專利名稱：檢測他達(dá)拉非及其衍生物的一種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測他達(dá)拉非及其衍生物的方法。
背景技術(shù)：
他達(dá)拉非是美國禮來公司研制開發(fā)的第二代磷酸二酯酶抑制劑，臨床上用于治療男性勃起功能障礙(ED)，其結(jié)構(gòu)式如式I所示，分子式為C22H19N3O4，商品名稱為希愛力，屬于處方藥。他達(dá)拉非與其他兩種治療ED藥物西地那非、伐地那非相比起效迅速、藥效時間長，目前已多次在食品、壯陽類中藥制劑或保健食品中檢出，甚至檢出其衍生物，對于不知情消費(fèi)者的危害是不言而喻的，另外也造成了中藥制劑和保健食品市場的混亂狀況。
(式I)目前食品、藥品檢驗(yàn)行業(yè)尚無他達(dá)拉非快速檢驗(yàn)方法的發(fā)布，對于藥店和基層藥檢所，由于缺乏先進(jìn)的檢驗(yàn)設(shè)備，甄別食品、中藥制劑和保健食品中是否含有違禁藥物很困難，因此建立簡單、準(zhǔn)確、快速的鑒別方法具有特別的意義。此外，某些生產(chǎn)商為了規(guī)避執(zhí)法部門的檢查，不斷制造上述化合物的衍生物，即使依靠HPLC方法也無法識別新衍生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測他達(dá)拉非及其衍生物的方法。
本發(fā)明所提供的檢測他達(dá)拉非及其衍生物的方法，包括如下步驟1)顯色反應(yīng)向待測樣品加入濃硫酸，進(jìn)行顯色反應(yīng)；2)結(jié)果判斷當(dāng)顯色反應(yīng)呈藍(lán)紫色時，說明待測樣品中含有他達(dá)拉非或其衍生物。
本發(fā)明方法不僅可以檢測他達(dá)拉非，還可以檢測他達(dá)拉非衍生物，其衍生物主要是含N雜環(huán)上的甲基被氨基(-NH2)取代，被乙基(-CH2CH3)、羥甲基(-CH2OH)取代的衍生物。檢測他達(dá)拉非衍生物的過程以及陽性結(jié)果判斷與他達(dá)拉非的檢測過程相同。
為了能排除樣品輔料對于顯色反應(yīng)結(jié)果判斷的干擾，顯色反應(yīng)前還可將待測樣品制備為供試品進(jìn)行檢測對于固體待測樣品，供試品制備過程如下在研細(xì)或剪碎的樣品中加入氯仿，研磨使溶解，用預(yù)先以氯仿濕潤的濾紙過濾，濾液置白瓷蒸發(fā)皿中，80℃水浴蒸干或用電吹風(fēng)吹干，殘?jiān)礊楣┰嚻贰?br> 對于液體待測樣品，供試品制備過程如下量取待測樣品置分液漏斗中，加氯仿振搖提取30秒，靜置使分層，分取氯仿層，用預(yù)先以氯仿濕潤的濾紙過濾，濾液置白瓷蒸發(fā)皿中，80℃水浴蒸干或用電吹風(fēng)吹干，殘?jiān)礊楣┰嚻贰?br> 本發(fā)明方法以濃硫酸作為他達(dá)拉非及其衍生物的顯色反應(yīng)試劑，具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)快速、簡便通常情況下，1分鐘之內(nèi)即可知道結(jié)果；即使由于樣品輔料有干擾使結(jié)果判斷模糊，需要將樣品用少量三氯甲烷溶解(2分鐘)、過濾(2分鐘)，濾液吹干或蒸干(10分鐘)，然后加入顯色劑，整個操作也可在30分鐘內(nèi)完成。相比于液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用方法(至少5小時)簡便快捷得多，并且無需對照品。
(2)反應(yīng)靈敏最小檢出量可達(dá)到1μg，而一次服用劑量樣品中(1～2片或粒、丸等)摻雜他達(dá)拉非的量至少為10mg(10000μg)以上，美國產(chǎn)他達(dá)拉非片有兩種規(guī)格，25mg和50mg，因此用該方法檢查食品、中藥制劑或保健品中是否摻雜違禁成分具有足夠的靈敏度。
(3)專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確率高根據(jù)方法驗(yàn)證結(jié)果，片劑、膠囊、蜜丸、酒劑等劑型的常用輔料對他達(dá)拉非的檢出均無干擾；同法檢查了與他達(dá)拉非有某些相似結(jié)構(gòu)的化學(xué)物質(zhì)，未發(fā)現(xiàn)有與他達(dá)拉非產(chǎn)生相同的顏色反應(yīng)。
(4)適用范圍廣該方法可以用于液體、固體，無論是食品、中藥制劑、保健食品均可使用該方法。
(5)顯色試劑無需配制，可長期儲存。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、檢測他達(dá)拉非及其衍生物的方法本發(fā)明檢測他達(dá)拉非及其衍生物的方法具體操作如下一、取樣量對于不同種類的待測樣品，推薦取樣量見下表1。
表1推薦取樣表

二、供試品制備固體供試品制備在研細(xì)或剪碎的樣品中加入5～10ml氯仿，研磨使溶解，用預(yù)先以氯仿濕潤的濾紙過濾，濾液置白瓷蒸發(fā)皿中，80℃水浴蒸干或用電吹風(fēng)吹干，殘?jiān)礊楣┰嚻罚灰后w供試品制備量取適量供試品，置分液漏斗中，加氯仿5～10ml，振搖提取30秒，靜置使分層，分取氯仿，用預(yù)先以氯仿濕潤的濾紙過濾，濾液置白瓷蒸發(fā)皿中，80℃水浴蒸干或用電吹風(fēng)吹干，殘?jiān)礊楣┰嚻贰?br> 三、顯色反應(yīng)上述殘?jiān)屑尤霛饬蛩?滴，進(jìn)行顯色反應(yīng)。
四、陽性結(jié)果判斷當(dāng)待測樣品中含有他達(dá)拉非或其衍生物時，加入顯色劑后應(yīng)立即顯藍(lán)紫色；他達(dá)拉非濃度微量(μg級)時顯紫紅色，放置后漸顯藍(lán)紫色；濃度高時所呈現(xiàn)的溶液顏色很濃，表面看去呈黑色，只需旋轉(zhuǎn)白瓷蒸發(fā)皿將溶液鋪開，即可見藍(lán)紫色。
如果顯色后溶液漸漸顯黃褐色甚至灰黑色，那是由于硫酸的腐蝕作用，不作為陽性反應(yīng)的結(jié)果。
五、注意事項(xiàng)由于本反應(yīng)靈敏度高，凡是呈陽性反應(yīng)試驗(yàn)用過的器具，如白瓷蒸發(fā)皿，再次使用前必須充分清洗，必要時加入濃硫酸1滴，如果不顯色，沖洗干凈，擦干使用；如果顯藍(lán)紫色，不能使用。
濃硫酸是一種通用型顯色劑，通常濃硫酸所顯顏色為黃色至褐色。生物堿能用濃硫酸顯色的并多見，濃硫酸與他達(dá)拉非反應(yīng)所顯的藍(lán)紫色非常少見；各種制劑輔料與濃硫酸接觸，往往由于硫酸的強(qiáng)腐蝕作用而呈現(xiàn)黑色或黑褐色，不會出現(xiàn)藍(lán)紫色?？v上所述，本發(fā)明以濃硫酸作為他達(dá)拉非的檢測試劑，達(dá)到化學(xué)鑒別試驗(yàn)的專屬性要求。
實(shí)施例2、本發(fā)明方法檢測他達(dá)拉非的準(zhǔn)確性試驗(yàn)對市售39批樣品采用本發(fā)明方法進(jìn)行檢測，同時，根據(jù)國家藥品食品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件(2006009，2006年3月14日公布)，采用HPLC-MS-MS方法檢查他達(dá)拉非、枸櫞酸西地那非、鹽酸伐地那非，結(jié)果見表3。
表3多批樣品試驗(yàn)結(jié)果


*“不含”表示不含他達(dá)拉非、枸櫞酸西地那非和鹽酸伐地那非。
結(jié)論上述試驗(yàn)與二級質(zhì)譜驗(yàn)證結(jié)果表明，本發(fā)明檢測方法無一例假陽性報告，同時也未漏檢任何含他達(dá)拉非及其衍生物的樣品，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
取上述他達(dá)拉非呈陰性反應(yīng)的36批樣品，摻入他達(dá)拉非對照品10mg，研磨，按本發(fā)明方法進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)均呈陽性反應(yīng)，結(jié)果表明本發(fā)明方法具有良好的準(zhǔn)確性，可排除樣品中各種輔料的干擾，專屬性強(qiáng)。
實(shí)施例3、本發(fā)明方法檢測他達(dá)拉非衍生物本發(fā)明方法不僅可以檢測他達(dá)拉非，還可以檢測他達(dá)拉非衍生物，其衍生物主要是含N雜環(huán)上的甲基被氨基(-NH2)取代，見式II(氨基他達(dá)拉非)；以及含N雜環(huán)上的甲基被乙基(-CH2CH3)、羥甲基(-CH2OH)取代的衍生物。檢測他達(dá)拉非衍生物的過程與他達(dá)拉非的檢測過程相同，陽性結(jié)果判斷也與之相同。

(式II)
對于HPLC-MS-MS方法檢測含有如式II結(jié)構(gòu)的他達(dá)拉非衍生物的膠囊樣品，取1粒內(nèi)容物進(jìn)行檢測，顯色結(jié)果呈藍(lán)紫色，陽性結(jié)果。
實(shí)施例4、本發(fā)明檢測方法的靈敏度試驗(yàn)一、樣品、對照品來源1、他達(dá)拉非對照品禮來公司，批號060904純度100％2、他達(dá)拉非片禮來公司，規(guī)格20mg二、方法靈敏度1、對照品最小檢出量取他達(dá)拉非對照品10mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加氯仿溶解并稀釋制成每1ml中含1μg的溶液，搖勻，精密量取1ml，水浴蒸干后，加入1滴顯色劑(濃硫酸)紫紅色，放置漸變藍(lán)紫色。
2、制劑最小檢出量取他打拉非片(規(guī)格20mg)1片，研細(xì)，取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于他達(dá)拉非10mg)，精密稱定，置100ml量瓶中，加氯仿溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，精密量取濾液1ml，置100ml量瓶中，加氯仿溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml(1μg)，水浴蒸干后，加入1滴顯色劑(濃硫酸)顯紫紅色，放置漸變藍(lán)紫色。
3、他達(dá)拉非衍生物-氨基他達(dá)拉非最小檢出量取氨基他達(dá)拉非片(含量20mg/片)1片，研細(xì)，取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于氨基他達(dá)拉非10mg)，精密稱定，置100ml量瓶中，加氯仿溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，精密量取濾液1ml，置100ml量瓶中，加氯仿溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml(1μg)，水浴蒸干后，加入顯色劑(濃硫酸)顯紫紅色，放置漸變藍(lán)紫色。
根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，可判定本發(fā)明方法檢測他達(dá)拉非及氨基他達(dá)拉非的靈敏度至少可達(dá)到1μg。
權(quán)利要求
1.檢測他達(dá)拉非及其衍生物的方法，包括如下步驟1)顯色反應(yīng)向待測樣品加入濃硫酸，進(jìn)行顯色反應(yīng)；2)結(jié)果判斷當(dāng)顯色反應(yīng)呈藍(lán)紫色時，說明待測樣品中含有他達(dá)拉非或其衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述他達(dá)拉非衍生物是在他達(dá)拉非的含N雜環(huán)上的甲基被氨基(-NH2)，乙基(-CH2CH3)或羥甲基(-CH2OH)取代的化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于對于固體待測樣品，進(jìn)行顯色反應(yīng)前還進(jìn)行如下過程處理在研細(xì)或剪碎的樣品中加入氯仿，研磨使溶解，用預(yù)先以氯仿濕潤的濾紙過濾，濾液置白瓷蒸發(fā)皿中，80℃水浴蒸干或用電吹風(fēng)吹干，殘?jiān)礊楣┰嚻贰?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于對于液體待測樣品，進(jìn)行顯色反應(yīng)前還進(jìn)行如下過程處理量取待測樣品置分液漏斗中，加氯仿振搖提取30秒，靜置使分層，分取氯仿層，用預(yù)先以氯仿濕潤的濾紙過濾，濾液置白瓷蒸發(fā)皿中，80℃水浴蒸干或用電吹風(fēng)吹干，殘?jiān)礊楣┰嚻贰?br> 全文摘要
本發(fā)明公開了檢測他達(dá)拉非及其衍生物的方法。本發(fā)明所提供的檢測他達(dá)拉非及其衍生物的方法，包括如下步驟1)顯色反應(yīng)向待測樣品加入濃硫酸，進(jìn)行顯色反應(yīng)；2)結(jié)果判斷當(dāng)顯色反應(yīng)呈藍(lán)紫色時，說明待測樣品中含有他達(dá)拉非或其衍生物。本發(fā)明方法具有快速、簡便、靈敏度高、專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N1/28GK101021483SQ20071006466
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月22日
發(fā)明者高青, 張喆, 周立春, 代紅, 車寶泉, 王志斌, 趙明, 方潁, 郭洪祝 申請人:北京市藥品檢驗(yàn)所