專利名稱：評(píng)估人半胱氨酸蛋白酶抑制劑c的濁度測(cè)定法免疫測(cè)定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及這樣的納米顆粒-抗體綴合物在評(píng)估人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫測(cè)定中或者在評(píng)估哺乳動(dòng)物的腎小球?yàn)V過(guò)率的診斷方法中的應(yīng)用。
最后，本發(fā)明涉及這樣的納米顆粒-抗體綴合物在評(píng)估人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫測(cè)定中或者在評(píng)估腎功能障礙如腎不足或衰竭的診斷方法中的應(yīng)用。
b)抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體的制備 b1)多克隆抗體 多克隆抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法制備，諸如例如由Chase，M.W.，1967，.在″Methods of Immunology andImmunochemistry(免疫學(xué)和免疫化學(xué)方法)″中，Williams，A.等編，M.W.，第197-209頁(yè)，學(xué)院出版社(Academic Press)，紐約中所述的那些。簡(jiǎn)言之，將適當(dāng)物種的動(dòng)物(例如，兔、山羊、或綿羊、或者，優(yōu)選地禽類物種，特別是家禽，如母雞)用在適當(dāng)?shù)淖魟┤绺ナ贤耆虿煌耆魟┲械募兓目乖貜?fù)免疫。在免疫后，將動(dòng)物采血，并且通過(guò)諸如例如硫酸銨或氯化銨沉淀、陰離子交換層析、免疫親和層析和/或親和層析的方法純化多克隆抗體。
為了獲得充分的濁度測(cè)定信號(hào)，優(yōu)選高抗體親抗原性的抗體。由于多克隆抗體包括許多不同的抗體分子，所以不能計(jì)算親和力常數(shù)，然而，通過(guò)常規(guī)的多克隆抗體技術(shù)獲得高的抗體親抗原性和親和力。使用通過(guò)常規(guī)方法獲得的兔抗體，然而，使用綿羊抗體獲得甚至更好的結(jié)果。當(dāng)使用禽類抗體時(shí)，獲得甚至更好的結(jié)果。禽類抗體可以按照在Larsson A，BaaloewR-M，Lindahl T，和Forsberg P-O在Poultry Science(家禽科學(xué))721807-1812，1993中所述的方法?？紤]到在遺傳上與人更不同的禽類能夠產(chǎn)生具有比多克隆哺乳動(dòng)物抗體更高的抗體親抗原性的針對(duì)人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的抗體。
多克隆禽類抗體通常從蛋黃中獲得(并且因此指定為IgYs)。然而，蛋黃含有大量的脂質(zhì)，使得它們的進(jìn)一步應(yīng)用成問(wèn)題。IgY可以通過(guò)使用逐步硫酸銨(例如25-40％)和聚乙二醇(PEG)沉淀而從蛋黃中分離。對(duì)于初始純化，還可以參考供應(yīng)商的用法說(shuō)明而應(yīng)用也是商業(yè)的可從GallusImmunotch Inc，Cary，美國(guó)獲得的IgY純化試劑盒，或從Pierce，Rockford，美國(guó)獲得的雞EggcellentIgY純化試劑盒。
此外，多克隆抗體的抗體親抗原性可以通過(guò)使用利用抗原親和純化方法，如按照從www.piercenet.com(2006年4月)下載并且通過(guò)引用結(jié)合的“Affinity Purification of Proteins(蛋白質(zhì)的親和純化)”中的教導(dǎo)，而純化的抗體而進(jìn)一步提高。在下文進(jìn)一步描述親和純化。
當(dāng)所用的抗體中有20％是抗原親和純化的時(shí)，特別觀察到提高的抗體親抗原性，當(dāng)所述抗體中有50％是抗原親和純化的時(shí)，觀察到甚至有更高的提高，并且當(dāng)所述抗體中有大于75％，如75-100％是通過(guò)抗原親和純化方法獲得的時(shí)，甚至提高更高。
對(duì)于禽類多克隆抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體的親和純化，已經(jīng)制備了適當(dāng)?shù)娜税腚装彼岬鞍酌敢种苿〤親和柱。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法將純化的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C固定在適當(dāng)?shù)墓腆w支持物上，例如瓊脂糖或親和凝膠，其是活化的以將所述抗原共價(jià)連接到支持物上(例如，適當(dāng)?shù)幕罨墓腆w支持物可從Pierce，Rockford，美國(guó)獲得)。然后，由所述攜帶抗原的樹脂而制備親和柱。
抗體的成功的親和純化取決于所述抗原上的相關(guān)表位向所述抗體的結(jié)合位點(diǎn)的有效呈遞。如果所述抗原是小的，并且通過(guò)多個(gè)化學(xué)鍵直接固定在固體支持物表面上，那么重要的表位可能被封閉或者空間位阻，而抑制有效的抗體結(jié)合。因此，最好使用獨(dú)特的官能團(tuán)(例如，在肽的單個(gè)末端半胱氨酸上的巰基)而固定抗原，并且最好使用其反應(yīng)基團(tuán)存在于幾個(gè)原子長(zhǎng)的間隔臂上的活化的支持物。對(duì)于更大的抗原，特別是具有多個(gè)固定位點(diǎn)的那些抗原，由于所述抗原本身作為支持基質(zhì)和表位之間的有效的間隔，所以所述間隔臂長(zhǎng)度不那么重要。
由于每種方法的核心是對(duì)于其各自的抗原的抗體的親和力，所以在抗體的親和純化的典型的結(jié)合和洗脫條件之間通常存在很少的變化。由于抗體設(shè)計(jì)成在生理?xiàng)l件下識(shí)別并且緊密結(jié)合抗原，所以大部分的親和純化方法使用模擬生理pH和離子強(qiáng)度的結(jié)合條件。最常見(jiàn)的結(jié)合緩沖液是在pH7.2的磷酸緩沖鹽(PBS)和Tris緩沖鹽(TBS)以及1.5M NaCl(例如，預(yù)先混合的緩沖液包裝可從Pierce，Rockford，美國(guó)獲得)。一旦所述抗體已經(jīng)結(jié)合到固體的抗原上，其余的結(jié)合緩沖液用來(lái)洗滌支持物的未結(jié)合的物質(zhì)。為了將非特異性結(jié)合最小化，所述洗滌緩沖液可以包含其它的鹽或去污劑，以破壞任何弱的相互作用。
特別地，通過(guò)改變緩沖液(例如，常見(jiàn)的洗脫緩沖液可從Pierce，Rockford，美國(guó)獲得)的pH和/或離子強(qiáng)度而將純化的抗體從親和樹脂上洗脫下來(lái)。抗體通常是耐受pH 2.5-11.5范圍的彈性蛋白，具有最小的抗體親抗原性損失，并且迄今為止，這是最常見(jiàn)的洗脫策略。在一些情形中，抗體-抗原的相互作用沒(méi)有被pH變化有效破壞或者被pH損壞，這需要應(yīng)用備選策略。
下面給出親和純化方法的實(shí)例 步驟1在每次使用之前，用10個(gè)柱體積的下述順序的緩沖液洗滌柱(～1ml樹脂床)，以去除殘留的蛋白質(zhì) 0.2M甘氨酸，pH 2.8～10ml 0.1M NaHCO3，pH 8.5，0.5M NaCl～10ml 使用上述緩沖液重復(fù)循環(huán)兩次。然后將所述柱在含有被調(diào)整到0.5M的NaCl的TTBS緩沖液(0.3M NaCl，20mM Tris/Cl，pH 7.8，0.1％(v/v)吐溫-20和0.01％NaN3)中平衡。
步驟2向10ml等分試樣的粗抗體制備物中，加入1ml 10X TTBS和0.55ml 4M NaCl。將混合物離心以去除任何沉淀。
步驟3通過(guò)將所述親和樹脂轉(zhuǎn)移到含有血清的管(15ml管)中，而分批吸收所述抗體。在冷室中溫育。備選地，人們可以使用低流速將血清施加到柱上。獲得人工收集的級(jí)分。收集流過(guò)柱的相(phase)，并且使用低流速將其第二次重新施加。
步驟4用TTBS+NaCl至0.5M充分洗滌柱，直到A280小于0.02。收集10ml洗滌的級(jí)分，并且檢驗(yàn)所述級(jí)分的A280。
步驟5使用含有0.02％NaN3的0.2M甘氨酸，pH 2.8洗脫抗體。使用1ml等分試樣的緩沖液進(jìn)行洗脫。將級(jí)分收集到含有50ml 1M Tris，pH8.5的1.5ml微量離心管中。這在蛋白洗脫下來(lái)之后立即中和酸性的洗脫緩沖液。收集至少10個(gè)級(jí)分。這通常足以去除所述抗體。使用適當(dāng)?shù)目瞻?即，1ml甘氨酸緩沖液加50ml 1M Tris)，讀取每個(gè)級(jí)分的A280。
步驟6將適當(dāng)?shù)募?jí)分合并。獲得合并物的A280，并且將抗體保存在4℃，或者考慮在存在50％甘油時(shí)以等分試樣冷凍(-70℃)。
步驟7通過(guò)用0.2M甘氨酸，pH 2.8緩沖液，而后用TTBS充分洗滌而洗滌柱。
b2)單克隆抗體 在顆粒-增強(qiáng)的濁度測(cè)定中，多克隆抗體通常比單克隆抗體更優(yōu)選。多克隆抗體固有地與抗原(或分析物)上的許多不同的表位反應(yīng)(與單克隆抗體相反)，并且因此，更容易在抗原分子自身之間，以及在抗原和固定抗體的顆粒之間產(chǎn)生交叉結(jié)合和網(wǎng)絡(luò)。相反，單克隆抗體通常只結(jié)合一種類型的表位，這使得其更難以形成交叉結(jié)合和網(wǎng)絡(luò)。然而，診斷行業(yè)通常優(yōu)選使用單克隆抗體，原因在于它們更容易標(biāo)準(zhǔn)化，并且更容易對(duì)預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行定性控制，特別是在許多年的產(chǎn)品壽命時(shí)間內(nèi)。因此，存在關(guān)于將單克隆抗體用于顆粒增強(qiáng)的濁度測(cè)定法免疫測(cè)定的良好的實(shí)例，特別是當(dāng)存在有利于單克隆抗體的使用的抗原性特征時(shí)。Eda等，在“Development of a New Microparticle-Enhanced Turbidimetric Assay forC-reactive proten With Superior features in Analytical Sensitivity and Dynamicrange(在分析靈敏性和動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)具有優(yōu)良特征的C-反應(yīng)性蛋白的新的微粒-增強(qiáng)的濁度測(cè)定法測(cè)定的發(fā)展)”，J.Clin.Lab.Analysis(臨床實(shí)驗(yàn)室分析)，12137-144(1998)中描述了使用兩種不同的單克隆抗體和兩種不同的微粒。由于CRP分子是相同亞基的五聚體----并且因此攜帶五個(gè)所有表位的重復(fù)(Pepys MB等，Adv.Immunol.(高級(jí)免疫學(xué))34141-212(1983))，這使得使用單克隆抗體容易得多，所以CRP特別有利于使用單克隆。然而，此外，與單體和更小的蛋白如半胱氨酸蛋白酶抑制劑C一起，不同的單克隆抗體的混合物可以用于本發(fā)明的特別的實(shí)施方案中。不同的單克隆抗體的混合物，特別當(dāng)它們由具有針對(duì)半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的高親和力的許多不同的單克隆抗體組成時(shí)，將導(dǎo)致關(guān)于半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測(cè)定的本發(fā)明的良好的實(shí)施方案。
單克隆抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體還可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法制備，例如由G.

等，1975，Nature(自然)256，495，G. Galfre等，1981，Meth.Enzymol.(酶學(xué)方法)73，3-46，或R.Kennet，1980，在″Hybridomasa new dimension in biological analysis(雜交瘤生物學(xué)分析的新紀(jì)元)″中，R.Kennet等編，Plenum出版社，紐約和倫敦中所述的那些。將來(lái)自免疫小鼠或大鼠的脾細(xì)胞或外周血細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系融合，例如使用聚乙烯融合方法進(jìn)行。在融合后，將細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下生長(zhǎng)，例如，在培養(yǎng)平板上，并且使用例如次黃嘌呤/氨喋呤/胸苷(HAT)選擇方法進(jìn)行正確融合的細(xì)胞的選擇。產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系通過(guò)如EIAs，RIAs或凝聚測(cè)定的方法鑒定。在鑒定產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系后，將所述細(xì)胞重復(fù)亞克隆，例如通過(guò)有限稀釋的方法，以保證新生長(zhǎng)的細(xì)胞系來(lái)源于一個(gè)單一的細(xì)胞。
b3)嵌合抗體 嵌合的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法獲得，諸如由G.L.Boulianne等，1984，Nature(自然)312，643-645所述的方法。所述方法可以概括描述如下。將來(lái)自于一種物種或其部分的單克隆抗體的抗原-結(jié)合位點(diǎn)的DNA轉(zhuǎn)移到不同物種的另一種抗體的抗體構(gòu)架的DNA。將這種新的構(gòu)建體克隆到表達(dá)載體中，將其轉(zhuǎn)移到相對(duì)應(yīng)的表達(dá)系統(tǒng)中以產(chǎn)生所述抗體。
b4)重組抗體 重組抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法不使用動(dòng)物載體而獲得，例如由G.Winter等，1991，Nature(自然)，349，293或J.S.Huston等，1988，Proc.Ntl.Acad.Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))，85，5879所述的那些方法。那些方法包括下述步驟將編碼抗體或其片段的DNA(cDNA或合成的DNA)引入到宿主細(xì)胞中，例如，大腸桿菌(E.coli)，真菌，酵母菌，植物或真核細(xì)胞中，選擇具有需要的特異性和親和力的抗體，并且在相應(yīng)的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)所述抗體或其片段。
b5)抗體片段 任何物種的多克隆抗體、單克隆抗體(包括嵌合抗體和/或重組抗體)的Fab-，F(xiàn)ab′-，和F(ab′)2-片段可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法制備，諸如例如由A.Nissonoff等，1960，Arch Biochem Biophys(生物化學(xué)和生物物理學(xué)檔案)，89，230，或R.P.Porter，1959，Biochem J(生物化學(xué)雜志)，73，119，或E.Harlow等，1988，在″Antibodies-A Laboratory Manual(抗體-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))″，626-631，冷泉港出版社(Cold Spring Harbour Press)，紐約，美國(guó)所述的那些方法。
b6)選擇與人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C不同反應(yīng)性的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體 當(dāng)使用單克隆抗體或其片段作為結(jié)合配偶體時(shí)，可以便利地進(jìn)行不同的、特別是高和低反應(yīng)性的抗體的選擇，其通過(guò)常規(guī)包被技術(shù)，將每種單克隆抗體獨(dú)立地包被到相同材料和大小的納米顆粒上，而后以給定的比例，如1/1v/v，以變換的方式將納米顆粒試劑與分析物混合。在相同條件下生成納米顆粒試劑的校正曲線之后，對(duì)于低濃度的分析物所得到的校正曲線的斜率給出所述免疫結(jié)合配偶體的反應(yīng)性的第一指示。
當(dāng)使用多克隆抗體作為結(jié)合配偶體時(shí)，可以按照本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行高和低反應(yīng)性多克隆抗體的制備，其通過(guò)將所述多克隆抗體引入到攜帶與凝膠基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的抗原性分析物的親和層析柱上而進(jìn)行。使用梯度洗脫緩沖液，低反應(yīng)性的多克隆抗體級(jí)分將最先從柱上洗脫下來(lái)，而后是具有增加的更高的反應(yīng)性的級(jí)分(參見(jiàn)，S.Yamamoto等，1993，″VeterinaryImmunology and Immunopathology(獸醫(yī)免疫學(xué)和免疫病理學(xué))″36，257-264，Elsevier科學(xué)出版社(Elsevier Science Publishers)B.V.，Amsterdam)。然后，可以使用BIAcore儀器或者通過(guò)將它們獨(dú)立地包被到相同大小和材料的納米顆粒上并且生成相應(yīng)的校正曲線，而檢驗(yàn)級(jí)分的反應(yīng)性。
抗體的選擇可以通過(guò)上文提及的將它們包被在納米顆粒上的方法進(jìn)行，而后檢測(cè)界限分析或確定其功能親和性，如上文所述。如果適當(dāng)?shù)脑?，關(guān)于它們對(duì)人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的親和力/抗體親抗原性而不同的不同的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體的混合物可以用于制備本發(fā)明的納米顆粒-抗體綴合物。適當(dāng)?shù)幕旌媳壤梢杂墒炀毜募夹g(shù)人員通過(guò)有限系列的實(shí)驗(yàn)而確定。
適當(dāng)?shù)目谷税腚装彼岬鞍酌敢种苿〤抗體還可以從不同的來(lái)源商購(gòu)。例如，芬蘭的HyTest提供一組識(shí)別所述抗原的不同表位的高親和力抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體。這些抗體以常規(guī)方法制備，其通過(guò)用從人尿純化的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫Balb/c小鼠，并且通過(guò)與雜交瘤細(xì)胞系Sp2/0融合而產(chǎn)生雜交瘤進(jìn)行。通過(guò)選擇的克隆產(chǎn)生的抗體通過(guò)蛋白質(zhì)A親和層析而純化。目前可從HyTest獲得下述mAbsCyst10，Cyst13，Cyst16，Cyst18，Cyst19，Cyst23，Cyst24，和Cyst28。其它商購(gòu)單或多克隆抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體的供應(yīng)商為Fusion，北愛(ài)爾蘭；Bio Vendor，捷克共和國(guó)，AB Location，德國(guó)；高級(jí)Immunicemical(AdvancedImmunicemical)，美國(guó)；Abcam，英國(guó)；Axxora，英國(guó)；生物設(shè)計(jì)(Biodesign)，美國(guó)；R&D系統(tǒng)，美國(guó)；AbD Serotec，挪威；Strategic生物溶液(StrategicBiosolutions)，美國(guó)。原則上，所述來(lái)源的所有抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體可以單獨(dú)或組合使用，以實(shí)施本發(fā)明。
c)納米顆粒以及它們與抗體的綴合物 用于制備本發(fā)明的納米顆粒的物質(zhì)可以是適合產(chǎn)生并且實(shí)施顆粒-增強(qiáng)的光散射測(cè)定的任何天然的或合成的、無(wú)機(jī)的、有機(jī)的、非聚合物或聚合物物質(zhì)。這樣的物質(zhì)包括，例如，硒，碳，金；碳、硅或鍺的氮化物，例如Si3N4；鐵、鈦或硅的氧化物，例如TiO2或SiO2；以及聚合材料，諸如例如，膠乳，聚苯乙烯，聚(氯乙烯)，環(huán)氧樹脂，聚偏1，1-二氯乙烯，聚(α-萘基甲基丙烯酸酯)，聚(乙烯基萘(naphtalene))，或它們的共聚物，特別是苯乙烯和可共聚化的烯鍵式不飽和的化合物的共聚物，例如苯乙烯-(甲基)丙烯酸酯共聚物。由聚合材料制成的顆粒，以及由苯乙烯聚合的內(nèi)核和苯乙烯與可共聚化的烯鍵式不飽和的化合物共聚形成的外殼而組成的核-殼顆粒，如例如在美國(guó)專利號(hào)4,210,723中所述，也是適合的。
適用于綴合的聚合物顆?？梢再?gòu)自Bangs顆粒公司(Bangs ParticlesInc.)或界面動(dòng)力學(xué)公司(Interfacial Dynamics Inc)，默克SA，法國(guó)或其它適當(dāng)?shù)膩?lái)源。所述顆粒可以按照許多方法激活，用于結(jié)合抗體，例如，這樣的偶聯(lián)化學(xué)的詳細(xì)的教導(dǎo)可以在TechNote 205，Rev.003中，例如2002年3月，“共價(jià)偶聯(lián)(Covalent Coupling)”(通過(guò)引用結(jié)合)中找到，其可以從Bangs實(shí)驗(yàn)公司(Bangs Laboratories，Inc)的網(wǎng)頁(yè)上下載。例如，偶聯(lián)可以通過(guò)在它們表面上攜帶羧基-、氨基-、羥基-、酰肼-或氯甲基基團(tuán)的顆粒的方式而實(shí)現(xiàn)。待偶聯(lián)的分子可以直接與這樣的基團(tuán)反應(yīng)，或者通過(guò)適當(dāng)?shù)慕宇^如例如碳二亞胺、戊二醛或溴化氰的方式反應(yīng)。
按照本發(fā)明的顆粒的外殼優(yōu)選地必須包括對(duì)半胱氨酸蛋白酶抑制劑C具有高親和力的抗體，其與特定大小的納米顆粒核心組合，產(chǎn)生充分的濁度測(cè)定信號(hào)。典型地，包括蛋白物質(zhì)的外殼的納米顆粒在58和200nm之間，更優(yōu)選地在65和150nm之間，并且甚至更優(yōu)選地在80和135nm之間。
在本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施方案中，未包被的顆粒的平均直徑約80nm。使用這些顆粒，在包被之后，它們的直徑典型地為90-100nm。作為通用的法則，單層抗體約5nm厚，以致認(rèn)為這樣的顆粒攜帶單層抗體。
當(dāng)所述綴合的顆?？偢芍氐?-35％是由抗體組成時(shí)，這些顆粒將具有良好的性能，在所述綴合的顆粒的總干重的10-30％由抗體組成時(shí)，所述顆粒具有更好的性能，并且當(dāng)所述綴合的顆粒的總干重的15-25％是由抗體組成時(shí)，具有最佳性能。
如果使用稍微更大的顆粒，這些最佳百分比值下降。通過(guò)舉例的方式，如果使用95nm的裸顆粒，如果包被的話，它們的中值直徑典型地終止在110nm。那么，相對(duì)應(yīng)的百分比為4-32％，8-26％，并且對(duì)于最佳性能，相對(duì)應(yīng)的百分比為12-22％(由抗體組成的綴合的顆粒的總干重百分?jǐn)?shù))。然而，使用這些稍微更大的顆粒，在所述測(cè)定中必須使用更多的顆粒(是更重的顆粒的意思)，以具有足夠的結(jié)合容量來(lái)產(chǎn)生校正曲線，而在更高半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的濃度，沒(méi)有所述曲線的平化(測(cè)定校正曲線必須具有達(dá)到超過(guò)8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/μl樣品的良好的動(dòng)力學(xué)范圍)，這導(dǎo)致高得多的吸收背景(更大的顆粒和更多的顆粒)，和更低的信號(hào)比噪音比例。
在另一方面，更小的顆粒將在包被的免疫顆粒中具有更高的抗體百分?jǐn)?shù)最適值。例如，如果使用大小70nm的未包被的顆粒，那么包被的顆粒的中值直徑典型地為80nm，并且綴合顆粒的總干重的18-30％抗體的比例將導(dǎo)致最佳百分?jǐn)?shù)，并且次最佳的是12-36％的比例，并且甚至更次最佳的是4-42％的抗體的比例。然而，使用這些稍微更小的顆粒，在所述測(cè)定中必須使用更少的顆粒(是更少重量的顆粒的意思)，以產(chǎn)生在更低的濃度，即，低于1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/μl樣品，足夠陡峭的校正曲線，并且信號(hào)將更低，并且還更容易受背景噪音的影響。
基于上述闡釋，在本發(fā)明的教導(dǎo)的指導(dǎo)下，熟練的讀者應(yīng)該能夠提供用于不同的測(cè)定條件的最佳免疫顆粒制劑。
將抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體包被到納米顆粒上可以按照滿足所用的材料的特性的本領(lǐng)域公知的方法而吸附性地或共價(jià)性地實(shí)施。
按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，一種或多種親水惰性蛋白質(zhì)與抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體的混合物應(yīng)該存在于所述抗體與所述納米顆粒的綴合/結(jié)合過(guò)程中。本發(fā)明人已經(jīng)意外地觀察到，當(dāng)將抗體與具有接近綴合pH的pI值的親水蛋白一起與所述顆粒綴合時(shí)，獲得使用具有高結(jié)合容量的親水性顆粒的最佳結(jié)果。當(dāng)在綴合過(guò)程中存在牛運(yùn)鐵蛋白和白蛋白時(shí)，獲得最好的結(jié)果。然而，在綴合過(guò)程中，其它的惰性蛋白也可以與抗體混合。這樣的親水性、惰性蛋白的非限制性實(shí)例是

(limpet)血藍(lán)蛋白、觸珠蛋白以及其它水溶性蛋白，它們對(duì)于所述抗體和半胱氨酸蛋白酶抑制劑C沒(méi)有任何親和力。
在偶聯(lián)過(guò)程中，條件為，或者應(yīng)該為，或者如果必要，應(yīng)該采用這樣的條件，以致所述抗體比所述惰性蛋白與納米顆粒核心材料更具反應(yīng)性，以致它們將或多或少地與所述核心定量結(jié)合。所述納米顆粒表面的殘余的反應(yīng)部分將由所述惰性蛋白封閉。
本發(fā)明人觀察到，作為通用法則，在第一步驟中，抗體的疏水部分似乎與所述顆粒物理性結(jié)合，并且因此整個(gè)分子接近顆粒表面上的反應(yīng)基團(tuán)，例如氯甲基基團(tuán)，然后其與蛋白分子的相對(duì)應(yīng)的基團(tuán)例如胺反應(yīng)。由于這種物理學(xué)吸附，大的抗體分子令人驚訝地與更小的、惰性的親水蛋白如白蛋白和運(yùn)鐵蛋白充分競(jìng)爭(zhēng)。然而，由于使用比顆粒的結(jié)合容量更少的抗體，所述惰性蛋白，如白蛋白和運(yùn)鐵蛋白，與顆粒表面上留下來(lái)反應(yīng)的任何基團(tuán)起反應(yīng)，并且然后使得本發(fā)明的顆粒同時(shí)具有良好的親水表面和良好的抗體結(jié)合容量，并且具有可以產(chǎn)生良好的信號(hào)的適當(dāng)?shù)募{米顆粒材料比例。
采用適合每種包被方法的條件，通過(guò)本文提供的教導(dǎo)的指導(dǎo)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，變化是常規(guī)的。
例如，對(duì)于偶聯(lián)，當(dāng)使用單克隆抗體時(shí)，可以選擇高于抗體的pI半個(gè)單位的pH。多克隆抗體具有非常多變的pI，并且因此可以優(yōu)選地選擇使用pH 8.8的多克隆抗體。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，基于偶聯(lián)反應(yīng)混合物的總蛋白含量，在綴合過(guò)程中存在的約3-70重量％，或者甚至更優(yōu)選地5-40重量％的蛋白應(yīng)該由所述抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體組成。
如上述所闡釋，由于所述抗體具有比親水惰性蛋白更高的與所述顆粒的結(jié)合率，所以，抗體蛋白與結(jié)合到顆粒表面上的總蛋白的比例將高得多，例如，20-90％，并且更優(yōu)選地結(jié)合到顆粒表面上的總蛋白的35-80％，并且甚至更優(yōu)選地40-70％是由所述抗體組成的。
d)所要求保護(hù)的濁度測(cè)定方法的優(yōu)選實(shí)施方案 d1)發(fā)明優(yōu)點(diǎn) 本發(fā)明提供具有比現(xiàn)有技術(shù)更強(qiáng)的信號(hào)比噪音比例的濁度測(cè)定半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測(cè)定。通過(guò)選擇大的核心和蛋白外殼顆粒，優(yōu)選特定的最小的大小，與抗原親和純化的抗體組合，獲得了令人吃驚地高凝聚信號(hào)。由于與測(cè)定緩沖液相比較，在顆粒的折射指數(shù)和高度純化的抗體的高親和力(或抗體親抗原性)之間的令人吃驚的協(xié)同作用，獲得了強(qiáng)濁度測(cè)定信號(hào)。所述強(qiáng)濁度測(cè)定信號(hào)導(dǎo)致對(duì)干擾物質(zhì)如三酰甘油的更高的穩(wěn)定性，并且比濁度測(cè)定半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測(cè)定的現(xiàn)有技術(shù)具有更好的線性。
均相免疫測(cè)定的關(guān)鍵因素是每質(zhì)量單位每體積測(cè)定混合物所產(chǎn)生的信號(hào)。所述測(cè)定混合物是在已經(jīng)加入全部的試劑和樣品時(shí)獲得的混合物。例如，如果要分析3μl的樣品，并且所述樣品含有1mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的，并且在混合全部的試劑和樣品后終體積是300μl，那么半胱氨酸蛋白酶抑制劑C在終測(cè)定混合物中的濃度是10μg/l。如果所述分析物在樣品中的濃度是低的，那么這通常可以通過(guò)使用與測(cè)定混合物的體積相比更大的樣品而補(bǔ)償，例如，在300μl的測(cè)定混合物體積中將樣品增加到6μl。對(duì)于增加樣品體積，存在一些障礙。首先，在樣品中可能存在的所有干擾物質(zhì)在所述測(cè)定混合物中的濃度增加。其次，為了克服臨界曲線作用(critical hook effect)(即，具有負(fù)斜率的劑量/反應(yīng)曲線)，對(duì)抗體的需求增加，其又相對(duì)應(yīng)地增加測(cè)定的抗體成本。
因此，存在這樣的需要，即，在分析物的低的測(cè)定混合物濃度以及相對(duì)應(yīng)低的樣品體積下，獲得良好的信號(hào)強(qiáng)度和穩(wěn)定的測(cè)定。在均相免疫測(cè)定中增加樣品的體積導(dǎo)致更多的干擾和更昂貴的測(cè)定。
本發(fā)明提供濁度測(cè)定半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測(cè)定的信號(hào)強(qiáng)度、穩(wěn)定性和線性的令人吃驚的增加。本發(fā)明還具有來(lái)自脂質(zhì)如三酰甘油的更少的干擾。在理解基于每質(zhì)量單位的分析物的濁度測(cè)定信號(hào)中的過(guò)低的信號(hào)強(qiáng)度的現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)后，實(shí)現(xiàn)了上述，并且提供具有比現(xiàn)有技術(shù)中的濁度測(cè)定方法更好的精確性、線性和更少的干擾的方法。
d2)在不同的檢測(cè)條件觀察到的特別的改進(jìn) 按照本發(fā)明，提供用于測(cè)量體液樣品中或者來(lái)自于體液的樣品中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的改進(jìn)的濁度測(cè)定免疫測(cè)定方法，其特征在于， 通過(guò)將含有所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的液體樣品，或者來(lái)自于含有半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的液體的樣品，或者含有半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的稀釋物的樣品，與納米顆粒結(jié)合的多克隆抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體或抗體片段接觸，形成測(cè)定混合物，以結(jié)合所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，并且 如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，通過(guò)測(cè)量所述混合物的濁度的變化而評(píng)估半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的含量，并且所述濁度進(jìn)一步特征在于，所述混合物在546nm波長(zhǎng)處光吸收的改變，所述改變 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于15mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于30mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于75mAbs單位/cm， 并且所述方法進(jìn)一步特征在于所述納米顆粒結(jié)合的多克隆抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體或抗體片段綴合物的中值直徑大于58nm。
由于546nm的波長(zhǎng)和37℃是許多大規(guī)模自動(dòng)化臨床化學(xué)分析器如日立(Hitachi)，來(lái)自羅氏(Roche)的Cobas和Modular，奧林巴斯以及許多其它的儀器的典型的操作模式，所以這是特別有益的。
本發(fā)明還提供改進(jìn)的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有546nm波長(zhǎng)的光吸收的變化，所述變化 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于25mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于55mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于125mAbs單位/cm， 所述方法因?yàn)橥瑯拥脑蚨幸妗?br> 此外，本發(fā)明提供一種方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有546nm波長(zhǎng)的光吸收的變化，所述變化 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于30mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于85mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于190mAbs單位/cm， 所述方法也是因?yàn)橥瑯拥脑蚨幸妗?br> 一些分析型分光光度計(jì)儀器在更低的波長(zhǎng)下操作。因此，本發(fā)明還提供這樣一種方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有505nm波長(zhǎng)的光吸收的變化，所述變化 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于20mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于50mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于90mAbs單位/cm。
特別地，本發(fā)明提供這樣一種方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有505nm波長(zhǎng)的光吸收的變化，所述變化 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于30mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于75mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于150mAbs單位/cm。
此外，本發(fā)明提供一種這樣的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有505nm波長(zhǎng)的光吸收的變化，所述變化 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于40mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于100mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于250mAbs單位/cm。
其它分析型分光光度計(jì)儀器可以在更高的波長(zhǎng)操作。
因此，本發(fā)明還提供這樣的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有570nm波長(zhǎng)的光吸收的變化，所述變化 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于10mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于30mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于80mAbs單位/cm。
特別地，本發(fā)明提供這樣的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有570nm波長(zhǎng)的光吸收的變化，所述變化 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于15mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于45mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于100mAbs單位/cm。
另外，本發(fā)明提供這樣的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有570nm波長(zhǎng)的光吸收的變化，所述變化為 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于20mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于55mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于125mAbs單位/cm。
存在一些在比37℃更低的溫度操作的臨床化學(xué)儀器。因此，本發(fā)明提供這樣的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在32℃保持600秒，所述混合物在具有546nm波長(zhǎng)的光吸收的變化，所述變化 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于12mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于25mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于70mAbs單位/cm。
為了提高臨床化學(xué)自動(dòng)化的能力，存在對(duì)于更快和更有效的測(cè)定方法的巨大的需求。如果測(cè)定運(yùn)行得更快，那么在每個(gè)時(shí)間單位可以進(jìn)行更多的測(cè)定。特別地，如果構(gòu)建所述儀器以動(dòng)力學(xué)模式運(yùn)行，那么在測(cè)定開(kāi)始后，快速而強(qiáng)烈的信號(hào)的增加是有益的。因此，本發(fā)明提供這樣的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持120秒，所述混合物在具有546nm波長(zhǎng)的光吸收的變化，所述變化 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于8mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于20mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于50mAbs單位/cm。
特別地，本發(fā)明提供這樣的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持120秒，所述混合物在具有546nm波長(zhǎng)的光吸收的變化，所述變化 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于15mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于30mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于75mAbs單位/cm。
此外，本發(fā)明提供這樣的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持40秒，所述混合物在具有546nm波長(zhǎng)的光吸收的變化，所述變化為 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于4mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于7mAbs單位/cm，或者 在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于15mAbs單位/cm。
d3)使用現(xiàn)有技術(shù)濁度測(cè)定系統(tǒng)在相同條件下獲得的結(jié)果 如上文所闡釋，用于所述測(cè)定的納米顆粒的顆粒大小必須仔細(xì)平衡。大的顆粒產(chǎn)生良好的信號(hào)，然而，背景高，并且結(jié)合容量低，以致必須加入大量的顆粒，這產(chǎn)生高的背景濁度。先前的測(cè)定供應(yīng)商，如DakoCytomation AS，可能是由于這一主要原因而沒(méi)有獲得良好的濁度測(cè)定信號(hào)。
當(dāng)按照在Dako Cytomation AS，產(chǎn)品號(hào)LX002/EFG/CS/25.10.04，S2361/EFG/KGR/09.07.03和X0974/EFG/SUM/09.09.04的包裝插件中提供的用法說(shuō)明，以及在上文所引用的Schmidt，Kjoller和

的論文中的用法說(shuō)明，這導(dǎo)致用于半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的濁度測(cè)定免疫測(cè)定方法，其特征在于----在37℃260秒內(nèi)，在波長(zhǎng)546nm----吸收的變化，如下 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，僅為9mAbs單位， 在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，僅為24mAbs單位，和 在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，僅為50mAbs單位。
這些結(jié)果遠(yuǎn)低于本發(fā)明觀察到的結(jié)果(見(jiàn)上文)。
當(dāng)嘗試使用更短的測(cè)定時(shí)間(目的在于動(dòng)力學(xué)讀數(shù))時(shí)，120秒導(dǎo)致下述吸收的變化 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，僅為6mAbs單位， 在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，僅為15mAbs單位，并且 在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，僅為24mAbs單位， 其遠(yuǎn)低于本發(fā)明所獲得的結(jié)果。
此外，當(dāng)嘗試使用甚至更短的測(cè)定時(shí)間(目的在于動(dòng)力學(xué)讀數(shù))時(shí)，40秒導(dǎo)致下述吸收的變化 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，僅為3mAbs單位， 在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，僅為6mAbs單位，并且 在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，僅為9mAbs單位， 其也遠(yuǎn)低于本發(fā)明所獲得的結(jié)果。
上述測(cè)定時(shí)間定義為從將免疫顆?；鞈乙杭尤氲綔y(cè)定試劑和樣品的混合物起的時(shí)間。所有的體積和順序都按照供應(yīng)商的信息。使用來(lái)自美國(guó)埃德-白令(Dade-Behring)，產(chǎn)品號(hào)OQNM13N膠乳半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的ProSpec比濁法參照方法，確定半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的濃度。
d4)實(shí)施本發(fā)明的測(cè)定方法 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將測(cè)定緩沖液與樣品和免疫顆?；鞈乙夯旌希⑶彝ㄟ^(guò)光度計(jì)，特別是記錄式光度計(jì)，并且更優(yōu)選記錄式分光光度計(jì)，監(jiān)測(cè)所述混合物或得到的混懸液的濁度。優(yōu)選的步驟順序?yàn)閷悠坊旌显跍y(cè)定緩沖液中，允許所述混合物完全溶解并且穩(wěn)定，然后加入免疫顆?；旌衔铩１景l(fā)明還可以這樣實(shí)施，即，通過(guò)最先將測(cè)定緩沖液與免疫顆?；鞈乙夯旌?，然后加入和混合樣品而進(jìn)行。應(yīng)該應(yīng)用最佳混合方法(在本領(lǐng)域公知的方法中選擇)，其可以通過(guò)有限量的預(yù)實(shí)驗(yàn)而確定。
當(dāng)使用記錄式光度計(jì)時(shí)，可以確定濁度增加的初始速率，其通過(guò)測(cè)量吸收增加的初始速率而確定樣品的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度，或者通過(guò)在混合時(shí)直接記錄，或者通過(guò)在混合后立即記錄，與吸收的初始增加的后推組合，或者通過(guò)在樣品和試劑混合后測(cè)量在兩個(gè)或多個(gè)小于1分鐘的時(shí)間點(diǎn)之間的吸收差異。
這些測(cè)量或組合的測(cè)量可以是相關(guān)的，或者與使用已知的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度的校正的對(duì)應(yīng)結(jié)果進(jìn)行比較，并且這樣可以計(jì)算未知樣品的濃度。這些記錄吸收值和計(jì)算結(jié)果的方法對(duì)于臨床化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員測(cè)量的許多其它物質(zhì)是眾所周知的。當(dāng)然，來(lái)自于本發(fā)明的非常良好的信號(hào)使得這樣的測(cè)量和計(jì)算穩(wěn)定和準(zhǔn)確得多，特別在如上文所述，在將樣品和試劑混合之后立即獲得的良好的信號(hào)時(shí)。
存在一些可以使用的測(cè)定緩沖液混合物，其具有加入所述緩沖液中的不同種類的緩沖物質(zhì)，具有不同種類的去污劑和/或不同種類的聚合物和/或鹽。
可以使用TRIS緩沖液，磷酸鹽緩沖液，硼酸鹽緩沖液以及其它緩沖物質(zhì)，如MOPS，PIPES，HEPES，并且對(duì)于本發(fā)明不是關(guān)鍵的，只要所述測(cè)定可以不依賴于加入的樣品的pH和緩沖能力而保持最終測(cè)定混合物的充分調(diào)節(jié)的pH。典型地，以約5mM-0.2M或10mM-0.1M的終摩爾比例加入所述緩沖液。將pH調(diào)整到6-8的范圍，特別是6.5-7.5。
此外，可以使用一些去污劑，只要它們能夠溶解所加入的樣品的任何脂質(zhì)內(nèi)容物，并且不太強(qiáng)烈地干擾抗體與所述樣品引入的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的反應(yīng)。由于脂質(zhì)形成給出干擾信號(hào)的微滴和微團(tuán)，所以，三酰甘油，膽固醇和一定范圍的脂蛋白是濁度測(cè)定法測(cè)定中干擾物質(zhì)的實(shí)例。吐溫20，Triton X-100和脫氧膽酸鹽是適當(dāng)?shù)娜ノ蹌┑膶?shí)例。在含有脂質(zhì)的樣品中測(cè)量半胱氨酸蛋白酶抑制劑C是一個(gè)大挑戰(zhàn)，并且需要所述脂質(zhì)的良好的溶解性，但是甚至更重要地是，超過(guò)任何次要的干擾的強(qiáng)信號(hào)。去污劑典型地以分別為最終反應(yīng)混合物重量的0.01-0.5％或0.1-0.3％的終比例加入。
最廣泛應(yīng)用的聚合物是不同分子大小的聚乙二醇(特別地，約6.000-8.000)，但是還可以使用葡聚糖和其它聚合物。所述聚合物具有缺點(diǎn)，----當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)----它們產(chǎn)生在將檢測(cè)樣品與測(cè)定混合物混合時(shí)引入的其它物質(zhì)的非特異性沉淀。另一方面，同時(shí)，所述聚合物提高信號(hào)。然而，它們傾向于減小免疫顆粒的總體結(jié)合容量。聚合物典型地以分別為最終反應(yīng)混合物重量的約0.05-0.5％或0.1-0.3％的終比例加入。
適合離子強(qiáng)度的適合鹽是例如，堿金屬鹵化物，特別是氯化鈉，以1-100mM，或5-50mM的濃度加入。
可以存在于測(cè)定混合物中的其它適當(dāng)?shù)某煞譃? 氨基酸，如甘氨酸，以約1-50mM或5-20mM的終濃度加入； 蛋白質(zhì)，如白蛋白，以0.1-5g/l或0.5-2g/l的終比例加入； 抗微生物試劑，如疊氮鈉，以0.1-10或1-5g/l的終比例加入； 校正劑或?qū)φ瘴镔|(zhì)這些是典型地包括溶解在緩沖物質(zhì)中，典型地是磷酸緩沖液或TRIS緩沖液中的已知濃度的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的溶液，任選地具有一些蛋白質(zhì)物質(zhì)，任選地包括達(dá)到100體積％的人或動(dòng)物血清(如果100體積％是血清，那么對(duì)于緩沖溶液，沒(méi)有空間也沒(méi)有需要)。
此外，一種或多種試劑可以以干燥的、任選地凍干的形式使用。綴合到納米顆粒上的抗體可以以干燥的形式使用，例如，作為顆粒物(pellet)，并且在使用之前溶解，或者可以溶解在測(cè)定緩沖液試劑中或者溶解在反應(yīng)混合物中。反應(yīng)緩沖液中的一種或多種成分可以在實(shí)施所述測(cè)定之前或過(guò)程中以干燥形式加入，校正劑也是這樣。甚至所述樣品可以以干燥的或凍干的形式提供，并且以干燥形式加入到反應(yīng)混合物中，或者在其使用之前溶解。
在臨床化學(xué)分析中，使用用于校正目的的標(biāo)準(zhǔn)曲線是標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐。因此，在實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，可以使用已知半胱氨酸蛋白酶抑制劑C含量的樣品替代臨床樣品，以構(gòu)建待測(cè)量的反應(yīng)/信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且然后，可以通過(guò)從所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)插法而計(jì)算未知樣品的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C含量。
按照顆粒增強(qiáng)的光散射免疫測(cè)定領(lǐng)域中公知的方法，選擇在混合物中納米顆粒-免疫綴合物的總濃度，以致來(lái)源于所述納米顆粒的吸收值不影響準(zhǔn)確的和精確的測(cè)量，但是微粒的濃度足夠高，足以得到信號(hào)發(fā)展。所述量當(dāng)然受到不同的參數(shù)的影響，如體液樣品或來(lái)源其的樣品的體積，以及半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的含量。
作為測(cè)定的非限制性的典型的參數(shù)，可以提及下述 典型的樣品體積是1-20μl，例如2-10μl，或者特別是3μl。
典型的免疫顆粒體積是10-100μl或20-60μl，或者特別是40μl。
所述免疫顆?？梢蕴峁?.5-10或1-5，典型地約2-3，特別是2.26mg顆粒/ml緩沖溶液的混懸液。所述緩沖液可以具有在6-9范圍內(nèi)的pH，例如7-8.5，典型地約pH 8.4。除了緩沖物質(zhì)之外，所述緩沖溶液可以包含其它組分，例如氨基酸、鹽、惰性蛋白質(zhì)和乳化劑或增溶劑，如上文所定義。這樣的組分和緩沖液的典型的混合物包括10mM硼酸鹽緩沖液，10mM甘氨酸，15mM NaCl，0.25％吐溫20和1g/l白蛋白。
典型的總測(cè)定體積是100-1000μl，或200-500μl，或250-300μl，或者特別地約280μl。
不同的儀器使用不同的總體積運(yùn)行，以致這些體積的30％或60％，或者這些體積的150％或300％典型地用于其它的儀器。樣品體積和免疫顆粒體積的比例可以是在1/100-2/3，更優(yōu)選地2/100-1/3，并且甚至更優(yōu)選地1/40-1/5之間的任意值。
d5)醫(yī)學(xué)用途 本發(fā)明的測(cè)定方法可以用于診斷和監(jiān)測(cè)與體液或組織的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C含量相關(guān)的或以此為表現(xiàn)的病理性或潛在的病理性病況。這些特別包括哺乳動(dòng)物的腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR，作為腎功能的測(cè)量)或影響所述濾過(guò)率的病理性病況。
本發(fā)明的方法可以用來(lái)確定兒童的GFR；或者患有肌肉萎縮的患者的GFR；用來(lái)指導(dǎo)腎功能癌癥治療的作用；用來(lái)指導(dǎo)腎臟移植和免疫抑制治療；用來(lái)指導(dǎo)糖尿病的腎臟濾過(guò)率；用于檢測(cè)并且管理驚厥；并且在藥物施用與可能導(dǎo)致體內(nèi)不理想的藥物累積的GFR減少相關(guān)的情形中，用來(lái)發(fā)現(xiàn)正確的藥物劑量。
所述測(cè)定方法還可以用于評(píng)估藥物對(duì)所述濾過(guò)率的作用。
對(duì)于本說(shuō)明書的熟練的技術(shù)人員可以明白其它潛在的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供實(shí)施按照本發(fā)明的免疫測(cè)定的一組試劑。所述試劑組特征在于，包括抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫顆粒，適當(dāng)?shù)臏y(cè)定緩沖液，和任選地，校正劑溶液與對(duì)照溶液。任選地，所述顆?；鞈乙汉蜏y(cè)定緩沖液作為組合的試劑遞送。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供分析產(chǎn)品，任選地以試劑盒或部分的試劑盒形式，用于測(cè)定樣品中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，所述產(chǎn)品包括至少一種如上文所述的以干燥的或混懸形式存在的納米顆粒-免疫綴合物，并且任選地，一種或多種如本文定義的其它組分，例如，適當(dāng)?shù)臏y(cè)定緩沖液，并且任選地，校正溶液和對(duì)照溶液。
本發(fā)明還提供用于實(shí)施按照本發(fā)明的免疫測(cè)定的一組試劑。所述試劑組特征在于，包括，抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫顆粒，適當(dāng)?shù)臏y(cè)定緩沖液，并且任選地，校正劑溶液和對(duì)照溶液。任選地，所述顆?；鞈乙汉蜏y(cè)定緩沖液作為組合的試劑遞送。
任選地，還可以存在信號(hào)評(píng)估的方式，如計(jì)算方案，允許將觀察到的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度與GFR參數(shù)直接相關(guān)。
下述非限制性實(shí)例舉例說(shuō)明本發(fā)明方法的非限制性方式。
實(shí)驗(yàn)部分 合成實(shí)施例1制備多克隆禽類血清及其親和純化 a)制備禽類血清 可以使用下述免疫方法來(lái)產(chǎn)生針對(duì)人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的多克隆IgY抗體 每個(gè)免疫實(shí)驗(yàn)使用2-4只母雞。在免疫開(kāi)始之前，收集一對(duì)卵。從這些卵中純化的IgY將作為對(duì)照IgY。將在磷酸緩沖液中的100μg高度純化的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(從患有腎小管蛋白尿的患者的尿中純化)用弗氏完全佐劑乳化，并且注射到母雞的胸肌中。每4周重復(fù)注射。在注射起始后10周，收集卵。將蛋黃從卵分離，并且通過(guò)氯化銨沉淀，以按照卵抗體分離的現(xiàn)有技術(shù)方法的常規(guī)方式，分離來(lái)自蛋黃的IgY級(jí)分(參見(jiàn)，例如，Larsson A，Baaloew R-M，Lindahl T，和Forsberg P-O，在PoultryScience(家禽科學(xué))中，721807-1812，1993)。
b)多克隆血清的親和純化 按照在柱子的包裝插件中的指示，將10mg高度純化的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C固定在來(lái)自安瑪西亞法瑪西亞生物技術(shù)(AmershamPharmacia Biotech)的HITRAP NHS-活性HP柱上。
將分離的IgY級(jí)分在磷酸緩沖鹽中稀釋至2mg/ml。將200ml的這種IgY溶液流過(guò)柱子，然后是50ml無(wú)IgY的磷酸緩沖鹽。具有對(duì)固定的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的特異性親和力的抗體用35ml 0.1摩爾的檸檬酸鹽緩沖液pH＝3.2洗脫。將洗脫的特異性抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體針對(duì)磷酸緩沖鹽透析，并且使用具有30,000道爾頓的截留分子量的AmiconCentircon離心過(guò)濾裝置濃縮至3mg/ml。
合成實(shí)施例2制備單克隆抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體 單克隆抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體的制備可按照下述實(shí)施，通過(guò)利用本領(lǐng)域公知的方法，例如，由Harlow等，1988，″AntibodiesaLaboratory Manual(抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))″的第6節(jié)，冷泉港出版社，紐約，美國(guó)所述。按照Sensabaugh等，1990，J.Urology(泌尿?qū)W雜志)144，1523所述，從人精液血漿中分離人PSA。
在規(guī)律的時(shí)間間隔，將小鼠用在RAS(RIBI佐劑系統(tǒng))中的50μg人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的4次注射進(jìn)行免疫。在第一次注射后4個(gè)月，使用G.Galfre等，1981，Methods in Enzymology(酶學(xué)方法)，73，3-46所述的聚乙二醇方法，將從免疫的小鼠的脾臟分離的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0-Ag14融合。
分泌針對(duì)半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的抗體的雜交瘤通過(guò)下述篩選ELISA鑒定將微量滴定板用兔抗-人-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫球蛋白包被；將結(jié)合到這種固相上的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C與雜交瘤培養(yǎng)物的上清一起溫育。使用抗-小鼠-免疫球蛋白-過(guò)氧化物酶-綴合物，檢測(cè)與半胱氨酸蛋白酶抑制劑C結(jié)合的單克隆抗體。
可以分離數(shù)百種分泌針對(duì)人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的不同的表位的抗體的雜交瘤。然后，親和純化相對(duì)應(yīng)的單克隆抗體，并且可以進(jìn)行更詳細(xì)地特征性描述。
實(shí)施表位結(jié)合，并且使用BIAcore生物傳感器技術(shù)(法瑪西亞(Pharmacia)，瑞典)，關(guān)于它們的表觀解離常數(shù)確定抗體的相關(guān)反應(yīng)性。后者是基于表面等離振子共振技術(shù)(參見(jiàn)，J.L.Daiss等，1994.在″MethodsA Companion to Methods in Enzymology(方法酶學(xué)方法的指南)″中6，143-156，學(xué)院出版公司(Academic Press Inc.)，紐約，美國(guó))，并且允許監(jiān)測(cè)生物分子反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)和化學(xué)計(jì)量。
從細(xì)胞培養(yǎng)物的上清開(kāi)始，單克隆抗體通過(guò)多克隆兔抗-小鼠-Fc-抗體而結(jié)合到生物傳感器的表面。監(jiān)測(cè)抗原半胱氨酸蛋白酶抑制劑C與所述單克隆抗體的締合和解離。數(shù)據(jù)可以使用內(nèi)在的BIA評(píng)估軟件，基于簡(jiǎn)單的A+B＝AB平衡模型(L.G.Fagerstam等，1992，Journal of Chromatography(層析雜志)，597，397-410)，而進(jìn)行分析。然后，得到的抗體可以關(guān)于它們各自的表觀解離常數(shù)進(jìn)行比較。然后，適當(dāng)?shù)目贵w或它們的組合可以用于制備本發(fā)明的免疫顆粒。
合成實(shí)施例3制備抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫顆粒 a)偶聯(lián)方法-標(biāo)準(zhǔn)方法 (1)緩沖液和試劑
為了具有來(lái)自聚合物顆粒的更多的信號(hào)/mg抗體，將偶聯(lián)緩沖液的pH以特殊方式適合待偶聯(lián)的抗體的pI。另外，在偶聯(lián)之前，將所述抗體用白蛋白/運(yùn)鐵蛋白稀釋(見(jiàn)下文)。對(duì)于偶聯(lián)，當(dāng)使用單克隆抗體時(shí)，選擇高于抗體的pI半個(gè)單位的pH。多克隆抗體具有非常多變的pI，并且因此使用pH 8.8的多克隆抗體。通過(guò)將上文提及的PBS和硼酸鹽緩沖液混合，而獲得所選擇的pH。
下述標(biāo)準(zhǔn)方法概括了通過(guò)抗體與氯甲基的物理吸附而附著的兩種簡(jiǎn)單的一步方法。所述方法用于以1％固體的1μm的氯甲基膠乳。這一反應(yīng)可以容易地放大或縮小，以適合個(gè)別需要。例如，如果使用不同的顆粒大小，那么可以從下式計(jì)算抗體(Ab)的量 Ab的重量＝(用于1μm-顆粒的Ab的重量)/(單位為μm的顆粒直徑) (2)制備膠乳顆?；鞈乙? 1.移取2.5ml(40mg/ml)氯甲基膠乳微球體，并且用10mL MES緩沖液稀釋。
2.將所述混合物離心，以沉淀顆?！?,000G持續(xù)～20分鐘。
3.去除上清，并且將沉淀重新分散在10ml MES緩沖液中。
4.再次離心，并且從顆粒上去除上清。
5.將沉淀重懸在5ml MES緩沖液中，確保完全懸浮微球體顆粒。
現(xiàn)在，所述膠乳混懸液約2％固體(即，～20mg/ml)。
(3)偶聯(lián) 1.向5ml在調(diào)節(jié)到適當(dāng)?shù)膒H(見(jiàn)上文)的PBS/硼酸鹽緩沖液中的1.5mg抗體、3.75mg白蛋白和7mg牛運(yùn)鐵蛋白的溶液中，加入5ml的膠乳。這小于需要的抗體單層。所述抗體與所述運(yùn)鐵蛋白(transferring)和白蛋白相比，與膠乳更具反應(yīng)性，并且或多或少地與膠乳定量結(jié)合，并且其余的膠乳表面由白蛋白和/或運(yùn)鐵蛋白飽和。這種混合物還保證顆粒的抗凝聚和良好的親水性。此外，其它的惰性蛋白質(zhì)可以在綴合過(guò)程中與抗體混合，如

血藍(lán)蛋白、觸珠蛋白以及其它水溶性蛋白，它們對(duì)于所述抗體和半胱氨酸蛋白酶抑制劑C沒(méi)有任何親和力。
2.在室溫下輕輕攪拌，將膠乳/蛋白混合物溫育過(guò)夜。
3.離心，以從未結(jié)合的蛋白質(zhì)分離蛋白-標(biāo)記的膠乳顆粒。
4.去除并且保留用于蛋白質(zhì)確定的上清。在這一步驟，可以保留上清，并且進(jìn)行蛋白確定?？梢詮募尤氲某跏剂恐袦p去上清中的任何殘留的蛋白。將剩余的包被在顆粒上。與膠乳微球體相容的用于蛋白確定的唯一的方法是來(lái)自Pierce的Micro BCA蛋白測(cè)定試劑盒。
5.將沉淀重懸在10ml PBS中。
6.再次離心，以沉淀所述顆粒。
7.再重復(fù)步驟5-6兩次，總共進(jìn)行3次洗滌。
8.將最終的膠乳重懸在10ml儲(chǔ)存緩沖液中，產(chǎn)生1％固體的終濃度。在4℃保存?zhèn)溆?。勿冷凍?br> 將甘氨酸用于儲(chǔ)存緩沖液中，以填充已經(jīng)被蛋白質(zhì)覆蓋的微球體表面上的任何反應(yīng)位點(diǎn)。這是減少非特異性的結(jié)合。如果需要，惰性蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)或牛運(yùn)鐵蛋白，可以用于同樣的目的。存在NaN3作為生物殺滅劑。如果所述膠乳保持無(wú)菌，可以省略與細(xì)胞或組織培養(yǎng)物不相容的NaN3。
b)制備包被的納米顆粒 應(yīng)用上述標(biāo)準(zhǔn)方法包被直徑0.08μm的膠乳顆粒，以制備本發(fā)明的納米顆粒-綴合物。按照上式，24mg的抗體和65mg的白蛋白用來(lái)包被100mg的顆粒。
通過(guò)將來(lái)自挪威的挪威抗體AS(Norwegian Antibodies AS，Norway)的產(chǎn)品號(hào)A167 Cys-C-AF的抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體(所述多克隆抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體對(duì)應(yīng)從用來(lái)自患有慢性腎小管蛋白尿的患者的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫的母雞的卵分離的免疫球蛋白的親和純化的免疫球蛋白級(jí)分；親和純化方法使用固定的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C而進(jìn)行)，偶聯(lián)到氯甲基活化的膠乳顆粒(0.08μm，來(lái)自美國(guó)的界面動(dòng)力學(xué)公司(Intefacial Dynamics Inc.，USA)，產(chǎn)品號(hào)C37487)上，而產(chǎn)生所述抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫顆粒。對(duì)于所述偶聯(lián)，可以使用從http://www.idclatex.com/body-bgrounder-superactive-protocol-11.asp下載的方法“蛋白與IDC超凈氯甲基膠乳的偶聯(lián)(Coupling of Proteins toIDC Ultraclean Chloromethyl Latex)”。
備選的顆粒和偶聯(lián)方法可以在界面動(dòng)力學(xué)公司(Intefacial Dynamics)的網(wǎng)頁(yè)上、Invitrogen的網(wǎng)頁(yè)和Bangs顆粒公司(Bangs Particles Inc)的網(wǎng)頁(yè)上找到。
所獲得的顆粒用作在具有0.25％吐溫20和1g/l白蛋白的10mM硼酸鹽緩沖液，10mM甘氨酸，15mM NaCl中2.26mg顆粒/ml的混懸液。
測(cè)定實(shí)施例1在不同測(cè)定條件下，基于本發(fā)明的免疫顆粒的濁度測(cè)定半胱氨酸蛋白酶抑制劑C測(cè)定 按照合成實(shí)施例3制備的免疫顆?；鞈乙河糜谙率鰧?shí)驗(yàn) 在所述實(shí)驗(yàn)中，使用下述最優(yōu)化的測(cè)定緩沖液pH＝7.2 聚乙二醇(西格瑪(Sigma))22g/l， 吐溫20(西格瑪)3g/l， MOPS(西格瑪)9.4g/l， 疊氮鈉2.7g/l， 氯化鈉27g/l， 將3μl樣品與250μl所述測(cè)定緩沖液混合，并且允許靜止300秒，然后加入40μl顆?；鞈乙翰⑶一旌?。在所述混合之后，在Schimadzu UV 1601分光光度計(jì)中測(cè)量光吸收/cm。
取決于濃度、溫度、加入免疫顆?；鞈乙翰⑶一旌虾蟮臅r(shí)間、以及在分光光度計(jì)中所用光的波長(zhǎng)，獲得下述結(jié)果(mAbs單位/cm＝毫吸收單位/厘米光徑) a)在波長(zhǎng)546nm在37℃260秒測(cè)定時(shí)間內(nèi) 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，33mAbs單位的吸收變化，并且在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，88mAbs單位的吸收變化，并且在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，194mAbs單位的吸收變化。
b)在波長(zhǎng)505nm在37℃260秒測(cè)定時(shí)間內(nèi) 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，43mAbs單位的吸收變化，并且在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，128mAbs單位的吸收變化，并且在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，282mAbs單位的吸收變化。
c)在波長(zhǎng)570nm在37℃260秒測(cè)定時(shí)間內(nèi) 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，24mAbs單位的吸收變化，并且在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，65mAbs單位的吸收變化，并且在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，148mAbs單位的吸收變化。
d)在波長(zhǎng)546nm在37℃120秒測(cè)定時(shí)間內(nèi) 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，11mAbs單位的吸收變化，并且在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，31mAbs單位的吸收變化，并且在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，72mAbs單位的吸收變化。
e)在波長(zhǎng)546nm在37℃40秒測(cè)定時(shí)間內(nèi) 在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，4mAbs單位的吸收變化，并且在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，11mAbs單位的吸收變化，并且在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，23mAbs單位的吸收變化。
所述“測(cè)定時(shí)間”定義為從將免疫顆粒與測(cè)定緩沖液和樣品的混合物混合直到讀取吸收的秒數(shù)。使用來(lái)自美國(guó)埃德-白令(Dade-Behring)的產(chǎn)品號(hào)為OQNM13N膠乳半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的ProSpec比濁法參照方法，確定半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的濃度。
然后，將這些結(jié)果，與更快和更強(qiáng)的濁度測(cè)定信號(hào)一起，用來(lái)研究來(lái)自三酰甘油的干擾的作用，三酰甘油是濁度測(cè)定免疫測(cè)定中常見(jiàn)的干擾物質(zhì)，并且與最好的現(xiàn)有技術(shù)方法相比較，研究本發(fā)明方法的線性。這些實(shí)驗(yàn)描述如下。
測(cè)定實(shí)施例2研究三酰甘油對(duì)本發(fā)明方法的濁度測(cè)量的干擾 本研究的目的是確定本發(fā)明的方法是否在檢測(cè)樣品中經(jīng)歷來(lái)自三酰甘油(TG)的干擾。不管是否發(fā)現(xiàn)干擾低于預(yù)先確定的TG濃度，實(shí)施劑量反應(yīng)研究，以證明干擾與可能干擾的物質(zhì)的濃度之間的關(guān)系。這種方法是基于NCCLS指南“Interference testing in clinical chemistry；approvedguideline(臨床化學(xué)的干擾檢測(cè)；核準(zhǔn)的指南)”，NCCLS第6.1.2部分。
a)裝置 儀器帶有標(biāo)準(zhǔn)附件的日立(Hitachi)917儀器，由羅氏診斷(RocheDiagnostics)提供。
日立917儀器的設(shè)置 ●測(cè)定緩沖液體積230μl ●樣品體積 3μl ●免疫顆粒體積 40μl ●水體積20μl ●一級(jí)波長(zhǎng)546nm ●二級(jí)波長(zhǎng)700nm ●校正稀釋0.055，0.125，0.250，0.432，0.667，1.000 ●Logit Log(4P) b)試劑 測(cè)定緩沖液聚乙二醇(西格瑪)22g/l，吐溫20(西格瑪)3g/l，MOPS(西格瑪)9.4g/l，疊氮鈉2.7g/l，氯化鈉27g/l，pH＝7.2。
校正劑包含7.70mg/l人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的血清，使用關(guān)于ProSpec比濁計(jì)的Dade-Behring’s比濁法由參照實(shí)驗(yàn)室確定。
免疫顆粒按照上述合成實(shí)施例2制備的抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫顆粒。顆粒用作在10mM硼酸鹽緩沖液，10mM甘氨酸，15mM NaCl，0.25％吐溫20和1g/l白蛋白中的混懸液(2.26mg顆粒/ml混懸液)。
c)樣品 血清1具有高于20mmol/l的三酰甘油濃度的人血清的合并液。
血清2具有低于10mmol/l的三酰甘油濃度的人血清的合并液。
這兩種血清樣品用來(lái)制備需要的三酰甘油濃度的樣品。
d)確定在要用的兩種血清合并液中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度 以10次重復(fù)，測(cè)量在要用的兩種血清合并液中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度。
平均值指定所述血清合并液的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C值。
選擇在高于1mg/l的值的+/-5％干擾和在低于1mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的值的+/-7.5％的界限作為允許來(lái)自三酰甘油的最大的干擾。這種不同叫作dmax。
按照NCCLS指南，實(shí)施具有95％置信水平(α＝0.05)和95％冪(β＝0.05)----雙邊檢測(cè)(two-sided test)的這一實(shí)驗(yàn)需要的重復(fù)的數(shù)目(n) 其中s是在所述血清合并液的運(yùn)行精確度內(nèi)(以mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l)。
按照NCCLS指導(dǎo)計(jì)算最少重復(fù) 低樣品 高樣品 結(jié)果表明3次重復(fù)是充分的。
e)制備三酰甘油添加的血清(triglyceride spiked serum) 制備具有約20mmol/l三酰甘油的血清(血清合并液A)。由獨(dú)立的服務(wù)實(shí)驗(yàn)室確定三酰甘油的含量。將這部分血清的一半添加來(lái)自英國(guó)Scipac有限公司的純化的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，得到高于3mg/l的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C值(血清合并液B)。
將一半的血清合并液A和B通過(guò)在Beckman TL-100超高速離心機(jī)中以50,000rpm超高速離心30分鐘進(jìn)行處理。樣品的澄清部分用作對(duì)照合并液，并且對(duì)于去除的脂質(zhì)的體積校正體積。(分別命名為血清合并液C和D)。
f)分析運(yùn)行 制備基本合并液混合物和對(duì)照合并液混合物A，B，C和D每一種的三份等分試樣。
按照用法說(shuō)明校正儀器，并且以交替的順序進(jìn)行基本合并液混合物和對(duì)照合并液混合物(合并液A，B，C和D)的分析。
如果觀察到干擾，制備來(lái)自0％和100％的合并液的50％的中等合并液。從中等合并液和0％的合并液，制備25％的合并液。從中等合并液和100％的合并液，通過(guò)將等量的每種合并液混合而制備75％的合并液。在具有新的校正的一次運(yùn)行中隨機(jī)測(cè)量全部的n次重復(fù)。
對(duì)于0％的合并液，計(jì)算平均濃度，并且從所有其它的結(jié)果中減去。
g)數(shù)據(jù)分析的凈結(jié)果 g1)高半胱氨酸蛋白酶抑制劑C值樣品
g2)低半胱氨酸蛋白酶抑制劑C值樣品
觀察到，按照指定的檢測(cè)條件，在低于18mmol/l濃度的TG不干擾本發(fā)明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測(cè)定。
因此，可以推論，本發(fā)明提供用于半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的濁度測(cè)定免疫測(cè)定方法，其特征在于，在檢測(cè)樣品中的15mmol/l的三酰甘油對(duì)在3.2和0.83mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l水平的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的測(cè)量值具有等于或小于5％的干擾。
測(cè)定實(shí)施例3確定TG對(duì)現(xiàn)有技術(shù)測(cè)定的干擾 使用日立(Hitachi)917儀器和現(xiàn)有技術(shù)試劑(Dako Cytomation)進(jìn)行相應(yīng)的研究。
a)試劑 免疫顆粒 LX002/EFG/CS/25.10.04 校正劑X0974/EFG/SUM/09.09.04 對(duì)照組X0973/EFG/SUM/09.09.04 反應(yīng)緩沖液9 S2361/EFG/KGR/09.07.03 b)結(jié)果 b1)高半胱氨酸蛋白酶抑制劑C值樣品，現(xiàn)有技術(shù)試劑

b2)低半胱氨酸蛋白酶抑制劑C值樣品，現(xiàn)有技術(shù)試劑

從上述表格，我們可以推論，本發(fā)明的方法更穩(wěn)定地抵抗來(lái)自三酰甘油的干擾。
測(cè)定實(shí)施例4使用本發(fā)明的方法進(jìn)行線性研究 本研究按照NCCLS方法EP6-A，卷23，No 16進(jìn)行。
在本實(shí)驗(yàn)中，研究了本發(fā)明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測(cè)定的線性。這通過(guò)將3份不同的添加高血清的樣品用低濃度的血清樣品稀釋，從0-100％而進(jìn)行。通過(guò)繪制稀釋系列的結(jié)果并且通過(guò)一階、二階和三階回歸分析研究所述圖，我們推論，按照給定的標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測(cè)定方法是線性的。所述標(biāo)準(zhǔn)是通過(guò)斯氏t-檢驗(yàn)而檢驗(yàn)并且比較圖的參數(shù)，以查看測(cè)量點(diǎn)(針對(duì)稀釋因子繪圖)是否能夠比一階多項(xiàng)式更好地?cái)M合二階或三階多項(xiàng)式。如果t-檢驗(yàn)失敗了，我們接受在一階多項(xiàng)式和具有最低chi平方值的高階多項(xiàng)式之間6％的差異，其與每個(gè)水平的測(cè)量的平均值相關(guān)(除了在終點(diǎn)之外，在那里，由于人們很少或從不測(cè)量具有在這一區(qū)域的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度的樣品的事實(shí)，所以，可以接受達(dá)到25％的差異)。按照這些標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測(cè)定方法在日立(Hitachi)911測(cè)量系統(tǒng)上是線性的。
a)儀器 使用日立(Hitachi)911儀器。
b)試劑 使用上述測(cè)定緩沖液和半胱氨酸蛋白酶抑制劑C校正劑以及抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫顆粒。
c)樣品 3份不同患者血清樣品，A，B和C，其中所有的樣品具有高于6mg/l的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C值。
一份具有低半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度，低于0.8mg/l的患者血清樣品用作高血清的稀釋劑。
血漿樣品A，B和C的稀釋系列如在表1中關(guān)于樣品A所述。
使用低樣品D，將每份樣品A，B和C稀釋10次，制備從初始濃度的100％-0％，其中100％是純的高濃度血清(A100，B100，C100)，并且0％是純的低濃度血清(D100)。
表1.關(guān)于血清樣品A的稀釋表 進(jìn)行如表1所述的樣品B和樣品C的相同的稀釋系列。
使用下述測(cè)定參數(shù)，進(jìn)行關(guān)于日立(Hitachi)911的校正，以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 ○測(cè)定體積230μl ○樣品體積3μl ○免疫顆粒體積40μl ○水體積 10μl 每一份稀釋的樣品以3次重復(fù)測(cè)量，并且記錄每份樣品A，B和C的結(jié)果。
d)結(jié)果 d1)回歸分析 表1原始數(shù)據(jù)血清1 表2原始數(shù)據(jù)血清2 表3原始數(shù)據(jù)血清3 對(duì)于所有三種血清，使用回歸分析，測(cè)量的平均值相對(duì)于稀釋因子的圖顯示在

圖1，2和3中。
d2)斯氏t-檢驗(yàn) 進(jìn)行斯氏t-檢驗(yàn)，以檢驗(yàn)高階回歸參數(shù)是否擬合所述數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示在表4中
表4斯氏t-檢驗(yàn)值 血清1 從表4中，由于計(jì)算的t-值小于列表顯示的t-值，所以，我們推論，來(lái)自血清1的數(shù)據(jù)不擬合二階多項(xiàng)式。
從表4中，我們推論，所述數(shù)據(jù)可以擬合更高階的多項(xiàng)式，并且我們需要檢驗(yàn)在一階多項(xiàng)式和具有最低的chi平方值的更高階多項(xiàng)式之間的差異是否大于6％。三階多項(xiàng)式具有最低的chi平方值。
DL＝P(x)-L(x)， 其中P(x)是多項(xiàng)式方程，并且L(x)是線性方程。
表5DL(％)計(jì)算血清1 關(guān)于血清1的DL(％)圖顯示在圖4中。
血清2 從表4中，由于計(jì)算的t-值小于列表顯示的t-值，所以，我們推論，來(lái)自血清2的數(shù)據(jù)不擬合二階多項(xiàng)式。
由于計(jì)算的t-值小于列表顯示的t-值，所以，從中我們推論，來(lái)自血清2的數(shù)據(jù)不擬合三階多項(xiàng)式，并且認(rèn)為稀釋系列是線性的。
血清3 從表4中，由于計(jì)算的t-值小于列表顯示的t-值，所以，我們推論，來(lái)自血清3的數(shù)據(jù)不擬合二階多項(xiàng)式。
從表4中，我們推論，所述數(shù)據(jù)可以擬合更高階的多項(xiàng)式，并且我們需要檢驗(yàn)在一階多項(xiàng)式和具有最低的chi平方值的更高階多項(xiàng)式之間的差異是否大于5％(DL)。三階多項(xiàng)式具有最低的chi平方值。
DL＝P(x)-L(x)， 其中P(x)是多項(xiàng)式方程，并且L(x)是線性方程。
表6DL(％)計(jì)算血清3 關(guān)于血清3的DL(％)圖顯示在圖5中。
從上述計(jì)算和對(duì)線性的規(guī)格設(shè)置，我們發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測(cè)定在約0.6-8.5mg/l的檢測(cè)范圍內(nèi)是線性的。
由于參考區(qū)間包含在這一范圍內(nèi)，并且已測(cè)量高于8mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度，所以，記錄的線性范圍對(duì)于本方法的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測(cè)定的全部臨床目的是充分的。
從本研究可以推論，按照本發(fā)明用于半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的濁度測(cè)定免疫測(cè)定方法特征在于，在1.32-7.5mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的測(cè)量范圍內(nèi)，具有小于4％的線性偏差，并且在0.75-7.5mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的測(cè)量范圍內(nèi)，小于15％的線性偏差。
測(cè)定實(shí)施例5關(guān)于按照本發(fā)明的方法的線性研究 本研究按照NCCLS方法EP6-A，卷23，No 16進(jìn)行。
在本實(shí)驗(yàn)中，研究了本發(fā)明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測(cè)定的線性。這通過(guò)將添加的高血清樣品用低濃度的血清樣品稀釋，從0-100％而進(jìn)行。通過(guò)繪制稀釋系列的結(jié)果并且通過(guò)一階、二階和三階回歸分析研究所述圖，我們推論，按照給定的標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測(cè)定方法是線性的。所述標(biāo)準(zhǔn)是通過(guò)斯氏t-檢驗(yàn)而檢驗(yàn)并且比較圖的參數(shù)，以查看測(cè)量點(diǎn)(針對(duì)稀釋因子繪圖)是否能夠比一階多項(xiàng)式更好地?cái)M合二階或三階多項(xiàng)式。如果t-檢驗(yàn)失敗了，我們接受在一階多項(xiàng)式和具有最低的chi平方值的更高階多項(xiàng)式之間6％的差異，其與在每一水平的測(cè)量平均值相關(guān)(除了在終點(diǎn)之外，在那里，由于人們很少或從不測(cè)量具有在這一區(qū)域的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度的樣品的事實(shí)，所以，可以接受達(dá)到25％的差異)。按照這些標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測(cè)定方法在Architect ci8200測(cè)量系統(tǒng)上是線性的。
a)儀器 使用Architect ci8200儀器。
b)試劑 使用上述測(cè)定緩沖液和半胱氨酸蛋白酶抑制劑C校正劑以及抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫顆粒。
c)樣品 一份患者血清樣品，A，其具有高于6mg/l的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C值。
一份患者血清樣品，D，其具有低于0.8mg/l的低半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度，用作高血清的稀釋劑。
血漿樣品A的稀釋系列，如在表1中所述。使用低樣品D，將樣品稀釋10倍，從初始濃度的100％-0％，其中100％是純的高濃度血清(A100)，并且0％是純的低濃度血清(D100)。
表7.血清樣品A的稀釋表 使用下述測(cè)定參數(shù)，進(jìn)行關(guān)于日立(Hitachi)911的校正，以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 ○測(cè)定體積220μl ○樣品體積3μl ○免疫顆粒體積45μl 每一份稀釋的樣品以3次重復(fù)測(cè)量，并且記錄樣品A的結(jié)果。
d)結(jié)果 d1)回歸分析 表8原始數(shù)據(jù)血清A 使用回歸分析，對(duì)于血清A測(cè)量的平均值相對(duì)于稀釋因子的圖顯示在圖6，7和8中。
d2)斯氏t-檢驗(yàn)
表9斯氏t-檢驗(yàn)值 血清A 從表9中，由于計(jì)算的t-值小于列表顯示的t-值，所以，我們推論，來(lái)自血清A的數(shù)據(jù)不擬合二階多項(xiàng)式。
從表9中，我們推論，所述數(shù)據(jù)可以擬合更高階的多項(xiàng)式，并且我們需要檢驗(yàn)在一階多項(xiàng)式和具有最低的chi平方值的更高階多項(xiàng)式之間的差異是否大于6％。三階多項(xiàng)式具有最低的chi平方值。
DL＝P(x)-L(x)， 其中P(x)是多項(xiàng)式方程，并且L(x)是線性方程。
表10DL(％)計(jì)算 從上述計(jì)算和對(duì)線性的規(guī)格設(shè)置，我們發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測(cè)定在約0.6-8.8mg/l的檢測(cè)范圍內(nèi)是線性的。
由于參考區(qū)間包含在這一范圍內(nèi)，并且已測(cè)量高于8mg/l的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度，所以，記錄的線性范圍對(duì)于本方法的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測(cè)定的全部臨床目的是充分的。
從本研究可以推論，按照本發(fā)明用于半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的濁度免疫測(cè)定方法特征在于，在1.32-7.5mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的測(cè)量范圍內(nèi)，具有小于4％的線性偏差，并且在0.75-7.5mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的測(cè)量范圍內(nèi)，小于15％的線性偏差。
測(cè)定實(shí)施例6關(guān)于現(xiàn)有技術(shù)濁度測(cè)定的線性研究 a)分析 使用現(xiàn)有技術(shù)方法和設(shè)置，按照Camilla Schmidt在journal EuropeanClinical Laboratory(歐洲臨床實(shí)驗(yàn)室雜志)，2004年2月10日，“CystatinC-The marker of choice for renal function testing(半胱氨酸蛋白酶抑制劑C-腎功能檢測(cè)的選擇標(biāo)記”，以及在所述文獻(xiàn)中提及的Dako產(chǎn)品的包裝插件，進(jìn)行與測(cè)定實(shí)施例4相對(duì)應(yīng)的研究，獲得下述結(jié)果 b)結(jié)果 b1)回歸分析 對(duì)于所有三份血清A，B和C，使用回歸分析，測(cè)定的平均值相對(duì)于稀釋因子的圖顯示在圖10，11和12中。
b2)斯氏t-檢驗(yàn) 進(jìn)行斯氏t-檢驗(yàn)，以檢驗(yàn)更高階回歸參數(shù)是否擬合所述數(shù)據(jù)。對(duì)應(yīng)的值總結(jié)在表11中

表11斯氏t-檢驗(yàn)值 血清1 數(shù)據(jù)可能擬合更高階多項(xiàng)式，并且我們需要檢驗(yàn)在一階多項(xiàng)式和具有最低的chi平方值的更高階多項(xiàng)式之間的差異是否大于6％(DL)。所述三階多項(xiàng)式具有最低chi平方值。差異(DL)為 表12DL(％)計(jì)算 關(guān)于血清1的DL(％)圖顯示在圖13中。
血清2 數(shù)據(jù)可能擬合更高階多項(xiàng)式，并且我們需要檢驗(yàn)在一階多項(xiàng)式和具有最低的chi平方值的更高階多項(xiàng)式之間的差異是否大于6％(DL)。所述三階多項(xiàng)式具有最低chi平方值。
差異(DL)為 表13DL(％)計(jì)算 關(guān)于血清2的DL(％)圖顯示在圖14中。
血清3 這意味著，數(shù)據(jù)可能擬合更高階多項(xiàng)式，并且我們需要檢驗(yàn)在一階多項(xiàng)式和具有最低的chi平方值的更高階多項(xiàng)式之間的差異是否大于6％(DL)。所述三階多項(xiàng)式具有最低chi平方值。
差異(DL)為 表14DL(％)計(jì)算 關(guān)于血清3的DL(％)圖顯示在圖15中。
我們推論，在參照范圍的下限部分，通過(guò)Dako半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測(cè)定示例的濁度測(cè)定法免疫測(cè)定的現(xiàn)有技術(shù)不是令人滿意的線性的。
測(cè)定實(shí)施例7本發(fā)明的濁度測(cè)定與比濁度參照方法的相關(guān)性 參考2005年春季C.Schmidt，C.

和K

的公布“Newimproved automated particle-enhanced turbidimetric immunoassay forquantitative determination of human Cystatin C in serum and plasma(用于定量確定血清和血漿中的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的新改進(jìn)的自動(dòng)化顆粒-增強(qiáng)的濁度免疫測(cè)定)”，其可從Dako Cytomation網(wǎng)頁(yè)下載。在使用來(lái)自埃德-白令(Dade-Behring)的比濁法參照方法的相關(guān)性研究中，他們發(fā)現(xiàn)+0.214的截取，以及在相關(guān)性曲線中0.6954的增量/斜率。這是與所述參照方法的大的差異。
由于上述原因，通過(guò)本發(fā)明，提供比所述參照方法具有好得多的相關(guān)性的方法。
a)測(cè)定條件 在本實(shí)驗(yàn)中，在瑞典烏普薩拉的Akademiska大學(xué)醫(yī)院(AkademiskaUniversity Hospital)，將本發(fā)明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測(cè)定，其使用如上文所述的日立917儀器的設(shè)置，與在BN ProSpec上的埃德-白令(Dade-Behring)半胱氨酸蛋白酶抑制劑C方法進(jìn)行比較，其通過(guò)用兩種方法一式兩份測(cè)量相同的51份血清樣品(在同一種校正劑和同一天)，并且將它們使用偏性分析(bias analysis)和線性回歸分析進(jìn)行比較。另外，確定與埃德-白令(Dade-Behring)置信上限的差異，也叫作醫(yī)學(xué)決定點(diǎn)(Medical Decision point)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析按照NCCLS方法EP-2，卷22，No.19的推薦。
b)結(jié)果 下述附圖16，17和18表示所述結(jié)果。所述附圖16，17和18表明，本發(fā)明的方法令人吃驚地提供具有非常好的準(zhǔn)確性的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C測(cè)量，其使得結(jié)果沒(méi)有顯著不同于比濁法參照方法。在50份檢測(cè)樣品的所述研究中，在兩種方法之間沒(méi)有顯著的偏性?？偣泊嬖?.023的偏性，具有-0.023到+0.0658的95％置信區(qū)間；本質(zhì)上，沒(méi)有顯著不同于0的偏性。
埃德-白令(Dade-Behring)半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測(cè)定具有0.95mg/l的醫(yī)學(xué)決定點(diǎn)。使用線性回歸分析，我們發(fā)現(xiàn)，用Dade Behring方法測(cè)量為0.95mg/l的樣品，使用按照本發(fā)明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測(cè)定方法，將測(cè)量在0.83-0.89mg/l之間。血漿方法比較分析導(dǎo)致0.968的相關(guān)性曲線斜率，具有0.103mg/l的截取。這意味著，所述血漿分析的斜率和截取落在血清分析的斜率和截取的置信區(qū)間內(nèi)。
這證明，與濁度測(cè)定方法技術(shù)先前的最好狀態(tài)相比，本發(fā)明的方法導(dǎo)致與比濁法參照方法好得多的相關(guān)性。
上文提及的公布“New improved automated particle-enhancedturbidimetric immunoassay for quantitative determination of human Cystatin Cin serum and plasma(用于定量確定在血清和血漿中的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的新改進(jìn)的自動(dòng)化顆粒-增強(qiáng)的濁度測(cè)定法免疫測(cè)定)”證明，濁度測(cè)定半胱氨酸蛋白酶抑制劑C測(cè)量可以用來(lái)估計(jì)腎小球?yàn)V過(guò)率。這也由Grubb等在Clinical Chemistry(臨床化學(xué))518，1420-1431中的公布“SimpleCystatin C-Based Prediction Equations for Glomerular Filtration RateCompared with the Modification of Diet in Renal Disease Prediction Equationfor Adults and the Schwartz and the Counahan-Barratt Prediction Equations forChildren(單純基于半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的腎小球?yàn)V過(guò)率預(yù)測(cè)方程與用于成年人的腎病預(yù)測(cè)方程和用于兒童的Scwartz和Counahan-Barratt預(yù)測(cè)方程中的飲食改進(jìn)的比較)”證明。使用比濁法參照方法的類似公布是A.Larsson等，在Scand.J.Lab.Invest.(斯堪的納維亞實(shí)驗(yàn)室研究雜志)2004；64，25-30中的“Calculation of glomerular filtration rate expressed in ml/minfrom plasma Cystatin C values in mg/l(來(lái)自以mg/l的血漿半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的表示為ml/min的腎小球?yàn)V過(guò)率的計(jì)算)”。按照本發(fā)明的方法，其與比濁法方法具有更好的相關(guān)性，當(dāng)然比現(xiàn)有技術(shù)濁度測(cè)定測(cè)量方法甚至更好地適用于這一目的。
權(quán)利要求
1.用于評(píng)估人體液樣品中的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的濁度測(cè)定法免疫測(cè)定，其通過(guò)下列步驟進(jìn)行
a)通過(guò)將所述樣品與包含適用于濁度測(cè)定法測(cè)量的納米顆粒的納米顆粒-抗體綴合物接觸而形成測(cè)定混合物，其中所述納米顆粒用抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體或其抗原結(jié)合片段包被，以結(jié)合所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，其中所述包被的納米顆粒具有至少40nm范圍內(nèi)的中值直徑，并且
b)通過(guò)測(cè)量所述混合物的濁度的變化而評(píng)估所述人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的含量。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體是針對(duì)人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的多克隆非人、非嚙齒動(dòng)物抗體。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述多克隆抗體是針對(duì)人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的禽類抗體。
4.權(quán)利要求2和3中任一項(xiàng)的方法，其中至少25重量％的所述多克隆抗體或片段通過(guò)使用人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C親和純化而獲得。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體包括(a)結(jié)合人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的單一表位的單克隆抗體，或(b)一組兩種或多種種類的單克隆抗體，其中每種種類的單克隆抗體結(jié)合人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的不同的表位，或者兩種或多種種類以不同的結(jié)合強(qiáng)度而結(jié)合相同的表位。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述單克隆抗體是非人來(lái)源的。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述包被的納米顆粒具有大于58nm的平均直徑。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述包被的納米顆粒具有80-105nm范圍內(nèi)的平均直徑。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述包被的納米顆粒用約5-35％的抗體/所述納米顆粒-抗體綴合物的總重而包被。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述包被的納米顆粒用抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體和至少一種惰性蛋白質(zhì)的混合物包被。
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，所述納米顆?；旧嫌删郾揭蚁⒕勐纫蚁?、環(huán)氧樹脂、聚偏1，1-二氯乙烯、聚-α-萘基甲基丙烯酸酯、聚乙烯萘、以及它們相對(duì)應(yīng)的共聚物制成。
12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述濁度變化通過(guò)在所述測(cè)定混合物在500-600nm范圍的波長(zhǎng)，以及在10-50℃范圍內(nèi)的溫度的光吸收的變化而測(cè)量。
13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述關(guān)于波長(zhǎng)546nm的光的濁度的變化，表示為mAbs單位/cm，是
在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于15mAbs單位/cm，或者
在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于30mAbs單位/cm，或者
在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于75mAbs單位/cm。
14.按照權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述關(guān)于波長(zhǎng)505nm的光的濁度的變化，表示為mAbs單位/cm，是
在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于20mAbs單位/cm，或者
在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于50mAbs單位/cm，或者
在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于90mAbs單位/cm。
15.按照權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述關(guān)于波長(zhǎng)570nm的光的濁度的變化，表示為mAbs單位/cm，是
在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于10mAbs單位/cm，或者
在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于30mAbs單位/cm，或者
在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于80mAbs單位/cm。
16.按照權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中如果在形成所述混合物后，將所述混合物在32℃保持600秒，所述關(guān)于波長(zhǎng)546nm的光的濁度的變化，表示為mAbs單位/cm，是
在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于12mAbs單位/cm，或者
在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于25mAbs單位/cm，或者
在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于70mAbs單位/cm。
17.按照權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持120秒，所述關(guān)于波長(zhǎng)546nm的光的濁度的變化，表示為mAbs單位/cm，是
在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于8mAbs單位/cm，或者
在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于20mAbs單位/cm，或者
在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于50mAbs單位/cm。
18.按照權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持120秒，所述關(guān)于波長(zhǎng)546nm的光的濁度的變化，表示為mAbs單位/cm，是
在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于15mAbs單位/cm，或者
在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于30mAbs單位/cm，或者
在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于75mAbs單位/cm。
19.按照權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持40秒，所述關(guān)于波長(zhǎng)546nm的光的濁度的變化，表示為mAbs單位/cm，是
在所述測(cè)定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于4mAbs單位/cm，或者
在所述測(cè)定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于7mAbs單位/cm，或者
在所述測(cè)定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于15mAbs單位/cm。
20.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于----當(dāng)構(gòu)建針對(duì)比濁法的相關(guān)性曲線時(shí)----關(guān)于用比濁法獲得的0mg/l半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的相對(duì)應(yīng)值，用濁度測(cè)定方法獲得的是小于0.15mg/l半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的截取值。
21.按照權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的方法，其特征在于----當(dāng)構(gòu)建針對(duì)非均相免疫測(cè)定方法的相關(guān)性曲線時(shí)----對(duì)于0mg/l半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的相對(duì)應(yīng)值獲得小于0.25mg/l半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的截取值。
22.按照權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，在所述檢測(cè)的樣品中，對(duì)于在1.2mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l水平的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的測(cè)量值，具有來(lái)自15mmol/l三酰甘油的小于6％的干擾。
23.按照權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，在1.32-7.5mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的測(cè)量范圍內(nèi)，具有低于5％的線性偏差，并且在0.75-1.32mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的測(cè)量范圍的測(cè)量區(qū)域內(nèi)，具有低于15％的線性偏差。
24.按照權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，通過(guò)測(cè)量吸收增加的初始速率而確定樣品的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度，(a)通過(guò)在混合時(shí)直接記錄，或者(b)通過(guò)在混合后立即記錄，與吸收的初始增加的后推組合，或者(c)通過(guò)在樣品和試劑混合后測(cè)量在兩個(gè)或多個(gè)小于1分鐘的時(shí)間點(diǎn)之間的吸收差異而確定。
25.一種用于評(píng)估哺乳動(dòng)物的腎小球?yàn)V過(guò)率的方法，所述方法包括按照權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的濁度測(cè)定法評(píng)估。
26.用于實(shí)施權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的方法的試劑盒或試劑組，其包括(a)顆粒，其包括以干燥或混懸形式存在的在前述權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)中定義的抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫顆粒，(b)以干燥或溶解形式存在的測(cè)定緩沖液，以及，任選地，(c)分別以干燥或溶解形式存在的校正劑混合物和對(duì)照混合物。
27.權(quán)利要求26的試劑盒，其中所述顆粒和測(cè)定緩沖液以干燥或混懸的形式組合提供。
28.按照權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的定義的納米顆粒-抗體綴合物。
29.權(quán)利要求28的納米顆粒-抗體綴合物在用于評(píng)估人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫測(cè)定中或在用于評(píng)估哺乳動(dòng)物的腎小球?yàn)V過(guò)率的診斷方法中的應(yīng)用。
30.權(quán)利要求28的納米顆粒-抗體綴合物在用于評(píng)估人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫測(cè)定中或在用于評(píng)估腎功能障礙的診斷方法中的應(yīng)用。
全文摘要
需要用于生物樣品，特別是人的體液臨床樣品中的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的改進(jìn)的濁度測(cè)定法免疫測(cè)定。本發(fā)明提供能夠通過(guò)濁度測(cè)定方法測(cè)量人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的濁度測(cè)定免疫測(cè)定方法和試劑組，其令人驚訝地導(dǎo)致比現(xiàn)有狀態(tài)的技術(shù)更強(qiáng)和更快的濁度測(cè)定信號(hào)。提高的和更快的信號(hào)通過(guò)使用新的試劑和組合物而獲得，并且能夠獲得更短的測(cè)定時(shí)間和具有更強(qiáng)的信號(hào)的動(dòng)力學(xué)讀數(shù)，提高了整體測(cè)定速率和質(zhì)量。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了針對(duì)脂質(zhì)干擾的提高的穩(wěn)定性和提高的線性。
文檔編號(hào)G01NGK101356438SQ200680043918
公開(kāi)日2009年1月28日 申請(qǐng)日期2006年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月24日
發(fā)明者卡特林·森德, 湯姆·尼爾森 申請(qǐng)人:根田股份有限公司