專利名稱：微觀元素多參數(shù)分析設備和方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及微觀元素分析領域，具體地說，涉及用光對微觀元素進行表征和計數(shù)的設備。
在這里，“微觀元素”是指任何外形尺寸極微小的元素，特別是生物微?；蚣毎?原核細胞和真核細胞)。

背景技術(shù)：
在活體外診斷領域(值得注意的是血液計數(shù)或流式血細胞計數(shù))中，常規(guī)是使用基于光與各種構(gòu)成樣本的微觀元素之間的交互作用的表征和計數(shù)設備，以便獲得這些微觀元素的定性和定量信息。
在廣泛使用的技術(shù)中，可以特別提到的有包括透射、衍射、反射和折射的稱為散射技術(shù)和包括發(fā)熒光和發(fā)磷光的稱為光致發(fā)光的技術(shù)。它們可以獲得特別是形狀、體積、大小、顏色、密度、結(jié)構(gòu)、生化性質(zhì)和/或粒度分布的單獨或組合信息。
然而，用流式血細胞計數(shù)這種普通的技術(shù)得到的生物元素特別是血球的表征基于有限的變量和細胞鑒別可能性。
每個測量原理是比較簡易的物理方法，而同時進行多重測量導致可能干擾以后的測量的交互作用，使得以后的測量無法使用。因此，實現(xiàn)多個測量受到避免這些交互作用的能力的限制。
在市場上現(xiàn)有的血液分析器和流式血細胞計數(shù)器中，元素通常用稱為Wallace Coulter方法的阻抗測量的電子方法或光學方法(散射、光致發(fā)光)檢測。
例如，體積和折射率可以根據(jù)單個波長和兩個不同的觀測角度從散射分析結(jié)果推斷。這種檢測模式例如可參見TECHNICON儀器公司的專利US 4,735,504。在這個專利中所揭示的光學系統(tǒng)使用對在兩個不同角度范圍內(nèi)衍射的光的測量，使各元素的體積和折射率可以通過將它們的光響應與在體積和折射率上標定的元素的光響應相比較分離出來。這些數(shù)據(jù)值的處理基于由Gustav MIE開發(fā)的球狀顆粒光散射原理，在網(wǎng)址<http://en.wikipedia.org/wiki/Mie_scattering>處有值得注意的說明。
在流式細胞計中，普遍接受的是，對在接近光軸(FSC(“前向散射”)或軸上衍射)的角度范圍內(nèi)的衍射的測量可以得到所分析的微觀元素的體積的指示。此外，與光軸正交散射(或“側(cè)向散射”，或者是以90°散射)的光表示了元素的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。這些特征與進行測量的角度和波長密切相關。
注意到發(fā)熒光是在可激勵分子受到波長為它的特征波長之一的光能激勵后返回到基態(tài)時所出現(xiàn)的現(xiàn)象。發(fā)射的熒光始終出現(xiàn)在比激勵頻率低的頻率。熒光發(fā)射基本上是無方向性的。通常不在入射光的激勵軸上進行測量，通過濾波器發(fā)送給檢測器的只是所關心的光譜頻帶。
在熒光中所使用的分子探針(probe)可以是對特定類型的微粒有內(nèi)在親和力的活體或離體活體染料?？梢蕴貏e提到的是核酸的添加染料，諸如橙噻唑、O槐黃、Y二苯氧芑胺之類，或者由附有染色標志(通常是單一或縱列熒光染料，或者有時是納米晶體)的抗體組成的免疫探針。
這種通過實現(xiàn)免疫探針進行標記的模式對于細胞識別特別是按照上面所說明的流式細胞計技術(shù)進行細胞識別已經(jīng)非常普遍。Ortho診斷公司的專利EP 0022670揭示了用流式細胞計識別各種細胞(通過它們的抗原決定基)的情況。這個專利中所揭示的技術(shù)打開了非常廣泛地開發(fā)現(xiàn)在公認為有效、安全和可靠的細胞識別技術(shù)的免疫表現(xiàn)的大門。
然而，可以執(zhí)行多參數(shù)細胞學分析而不使用抗原性識別。因此，在文獻“采用熒光染料著色和流式儀器的復合血細胞計數(shù)和分類”(“Combined Blood Cell Counting Blood Cell Counting andClassification with Fluorochrome Stains and Flow Instrumentation”，J.of Histochem.Cytochem Vo 124.No.1，pp.396-411，1976)中，Howard M.Shapiro揭示了用執(zhí)行吸收、衍射和熒光測量的多參數(shù)細胞計進行的對血細胞的一般分類，其中使這些元素與核酸和蛋白質(zhì)的特定熒光染料的混合物接觸。
同時，增加分析器內(nèi)的熒光測量波長允許使用更多的標記，從而使用更多的抗體，如John A.Steinkamp在文獻“流式細胞計多色熒光測量的模塊化檢測器”(“A Modular Detector for Flow CytometricMulticolor fluorescence”，1987，Cytometry 8353-365)中所指出的那樣，但是也大大增大了設備和實現(xiàn)它們的復雜性。
使用由單一波長激勵的復合染料很快就呈現(xiàn)出一些由于它們的激勵和/或它們的熒光發(fā)射的光譜重疊而引起的限制。
為了克服光譜重疊的這些問題，通常使用稱為“補償”的校正方法，這些方法都包括減小所分析的微觀元素的與其他微觀元素光譜重疊的部分的熒光信號，如在文獻“流式細胞計的光譜補償顯形膺象、局限性和注意事項”(“spectral compensation for FlowCytometryVisualization Artifacts，Limitations and Caveats”，MarioRoederer 2001，Cytometry 45，pp.194-205)中所指出的那樣。
補償所引起的一個問題是以平均值來計算這些補償，而且對于一組給定的熒光染料來說補償值計算不能一勞永逸。確實，同屬于一族的熒光染料的物理性質(zhì)變化范圍很寬，值得注意的是取決于供貨源。同樣的產(chǎn)品來自不同廠家的因此就會導致不同的補償設置。這在診斷方面就特別成問題，因為供貨源的失控會導致錯誤的因此可能是危險的測量結(jié)果。例如，為了接受如在值得注意的Carleton C·Steward和Sigrid J.Stewart的論文“四色補償”(“Four color compensation”，Cytometry，Vol.38，pp.161-175，1999)中所說明的決定性的軟件補償，PE-TR轉(zhuǎn)移的效率和所使用的抗體的特性都不夠穩(wěn)定。
使用幾個激勵波長可以更寬地選擇需敞開的染料，并且可以更容易地使發(fā)射光譜分開。不同的激勵波長在測量槽內(nèi)經(jīng)常是空間分開的，在這種情況下提供了進行幾個獨立測量的優(yōu)點，如J.Steinkamp在論文“經(jīng)改善的用于細胞和微粒分析和分類的多激光器/多參數(shù)流式細胞計”(“Improved multilaser/multiparameter flow cytometer foranalysis and sorting of cells and particles”，John A.Steinkamp，Robert C.Habbersett，and Richard D.Hiebert；Review of ScientificInstruments Vol 62(11)pp.2751-2764，November 1991)中所揭示的。這種方法的問題是，空間錯位導致響應中的時間相移，而重新調(diào)整信息必須在下游通過以模擬方式延遲信息或者通過用軟件措施重新調(diào)整測量結(jié)果來實現(xiàn)。
增加激勵波長(特別是激光源)連同熒光和其他光參數(shù)的測量結(jié)果導致實現(xiàn)中工藝復雜和明顯困難，例如在論文“使用3激光器流式細胞計的9色11參數(shù)免疫表現(xiàn)”(“Nine Color Eleven ParameterImmunophenotyping Using Three Laser Flow Cytometry”，MartinBigos 1999，Cytometry 36，pp.36-45)中所揭示的那樣。
判讀結(jié)果中出錯的風險隨著參數(shù)的增加而增加，而使用這些儀器需要非常專業(yè)的技術(shù)人員，而且要冒著得到會是不適當和錯誤的因而可能是危險的結(jié)果的風險。
補償?shù)囊粋€限制是它的臨界狀況隨著熒光染料的數(shù)目而增加，這與熒光測量結(jié)果中的噪聲和用來校正原始測量結(jié)果的熒光測量結(jié)果的線性組合的傳播和放大有關。


發(fā)明內(nèi)容
由于還沒有已知的分析設備是完全滿意的，因此本發(fā)明的目的是改善這種情況。具體地說，本發(fā)明用來克服在現(xiàn)有技術(shù)中通常遇到的補償?shù)膯栴}。
為此，本發(fā)明提供了一種分析微觀元素的設備，這種設備包括 ·第一，用于需分析的微觀元素的測量空間； ·第二，至少一個提供具有至少兩個不同的分析波長、用來與測量空間內(nèi)的微觀元素交互作用以便形成交互作用輻射的輻射的光源； ·第三，負責將來自測量空間的交互作用輻射的至少一部分變換成電信號的檢測裝置；以及 ·第四，負責分析電信號以確定表示所分析的微觀元素的數(shù)據(jù)的分析裝置。
在這里，“交互作用輻射”是指由于分析光束與需分析的微觀元素之間的交互作用而引起的輻射。這種交互作用輻射值得注意的是可以是由于散射(折射、反射、衍射)和/或光致發(fā)光(熒光、磷光)而引起的輻射。
此外、在這里，“輻射”是表示波長在紫外到紅外之間的范圍內(nèi)也就是說大約在100nm(0.1μm)到5000nm(5μm)之間的光束。
按照本發(fā)明，這種設備的特征是 -它的編碼輻射在測量空間內(nèi)聯(lián)合在一起； -它包括i)負責在測量空間的上游以不同的碼對輻射進行編碼的編碼裝置，以及ii)負責在檢測裝置上游對熒光和/或散射交互作用輻射根據(jù)它的波長進行選擇性濾波的濾光裝置；以及 -它的分析裝置包括負責對電信號進行解碼的解碼裝置，以便根據(jù)它們原來的碼進行分析。
在這里、“編碼”是指在分析輻射光束(Ri)與微觀元素相互作用前將碼(ωi)施加到分析輻射光束(Ri)上的操作，以便產(chǎn)生本身包括這個原來的碼的交互作用輻射。特別是，可以將碼(ωi)選擇成對每個分析輻射光束進行脈沖調(diào)制。
這些脈沖可以是同步的，也可以異步的。在同步脈沖的情況下，所有的波長同時與需分析的微觀元素交互作用。在異步脈沖的情況下，這些波長相繼與需分析的微觀元素交互作用。濾光裝置設計成使得對于給定的熒光染料組和給定的編碼類型可以不用執(zhí)行補償。
按照本發(fā)明所設計的設備可以包括一些可以分別或以復合形式取得的輔助特征，值得注意的是 ·它的濾光裝置可以負責對波長屬于一些分別處在兩個分析波長之間和超過最長的分析波長的熒光分析頻帶的熒光交互作用輻射進行選擇性濾波； ·它的編碼裝置可以負責對分析的輻射在強度上進行周期性和/或正弦編碼； ·它的編碼裝置的至少一部分可以在提供輻射的輸出端的上游對光源進行操作，而這個部分可以集成在光源內(nèi)； ·它的編碼裝置的至少一部分可以在源的下游對輻射進行操作，以形成分析輻射； ·它的編碼裝置可以對源所提供的輻射用例如聲光調(diào)制器進行調(diào)制，以形成分析輻射； ·光源可以包括至少兩個單色型的(如果需要的話)和/或至少一個發(fā)光二極管，它的分析輻射在測量空間內(nèi)聯(lián)合在一起。作為一種變型，光源也可以包括一個基本上連續(xù)的多色光光源，諸如多色激光器、白熾燈或弧光燈之類； ·光源可以按照連續(xù)模式和/或脈沖模式提供分析輻射； ·光源所提供的每個分析輻射光束的強度可以是可調(diào)的； ·它的檢測裝置可以包括多個專用于檢測分析輻射作用于需分析的微觀元素上所引起的交互作用輻射(表示散射和熒光過程)的光敏傳感器。作為一個變型，檢測裝置可以包括多個專用于檢測表示散射過程的交互作用輻射的光敏傳感器，植入在由與分析輻射在測量空間內(nèi)的總體傳播方向相交的軸限定的位置，這個軸定向成相對總體方向成在從0°到360°的范圍內(nèi)的角度； ·它的分析裝置可以根據(jù)從對表示散射過程的交互作用輻射的變換得到的信號推斷一種所分析的微觀元素的折射率。具體地說，在微觀元素屬于血液樣本時，值得注意的是分析裝置可以確定紅血球內(nèi)的血紅蛋白含量或白血球的胞漿內(nèi)蛋白含量； ·它的分析裝置可以根據(jù)由于分析輻射與兩種發(fā)光媒介(或熒光染料)之間的交互作用而產(chǎn)生的信號推斷表示具有不同波長的兩種發(fā)光媒介之間的能量轉(zhuǎn)移的耦合度。
本發(fā)明還提供了一種分析微觀元素的方法，這種方法包括 ·第一步驟，其中用在測量空間內(nèi)聯(lián)合在一起的具有至少兩個不同的分析波長和按照不同的所選碼編碼的分析輻射照射放置在測量空間內(nèi)的微觀元素以便形成交互作用輻射； ·第二步驟，其中收集交互作用輻射的至少一部分，根據(jù)它的波長對它進行分離和濾波； ·第三步驟，其中檢測經(jīng)濾波的交互作用輻射，將它變換成電信號；以及 ·第四步驟，其中對檢測到的信號根據(jù)它們原來的碼進行解碼，以便確定表示所分析的微觀元素的數(shù)據(jù)。
按照本發(fā)明所設計的方法可以包括一些可以分別或以組合形式得到的輔助特征，值得注意的是 ·在第一步驟，可以將分析輻射相繼或同時加到需分析的微觀元素上； ·在第一步驟，還可以對分析輻射的強度進行正弦調(diào)制； ·在第二步驟，可以對波長屬于一些分別處在兩個分析波長之間和超過最長的分析波長的熒光分析頻帶的熒光交互作用輻射進行選擇性濾波； ·在第四步驟，可以根據(jù)從對表示散射過程的交互作用輻射的變換得到的信號推斷一種所分析的微觀元素的折射率。具體地說，在微觀元素屬于血液樣本時，值得注意的是可以確定紅血球內(nèi)的血紅蛋白含量或白血球的胞漿內(nèi)蛋白含量； ·在第四步驟，可以根據(jù)由于分析輻射與兩種發(fā)光媒介(熒光染料)之間的交互作用而產(chǎn)生的信號推算表示具有不同波長的兩種發(fā)光媒介之間的能量轉(zhuǎn)移的耦合度。
本發(fā)明特別適合(雖然是非限制性的)活體外診斷領域(特別要提到的是流式細胞計)和對液體中任何微觀單元的分析。特別要提到的是它可適用于生物、生化、化學、微粒形態(tài)分析，具體地說，可適用于多參數(shù)流式細胞計、對液體或氣態(tài)流體中帶電粒子和粒子大小分布的分析。



從以下結(jié)合附圖所作的詳細說明中可以清楚地看到本發(fā)明的其他一些特征和優(yōu)點，在這些附圖中 圖1A示意性地在功能上示出了按照本發(fā)明所設計的光學分析設備的第一示范性實施例，而圖1B示意性地在功能上示出了按照本發(fā)明所設計的光學分析設備的第二示范性實施例，其中若干光源能產(chǎn)生可以在測量空間(CM)內(nèi)聯(lián)合在一起的輻射； 圖2A示出了可以加到光輻射上同時照射的正弦編碼的例子，圖2B示出了相繼二進制編碼的例子，而圖2C示出了周期性重復圖2B中二進制編碼的信號的形式； 圖3為示出熒光染料的與三個分析波長(λ1至λ3)相應的三個吸收光譜(SA1至SA3)和這些熒光染料的三個熒光光譜(SF1至SF3)的示意圖； 圖4示意性地示出了分析設備的處在測量槽的上游的部分的示范性實施例，其中調(diào)制器是聲光型的； 圖5示意性地示出了分析設備的處在測量槽下游的用來檢測和分析熒光的部分的示范性實施例；以及 圖6為可以根據(jù)分析波長為488nm和976nm的散射截面Cext確定血球血紅蛋白的體積和濃度的等體積和等濃度曲線的示意圖。
這些附圖不僅能用來實現(xiàn)本發(fā)明而且在必要情況下有助于清晰地理解本發(fā)明。

具體實施例方式 首先參見圖1A和1B，對按照本發(fā)明所設計的光分析設備DA的兩個示范性的實施例進行說明。
以下，所考慮的是設備DA用于流式細胞計內(nèi)對血樣本內(nèi)的微觀元素進行表征和計數(shù)。然而，本發(fā)明并不局限于這種樣本也不局限于流式細胞計。實際上它涉及任何類型的需通過熒光和/或光散射進行光學分析的微觀元素，特別是液體或生物樣本內(nèi)的微粒。
如在圖1A和1B中示意性地在功能上所示出的那樣，按照本發(fā)明所設計的分析設備DA至少包括 ·測量空間CM，有時稱為測量槽(或測量區(qū)域，甚至也稱為測量窗)，需分析的樣本的微觀元素就放在(或通過)那里； ·一個(或幾個)負責提供具有至少兩個不同的分析波長λ1至λn在測量空間(CM)內(nèi)聯(lián)合在一起的輻射Ri的光源S，[在圖1A的情況下，用單個光源來提供幾個波長，而在圖1B的情況下，用三個光源各按規(guī)定提供一個波長，在這里認為圖1B中的不同的光源形成了輻射源的子部件]； ·至少負責對每個波長λi的輻射光束Ri用特定代碼ωi編碼(調(diào)制)的編碼裝置M(在這里i＝1至n，例如n＝2或3)，它可以由控制模塊MC控制，編碼例如是圖2A至2C所示的那種， ·濾光裝置FO，負責對來自測量空間CM在可能與微觀元素交互作用后產(chǎn)生的交互作用輻射進行選擇性濾波，優(yōu)選的是，交互作用輻射的波長都屬于一些分別處在兩個分析波長λi與λi+l之間的熒光分析頻帶，除了最后一個(即最長的波長)，它處在超過最長的分析波長λn之外； ·包括光敏傳感器(或光敏器件)的檢測裝置DF和/或DE，負責將來自測量空間的在可能與微觀元素交互作用后產(chǎn)生的熒光和/或散射交互作用輻射的至少一部分變換成電信號，以及 ·包括至少解碼裝置DRF和/或DRE的分析裝置MA，負責對檢測裝置DF和/或DE發(fā)送給它的電信號進行解碼，以便根據(jù)它們的碼ωi分析它們，從而可以確定表示所分析的微觀元素的數(shù)據(jù)。
重要的是注意到分析設備DA可以執(zhí)行熒光和/或散射分析。因此，取決于不同情況，分析設備DA可以配置成 ·或者是，具有與帶有所關聯(lián)的解碼裝置DRF的專用于熒光DF的檢測裝置配合的濾光裝置FO，而沒有專用于散射DE的檢測裝置和所關聯(lián)的解碼裝置DRE； ·或者是，具有與帶有所關聯(lián)的解碼裝置DRF的專用于熒光DF的檢測裝置配合的濾光裝置FO和與專用于散射DE的檢測裝置和所關聯(lián)的解碼裝置DRE配合的濾光裝置FO； ·否則就是，具有專用于散射DE的檢測裝置和所關聯(lián)的解碼裝置DRE，但沒有濾光裝置FO也沒有用于熒光DF的檢測裝置和所關聯(lián)的解碼裝置DRF。
在分析設備DA專用于流式細胞計或計數(shù)時，它的測量槽CM(或測量空間)可以為稱為“帶有通量耦合”的類型，諸如在專利文獻FR2653885所說明的。
在圖1A所示的例子中，光源S負責產(chǎn)生單個由n個波長分別為λ1至λn(n≥2)的輻射光束Ri疊加在一起組成的光束。在圖1B所示的例子中，三個光源S各負責產(chǎn)生由一個波長為λi(λ1、λ2或λ3)的輻射光束Ri(R1、R2或R3)組成的單個光束。
每個光束的強度標為Ii，可以調(diào)整到預定值。這例如可以將一組熒光染料(或熒光化合物)在受到波長為λi、強度為Ii的分析輻射Ri激勵時的熒光強度設置在一個預定級。量子熒光效率很高的熒光染料組(例如為對于某些諸如橙噻唑之類的分子探針的情況)還可以用低強度激勵。相反，在具有相同的量子效率的熒光染料同時用來標記相同的細胞上受到不同表示的抗原時，各種熒光染料所發(fā)射的熒光強度可以通過調(diào)整它們各自的分析輻射光束的強度近似地加以補償。
由于這可以控制微觀元素的熒光強度，因此這種光源S也稱為光“合成均衡器”。
還可以由編碼裝置對n個強度為Ii的輻射光束Ri中的每個輻射光束在強度上進行周期性和/或正弦編碼。這種編碼過程，例如為圖2A至2C所示的類型，是確定性的，因為它允許通過解碼裝置DRE和/或DRE多路分離由于與所分析的微觀元素的交互作用而引起的輻射(特別是由于發(fā)熒光和/或散射的機制引起的)。
在光源S包括諸如半導體激光器或發(fā)光二極管之類的激光器時可以通過對注入電流進行操作實現(xiàn)編碼，于是調(diào)制器M就是能提供表示加到每個輻射光束上的碼的電流的電流產(chǎn)生器。在編碼為正弦編碼時，值得注意的是這種編碼就是確定調(diào)制頻率ωi，下面將對這種情況的各種經(jīng)驗設想進行說明。
調(diào)制器M的輸出端有n個可能選來在測量空間內(nèi)聯(lián)合在一起的波長為λi強度為Ii的輻射光束Ri。在正弦編碼的情況下，光強度Ii(以W/m2表示)由附錄中的式A1給出。
n個輻射Ri的光束由在測量(或計數(shù))空間內(nèi)的光學裝置(未示出)聚焦，這些光束在測量空間內(nèi)與先前按照熟悉該技術(shù)的人員所知的任何技術(shù)標記和/或染色的微觀元素(在這里為生物細胞)交互作用。
圖3示出了三種假設的與三個分析波長λ1至λ3相應的熒光染料的三個吸收光譜SA1至SA3以及熒光檢測裝置DF檢測到的這三種熒光染料的三個熒光光譜SF1至SF3。B1至B3標示了濾光裝置FO允許通過的三個波長帶(頻帶)。
在這里類型不同的熒光染料限于三種，以便說明。然而，本發(fā)明并不局限于這個數(shù)字。實際上本發(fā)明可以應用于任何給定多種的熒光染料。
按照本發(fā)明，如從圖3中可以看到的那樣，與第一熒光染料的熒光光譜SF1的最大值相應的頻帶B1處在分析波長λ1與λ2之間，與第二熒光染料的熒光光譜SF2的最大值相應的頻帶B2處在分析波長λ2與λ3之間，而與第三熒光染料的熒光光譜SF3的最大值相應的頻帶B3處在超過分析波長λ3(是這三個波長中最長的波長)處。
優(yōu)選的是，對于每個頻帶Bi，有一個相應的熒光檢測器DFi。
對吸收光譜SAi和熒光光譜SFi的分析可以寫出檢測器(n＝3)所給出的(光電)信號與熒光染料量之間的矩陣方程[PMo]＝I1[C][Q]+I2[D][Q]+I3[B][Q]。
這里，[PMo]為熒光檢測器DFi(n＝3)所給出的光電信號矩陣，下標o表示在沒有能量轉(zhuǎn)移的情況下的熒光信號。[C]、[D]和[B]為計算熒光光束的轉(zhuǎn)移矩陣。[Q]為以摩爾數(shù)表示的(n＝3)熒光染料量Q1至Q3的矩陣。
轉(zhuǎn)移矩陣[C]、[D]和[E]的系數(shù)cij、dij和eij分別由附錄中式A2、A3和A4給出。
考察對矩陣[PMo]的分解和所關聯(lián)的系數(shù)表明，不用將測量信號進行線性組合就可以確定各個克分子濃度Qi。采用前面提到的書寫協(xié)定，克分子濃度Qi由附錄中的式A5至A7給出。在這三個式A5至A7中，項PMi(ωi)表示代碼ωi的特性。
這個特性例如可以是在由分析光脈沖的持續(xù)時間限定的時間間隔內(nèi)的信號的峰值振幅或甚至均方根值，或者也可以是諸如熒光衰減時間之類的信號時間特性。不用將測量結(jié)果線性組合直接確定熒光染料的克分子濃度Qi提高了結(jié)果的精度，因此也就提高了診斷的準確性。
這樣一來，為了確定給定熒光染料的克分子濃度就不用進行補償(線性組合各個信號)。本發(fā)明的穩(wěn)固性可以避免干涉效應，從而就不用補償，因此比迄今所用的常規(guī)方法更為可靠和更為穩(wěn)固。
本發(fā)明還可以確定與“授體”熒光染料與“受體”熒光染料之間的能量(熒光)轉(zhuǎn)移相應的兩種熒光染料(或熒光化合物)之間的耦合度。確定了兩種熒光染料之間的耦合，就可以度量抗原決定基之間的距離或它們的物理關聯(lián)。
考慮到上面所給定的書寫協(xié)定，在有能量轉(zhuǎn)移的情況下的各個熒光信號的表達式由附錄中的式A8至A10給出。
下面將解析地說明前兩種熒光染料之間的能量轉(zhuǎn)移的情況。在這種情況下，由附錄中的式A8至A10給出的各個光電信號的表達式可改寫為附錄中的式A11至A13的形式。這是由于只有系數(shù)κ12和ρ12需要考慮，而其他的系數(shù)κij和ρij都取為等于1。
考慮到式A2至A7，就可以從附錄中的式A11和A12得出附錄中的三個表達式A14至A16。然后，通過從式A14至A16中消去克分子濃度Q1至Q3，就可以確定前兩種熒光染料之間的能量轉(zhuǎn)移參數(shù)κ12。這個能量轉(zhuǎn)移參數(shù)κ12的公式由附錄中的式A17給出。
在前兩種熒光染料之間有能量轉(zhuǎn)移的情況下的克分子濃度Q1于是可以改用附錄中的式A18所示的形式表示。在前兩種熒光染料之間有能量轉(zhuǎn)移的情況下的克分子濃度Q2和Q3于是由附錄中的式A6和A7給出。
重要的是注意到上面和附錄中所給出的這些公式可以擴展到也考慮第一與第三熒光染料之間和/或第二與第三熒光染料之間有能量轉(zhuǎn)移的情況。
在圖4中，示出了按照本發(fā)明所設計的分析設備DA的上游部分，其中光源S向調(diào)制器M提供寬帶光(輻射)，而調(diào)制器M選擇分析波長和在強度上對相應輻射進行編碼。
這里，寬帶光(或白光，或多色光)用脈沖激光器L得到，被注入微結(jié)構(gòu)光纖OF。這種光源S例如為由本申請人在論文“用原來的多波長泵激系統(tǒng)在普通色散光纖內(nèi)連續(xù)產(chǎn)生白色光”(“White-lightsupercontinuum generation in normally dispersive optical fiber usingoriginal multi wavelength pumping system”，Optics Express，vol.12，No.19，September 2004)中所揭示的。
用作微結(jié)構(gòu)光纖OF的泵的激光器L可以例如用工作在反向置偏模式狀態(tài)(例如脈沖重復頻率為50MHz)的銣摻雜或鐿摻雜的光纖激光器代替，后面接有能提供與以微結(jié)構(gòu)光纖OF的非線性相互作用方式激勵一致的通量的光放大器。
這種光源S所發(fā)出的多色光與白熾燈的不同，它的空間相干性極強(連續(xù)光譜的所有光子都以相同的空間模式發(fā)射)。
當然，也可以設想其他類型的光源S。因此，光源可以包括至少兩個耦合激光器(可以是單色型的)和/或至少一個發(fā)光二極管。它也可以包括其他類型的基本上連續(xù)的多色光源，諸如白熾燈或弧光燈之類。
來自微結(jié)構(gòu)光纖OF的光束通過聚焦光學系統(tǒng)O1用反射折射型組合(鏡)調(diào)節(jié)成具有正確的色差或零色差。這個光束聚焦到調(diào)制器M上，調(diào)制器M呈現(xiàn)為聲光單元的形式，優(yōu)選的是它的角色差通過節(jié)距修改成以布拉格(Bragg)入射角衍射的衍射光柵的空間疊加得到校正。
通過疊加由振動單元維持的聲波形成這些衍射光柵，振動單元是壓電型的，由能支持n個調(diào)制信號mi(t)＝Micos2πωit的電信號供電，這些調(diào)制信號包括在附錄中給出受調(diào)強度Ii(t)的式A1內(nèi)。
這樣的聲光調(diào)制器M例如是由A-A光電子公司銷售的那種。
這里，聲光調(diào)制器M由能同時產(chǎn)生(至少)3個音頻(f1、f2、f3)的電子控制器SF控制，而電子控制器SF本身由控制模塊MC(它可以形成為包括控制軟件接口的計算機系統(tǒng)的一部分)控制。音頻頻帶例如在80MHz到150MHz之間的范圍內(nèi)。這些頻率選擇成使得在光束的連續(xù)光譜內(nèi)可以選擇三個(在所說明的這個例子中)準單色輻射光束，例如波長等于488nm(藍色)、570nm(黃色)和976nm(紅外)。對這三個輻射光束的均衡通過調(diào)整聲信號的強度實現(xiàn)。聲強度越高，聲光調(diào)制器M內(nèi)的衍射效率也越高。也就是說，可以將光量從0衍射級調(diào)整到+1衍射級(通過調(diào)整聲信號的強度)。
準單色輻射在這里是指所發(fā)射的光在光譜頻帶內(nèi)在寬度上在1到50nm之間的范圍內(nèi)。
重要的是注意到光源S和調(diào)制器M的所有參數(shù)可以都是用控制模塊MC(例如為計算機類型的)遠程可調(diào)的。因此，光源S的所有參數(shù)，諸如各個分析波長和相應的分析輻射強度之類，都可以由操作員通過軟件接口選擇。
調(diào)制器M的輸出端發(fā)出的分析輻射Ri例如由光學系統(tǒng)O2調(diào)節(jié)成在測量槽(或空間)CM內(nèi)聚焦。
調(diào)制頻率ωi根據(jù)諸如生物細胞通過測量空間CM的速度、稀釋液、測量空間CM的光學窗的尺寸、分析設備DA的采集部件(濾光裝置FO、檢測器DE和/或DF)的帶寬之類的各個參數(shù)選擇。
例如，如果需分析的生物細胞以1m/s左右的速度通過具有半高度寬度為30μm左右的高斯外形的輻射的分析光束，將產(chǎn)生基本上為高斯形狀的持續(xù)時間基本上等于30μs的交互作用輻射(熒光或散射(消光))脈沖。頻譜于是為高斯形狀的，它的半高度高度基本上等于0.3/30μs，或者說10kHz左右。為了避免電子串擾現(xiàn)象，優(yōu)選的是選擇兩個相繼的調(diào)制頻率ωi和ωi+1之間至少相距100kHz。例如，可以選擇ω1等于100kHz，ω2等于200kHz，而ω3等于300kHz。
如果液流通過的持續(xù)時間為5μs而不是30μs，每個交互作用輻射脈沖占據(jù)200kHz左右的頻帶，因此調(diào)制頻率必須隔開至少這個特征頻率例如，ω1＝1MHz，而ω2＝1.5MHz。
應注意的是可以設想其他類型的調(diào)制器M。值得注意的是，調(diào)制器M可以至少部分可集成在光源S內(nèi)，或者至少部分設置在光源S的下游。調(diào)制器M也可以至少部分設置在光源S的上游，例如用來控制對光源S供電的電流。
分析設備DA的上面結(jié)合圖4所說明的處在測量槽CM上游的部分可以與圖1A或1B中所例示的這種的下游部分耦合。在這種情況下，交互作用輻射中由于散射引起的部分到達檢測器DE，在那里被變換成電信號，供分析模塊MA處理。
在圖1A中，檢測器DE例示性地示為平均方向離分析輻射在測量空間CM內(nèi)的總體傳播方向45°左右。然而，這個平均方向的角度可以根據(jù)所需的信息類型取在0°到360°的范圍內(nèi)的任意給定值。
檢測器DE將這些光電信號發(fā)送給分析模塊MA的解碼器(或解調(diào)器)DRE，以對它們解碼。這個解調(diào)器DRE例如配置成一些濾波(解碼)級，例如為模擬型的。作為一種變型，光電信號可以是經(jīng)數(shù)字化的，而濾波(解碼)操作可以以數(shù)字方式實時執(zhí)行或者通過后處理(記錄后再處理)執(zhí)行。
解調(diào)器DRE的輸出端上有三個散射信號SE(λ1＝488nm)、SE(λ2570nm)和SE(λ3＝976nm)。散射信號SE(488nm)和SE(976nm)的值可以用來確定散射截面Cext(488nm)和Cext(976nm)，這兩個散射截面是確定紅血球的折射率和體積所需要的。
將散射信號變換成截面是例如通過標定程序用在折射率和體積上經(jīng)標定的微珠實現(xiàn)的。這些微珠可以例如由乳液構(gòu)成或來自乳狀液。
交互作用輻射的由熒光引起的部分通過信號調(diào)整光陣列后再到達濾光裝置FO。交互作用輻射于是被過濾出一些波長，因此只保全了波長屬于n(在這里n＝3)個檢測頻帶Bi的交互作用輻射。
在圖1A中，熒光檢測裝置DF全部在同一位置組合在一起。在這種情況下，濾光裝置FO形成一個多頻帶濾波器。
如圖5中所示，可以用分離裝置LS將熒光交互作用輻射在頻譜上分離成至少兩個部分。為此，可以使用例如分光板LS，它可以是兩色型的。因此，規(guī)定了(至少)兩個熒光檢測和分析信道，使得在第一信道上可以得到來自第一熒光染料的經(jīng)濾波器FO1濾波的處在第一濾波頻帶B1內(nèi)的熒光信號，而在第二信道上可以得到來自第二熒光染料的經(jīng)濾波器FO2濾波的處在第二濾波頻帶B2內(nèi)的熒光信號。
圖5所示的設備例如可以用于計量核酸(RNA+DNA)和檢測膜抗原。
在這里用波長λ1和λ2分別為488nm和560nm的兩個分析輻射光束R1(ωl)和R2(ω2)來檢測可以分別標記白血球的核酸和膜抗原的兩種熒光染料(橙噻唑和PE)的熒光。這兩個輻射光束R1(ω1)和R2(ω2)用上面結(jié)合圖4說明的設備得到。
第一檢測頻帶B1的中心波長為λ3(530nm)。具有例如為30nm的譜寬度，而第二檢測頻帶B2的中心波長為λ4(670nm)，具有例如為40nm的譜寬度。按照本發(fā)明，λ3處在λ1與λ2之間，而λ4大于λ2。
經(jīng)第一濾波器FO1濾波的交互作用輻射到達第一熒光檢測器DF1，在那里由光電檢測器變換成電信號發(fā)送給分析模塊MA的第一熒光解碼器(或解調(diào)器)DRF1，由它按照第一調(diào)制頻率ω1解調(diào)，得出信號PM1(ω1)。
經(jīng)第二濾波器FO2濾波的交互作用輻射到達第二熒光檢測器DF2，在那里由光電檢測器變換成電信號發(fā)送給分析模塊MA的第二熒光解碼器(或解調(diào)器)DRF2，由它按照第一和第二調(diào)制頻率ω1和ω2解調(diào)，得出信號PM2(ω1)和信號PM2(ω2)。
熒光解調(diào)器DRF1和DRF2例如配置成由一些中心為調(diào)制頻率的Butterworth帶通型的濾波級組成的形式。
在前面所提到的激勵條件下，熒光染料量(或克分子濃度)Q1和Q2可以用式A5和A6計算，系數(shù)c11和d22由A2和A3限定。
克分子濃度Q2可以由第二解調(diào)器DRF2用中心處在頻率ω2的帶通型濾波器從熒光信號PM2中提取。確實，如前面所指出的那樣，由于熒光染料之間的光串擾，PM2包括兩個頻率分量與經(jīng)濾波的頻率為ω2左右的電脈沖的均方根值或峰峰值相應的PM2(ω2)和與光串擾相應的PM2(ω1)。因此，PM2＝PM2(ω1)+PM2(ω2)。這兩個由附錄中的式A15和A16給出的頻率分量PM2(ω1)和PM2(ω2)可以用一個簡單的中心處在頻率ω2的帶通濾波器分開。
克分子濃度Q1可以直接從等于PM1(ω1)的熒光信號PM1中提取。
在不包括分離裝置LS的配置中，情況與κ12＝1的相應，單個熒光檢測器PM得出的信號由式A19給出，它可以改寫為附錄中的式A20。由附錄中的式A11和A12給出的信號PM(ω1)和PM(ω2)可以通過解調(diào)從信號PM中提取。
式A21可以用來計算Q2，將Q2代入式A22就可以確定Q1。
上面所說明的例子可以擴展到任意多種具有任意給定復雜程度的光串擾的熒光染料。
在第二個示范性應用中，按照本發(fā)明所設計的分析設備DA可以測量包含在需測量的全血樣本內(nèi)的細胞的折射率。在紅血球菌株的情況下，認為這個折射率表示了血球血紅蛋白的濃度。
確實，從光學上來看，紅血球由厚度為7nm左右、折射率接近1.46的“雙層類脂”膜組成。細胞內(nèi)的內(nèi)容含有一些水相分解的固體化合物，其中有血紅蛋白(～34g/dl)、鹽(～0.7g/dl)和少數(shù)有機化合物(～0.2g/dl)。
可以將折射率寫成由式A23給出的形式。
濃度(以mmol/dl計)可以等于質(zhì)量濃度(g/dl)，因為血紅蛋白的摩爾量是已知的(M＝66 500g/mol)。在紅血球內(nèi)分解的血紅蛋白為12pg。這導致平均濃度為33g/dl，或5mmol/l。
在全血的情況下，血紅蛋白的測量結(jié)果必須用血球比率因子校正，血球比率因子對于男性約在40％到55％之間，而對于女性約在35％到45％之間。這個血球比率因子取為等于0.42(平均值)；例如，5mmol/l的血球血紅蛋白的平均濃度對于根據(jù)全血得到的測量結(jié)果來說全血紅蛋白的平均濃度就為2.1mmol/l。
考慮到上述情況和式A23，紅血球的折射率可以寫成 對于分析波長為980nm的情況，n(980nm)＝1.34+0.0019*Hb(血球濃度g/dl)，以及 對于分析波長為488nm的情況，n(488nm)＝1.35+0.0016*Hb(血球濃度g/dl)。
這些公式的有效范圍取為血球血紅蛋白濃度(以g/dl計)從25到50g/dl。
分析波長等于980nm和488nm的折射率的虛部在數(shù)值上可以用下式確定 κ(980nm)＝1.47*10-5*Hb，以及 κ(488nm)＝3.7*10-5*Hb。
血球的血紅蛋白濃度可以用在兩個波長處的衰減系數(shù)的測量結(jié)果確定。為此，可以使用A.G.Borovoi所開發(fā)的幾何途徑，它可以用來計算近似球狀的紅血球的散射截面Cext，表示式由附錄中的式A24給出。
可以構(gòu)成圖6所例示的這種等體積和等濃度曲線圖，用來根據(jù)對于不同分析波長(在這里，為488nm和976nm)的散射截面Cext確定血球的血紅蛋白的濃度。在這個圖中，對于每一對測量結(jié)果Cext(488nm)和Cext(976nm)相應有一個給出血紅蛋白濃度和體積的球面。
得到血紅蛋白含量和對它的監(jiān)視可以是特別有用的。值得注意的是監(jiān)視貧血和缺鐵癥的情況。在由于生長激素治療(“r-Hu EPO治療”)引起的高脊髓消耗期間，平均血球血紅蛋白負荷對監(jiān)視確實特別有用。在細胞治療中監(jiān)視網(wǎng)狀紅血球和它們的血紅蛋白內(nèi)容也可以是有用的，如Carlo Brugnara在文獻“缺鐵癥和紅血球生成新的診斷法”(“Iron Deficiency and ErythropoiesisNew Diagnostic Approaches”，Clinical Chemistry 4910，2003，pp.1573-1578)中所指出的那樣。
由于有了本發(fā)明，現(xiàn)在能同時執(zhí)行血紅蛋白含量測量(通過散射測量)和其他測量(通過熒光測量)，而它們之間不會有干擾，從而減少了由于處理模式而引起差錯的風險。
在這種情況下，血紅蛋白內(nèi)容可以有益地通過對紅血球內(nèi)的RNA的使早期的紅血球或網(wǎng)狀紅血球可以與成熟的元素分離的熒光測量完成。可以同時用一個或多個熒光波長來進行附加標記，以作出其他可能的有用特定識別，諸如發(fā)現(xiàn)或測試 ·含有胎兒血紅蛋白(HbF)的紅血球，或 ·寄生有瘧疾寄生蟲的紅血球，或 ·轉(zhuǎn)鐵蛋白(CD 71)受體，或 ·glycophorine A(CD 235A)的表現(xiàn)， 如在Hans J.Tanke的論文“網(wǎng)狀紅血球和成熟紅細胞”(“Reticulocytes and Mature Erythrocytes”，F(xiàn)low Cytometry inHematology，ISBN 0-12-432940-3)中明顯說明的那樣。
本發(fā)明在有核細胞(白血球等)上和在紅菌株或血小板元素(標記活化或血小板不成熟)上都有眾多應用。
此外，本發(fā)明不僅可用于元素存在于血液內(nèi)或骨髓內(nèi)的情況，而且還可以適用于任意生物細胞懸浮液，無論它是真核的還是原核的。
在上面的說明中，主要是以分析設備的形式對本發(fā)明進行說明的。然而，本發(fā)明還可以呈現(xiàn)為可以由所說明的分析設備及其變形實現(xiàn)的分析方法。
這種方法除了流式細胞計外還可以用于活體內(nèi)或活體外的應用。例如，這種方法可以適用于對細胞表層區(qū)(值得注意的是，涂片測試和組織切片)或細胞懸浮液進行掃描的設備。
本發(fā)明不局限于上面所說明的光學分析設備和方法的實施例，這些實施例只是例示性的。本發(fā)明應包括熟悉該技術(shù)的人員在下面所列的權(quán)項的范圍內(nèi)可以設想到的所有變形。
附錄 其中，i＝1至n，Ii0為輻射Ri的最大強度，Mi為調(diào)制深度(或振幅)(通常在0到1之間的范圍內(nèi))，ωi為加到輻射Ri上的調(diào)制的頻率，而t為時間。
*c11＝α11η11F11c12＝0 c13＝0(A2) c21＝α11η11F12 c22＝α21η21F22c23＝0 c31＝α11η11F13 c32＝α21η21F32c33＝α31η31I3F33 d11＝0 d12＝0 d13＝0(A3) d21＝0 d22＝α22η22F22 d23＝0 d31＝0 d32＝α22η22F32 d33＝α32η32F33 e11＝0 e12＝0 e13＝0(A4) e21＝0 e22＝0 e23＝0 e31＝0 e32＝0 e33＝α33η33F33 其中，αij為分量i在波長λj處的摩爾吸收系數(shù)，ηij為分量i在檢測頻帶Bj內(nèi)的熒光效率，F(xiàn)ij為與分量i的熒光光譜處在檢測頻帶Bj內(nèi)的部分有關的在0到1之間的范圍內(nèi)的加權(quán)因子， *Q1＝c11 PM1(ω1)(A5) Q2＝d22 PM2(ω2) (A6) Q3＝e33PM3(ω3) (A7) *PM1＝κ12*κ13*PM10(A8) PM2＝κ23*PM20+ρ12(1-κ12)κ13PM10 (A9) PM3＝PM30+ρ13(1-κ13)κ13 PM10+ρ23(1-κ23)PM10(A10) 其中，κij為在0到1之間的范圍內(nèi)的從熒光染料i向熒光染料j的能量轉(zhuǎn)移的恒定現(xiàn)象耦合系數(shù)，而ρij為熒光染料j將從熒光染料i轉(zhuǎn)移來的光變換成熒光的量子效率的系數(shù)。
*PM1＝κ12*PM10 (A11) PM2＝PM20+ρ12(1-κ12)PM10(A12) PM3＝PM30 (A13) *PM1(ω1)＝κ12α11η11I1F11Q1(A14) PM2(ω2)＝α22η22I2F22Q2 (A15) PM2(ω1)＝α21η21I1F22Q2+α11η11I1F12Q1+ρ12(1-κ12)α11η11I1F11Q1(A16) *Q1＝(1/κ12c11I1)PM1(ω1)(A18) *PM＝(a11+a21)Q1+a22Q2(A20) *PM(ω2)＝α22η22I2F22Q2 (A21) *PM(ω1)＝α21η21I1F22Q2+α11η11I1(F11+F12)Q1(A22) *m(Hb，λ)＝n(Hb，λ)-i κ(Hb，λ)(A23) 其中，n(Hb，λ)＝n0(λ)+α(λ)*Hb為折射率的實部，n0(λ)為純?nèi)軇┑恼凵渎剩遣ㄩL的函數(shù)，α(λ)為血紅蛋白的折射率特性，是波長的函數(shù)，κ(Hb，λ)＝β(λ)*Hb為折射率的虛部，而β(λ)為摩爾吸收系數(shù)。
*Cext＝πa2Qext(A24) 有 m＝n-ik，紅血球的折射率， ρ＝2x(n-1)，給出相位差的參數(shù)， x＝2πa/λ， a，球的半徑，以及 tanβ＝κ/(n-1)。
權(quán)利要求
1.一種用于分析微觀元素的設備(DA)，包括需分析的微觀元素的測量空間(CM)；至少一個能提供輻射的光源(S)，所述輻射具有至少兩個不同的分析波長，用來與在所述測量空間(CM)內(nèi)的所述微觀元素交互作用以便形成交互作用輻射；用來將來自所述測量空間(CM)的交互作用輻射的至少一部分變換成電信號的檢測裝置(DE，DF)；以及用來分析所述電信號以確定表示所分析的微觀元素的數(shù)據(jù)的分析裝置(MA)；其特征是
-所述經(jīng)編碼的輻射在所述測量空間(CM)內(nèi)聯(lián)合在一起；
-所述設備(DA)包括i)用來在所述測量空間(CM)的上游以不同的碼(ωi)對所述輻射進行編碼的編碼裝置(M)，以及ii)用來在所述檢測裝置(DE，DF)的上游對所述熒光和/或散射交互作用輻射根據(jù)它的波長進行選擇性濾波的濾光裝置(FO，LS)；以及
-所述分析裝置(MA)包括用來對所述電信號進行解碼的解碼裝置(DRE，DRF)，以便根據(jù)它們原來的代碼進行分析。
2.如權(quán)利要求1所述的設備，其特征是所述光源(S)所提供的所述分析輻射(Ri)相繼加到需分析的微觀元素上。
3.如權(quán)利要求1所述的設備，其特征是所述光源(S)所提供的所述分析輻射(Ri)同時加到需分析的微觀元素上。
4.如權(quán)利要求1至3中任一個權(quán)利要求所述的設備，其特征是所述濾光裝置(FO，LS)用來對波長屬于一些分別處在兩個分析波長之間和超過最長的分析波長的熒光分析頻帶的所述熒光交互作用輻射進行選擇性濾波。
5.如權(quán)利要求1至4中任一個權(quán)利要求所述的設備，其特征是所述光源(S)包括至少兩個能向所述測量空間(CM)提供聯(lián)合在一起的輻射的激光器。
6.如權(quán)利要求5所述的設備，其特征是所述激光器是單色型的。
7.如權(quán)利要求1至6中任一個權(quán)利要求所述的設備，其特征是所述光源(S)包括至少一個發(fā)光二極管。
8.如權(quán)利要求1至4中任一個權(quán)利要求所述的設備，其特征是所述光源(S)包括多色輻射源。
9.如權(quán)利要求8所述的設備，其特征是所述多色輻射源(S)從包括至少一個具有基本上連續(xù)光譜的多色激光器、白熾燈和弧光燈的組中選出。
10.如權(quán)利要求1至9中任一個權(quán)利要求所述的設備，其特征是所述光源(S)用來按照連續(xù)模式和/或脈沖模式提供所述分析輻射。
11.如權(quán)利要求1至10中任一個權(quán)利要求所述的設備，其特征是所述光源(S)所提供的每個分析輻射光束(Ri)的強度(Ii)是可調(diào)的。
12.如權(quán)利要求1至11中任一個權(quán)利要求所述的設備，其特征是所述編碼裝置(M)用來對所述分析輻射進行強度調(diào)制。
13.如權(quán)利要求1至12中任一個權(quán)利要求所述的設備，其特征是所述編碼裝置(M)的至少一部分用來在所述光源(S)的下游對輻射進行操作，以形成所述分析輻射。
14.如權(quán)利要求1至13中任一個權(quán)利要求所述的設備，其特征是所述編碼裝置(M)的至少一部分用來在提供分析輻射的輸出端的上游對所述光源(S)進行操作。
15.如權(quán)利要求14所述的設備，其特征是所述編碼裝置(M)的所述部分集成在所述光源(S)內(nèi)。
16.如權(quán)利要求1至15中任一個權(quán)利要求所述的設備，其特征是所述編碼裝置(M)包括能對所述光源(S)提供的所述輻射進行調(diào)制以形成所述分析輻射的聲光調(diào)制器。
17.如權(quán)利要求1至16中任一個權(quán)利要求所述的設備，其特征是所述檢測裝置(DE，DF)包括多個用來檢測交互作用輻射的光敏傳感器。
18.如權(quán)利要求1至16中任一個權(quán)利要求所述的設備，其特征是所述檢測裝置(DE，DF)包括多個用來檢測交互作用輻射的光敏傳感器，植入在由與分析輻射在約束通路處的總體傳播方向相交的軸限定的位置，這個軸定向成相對總體方向成在從0°到360°的范圍內(nèi)的角度。
19.如上述任一個權(quán)利要求所述的設備，其特征是所述設備包括具有控制軟件接口的計算機系統(tǒng)(MC)。
20.一種分析微觀元素的方法，其特征是所述方法包括
i)第一步驟，其中用在測量空間(CM)內(nèi)聯(lián)合在一起的具有至少兩個不同的分析波長和按照不同的所選碼編碼的分析輻射照射所述測量空間(CM)內(nèi)的微觀元素，以便形成交互作用輻射；
ii)第二步驟，其中收集所述交互作用輻射的至少一部分，根據(jù)它的波長對它進行分離和濾波；
iii)第三步驟，其中檢測經(jīng)濾波的交互作用輻射，將它變換成電信號；以及
iv)第四步驟，其中對所述檢測到的信號根據(jù)它們原來的碼進行解碼，以便確定表示所分析的微觀元素的數(shù)據(jù)。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征是，在第一步驟，所述分析輻射(Ri)相繼加到所述需分析的微觀元素上。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征是，在第一步驟，所述分析輻射(Ri)同時加到所述需分析的微觀元素上。
23.如權(quán)利要求20至22中任一個權(quán)利要求所述的方法，其特征是，在第二步驟，對波長屬于一些分別處在兩個分析波長之間和超過最長的分析波長的熒光分析頻帶的所述熒光交互作用輻射進行選擇性濾波。
24.如權(quán)利要求20至23中任一個權(quán)利要求所述的方法，其特征是，在第四步驟，根據(jù)從對表示散射過程的交互作用輻射的變換得到的信號推算一種所分析的微觀元素的折射率。
25.如權(quán)利要求20至24中的任一個權(quán)利要求所述的方法，其特征是，在第四步驟，在樣本是全血的情況下，根據(jù)所述折射率確定紅血球菌株的細胞的血球血紅蛋白濃度。
26.如權(quán)利要求20至25中任一個權(quán)利要求所述的方法，其特征是，在第四步驟，根據(jù)由于所述分析輻射與兩種不同的、空間上很接近的熒光染料之間的交互作用而產(chǎn)生的信號，推算表示所述熒光染料之間的能量轉(zhuǎn)移的耦合度。
27.在從包括生物、生化、化學、微粒、形態(tài)分析的組中所選擇的領域中，特別是在多參數(shù)流式細胞計、對液體或氣態(tài)流體中的帶電粒子和粒子大小分布的分析中，使用如上述任一個權(quán)利要求所述的分析設備和方法。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種分析微觀元素的設備(DA)，這種設備包括第一，需分析的微觀元素的測量空間(CM)；第二，至少一個提供在測量空間(CM)內(nèi)聯(lián)合在一起的射線的光源(S)，所述射線具有至少兩個不同的分析波長，用來與測量空間(CM)內(nèi)的微觀元素交互作用，以形成交互作用射線；第三，在測量空間(CM)的上游用不同的碼對射線進行編碼的編碼裝置(M)；第四，對熒光和/或擴散的交互作用射線根據(jù)它們的波長進行選擇性濾波的濾光裝置(FO)；第五，將來自測量空間(CM)的交互作用射線的至少一部分變換成電信號的檢測裝置(DE，DF)；以及第六，包括對電信號進行解碼的解碼裝置(DRE，DRE)的分析裝置(MA)，用來確定表示所分析的微觀元素的數(shù)據(jù)。
文檔編號G01N15/02GK101194159SQ200680020823
公開日2008年6月4日 申請日期2006年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月21日
發(fā)明者菲利普·納瑞, 迪迪爾·勒菲弗 申請人:奧里巴Abx股份有限公司(簡單形式)