孔滴入50ul被檢血清(漿)。
(3)每孔加入相應(yīng)的磁性粒子各50ul。
(4)置磁力分離器上分離10-20秒。
(5)置震蕩器上震蕩1分鐘。
(6)肉眼觀察凝集，出現(xiàn)凝集孔為血清中含有磁珠上包被的細(xì)胞膜抗原相應(yīng)特異性抗體，為陽性反應(yīng)。未出現(xiàn)凝集的孔為血清中不含有相應(yīng)特異性抗體，為陰性反應(yīng)。
2.2、對(duì)血清(漿)標(biāo)本中不完全抗體的檢測(cè)，以檢測(cè)RhD血型抗-D抗體為例
(1)(2)(3)(4)(5)步同2.1。
(6)加入完全抗體性質(zhì)的抗-D(單克隆抗體)。
(7)震蕩出現(xiàn)凝集反應(yīng)為陰性反應(yīng)。未出現(xiàn)凝集反應(yīng)為陽性反應(yīng)。
試驗(yàn)記錄
分別取100微升A.Bcell+100微升3％磁粒混合 多數(shù)細(xì)胞未磁化，有完整細(xì)胞
分別取100微升A.Bcell+200微升3％磁?；旌? 多數(shù)細(xì)胞磁化，有完整細(xì)胞
分別取100微升A.Bcell+300微升3％磁?；旌? 多數(shù)細(xì)胞磁化，有完整細(xì)胞
將未磁化的細(xì)胞取出+100微升3％磁?！?xì)胞全部溶血。
將A、B磁化細(xì)胞分別合并，用鹽水洗滌1次，檢測(cè)。
檢測(cè)
1、A細(xì)胞倍化稀釋16倍、32倍、64倍、128倍、256倍、512倍
2、B細(xì)胞倍化稀釋16倍、32倍、64倍、128倍、256倍、512倍
注磁化的A、B細(xì)胞本身有凝集。
分別取譜細(xì)胞1、2、3、4、5、6、7、8種，各100毫升，分別加入300毫升3％磁粒，用生理鹽水洗2次。
用完全抗體檢測(cè)抗原特異性
lewis抗原性較弱，正常及磁化細(xì)胞未檢出。
反定型試劑的穩(wěn)定性
分別提取支A、B反定型試劑，于沸水浴中煮0.5h、1h、2h、2.5h后檢測(cè)其抗原性
檢測(cè)結(jié)果煮沸1h，A、B磁化細(xì)胞為正常磁化細(xì)胞抗原性無明顯差別，2h抗原性下降。
權(quán)利要求
1、一種磁性粒子包被人細(xì)胞膜抗原的保存方法，其具體過程是
一、紅細(xì)胞抗原的制備
①取新鮮紅細(xì)胞，離心去上清。取壓積紅細(xì)胞進(jìn)入下一步處理；
②在壓積紅細(xì)胞中加入SDS置于室溫狀態(tài)；
③然后進(jìn)行離心去上清，留沉淀物加入蒸餾水；
二、磁性粒子的制備
①金屬鹽的溶解，將FeCL2及FeCL3加入蒸餾水中進(jìn)行溶解；
②金屬鹽的水解，在劇烈攪拌的狀態(tài)下，將氫氧化鈉加入到上述金屬鹽溶液中，使其水解為金屬復(fù)合氧化物，也就是鐵顆粒溶液；
三、細(xì)胞膜抗原包被磁性粒子
將步驟一獲得的紅細(xì)胞膜抗原加入到步驟二獲得的鐵顆粒溶液中，再加入聚乙二醇，進(jìn)行孵育，離心后棄上清，留沉淀，再在沉淀物中加入低滲磷酸緩沖液，即得包被了磁性粒子的細(xì)胞膜抗原。
2、由權(quán)利要求1的保存方法所獲得的包被了磁性粒子的細(xì)胞膜抗原。
全文摘要
一種人細(xì)胞膜抗原的保存方法及磁性粒子包被人細(xì)胞膜抗原，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及細(xì)胞膜的保存方法。本發(fā)明提供一種使細(xì)胞膜抗原在不依賴細(xì)胞的活性條件下，完整地保持其抗原性的磁性粒子包被人細(xì)胞膜抗原及其保存方法。首先制備紅細(xì)胞抗原，再制備磁性粒子，最后將細(xì)胞膜抗原包被磁性粒子。本發(fā)明是使細(xì)胞膜抗原在不依賴細(xì)胞的活性條件下，完整地保持其抗原性。本發(fā)明以磁性粒子改造活的人體細(xì)胞為無活性細(xì)胞，但保持了細(xì)胞膜抗原的抗原性。無限期保存的該磁性粒子具有原人體細(xì)胞膜抗原的抗原性，包括紅細(xì)胞、血小板、白細(xì)胞等人體細(xì)胞膜抗原。同時(shí)對(duì)于分離和分析液體介質(zhì)中顆粒性抗原抗體反應(yīng)比常規(guī)離心技術(shù)要簡單，易于操作和觀察結(jié)果，更有效率。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1763102SQ20051001711
公開日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2005年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月9日
發(fā)明者李勇, 陳亞光, 童軍, 楊文沖, 劉慶海, 馬學(xué)嚴(yán), 林宏杰, 陳維佳, 孫育昌, 高大松, 蔡紅霞, 顧殿茹, 欒玉璽, 李劍波, 王文學(xué) 申請(qǐng)人:李勇