專利名稱：凝膠包被為基礎(chǔ)的微流控化學(xué)傳感陣列芯片及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程和分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及化學(xué)傳感陣列芯片。
背景技術(shù)：
近年來，把化學(xué)和生物傳感裝置集成到微流控芯片中作為檢測手段的研究得到很大發(fā)展，這些微流控的傳感裝置在遺傳分析、藥物篩選、食物檢疫和臨床分析等方面都有重要的應(yīng)用價值。由于高度集成和并行處理技術(shù)有利于微流控芯片裝置的微型化，大量的相似功能單元的并行工作可用于提高分析效率，實(shí)現(xiàn)高通量分析和篩選，因此，微流控芯片中的傳感陣列技術(shù)得到了越來越廣泛的重視。而微加工技術(shù)的快速發(fā)展是傳感陣列技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)的重要基礎(chǔ)，如微加工技術(shù)或者微加工儀器可以實(shí)現(xiàn)芯片上微結(jié)構(gòu)陣列的加工，在微型化裝置上集成成千上萬的敏感單位。目前，多步光刻技術(shù)和芯片點(diǎn)樣機(jī)已經(jīng)被廣泛用于傳感陣列的加工。但是，基于這些方法的微傳感陣列芯片仍然存在結(jié)構(gòu)和加工復(fù)雜，價格昂貴等缺點(diǎn)。因此，開發(fā)更簡單實(shí)用的微傳感陣列芯片及其加工技術(shù)仍然是當(dāng)務(wù)之急。
最近，有學(xué)者利用膠包被方法把熒光傳感器集成到微流控系統(tǒng)中，在微流環(huán)境中很好地保留了超分子化學(xué)傳感物質(zhì)的復(fù)雜信號傳輸機(jī)制。這種芯片采用光敏感的膠物質(zhì)，膠物質(zhì)本身需要和化學(xué)敏感物質(zhì)發(fā)生耦連作用，然后采用光刻的方法進(jìn)行微加工。由于膠物質(zhì)和敏感物質(zhì)之間的化學(xué)耦連只能在少數(shù)物質(zhì)之間發(fā)生，可應(yīng)用的范圍很窄。而且，傳統(tǒng)光刻方法成本較高，加工工藝復(fù)雜，這種通道內(nèi)集成的膠包被傳感單元通常都是單個存在，未見有傳感陣列的報道。利用微通道陣列和微通孔的微馬賽克方法則實(shí)現(xiàn)了芯片上的細(xì)胞陣列加工。該微陣列芯片芯片由四層結(jié)構(gòu)承載層，傳感陣列層，通孔層和流動通道陣列層由下到上依次疊加而成。在傳感陣列層中利用瓊脂糖凝膠包裹具有生物熒光的細(xì)胞系(表達(dá)螢火蟲熒光素酶的大腸桿菌)，然后注入微通道中，并在微通道和通孔層的通孔中凝固。流動通道陣列層中的每條通道正好流過不同的微通孔，在通道中注入熒光素/ATP混合物后，可以在通孔處檢測到熒光，每個通孔都是熒光檢測陣列的一個單元。這個系統(tǒng)集合了微流控技術(shù)和陣列芯片的優(yōu)點(diǎn)，適合于高通量分析和篩選。但是，這個芯片只用在了細(xì)胞中生物熒光的檢測上，未進(jìn)行更普遍的化學(xué)傳感檢測，在凝膠濃度等方面的要求較低。而且，該芯片中微通孔的存在，雖然減小了樣品擴(kuò)散帶來的影響，微米級的通孔和上下兩層微通道的對齊在加工工藝上有很大的難度，不利于推廣使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種凝膠包被為基礎(chǔ)的微流控化學(xué)傳感陣列芯片，是微馬賽克方法的進(jìn)一步發(fā)展。首先，通過選擇合適濃度的凝膠來實(shí)現(xiàn)化學(xué)傳感物質(zhì)的包被和固定，并利用兩層微通道陣列(膠陣列和流動通道陣列)的直接接觸來形成化學(xué)傳感單元陣列，排除了微馬賽克方法中微孔加工和對齊所帶來的不便。
本發(fā)明提出的凝膠包被為基礎(chǔ)的微流控化學(xué)傳感陣列芯片是由相互結(jié)合的三層組成，第I層為承載層，第II層為傳感陣列層，第III層為微流通道層；傳感陣列層上分布有微通道網(wǎng)絡(luò)，所有微通道都被包被有化學(xué)傳感物質(zhì)的凝膠充滿；微流通道層上也有微通道網(wǎng)絡(luò)，微通道暢通，用于樣品溶液流動，傳感陣列層和微芯片層上的微通道網(wǎng)絡(luò)相正交。
所述承載層的材料可采用玻璃、硅等硬質(zhì)材料。
所述傳感陣列層材料采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)、硅橡膠、聚氨酯等彈性橡膠材料。
所述微芯片層采用玻璃、石英、PDMS等常用透明芯片加工材料。
所述凝膠采用采用加熱等方法融化，與不同濃度化學(xué)傳感物質(zhì)混合后，按不同濃度依次埋填在微通道網(wǎng)絡(luò)的不同微通道中。
本發(fā)明還提出了上述凝膠包被為基礎(chǔ)的微流控化學(xué)傳感陣列芯片的制備方法，首先通過微加工方法在傳感陣列層基底材料上加工微通道網(wǎng)絡(luò)，將不同混合比例的凝膠與化學(xué)傳感物質(zhì)混合物融化后注入不同的微通道中，凝結(jié)后形成傳感陣列層；然后在該傳感陣列層上疊加另一個具有微通道網(wǎng)絡(luò)的微流通道層，疊加時保證傳感陣列層和微流通道層上的微通道網(wǎng)絡(luò)相正交；最后，將結(jié)合好的微流通道層和傳感陣列層再結(jié)合到承載層上，由此形成一個完整的微流控化學(xué)傳感陣列芯片。
本發(fā)明提出的化學(xué)傳感陣列芯片具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)采用非偶連的方法，實(shí)現(xiàn)了用凝膠直接包被化學(xué)傳感物質(zhì)。與化學(xué)偶連方法相比，操作簡單，應(yīng)用廣泛；(2)本發(fā)明的傳感物質(zhì)在凝膠中保持了很好的傳感特性；
(3)本發(fā)明取消了以前微馬賽克方法中的硅片和其中的微孔結(jié)構(gòu)，使上下兩層基片(即第II和第III層)的對齊變得非常容易，避免在加工過程中使用復(fù)雜的對齊平臺和裝置，降低了加工難度。
(4)可以在芯片上獲得更多的傳感單元(在2×2cm大小的芯片上可以加工上萬個傳感單元和復(fù)雜的傳感單元陣列分布)，大量不同的敏感物質(zhì)也可以被加工到同一個芯片上，在高通量分析和篩選方面有巨大的潛在應(yīng)用價值。


圖1是本微流控化學(xué)傳感陣列芯片的平面示意圖。
圖2是本微流控化學(xué)傳感陣列芯片的剖面示意圖。
圖3是微流控化學(xué)傳感陣列芯片的檢測裝置示意圖。
圖4是單一傳感單元傳感檢測時間響應(yīng)曲線。
圖5是傳感單元陣列熒光掃描結(jié)果。
圖6是其中傳感陣列層的制備工藝流程示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1參見圖1和圖2，微流控芯片由三層組成，第I層是承載層1，采用玻璃，第II層是傳感陣列層2，第III層為微流通道層3，兩層均采用PDMS制成。第II和III層2和3上有正交的微通道網(wǎng)絡(luò)4，一個用于膠的凝固，另一個用于樣品的流動。第II層的微通道網(wǎng)絡(luò)由十條平行的微流通道A-J組成，在與其它層結(jié)合前，微通道網(wǎng)絡(luò)中所有通道都被凝膠充滿。而第III層的微通道網(wǎng)絡(luò)由六條平行的微流通道K-P組成，它們在芯片結(jié)合好后與第II層2的微通道垂直相交。兩個相交的微通道網(wǎng)絡(luò)共有60個交叉點(diǎn)，也只有在這些特定的交叉點(diǎn)，填埋的凝膠才能和第III層3中流動的樣品溶液相接觸。由于凝膠完全充滿了第II層2的微通道，因此，第III層的溶液只能在上面的微通道網(wǎng)絡(luò)中流動而不能進(jìn)入膠填充的微通道網(wǎng)絡(luò)中。每個特定交叉點(diǎn)下方凝膠塊中的敏感物質(zhì)可以與溶液中的待測物質(zhì)作用而成為一個單獨(dú)的敏感單元。一系列不同濃度的Fluo-3/凝膠混合物被凝固在第II層2的微通道網(wǎng)絡(luò)的不同微通道中，從而形成一個與上層樣品溶液的流動方向一致的濃度梯度。其中，在微流通道A中Fluo-3濃度最低，在微流通道J中濃度最高。在第III層上鉆的12個通孔用做樣品流動的進(jìn)口5(靠近微流通道A)和出口6(靠近微流通道J)。芯片中的第I層1的玻璃主要起支撐作用。整個芯片的尺寸為20(長)×10(寬)×5(高)mm，通道的寬度和深度分別為100μm和30μm，相鄰?fù)ǖ赖拈g隔為300μm，所有進(jìn)口5和出口6小孔的直徑為2mm。
實(shí)施例2利用瓊脂糖凝膠包被Fluo-3傳感物質(zhì)檢測溶液的鈣離子濃度圖3是采用這一微流控芯片的檢測裝置的結(jié)構(gòu)示意圖，采用內(nèi)徑1mm的橡膠管與芯片進(jìn)口5和出口6連接，并用支架固定好。盛放于6個試劑瓶7中的樣品溶液在微流蠕動泵8的驅(qū)動下流過流動通道網(wǎng)絡(luò)中的不同通道。在各個交叉點(diǎn)位置，溶液中的鈣離子擴(kuò)散到下層的凝膠中，并與其中的Fluo-3分子發(fā)生反應(yīng)，在激光的照射下發(fā)出熒光。利用激光共聚焦顯微鏡9來檢測各個交叉點(diǎn)的熒光強(qiáng)度。
當(dāng)1μM的氯化鈣溶液流經(jīng)微流通道K的時候，監(jiān)測交叉點(diǎn)JK(標(biāo)記為J和K通道的交點(diǎn)，以下同)處的熒光強(qiáng)度。圖4表示熒光強(qiáng)度和時間的關(guān)系，插圖為JK點(diǎn)的熒光顯微照片。圖中的熒光強(qiáng)度值經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理，最大熒光強(qiáng)度值與背景熒光強(qiáng)度的差值定義為1。當(dāng)溶液流動約1分鐘后，可以在交叉點(diǎn)JK檢測到微弱的熒光。在隨后的幾秒鐘之內(nèi)，熒光強(qiáng)度很快從0增加到0.8，然后緩慢增加到達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)，此時熒光強(qiáng)度基本維持在最大，而鈣離子在膠里面的擴(kuò)散也基本達(dá)到平衡。然后，用三蒸水來替代氯化鈣溶液，會觀察到一個明顯的熒光下降過程。這個集成的傳感單元的響應(yīng)非?？?其它熒光單元的相應(yīng)曲線也基本類似)，從熒光出現(xiàn)到熒光強(qiáng)度基本穩(wěn)定的時間大概為1分鐘。由于在鈣離子溶液換為不含鈣離子的三蒸水后，鈣離子從凝膠內(nèi)部擴(kuò)散出來的速度比鈣離子溶液中鈣離子的向內(nèi)擴(kuò)散更加緩慢，因而恢復(fù)時間比響應(yīng)時間曲線坡度要緩很多。
4個不同濃度的氯化鈣溶液被加入不同的微通道中，溶液在1分鐘內(nèi)可以充滿第II層2中的所有通道。3分鐘后，用共聚焦顯微鏡掃描每個交叉點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，檢測結(jié)果在圖5中。對于中的任何一條微流通道，沿流動方向(A到J，圖中的箭頭方向)的一系列交叉點(diǎn)上所檢測到的熒光強(qiáng)度成梯度排列，這是因?yàn)樵谶@個方向排列的膠通道中所固定的熒光物質(zhì)具有同樣的濃度梯度。對于所有的流動通道來說，與膠通道J相交的交叉點(diǎn)上的熒光強(qiáng)度最高。對于給定的熒光物質(zhì)濃度，很明顯，高濃度溶液所發(fā)出的熒光強(qiáng)度也最高。在1μM氯化鈣溶液流經(jīng)的通道中，所有交叉點(diǎn)的熒光都可以被清楚地檢測到，而當(dāng)100nM氯化鈣溶液流經(jīng)通道時，在熒光物質(zhì)較低的膠通道的交叉點(diǎn)上難以檢測清晰的熒光。在芯片上的流動通道中，熒光強(qiáng)度梯度非常明顯，最小可檢測的鈣離子濃度與普通溶液中的檢測結(jié)果基本一致。因此，F(xiàn)luo-3對鈣離子的敏感性在微流的凝膠環(huán)境得到了很好的保留。
實(shí)施例3化學(xué)傳感陣列層的制備方法，參見圖6首先，利用光刻-濕蝕刻技術(shù)在硅片上加工目標(biāo)通道結(jié)構(gòu)的正浮雕母板，該母板一經(jīng)加工完成可以多次重復(fù)使用。母板中的圖案與彈性橡膠中通道的尺寸完全一致。
當(dāng)母板加工完成后，用復(fù)制模塑方法在彈性橡膠上加工所需要的通道網(wǎng)絡(luò)。在模塑操作前，先把硅母板依次用水和甲醇清洗，然后用氮?dú)獯蹈伞?br> 把脫氣的彈性橡膠，此處采用PDMS，聚合物前聚物(Sylgard 184硅橡膠，Dow Corning，Midland，MI)和硬化劑根據(jù)10∶1的重量比配好然后傾倒在硅母板上。真空去除氣泡后在85℃恒溫箱中經(jīng)過至少4小時的硬化，PDMS在母板上凝固成型。
把復(fù)制好的PDMS膠塊從母板上剝離，可以得到與母板上凸結(jié)構(gòu)對應(yīng)的通道結(jié)構(gòu)。在每個通道的末端用打孔器打孔，用于凝膠注射。
把PDMS膠塊用氧氣等離子活化(在150W，0.75Torr條件下一分鐘)，然后蓋在清潔的硅片上。把敏感物質(zhì)溶液和熔融的凝膠溶液混合，然后混合物從不同的進(jìn)口依次加入不同的凝膠通道中，在通道的出口用注射器緩慢往外吸。
在不同濃度的混合物加入不同的通道以后，把芯片從恒溫箱中取出，讓凝膠完全凝結(jié)。
把所有通道都完全充滿凝固的凝膠的PDMS膠塊從硅片上小心剝離下來，用刻刀把PDMS塊加工成合適的尺寸。
在傳感陣列上面蓋上加工有微通道的網(wǎng)絡(luò)的微芯片，構(gòu)成一個完整的微流控化學(xué)傳感陣列芯片。
權(quán)利要求
1.一種凝膠包被為基礎(chǔ)的微流控化學(xué)傳感陣列芯片，其特征在于它由相互結(jié)合的三層組成，第I層為承載層，第II層為傳感陣列層，第III層為微流通道層；傳感陣列層上分布有微通道網(wǎng)絡(luò)，所有微通道都被包被有化學(xué)傳感物質(zhì)的凝膠充滿；微流通道層上也有微通道網(wǎng)絡(luò)，微通道暢通，用于樣品溶液流動，傳感陣列層和微流通道層上的微通道網(wǎng)絡(luò)相正交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝膠包被為基礎(chǔ)的微流控化學(xué)傳感陣列芯片，其特征在于所述承載層采用玻璃、硅硬質(zhì)材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝膠包被為基礎(chǔ)的微流控化學(xué)傳感陣列芯片，其特征在于所述傳感陣列層采用聚二甲基硅氧烷PDMS、硅橡膠、聚氨酯等彈性橡膠材料制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝膠包被為基礎(chǔ)的微流控化學(xué)傳感陣列芯片，其特征在于所述微流動通道層采用玻璃、石英、聚二甲基硅氧烷PDMS常用透明芯片加工材料制成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝膠包被為基礎(chǔ)的微流控化學(xué)傳感陣列芯片，其特征在于所述凝膠采用加熱方法融化，與化學(xué)傳感物質(zhì)混合后，按濃度大小依次埋填在微通道網(wǎng)絡(luò)的不同微通道中，凝膠濃度大于4％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝膠包被為基礎(chǔ)的微流控化學(xué)傳感陣列芯片，其特征在于微通道尺寸為10-100微米寬，10-50微米深。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝膠包被為基礎(chǔ)的微流控化學(xué)傳感陣列芯片，其特征在于相鄰微通道的間隔為1-2個通道寬度。
8.權(quán)利要求1、2、3、4、5、6或7之任意一項(xiàng)所述的凝膠包被為基礎(chǔ)的微流控化學(xué)傳感陣列芯片的制備方法，其特征在于通過微加工方法在傳感陣列層基底材料上加工微通道網(wǎng)絡(luò)，將不同混合比例的凝膠與化學(xué)傳感物質(zhì)混合物融化后注入不同的微通道中，凝結(jié)后形成傳感陣列層；然后在該傳感陣列層上疊加另一個具有微通道網(wǎng)絡(luò)的微流通道層，疊加時保證傳感陣列層和微流通道層上的微通道網(wǎng)絡(luò)相正交；最后，將結(jié)合好的微流通道層和傳感陣列層再結(jié)合到承載層上，由此形成一個完整的微流控化學(xué)傳感陣列芯片。
全文摘要
本發(fā)明提出一種凝膠包被為基礎(chǔ)的微流控化學(xué)傳感陣列芯片，它由相互結(jié)合的三層組成，第I層為承載層，第II層為傳感陣列層，第III層為微流通道層；傳感陣列層上分布有微通道網(wǎng)絡(luò)，所有微通道都被包被有化學(xué)傳感物質(zhì)的凝膠充滿；微流通道層上也有微通道網(wǎng)絡(luò)，微通道暢通，用于樣品溶液流動，傳感陣列層和微流通道層上的微通道網(wǎng)絡(luò)相正交。本發(fā)明還進(jìn)一步提出了其制備方法。本發(fā)明結(jié)構(gòu)簡單，加工方便，成本低廉，有利于推廣，它可以用于微芯片上固定不同性質(zhì)的傳感物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)高通量傳感分析和篩選芯片的研制開發(fā)。
文檔編號G01N31/00GK101051044SQ20071007814
公開日2007年10月10日 申請日期2007年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月25日
發(fā)明者楊軍, 劉向紹, 張麗果, 翟盛杰, 鄭小林 申請人:重慶大學(xué)