專利名稱：：電化學(xué)檢測(cè)法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種測(cè)定流體樣品中分析物的存在或含量的方法、該方法中使用的結(jié)合試劑、該結(jié)合試劑用于免疫分析法的用途以及一種用于測(cè)量樣品中分析物的含量或存在的試劑盒。
背景技術(shù)：
：已經(jīng)知道，用于測(cè)定流體樣品中分析物的存在或含量的免疫分析法依賴于與所關(guān)注的分析物結(jié)合的結(jié)合試劑的使用。在該類裝置中形成結(jié)合試劑-分析物復(fù)合體然后在捕獲點(diǎn)(capturesite)被固定，然后測(cè)定分析物的存在或含量。這類測(cè)定可以通過各種方法實(shí)現(xiàn)，如熒光分析法。然而，這類測(cè)定存在的一個(gè)問題是在分析物濃度較低時(shí)有時(shí)不是很有效。這是因?yàn)榻Y(jié)合試劑-分析物復(fù)合體的濃度也會(huì)較低，并且測(cè)定較低濃度的該物質(zhì)的存在和/或含量可能是困難的。如果能夠開發(fā)一種適于測(cè)定流體樣品中分析物的存在或含量的方法，該方法即使在分析物濃度較低的情況下也有效，這將是有益的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人已開發(fā)出了一種新的用于測(cè)定流體樣品中分析物的存在或含量的方法，該方法即使在分析物的濃度水平較低時(shí)也能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)到分析物。因此，本發(fā)明提供了一種測(cè)定流體樣品中分析物的存在或含量的方法，包含(a)將一種流體樣品與一種包含多個(gè)可裂解物質(zhì)分子(cleavablespecies)的結(jié)合試劑接觸，其中所述可裂解物質(zhì)分子當(dāng)被裂解的時(shí)候能夠用電化學(xué)方法測(cè)出；(b)將形成的所有的結(jié)合試劑-分析物復(fù)合體與未結(jié)合的結(jié)合試劑分離；(c)從固定化的結(jié)合試劑-分析物復(fù)合體上裂解該可裂解物質(zhì)；和(d)用電化學(xué)的方法檢測(cè)該裂解的物質(zhì)。本發(fā)明也提供一種本發(fā)明的結(jié)合試劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供本發(fā)明的結(jié)合試劑用于免疫分析法的用途。本發(fā)明還提供一種用于測(cè)量樣品中分析物的含量或存在的試劑盒，包含；(a)一種本發(fā)明的結(jié)合試劑，(b)一種捕獲相(capturephase)，該捕獲相包含一種含有一種試劑的載體，所述試劑能夠結(jié)合或連接到一種結(jié)合試劑-分析物復(fù)合體上，和；(c)一種能檢測(cè)出裂解時(shí)的可裂解物質(zhì)的電極，以提供待測(cè)分析物存在或含量的指示。所有形成的結(jié)合試劑-分析物復(fù)合體與未結(jié)合的結(jié)合試劑的分離可以通過結(jié)合試劑-分析物復(fù)合體的固定化來實(shí)現(xiàn)。圖1電化學(xué)測(cè)量UV裂解的電化學(xué)報(bào)道基團(tuán)的一般性方案。圖2已經(jīng)報(bào)道過的檢測(cè)體系的概括。20μm和400nm的珠子符合圖1中規(guī)定的要求。圖3在各種照射時(shí)間下，UV可裂解的二茂鐵分子9(濃度2.18mM)進(jìn)行光分解的情況的TLC。圖4試劑和條件a)0.4μm乙醛修飾的膠乳顆粒、氨基葡聚糖、NaBH3CN(1M)、MES(50mM，pH6.0)；b)GMBS、DMF、PBS(pH7.0)；c)脫保護(hù)9、DMF、PBS(pH7.0)。圖5CV’s照射前(重復(fù)2次，用和.....表示)。照射5分鐘后(重復(fù)2次，用實(shí)線和---表示)。將17μl的樣品施加于絲網(wǎng)印刷電極(screenprintedelectrode)(碳工作電極和對(duì)電極、銀/氯化銀參比電極)。圖6CV’s照射前(重復(fù)2次，用和.....表示)。照射5分鐘后(重復(fù)2次，用實(shí)線和---表示)。將17μl的樣品施加于絲網(wǎng)印刷電極(碳工作電極和對(duì)電極、銀/氯化銀參比電極)。圖7CV’s照射前(重復(fù)2次，用和.....表示)。照射5分鐘后(重復(fù)2次，用實(shí)線和---表示)。將17μl的樣品施加于絲網(wǎng)印刷電極(碳工作電極和對(duì)電極、銀/氯化銀參比電極)。圖8計(jì)時(shí)電流法測(cè)量可變的珠子濃度(每17μl中1.16E+08、46600000、23300000、11650000、5825000、2912500個(gè)珠子)。圖9計(jì)時(shí)電流法掃描可變的珠子濃度。每種濃度都已經(jīng)進(jìn)行PBS背景校正，即使用Autolab控制軟件中的消減磁盤文件(subtractdiskfile)/編輯數(shù)據(jù)(editdata)選項(xiàng)把PBS背景掃描從每種濃度中扣除。圖10計(jì)時(shí)電流法測(cè)量珠子的最低濃度(每17μL2912500個(gè)珠子)(實(shí)線)和PBS對(duì)照測(cè)量(虛線)。注意電流升高和降低表明該UV裂解的二茂鐵分子的消耗。圖11計(jì)時(shí)電流法測(cè)量已知濃度的UV裂解的二茂鐵分子。測(cè)量用與圖8中概括的研究中相同的方法。圖12UV裂解的二茂鐵分子的標(biāo)定曲線。數(shù)值(i/A)來自圖11中的200秒處的點(diǎn)。圖13顆粒數(shù)量與i/A(裂解的FcPEG)的關(guān)系的曲線。數(shù)值來自圖9中的200秒處的點(diǎn)。圖14FcPEG(裂解的)與顆粒數(shù)量的關(guān)系的曲線。用圖12將圖3.12中的數(shù)值(i/A)轉(zhuǎn)換成FcPEG濃度(μM)。圖15計(jì)時(shí)電流法測(cè)量UV裂解的二茂鐵分子，將用38mV(電壓輸入LED)對(duì)6μL樣品在一個(gè)毛細(xì)管填充電極(capillaryfillelectrode)裝置中的測(cè)量重復(fù)2次，用和.....表示。線---代表的內(nèi)容如前所述但電壓為22mV。實(shí)線如前所述代表PBS但電壓為38mV。圖16與圖15所示相同但重新標(biāo)度。圖17試劑和條件a)0.4μm乙醛修飾的膠乳顆粒、氨基葡聚糖、NaBH3CN(1M)、MES(50mM，pH6.0)；b)GMBS、DMF、PBS(pH7.0)；c)修飾的3299、PBS(pH7.0)；d)脫保護(hù)的9、DMF、PBS(pH7.0)圖18試劑和條件a)0.4μm乙醛修飾的膠乳顆粒、氨基葡聚糖、NaBH3CN(1M)、MES(50mM，pH6.0)；b)GMBS、DMF、PBS(pH7.0)；c)脫保護(hù)的9、DMF、PBS(pH7.0)、SHPEG4CO2H；d)氨基葡聚糖、EDCI、NHS、MES(50mM，pH6.0)；e)GMBS、DMF、PBS(pH7.0)；f)修飾的3299、PBS(pH7.0)圖19計(jì)時(shí)電流法測(cè)量具有抗體和UV可裂解連接體的400nmTRF珠子。將17μL的溶液施用到電極上(碳工作電極、對(duì)電極和銀/氯化銀參比電極)。線....表示當(dāng)先偶聯(lián)抗體再偶聯(lián)可裂解連接體時(shí)得到的結(jié)果。實(shí)線表示當(dāng)先偶聯(lián)可裂解連接體再偶聯(lián)抗體時(shí)得到的結(jié)果。圖20計(jì)時(shí)電流法測(cè)量具有抗體和UV可裂解連接物的400nmTRF珠子。將17μL的溶液施用到電極上(碳工作電極、對(duì)電極和銀/氯化銀參比電極)。實(shí)線表示具有抗體和UV可裂解連接物的400nmTRF珠子、線---表示1/2稀釋的具有抗體和UV可裂解連接物的400nmTRF珠子，并且線…表示PBS對(duì)照。圖21重新標(biāo)度的計(jì)時(shí)電流法測(cè)量具有抗體和UV可裂解連接物的400nmTRF珠子(源于圖19)。該LED輸入電壓在504秒的時(shí)候從22mV轉(zhuǎn)換成38mV，速率的變化可被清晰的觀察到。圖22試劑和條件a)F108-PMPI、去離子H2O；b)修飾的3468、PBS(pH7.0)。圖23計(jì)時(shí)電流法測(cè)量0(實(shí)線)和400(虛線)mIUhCG標(biāo)準(zhǔn)液。在使該溶液流過微流體IMF3裝置前進(jìn)行濕的hCG分析，在所述濕的hCG分析中包括將hCG標(biāo)準(zhǔn)液、400nm3299/UV可裂解二茂鐵化合物(UVCFC)和20μm3468膠乳珠子預(yù)混大約30分鐘。圖24與圖相同但重新標(biāo)度以突出0和400mIUhCG測(cè)量之間的差異。圖25電化學(xué)二茂鐵化合物結(jié)合HAS的百分比，這里二茂鐵PEG用一個(gè)0-12碳鏈修飾。圖26PBS中IT17的用2端的叉指形電極(interdigitatedelectrode)測(cè)量的計(jì)時(shí)電流分析圖。2μm的槽(line)和間隔(gap)(CSEM碳電極)。圖27PBS中IT17的2端的叉指形電極測(cè)定。2μm的槽和間隔(CSEM碳電極)。圖28差示脈沖、裸電極。各種濃度下對(duì)IT17的靈敏度線---表示2.5μM。線....表示1μM。實(shí)線表示750mM。線----表示500nM。線表示250nM。線表示PBS。圖29虛線表示PBS。實(shí)線表示PBS中的50μmIT17。電位以100mV/s的速度從0V掃描至0.4V，然后在0.4V持續(xù)120s，然后以100mV/s的速度掃描回至0V。使用EtOH流延(cast)的0.1％的高氟化樹脂包被的電極。將溶液施加于電極后掃描2分鐘。圖30虛線表示PBS。實(shí)線表示PBS中的50μMIT17。電位以100mV/s的速度從0V掃描至0.4V，然后在0.4V持續(xù)120s，然后以100mV/s的速度掃描回至0V。使用H2O流延的0.1％的高氟化樹脂包被的電極。將溶液施加于電極后掃描2分鐘。具體實(shí)施例方式測(cè)定一種流體樣品中分析物存在或含量的方法可以是一種例如非均相分析的分析方法，例如一種其中結(jié)合試劑-分析物復(fù)合體被固定在一個(gè)捕獲相的表面上的側(cè)流或微流型分析。一旦結(jié)合試劑-分析物復(fù)合體被固定在捕獲相上，可裂解物質(zhì)即可以被裂解并且接著用電化學(xué)方法檢測(cè)，所述方法可以包括例如一個(gè)電極或一個(gè)電極表面。任何合適的方法都可以被用來從未結(jié)合的結(jié)合試劑中分離結(jié)合試劑-分析物復(fù)合體。過濾是該方法的一個(gè)例子。合適的分離方法的另一個(gè)例子涉及形成一種被磁性標(biāo)記的結(jié)合試劑與結(jié)合試劑-分析物復(fù)合體的復(fù)合體，接著用一個(gè)磁體從未結(jié)合的結(jié)合試劑中分離結(jié)合試劑-分析物-被磁性標(biāo)記的結(jié)合試劑的復(fù)合體。優(yōu)選地，結(jié)合試劑-分析物復(fù)合體和未結(jié)合的結(jié)合試劑通過將結(jié)合試劑-分析物復(fù)合體固定在捕獲相中進(jìn)行分離。本發(fā)明中使用的結(jié)合試劑可以從任何能夠與所關(guān)注分析物結(jié)合形成結(jié)合對(duì)(bindingpair)的試劑中選擇。結(jié)合對(duì)的例子包括抗體抗原、生物素和抗生物素蛋白、聚合的酸和堿、染料和蛋白質(zhì)結(jié)合劑、肽和特定蛋白結(jié)合劑、酶和輔助因子、效應(yīng)物和受體分子，其中術(shù)語受體指任何能夠識(shí)別分子的一種特定的或極性的取向——即表位或決定位點(diǎn)——的化合物或組合物。提及的抗體包含但不限于多克隆、單克隆、雙特異性、人源化和嵌合的抗體、單鏈抗體、Fab片段和F(ab′)2片段、一個(gè)Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段、抗獨(dú)特型(anti-Id)抗體和所有以上抗體的表位結(jié)合片段。抗體段包括Fv和Fv’的段。因此，所述結(jié)合試劑通常包含一種使得所述分析物可被識(shí)別的工具。該工具可以包含一個(gè)能結(jié)合分析物的識(shí)別組分。識(shí)別組分的一個(gè)具體的實(shí)例是一種識(shí)別分子，例如一種生物識(shí)別分子。所述分子可以以多種方式——例如以共價(jià)的方式或通過被動(dòng)吸收——被連接至結(jié)合試劑上。如本文使用的術(shù)語“分析物”指任何的分子、化合物或顆粒，其存在或含量待檢測(cè)并且其中所述分子、化合物或顆?？梢越Y(jié)合本發(fā)明的結(jié)合試劑。合適的分析物包括有機(jī)和無機(jī)分子，包括生物分子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中該分析物可以是一種環(huán)境污染物(包括農(nóng)藥、殺蟲劑、毒素等)；一種化學(xué)物質(zhì)(包括溶劑、聚合物、有機(jī)物質(zhì)等)；治療用分子(包括治療用和濫用的藥物、抗體等)；生物分子(包括激素、細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)、肽、DNA及其片段、核苷酸、脂質(zhì)、碳水化合物、細(xì)胞膜抗原和受體(神經(jīng)的、激素的、營養(yǎng)的和細(xì)胞表面受體)或其配體等)；全細(xì)胞(包括原核細(xì)胞(例如病原菌)和真核細(xì)胞)；或孢子。在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中該分析物是一種心臟狀況標(biāo)志物(cardiacmarker)例如腦鈉肽(BNP)、N-端連接的BNP、心鈉素、硬骨魚緊張肽、硬骨魚緊張肽相關(guān)肽、肌紅蛋白、CK-MB、肌鈣蛋白I或肌鈣蛋白T。通常，該結(jié)合試劑包括多個(gè)可裂解物質(zhì)分子，當(dāng)被裂解后可以用電化學(xué)方法檢測(cè)。因此可裂解物質(zhì)必須顯示如下兩個(gè)特征。第一，它們必須能夠被從結(jié)合試劑上裂解下來并且，第二，一旦它們被裂解下來，它們必須能夠利用電化學(xué)方法測(cè)出。如本文使用的術(shù)語“電化學(xué)方法”指涉及一個(gè)電極表面的氧化和/或還原的任何方法，該方法能夠被應(yīng)用于測(cè)定一種電化學(xué)活性物質(zhì)——也稱為一種電活性物質(zhì)——的存在和/或含量。該可裂解物質(zhì)可以在被從結(jié)合試劑上裂解下來的時(shí)候顯示電化學(xué)活性?；蛘?，該可裂解物質(zhì)可以是一旦被從結(jié)合試劑上裂解下來就可轉(zhuǎn)化成一種電化學(xué)活性物質(zhì)。作為另一種選擇，該可裂解物質(zhì)在被從結(jié)合試劑上裂解下來以后能夠形成有電化學(xué)活性的其他物質(zhì)。然后這些其它物質(zhì)的存在可以用電化學(xué)方法檢測(cè)，并由此測(cè)定裂解物質(zhì)的存在和/或含量。優(yōu)選地，可裂解物質(zhì)在結(jié)合到結(jié)合試劑上的時(shí)候沒有電化學(xué)活性。對(duì)每種結(jié)合試劑提供一個(gè)以上的可裂解物質(zhì)分子為放大終信號(hào)提供了可能。例如，如果信號(hào)能夠被放大106，那么皮摩爾級(jí)的分析物可給出與毫摩爾級(jí)的分析物相當(dāng)?shù)男盘?hào)。這種放大提供了一個(gè)方便的測(cè)量低含量分析物的途徑。典型地，每種結(jié)合試劑包括至少104個(gè)可裂解物質(zhì)分子。優(yōu)選地，每種結(jié)合試劑包括至少105個(gè)的可裂解物質(zhì)分子。更為優(yōu)選地每種結(jié)合試劑包括至少106個(gè)的可裂解物質(zhì)分子。該結(jié)合試劑可以被一個(gè)電活性物質(zhì)分子標(biāo)記或可以被提供一個(gè)電活性部分可以與之連接的結(jié)合區(qū)域。被標(biāo)記的結(jié)合試劑可以選擇為使得從當(dāng)標(biāo)記物從結(jié)合試劑裂解下的時(shí)候具有電化學(xué)活性、或能夠轉(zhuǎn)化為一種電化學(xué)活性物質(zhì)、或使一種其他物質(zhì)變成有電化學(xué)活性。優(yōu)選地，被標(biāo)記的物質(zhì)在連接到結(jié)合試劑的時(shí)候沒有電化學(xué)活性。電活性物質(zhì)可以是任何能夠在一個(gè)電極表面被氧化或還原的物質(zhì)。電活性物質(zhì)可以是一種氧化還原試劑并因此能夠在一個(gè)電極表面重復(fù)地被氧化和還原。該結(jié)合試劑可以用多個(gè)電活性部分標(biāo)記。為每個(gè)結(jié)合試劑提供一個(gè)以上的電活性部分為放大終信號(hào)提供了可能。因此對(duì)于如放大10的6次冪倍，皮摩爾量級(jí)的分析物可給出與毫摩爾量級(jí)的分析物相當(dāng)?shù)男盘?hào)。這提供一個(gè)測(cè)量低量級(jí)的分析物的方便途徑?？闪呀馕镔|(zhì)可以包含任何能夠通過電化學(xué)方法檢測(cè)的部分。該部分的例子包括那些二茂鐵、硝基苯酚、氨基苯酚、氫醌、水楊酸和磺基水楊酸的衍生物。該部分的另一些例子是二茂鐵乙醛、二茂鐵甲酸(ferrocenecarboxylicacid)、4-硝基苯酚、p-氨基苯酚、m-硝基苯酚、氫醌、水楊酸和磺基水楊酸。優(yōu)選的部分是那些二茂鐵的衍生物。該二茂鐵的衍生物的實(shí)例是那些具有由醛、甲基酮、乙基酮、羥基甲烷、羥基乙烷、甲基(羥基亞胺)、羧酸、羧基苯基羧酸和羧基丙酸衍生的基團(tuán)的二茂鐵衍生物。優(yōu)選地，可裂解物質(zhì)衍生自二茂鐵乙醛。能通過電化學(xué)方法檢測(cè)的可存在于可裂解物質(zhì)中的部分的另一些例子是亞甲藍(lán)、膠態(tài)金、萘醌-4-磺酸鹽、p-N，N-二乙基氨基苯基異硫氰酸酯(p-N，N-dithylaminophenylisothiocyanate)、磷酸對(duì)氨基苯酯(PAPP)、磷酸對(duì)硝基苯酯、3-吲哚氧基磷酸酯(3-IP)、N-(10，12-二十五烷二炔羧)-乙酰基二茂鐵、膠態(tài)金上的銀標(biāo)記物、氫醌二磷酸酯(HQDP)、磷酸4-氨基-1-萘基酯、1，4-二羥基和1，4-二羥基胺衍生物、對(duì)氨基苯基β-D-吡喃半乳糖苷、氫醌、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺、三羰基(η-環(huán)戊二烯基)合錳(cymantrene)、TMB(Ox)、磷酸1-萘基酯、萘酚、靛藍(lán)、抗壞血維生素C(ascorbicacid2-phosphate)(AAP)和2，3-二氨基吩嗪。該電化學(xué)部分可以是任何適合于為了進(jìn)行一項(xiàng)檢測(cè)試驗(yàn)?zāi)康牡牟糠帧Ｋ囊粋€(gè)例子是二茂鐵及其衍生物。該電化學(xué)物質(zhì)可以有各種取代基或修飾以使其適合被使用，以例如影響其在所關(guān)注的流體樣品中的溶解度、影響氧化還原電位、減小或消除與可能存在于流體樣品中的組分的結(jié)合、使其穩(wěn)定等等。電化學(xué)物質(zhì)的裂解可以通過多種不同途徑完成，例如通過暴露于特定波長的光、用酶或化學(xué)法如用一種酸裂解。化學(xué)裂解試劑本身可以是光產(chǎn)生的。一般，可裂解物質(zhì)是光可裂解的或酸可裂解的。上述方法之中光裂解是優(yōu)選的，因?yàn)槠洳恍枰尤肟赡芨蓴_該檢測(cè)的其它試劑。光可以被應(yīng)用在該檢測(cè)裝置的單獨(dú)區(qū)域(discreteregion)，例如其捕獲區(qū)。而且光束的方向和位置也可以通過用鏡片、濾光片、擋板等等方便地控制。一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)電極可以作為該裝置的一部分被提供，并可以被安置于與捕獲電極很接近的區(qū)域。很靠近地放置這些電極使得可以獲得較高的捕獲裂解的電化學(xué)物質(zhì)的效率。該結(jié)合試劑有利地包含多個(gè)連接的可裂解不穩(wěn)定物質(zhì)分子。因此，當(dāng)被標(biāo)記的結(jié)合物在捕獲區(qū)被捕獲的時(shí)候，大量的氧化還原基團(tuán)可以從結(jié)合試劑中裂解出來，從而提供信號(hào)的放大。合適的可裂解基團(tuán)包含二硫鍵、鄰硝基苯、二醇、重氮鍵、酯鍵砜鍵、縮醛、縮酮、烯醇醚、烯醇酯、烯胺和亞胺。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中所述不穩(wěn)定基團(tuán)是一種光不穩(wěn)定基團(tuán)，其可能包含一個(gè)芳族硝基，特別是其中硝基在鄰位的一個(gè)芳族硝基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中可裂解基團(tuán)包含一個(gè)鄰硝基芐基衍生物。合適的酸可裂解基團(tuán)包括二硫鍵、羧酸的叔丁酯和酚的叔丁基碳酸酯?；蛘撸摬环€(wěn)定基團(tuán)可以是一種酸不穩(wěn)定基團(tuán)，其可以被光產(chǎn)酸劑(photoacidgenerator)產(chǎn)生的酸裂解。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中酸不穩(wěn)定基團(tuán)可以在光照之前用一種光產(chǎn)酸劑處理。在一個(gè)實(shí)施方案中，可裂解物質(zhì)包括一種可以使用上文定義的電化學(xué)方法和上文所定義的可裂解基團(tuán)檢測(cè)的部分。這種可裂解物質(zhì)的一個(gè)例子是包含二茂鐵乙醛衍生物和鄰硝基苯衍生物的物質(zhì)。為了提供一種有大量——例如大于10的6次冪個(gè)——不穩(wěn)定物質(zhì)的結(jié)合試劑，可以采用各種方法。這種方法之一是提供一個(gè)中央核心、例如一個(gè)聚合物顆粒作為連接結(jié)合試劑和/或被標(biāo)記物質(zhì)的位點(diǎn)?；谶@點(diǎn)考慮，在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明涉及一種包含一個(gè)中央核心的結(jié)合試劑。該中央核心可以作為可裂解物質(zhì)能夠連接的一個(gè)錨位點(diǎn)。該連接可以是直接的，即可裂解物質(zhì)不使用媒介而與中央核心相連接；或者間接的，即可裂解物質(zhì)通過一個(gè)媒介與中央核心相連接。合適的中央核心包括聚合物球，例如包含膠乳、納米金顆粒和水凝膠的聚合物球。中央核心的另一個(gè)例子是微晶顆粒。優(yōu)選的中央核心是膠乳珠子。為了把可裂解物質(zhì)連接于中央核心上，可以直接地或者間接地修飾該核心。合適的修飾包括醛修飾、羧酸修飾和氨基修飾。醛修飾是優(yōu)選的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該中央核心是一個(gè)醛修飾的膠乳顆粒。一般，中央核心大小在從5到5000nm之間，優(yōu)選在從10到1000nm之間，并且更優(yōu)選在從50到500nm之間。另外一種得到大量不穩(wěn)定物質(zhì)的方法是把它們連接在一個(gè)直的、支化的或卷曲的聚合物鏈上，如樹枝狀聚合物(dendrimer)、互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)(IPN)。所述一條或多條聚合物鏈可以被連接于基質(zhì)上、如在顆粒上形成聚合物刷子，或連接在其中聚合物鏈由基質(zhì)延伸出來的其它物質(zhì)上。一個(gè)或多個(gè)結(jié)合物質(zhì)分子也可以被連接于一條或多條聚合物鏈或基質(zhì)等上。在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明涉及到一種包含至少一個(gè)樹枝狀部分或聚合物部分的結(jié)合試劑。一般，可裂解物質(zhì)被連接于該樹枝狀部分或聚合物部分。合適的樹枝狀部分和聚合物部分包含那些可裂解物質(zhì)可以連接的部分。合適的樹枝狀聚合物的例子包括聚(酰氨基胺)PAMAM樹枝狀聚合物、聚(2-甲基吖丙啶)樹枝狀聚合物和苯乙炔樹枝狀聚合物。合適的聚合物的例子包括葡聚糖、PAMAM、PEI、PEG、聚電解質(zhì)和鏈霉親和素(streptavadin)。優(yōu)選的聚合物部分是葡聚糖。合適類型的葡聚糖的分子量在從10,000到2,000,000Da之間，優(yōu)選分子量為從100,000到500,000Da。通常該樹枝狀部分和聚合部分?jǐn)y帶官能團(tuán)，所述官能團(tuán)可以連接可裂解的物質(zhì)。這些官能團(tuán)可以或者是存在于樹枝狀部分和聚合部分本身或者是額外引入。合適的官能團(tuán)包括胺、羧酸/羧酸酯、NHS酯、羥基、醛、馬來酰亞胺、環(huán)氧、巰基。優(yōu)選的官能團(tuán)是胺基。關(guān)于所述聚合物部分，所述官能團(tuán)可以存在于聚合物鏈上或可以通過一種交聯(lián)劑引入。優(yōu)選的聚合物部分是氨基葡聚糖。所述樹枝狀部分或聚合物部分也可以連接于一個(gè)中央核心或顆粒上。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合試劑包含連接于中央核心的至少一個(gè)樹枝狀部分或聚合物部分。在該實(shí)施方案中，中央核心優(yōu)選是醛修飾的膠乳珠子且所述樹枝狀部分或聚合物部分優(yōu)選是氨基葡聚糖?？闪呀獠糠挚梢赃B接于該樹枝狀部分或聚合物部分。這是可裂解部分以樹枝狀部分或聚合物部分作為媒介間接地連接于中央核心的一個(gè)例子。本發(fā)明的結(jié)合試劑也可以通過逐層自組裝的方法制備，所述層自組裝的方法包括具有相反電荷的聚電解質(zhì)的連續(xù)沉淀。本文所使用的聚電解質(zhì)是一種具有可離子解離基團(tuán)的聚合物?？梢源嬖谟谠摼垭娊赓|(zhì)中的聚陰離子的例子有多磷酸鹽、多硫酸鹽、多磺酸鹽、多膦酸鹽、聚丙烯酸鹽?？梢源嬖谟谠摼垭娊赓|(zhì)中的聚陽離子的例子有聚烯丙胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、聚乙烯亞胺。為了制備這種結(jié)合試劑，可裂解物質(zhì)可以首先連接于一種或多種聚電解質(zhì)上。這可以通過使用例如功能性交聯(lián)劑實(shí)現(xiàn)。然后，聚電解質(zhì)可以和具有相反電荷的聚電解質(zhì)交替地裝配到一個(gè)中央核心上。合適的中央核心如上定義。合適的聚電解質(zhì)包含聚(烯丙胺鹽酸鹽)和聚(苯乙烯磺酸鹽)。在聚電解質(zhì)被裝配以后，可以接著加上識(shí)別組分。本發(fā)明人呈現(xiàn)的一個(gè)問題是不穩(wěn)定物質(zhì)和結(jié)合試劑的非特異性結(jié)合的問題。為每個(gè)結(jié)合試劑提供的不穩(wěn)定物質(zhì)越多，這個(gè)問題越嚴(yán)重。本發(fā)明人已經(jīng)指出，從空間和/或物理上把結(jié)合試劑與不穩(wěn)定物質(zhì)分離會(huì)減少或消除非特異性結(jié)合。因此，本發(fā)明也提供一種結(jié)合試劑，它們的可裂解物質(zhì)在其外部表面有樹枝狀部分或聚合物部分。本發(fā)明中，所述可裂解物質(zhì)的外部表面被認(rèn)為是它們的一部分，其中當(dāng)該結(jié)合試劑在一個(gè)流體樣品中時(shí)，該部分能夠與流體樣品相互作用，即該可裂解物質(zhì)基團(tuán)的外部表面是該可裂解物質(zhì)的在該結(jié)合試劑的外部的一部分。任何能夠減少或消除非特異性結(jié)合的聚合物部分或樹枝狀部分均可以用于此方面。典型的例子是葡聚糖、PEG、一種聚電解質(zhì)和鏈霉親和素。優(yōu)選的聚合物部分或樹枝狀部分是葡聚糖。該結(jié)合試劑的表面也可以用如PEG的聚合物或樹枝狀部分嵌段以減少非特異性結(jié)合。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，提供一種具有一條或多條聚合物鏈例如葡聚糖的顆粒，在所述聚合物鏈上連接有大量可裂解物質(zhì)形成一個(gè)內(nèi)核。這個(gè)核心周圍提供另外一個(gè)外部核心，該外部核心包含一條或多條聚合物鏈如葡聚糖，所述聚合物鏈與結(jié)合物質(zhì)連接。用這種方式把結(jié)合物質(zhì)與可裂解物質(zhì)分離已經(jīng)表現(xiàn)出可減少非特異性結(jié)合?？梢栽O(shè)想其它實(shí)施方案以使結(jié)合試劑與不穩(wěn)定物質(zhì)分離。當(dāng)使用含蛋白質(zhì)的生物樣品的時(shí)候被發(fā)現(xiàn)引起的另一個(gè)問題是不穩(wěn)定電化學(xué)活性基團(tuán)與該蛋白質(zhì)的一種結(jié)合。使用二茂鐵在生物樣品中作為電化學(xué)基團(tuán)通常伴隨的一個(gè)常見缺點(diǎn)是二茂鐵結(jié)合血液中的白蛋白和其它生物蛋白質(zhì)，這會(huì)消弱電極產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)的效應(yīng)。本發(fā)明人已經(jīng)通過提供可裂解的電化學(xué)分子(即可裂解物質(zhì))克服了這個(gè)問題，所述電化學(xué)分子通過裂解產(chǎn)生一種二茂鐵衍生物，其包含一個(gè)二茂鐵基團(tuán)和另外的一些阻礙或基本上阻礙二茂鐵部分與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合的其它基團(tuán)。如本文實(shí)施例中更詳細(xì)地表明，二茂鐵衍生物N-{2-[2-(2-氨基-乙氧基]-乙基}-二茂鐵酰胺(ferrocamide)在這個(gè)方面有特別的優(yōu)勢(shì)，且提供了與該樣品中分析物的濃度相當(dāng)?shù)男盘?hào)。因此，本發(fā)明也提供包含可裂解物質(zhì)的結(jié)合試劑，其中所述可裂解物質(zhì)是被修飾的從而使其當(dāng)被裂解的時(shí)候不與檢測(cè)中包含的分析物或其它部分相互作用。該修飾可以通過如聚乙二醇化(pegylation)而實(shí)現(xiàn)。通常，當(dāng)聚乙二醇化的時(shí)候每個(gè)可裂解部分將包含1至100個(gè)、優(yōu)選1至25個(gè)、更優(yōu)選1至10個(gè)乙二醇衍生的部分。當(dāng)可裂解物質(zhì)包含一種二茂鐵的衍生物的時(shí)候，已發(fā)現(xiàn)使用兩個(gè)乙二醇部分衍生的鏈進(jìn)行聚乙二醇化是有效的。該可裂解物質(zhì)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)表面連接化學(xué)方法連接于顆粒上。然而，該二茂鐵部分通過一個(gè)巰基和一個(gè)馬來酰亞胺基官能團(tuán)形成硫醚鍵的結(jié)合連接于這種顆粒上。該馬來酰亞胺基團(tuán)可以由如氨基葡聚糖或樹枝狀聚合物連接于這種顆粒表面。本發(fā)明的結(jié)合試劑可以包含如增溶劑的其它組分，所述增溶劑例如直鏈或支鏈PEG或糖衍生物，其在裂解前和裂解后均可以提高可裂解物質(zhì)的溶解度，這樣可以增強(qiáng)應(yīng)用本發(fā)明的結(jié)合試劑的檢測(cè)的效果?？梢源嬖谟诒景l(fā)明的結(jié)合試劑中的部分的例子顯示如下其中L1是一種包含至少一個(gè)能夠連接于樹枝狀部分或聚合物部分或者中央核心的官能團(tuán)的連接體?？梢源嬖谟贚1中的基團(tuán)包括胺、羧酸/羧酸酯、NHS酯、羥基、醛、馬來酰亞胺、環(huán)氧、巰基、鹵素基團(tuán)。L1的長度可以被控制以提高該可裂解物質(zhì)的溶解度和/或這個(gè)(些)官能團(tuán)的可及度；PRG是一種能夠吸收波長范圍最低為340nm的UV光的光反應(yīng)基團(tuán)。這類基團(tuán)的一個(gè)例子是2-硝基芐基衍生物；L2是一種包含一個(gè)或伯芐或仲芐型氫的連接體。仲芐型氫對(duì)提高裂解動(dòng)力而言是優(yōu)選的；L3促進(jìn)在L2處的裂解。L3的合適基團(tuán)包括氨基甲酸酯、酯和酰胺連接體；S1提高可光裂解分子和裂解的衍生物的溶解度。合適的增溶部分是直鏈或支鏈PEG、糖衍生物；L4是增溶部分S1和電化學(xué)基團(tuán)間的一個(gè)穩(wěn)定的連接體。合適的連接體的例子是酰胺、酯、氨基甲酸酯、醚、硫醚基團(tuán)；并且E是一個(gè)可電化學(xué)檢測(cè)的基團(tuán)。以上部分僅僅是可存在于本發(fā)明的結(jié)合試劑中的部分的一個(gè)例子?；诙喾N因素如裂解的機(jī)制——上述例子涉及光裂解、裂解時(shí)候物質(zhì)的性質(zhì)——上述的例子中裂解物質(zhì)本身具有電化學(xué)活性、并且基于具體檢測(cè)的需要，結(jié)合試劑中存在的實(shí)際的部分可以相應(yīng)地改變。本發(fā)明提供一種如本文限定的結(jié)合試劑。本發(fā)明也提供了這種結(jié)合試劑用于一種免疫分析法的用途。本發(fā)明還提供了一種包含這種結(jié)合試劑的檢測(cè)。一般而言，本發(fā)明的結(jié)合試劑當(dāng)結(jié)合于一種所關(guān)注的分析物的時(shí)候能夠被固定在一個(gè)捕獲相中。通常，在沒有該分析物的時(shí)候這種結(jié)合將不會(huì)發(fā)生。在捕獲相中的固定可涉及一種本身可固定在捕獲相中的或者可移動(dòng)的第二結(jié)合試劑。當(dāng)為可移動(dòng)的時(shí)候，這些組分通?？尚纬梢环N結(jié)合試劑-分析物-第二結(jié)合試劑的復(fù)合體，然后該復(fù)合體可以被固定在捕獲相中。所述檢測(cè)可以是一種非均相分析，例如一種側(cè)流或微流型的分析，其中一種結(jié)合試劑、分析物或分析物類似物被固定在一種捕獲相的表面，這種捕獲相起到直接地或者間接地結(jié)合一種可移動(dòng)的被標(biāo)記試劑的作用。該被標(biāo)記試劑(也稱結(jié)合試劑)可以在使用前預(yù)先裝入裝置或者與流體樣品混合。該被標(biāo)記試劑也可以是結(jié)合對(duì)的成員之一，如抗原或者抗體。本發(fā)明的檢測(cè)、裝置、試劑盒和方法依賴于一種捕獲相，該捕獲相需要一種能夠結(jié)合一種分析物的結(jié)合試劑，并且該結(jié)合試劑允許與被標(biāo)記試劑偶聯(lián)。一旦該被標(biāo)記試劑被固定在捕獲相，可以從該試劑中裂解出多個(gè)或一個(gè)所述電化學(xué)部分并在一個(gè)電極表面被檢測(cè)到。該捕獲相可以例如提供在一個(gè)顆粒的表面、多孔載體或無孔表面如一個(gè)微流體裝置的內(nèi)表面。多孔載體的一個(gè)例子是硝化纖維素或玻璃纖維。顆?？梢允抢缇酆衔锴蚶缒z乳或水凝膠。無孔表面可以選自例如塑料或玻璃的任何合適的材料，并且可以是光滑的或者是質(zhì)地粗糙的。該捕獲相適合于提供在一個(gè)單獨(dú)區(qū)域，該單獨(dú)區(qū)域可以被稱為捕獲區(qū)。一個(gè)檢測(cè)裝置可以有一個(gè)其中提供一種固定化的結(jié)合試劑(也稱為第二結(jié)合試劑)的捕獲區(qū)，使得可移動(dòng)的被標(biāo)記結(jié)合試劑能夠或者直接地或者間接地連接于該區(qū)域。根據(jù)另外的一個(gè)實(shí)施方案，未被標(biāo)記的和被標(biāo)記的結(jié)合試劑(其中未被標(biāo)記的結(jié)合試劑也稱為第二結(jié)合試劑)都可以是可移動(dòng)的，并且該裝置提供將未被標(biāo)記的結(jié)合試劑-被標(biāo)記試劑復(fù)合體或者未被標(biāo)記試劑-分析物-被標(biāo)記試劑復(fù)合體固定在捕獲區(qū)的工具。該工具可能允許未結(jié)合的被標(biāo)記試劑通過而不允許結(jié)合的被標(biāo)記試劑通過，例如一個(gè)基于尺寸排阻的過濾器。未被標(biāo)記結(jié)合試劑可以例如被一個(gè)其尺寸不允許其通過過濾器的顆粒標(biāo)記，同時(shí)被標(biāo)記的結(jié)合試劑能夠通過所述過濾器。因此，一個(gè)未被標(biāo)記的結(jié)合試劑-被標(biāo)記的結(jié)合試劑復(fù)合體的形成將該被標(biāo)記的結(jié)合試劑從過濾器上游固定或固定在過濾器上。因此過濾器和顆粒的尺寸可以被選擇。該顆?？梢允抢缢z。使用該裝置時(shí)可以與一個(gè)計(jì)量器聯(lián)合使用或可以是一個(gè)計(jì)量器的組成部分。該裝置一般擬作為一次性使用的，而計(jì)量器擬作為可重復(fù)使用的。當(dāng)計(jì)量器和裝置是一個(gè)整體單元時(shí)，該計(jì)量器可為一次性使用的。該計(jì)量器可以包含下列選項(xiàng)中的一個(gè)或多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件、一個(gè)光源、顯示工具、信號(hào)處理工具、接收或連接該裝置的工具、一個(gè)電源、存儲(chǔ)工具和信號(hào)輸出及輸入工具。對(duì)于本發(fā)明的目的，所提及的一種被標(biāo)記的結(jié)合試劑或連接于一種結(jié)合試劑的被標(biāo)記物質(zhì)并不一定意味著該結(jié)合試劑是直接連接于所述的標(biāo)記上。例如，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記和一個(gè)或多個(gè)結(jié)合試劑可以被連接于相同的或不同的其它基質(zhì)例如聚合物或顆粒上，從而有效地間接連接或鍵合該標(biāo)記物質(zhì)和結(jié)合試劑。一個(gè)結(jié)合試劑可以包含一個(gè)連接于基質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)。本發(fā)明的檢測(cè)裝置和試劑盒適合于檢測(cè)流體樣品中一定范圍的分析物。該樣品可以是自然界中生物的、環(huán)境的或工業(yè)的樣品。生物樣品可以來自于動(dòng)物或人。該樣品可以是選自血液、血清、血漿、組織液、尿、腦脊液、淚、唾液、鼻涕(nasalfluid)等的任何生物樣品。該樣品可以是一個(gè)固體樣品例如細(xì)胞碎屑或細(xì)胞，其可以與一種液體混合以提供一種流體樣品。本發(fā)明的一方面提供一個(gè)檢測(cè)裝置或試劑盒用于測(cè)定一個(gè)樣品中一種分析物的含量或存在，所述裝置或試劑盒包含；(a)一種結(jié)合試劑，其能夠結(jié)合樣品中所關(guān)注的分析物或一種固定化的試劑以形成結(jié)合對(duì)，其中該結(jié)合試劑用一種含有不穩(wěn)定基團(tuán)的物質(zhì)標(biāo)記，該物質(zhì)對(duì)一種刺激的反應(yīng)是可裂解以提供一種不穩(wěn)定的電化學(xué)活性物質(zhì)，(b)一個(gè)捕獲相，其包含一種含有一種試劑的載體，所述試劑能夠結(jié)合或連接于所述分析物或所述被標(biāo)記試劑，和；(c)一個(gè)電極，其能夠檢測(cè)該不穩(wěn)定電化學(xué)活性物質(zhì)以指示待測(cè)分析物的存在或含量。該裝置可以任選地被提供裂解該不穩(wěn)定物質(zhì)的其它試劑或工具。如果裂解的工具為例如通過光，則該裝置可以具有一個(gè)光源?；蛘?，該光源可以提供在一個(gè)計(jì)量器中，其中該裝置與該計(jì)量器相配合安裝。該光源的位置設(shè)置為使其照亮所關(guān)注的區(qū)域，例如捕獲相或區(qū)?？紤]到利用光作為裂解刺激物，本發(fā)明有特別的優(yōu)越性，因?yàn)槭褂迷撛噭┖袃H需要一個(gè)步驟就可以鑒定分析物的濃度，所述步驟即將特定波長的光應(yīng)用于裂解不穩(wěn)定鍵，以進(jìn)行對(duì)該樣品中該分析物的含量和存在的電化學(xué)測(cè)定。該電極表面的電化學(xué)化合物的氧化和/或還原產(chǎn)生的電流可以與該樣品中分析物的含量或存在相關(guān)聯(lián)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在放大相或捕獲相中或者同時(shí)在二者中所使用的顆粒可以是任何合適的具體底物，例如膠乳、金或二氧化硅珠子。當(dāng)該檢測(cè)試劑盒與一個(gè)微流體裝置聯(lián)合使用時(shí)，放大相的顆粒可以有利地以粉或可印刷油墨(printableink)的形式提供，其可以由一微通道的表面提供，并且其可以在樣品通過其以后被重新懸浮。根據(jù)本發(fā)明的電極可以以任何合適材料構(gòu)成，例如鈀、鉑、金、銀、碳、鈦或銅。該電極被一種離子交換膜如高氟化樹脂膜包被，其當(dāng)與例如作為電化學(xué)氧化還原基團(tuán)的二茂鐵共同使用的時(shí)候特別有利。該高氟化樹脂膜涂層有利地允許Fc+離子聚集，所述涂層可從電極表面剝落。電極可以間距很近，例如一個(gè)電極和另一個(gè)電極的距離是5u，這為信號(hào)的進(jìn)一步放大提供了可能。電極可以是叉指形的。本發(fā)明也涉及免疫分析中使用的被標(biāo)記的結(jié)合試劑以及其相關(guān)的可用于鑒定或測(cè)量流體樣品中想要的分析物含量的免疫分析、檢測(cè)裝置和試劑盒。本發(fā)明也涉及一個(gè)被設(shè)計(jì)為與檢測(cè)裝置和/或試劑盒聯(lián)合工作的計(jì)量器。根據(jù)第一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于免疫分析中的被標(biāo)記的結(jié)合試劑，其中結(jié)合試劑用一種可被從該結(jié)合試劑上裂解以產(chǎn)生一種不穩(wěn)定電化學(xué)活性物質(zhì)的不穩(wěn)定物質(zhì)標(biāo)記，所述不穩(wěn)定電化學(xué)活性物質(zhì)可隨后在電極表面被檢測(cè)到。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種用于測(cè)定樣品中一種分析物的存在或含量的免疫分析裝置，其中所述裝置包含根據(jù)前一方面的一種被標(biāo)記的結(jié)合試劑。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種包含一種根據(jù)第一方面的試劑的免疫分析試劑盒。還根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種使用一種根據(jù)第一方面的試劑進(jìn)行免疫分析的方法。本發(fā)明提供一種用于免疫分析的結(jié)合試劑，其中該結(jié)合試劑被通過一個(gè)可裂解基團(tuán)連接于該結(jié)合試劑上的一個(gè)或多個(gè)不穩(wěn)定的可裂解電化學(xué)活性物質(zhì)分子所標(biāo)記。本發(fā)明也提供這樣一種結(jié)合試劑，其中可裂解基團(tuán)可以選自光可裂解基團(tuán)和酸可裂解基團(tuán)。本發(fā)明進(jìn)一步提供這樣一種結(jié)合試劑，其中電化學(xué)活性物質(zhì)是一種氧化還原活性物質(zhì)。這種活性物質(zhì)可為二茂鐵或二茂鐵衍生物。本發(fā)明也提供這樣一種結(jié)合試劑，其中該結(jié)合試劑具有多個(gè)不穩(wěn)定的可裂解電化學(xué)活性基團(tuán)。本發(fā)明也提供一種檢測(cè)流體樣品中分析物的存在或含量的方法，該方法包括把一種被懷疑含有所關(guān)注分析物的流體樣品與標(biāo)記有一個(gè)或多個(gè)不穩(wěn)定的電化學(xué)活性基團(tuán)的結(jié)合試劑和第二結(jié)合試劑混和，以形成被固定于捕獲區(qū)的第二結(jié)合試劑-被標(biāo)記的結(jié)合試劑復(fù)合體；從該固定化的復(fù)合體上裂解該一個(gè)或多個(gè)電化學(xué)活性基團(tuán)并接著在一個(gè)電極表面檢測(cè)這些電化學(xué)活性基團(tuán)，以提供該流體樣品中待測(cè)分析物的含量或限度或者存在的指示。本發(fā)明還提供一種用于測(cè)量樣品中分析物的含量或者存在的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括；(a)一種結(jié)合試劑，其能夠結(jié)合該樣品中所關(guān)注的分析物或者一種被固定的試劑以形成結(jié)合對(duì)，其中該結(jié)合試劑被一種含有不穩(wěn)定基團(tuán)的物質(zhì)所標(biāo)記，該物質(zhì)對(duì)一種刺激的反應(yīng)是可被裂解以產(chǎn)生一種不穩(wěn)定的電化學(xué)活性的物質(zhì)，(b)一個(gè)捕獲相，其包含一種含有一種試劑的載體，所述試劑能夠結(jié)合或連接于所述分析物或所述被標(biāo)記的試劑，和；(c)一個(gè)電極，其能夠檢測(cè)該不穩(wěn)定電化學(xué)活性物質(zhì)以提供待測(cè)分析物的存在或含量的指示。本發(fā)明也提供這樣的檢測(cè)試劑盒，其中電極被裝置于捕獲區(qū)的附近區(qū)域。這種電極可以包被有一層離子交換膜。這種離子交換膜的一個(gè)例子是高氟化樹脂膜。下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明。實(shí)施例3.1放大載體/相的設(shè)計(jì)3.1.1UV可裂解的電化學(xué)分子鄰硝基芐基衍生物已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于有機(jī)合成中——特別是作為一個(gè)保護(hù)基，以及在生物學(xué)應(yīng)用中用于分離、純化和鑒定靶生物分子，由于其在使用低能量的UV光時(shí)也有很高的光裂解效率。一個(gè)假想的鄰硝基芐基衍生物的光分解機(jī)制在圖示3.1中顯示。此假想機(jī)制認(rèn)為與環(huán)狀形式B快速平衡的酸式硝基中間體A由一個(gè)三步的過程形成1)UV光激活硝基2)分子內(nèi)氫從芐基碳轉(zhuǎn)移到硝基的氧上。3)電子重排。接著化合物D的釋放和亞硝基衍生物C的形成通過氧從氮轉(zhuǎn)移到芐基碳而實(shí)現(xiàn)。圖示3.1提出的鄰硝基芐基衍生物光分解的機(jī)制我們打算應(yīng)用此光裂解性質(zhì)作為一種手段設(shè)計(jì)一個(gè)電化學(xué)檢測(cè)法，其中電化學(xué)信號(hào)由不穩(wěn)定鍵的UV裂解引發(fā)。3.1.2UV可裂解的二茂鐵分子的合成我們的第一個(gè)目標(biāo)是合成一種新的分子，該分子包含一個(gè)鄰硝基芐基核心、一個(gè)使該分子連接于載體上的官能團(tuán)、一個(gè)電化學(xué)基團(tuán)和一個(gè)可光裂解鍵，該可光裂解鍵可以在UV的照射下被高效地裂解以快速地把一種電化學(xué)衍生物釋放到溶液中。這種分子的一個(gè)例子表示如下。UV可裂解的二茂鐵分子UV可裂解的二茂鐵分子9的合成在圖示3.2中顯示。前體1-(5-溴甲基-2硝基-苯基)-乙酮4根據(jù)Doppler等人的方法由市售的5-甲基-2-硝基苯甲酸起始通過5個(gè)步驟得到。然后用硼氫化鈉處理酮4將其轉(zhuǎn)化成其相應(yīng)的仲醇5。接著，巰基以硫代乙酸鹽的形式被引入，其作為二茂鐵衍生物8的引入過程中的一個(gè)保護(hù)基團(tuán)。該二茂鐵衍生物8根據(jù)圖示3.3通過直接把二茂鐵甲酸與大量過量的2，2′-(亞乙二氧基)二-(乙胺)偶聯(lián)得到。過量物質(zhì)的使用是為了以生成二取代物為代價(jià)促進(jìn)單烷基化產(chǎn)物的形成。然后，將8的伯氨基官能團(tuán)與活性的(N-羥基正丁二酰亞胺)酯偶聯(lián)形成一個(gè)氨基甲酸酯鍵。圖示3.2試劑和條件a)SOCl2、CH2Cl2；b)Mg、EtOH、甲苯、回流；c)甲苯、回流；d)H3O+、回流；e)NBS、過氧化苯甲酰(benzoylperoxide)、CCl4、回流；f)NaBH4、二氧雜環(huán)己烷/甲醇；g)CH3C(O)S-K+、DMF；h)DSC、Et3N、CH3CN；i)8、Et3N、CH2Cl2。圖示3.3試劑和條件a)EDCI、HOBt、ET3N、H2N(CH2CH2O)2CH2CH2NH2、CH2Cl2。3.1.3溶液中的光分解鑒于分子已被合成，我們下一個(gè)目標(biāo)是證明它在溶液中的光裂解。根據(jù)圖示3.1(3.1.1節(jié))，UV可裂解的二茂鐵9的光分解(hv365nm)將導(dǎo)致兩種主要產(chǎn)物的形成(圖示3.4)。根據(jù)中間的pH值，二茂鐵衍生物8可以是質(zhì)子化的或者是非質(zhì)子化的。圖示3.4UV可裂解的二茂鐵分子9可能的光裂解裂解研究以后進(jìn)行薄層色譜法(TLC)，該薄層色譜法在UV可裂解的二茂鐵9的甲醇/PBS溶液經(jīng)過設(shè)定時(shí)間的照射后進(jìn)行(圖3)。-經(jīng)過2分鐘的照射后，觀察到兩種新產(chǎn)物的出現(xiàn)；一個(gè)與二茂鐵產(chǎn)物8(在基線上)相對(duì)應(yīng)，另一個(gè)可能與亞硝基衍生物10(恰好在前沿線下面)相對(duì)應(yīng)。-在所用的照射條件下，UV可裂解二茂鐵分子在不到6分鐘的時(shí)間內(nèi)被完全裂解。3.2把UV可裂解的二茂鐵分子連接于載體上/從載體上光裂解我們的下一個(gè)目標(biāo)是評(píng)估分子9當(dāng)連接于一個(gè)載體上的時(shí)候裂解的效率。如簡(jiǎn)介部分所示，可以考慮使用多種不同的載體，只要所述載體包含大量的連接位點(diǎn)。在我們的實(shí)施例中選擇0.4μm的乙醛修飾的膠乳顆粒。3.2.1把UV可裂解的二茂鐵分子連接于膠乳顆粒為了達(dá)到檢測(cè)最低至pM量級(jí)的分析物的目的，每個(gè)顆粒上需要連接大量的UV可裂解二茂鐵。因此，考慮使用表面修飾以提高該顆粒上可用的連接位點(diǎn)的數(shù)量。實(shí)際的UV可裂解的二茂鐵分子9具有一個(gè)被保護(hù)的巰基，該巰基在脫保護(hù)后呈現(xiàn)一種允許其結(jié)合一個(gè)馬來酰亞胺基官能團(tuán)形成一個(gè)硫醚鍵的活性(圖示3.5)。圖示3.5巰基結(jié)合馬來酰亞胺基因此，我們決定探索在該顆粒表面引入多個(gè)馬來酰亞胺基的方法。表面修飾的一個(gè)例子在圖4中顯示。UV可裂解二茂鐵的連接從市售的0.4μm珠子(1.6％的固體物，高分子微球，紅色熒光，乙醛修飾)起始通過3個(gè)步驟完成。在第一步，氨基葡聚糖通過還原性胺化作用被偶聯(lián)到珠子上。因?yàn)榘被暇厶堑木酆闲再|(zhì)，所以希望剩下的沒有偶聯(lián)的氨基官能團(tuán)在膠乳的表面仍然可進(jìn)行進(jìn)一步的偶聯(lián)。因此，在第二步中馬來酰亞胺基通過使用一種異雙官能(heterobifunctionnal)交聯(lián)劑GMBS(馬來酰亞胺基丁酰氧基-琥珀酰亞胺酯)被引入。最后，根據(jù)圖示3.6進(jìn)行巰基的脫保護(hù)后，UV可裂解二茂鐵分子通過硫醚鍵共價(jià)偶聯(lián)到膠乳上。圖示3.6試劑和條件a)MeOH/PBS(50/50)、EDTA(0.1M)、羥基胺.HCl(1M)。3.2.2從膠乳顆粒上光裂解UV可裂解的二茂鐵分子3.2.2.1用B100A型的UV燈進(jìn)行光裂解二茂鐵衍生物8被從珠子上光裂解并且因此被釋放到溶液中，然后對(duì)其用循環(huán)伏安法進(jìn)行研究。用一個(gè)B100A型的UV燈在365nm的波長(10”處強(qiáng)度為8,900μW/cm2)下對(duì)不同濃度的珠子照射5分鐘。照射前后的電化學(xué)響應(yīng)的差異在圖5、6和7中顯示，該差異歸因于從膠乳顆粒上對(duì)二茂鐵衍生物8進(jìn)行光釋放的差異。3.3用UV可裂解二茂鐵分子敏化的對(duì)400nmTRL珠子性質(zhì)的研究實(shí)驗(yàn)關(guān)注于實(shí)時(shí)跟蹤UV可裂解的二茂鐵分子的裂解(而不是進(jìn)行例如循環(huán)伏安法的單點(diǎn)測(cè)量，以更多地理解裂解過程)，并且測(cè)定每個(gè)珠子的UV可裂解二茂鐵分子的數(shù)量的近似值。制備了許多珠子溶液，其濃度隨后通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定(每17μL中1.16E+08、46600000、23300000、11650000、5825000、2912500和1456250個(gè)珠子)。實(shí)驗(yàn)的細(xì)節(jié)在2.5.2節(jié)中描述。結(jié)果總結(jié)在圖8中，顯示的原始數(shù)據(jù)中包含PBS對(duì)照。經(jīng)過大約50秒的計(jì)時(shí)電流法測(cè)量，開啟綠色LED提供360nm的UV光。有意思的是即使沒有UV可裂解的二茂鐵分子存在(即PBS對(duì)照)的時(shí)候也觀察到電流的最初升高，目前這個(gè)現(xiàn)象的原因仍然是未知的。所測(cè)量的電流與珠子濃度邏輯上相關(guān)，并因此與裂解的二茂鐵分子的量相關(guān)，最高的珠子濃度產(chǎn)生最大電流且最低的珠子濃度產(chǎn)生最小電流。同樣的數(shù)據(jù)經(jīng)歸一化(扣除PBS的數(shù)據(jù)進(jìn)行基線校正)和重新標(biāo)度后在圖9中顯示。電流隨珠子濃度變化的現(xiàn)象更清楚地顯示出來。必須指出，在四個(gè)最高的珠子濃度(1.16E+08、46600000、23300000、11650000)下當(dāng)計(jì)時(shí)電流法測(cè)量結(jié)束時(shí)電流仍然在增加，這說明在給定的時(shí)間范圍內(nèi)UV裂解是不完全的。最低的珠子濃度(每17μL中2912500個(gè)珠子)顯示電流的增加接著是電流的減小，這說明UV可裂解的二茂鐵分子正在被耗盡，相比之下PBS對(duì)照沒有顯示這個(gè)現(xiàn)象，如圖10所示。為了計(jì)算每個(gè)400nm珠子有大約多少個(gè)UV裂解的二茂鐵分子，做出了電流與UV可裂解的二茂鐵分子8的關(guān)系的標(biāo)定曲線。這包括用相同的方法在UV可裂解的二茂鐵分子的一個(gè)已知濃度范圍內(nèi)測(cè)量電流響應(yīng)，以用于對(duì)珠子濃度和電流強(qiáng)度進(jìn)行研究。這些數(shù)據(jù)總結(jié)在圖11中。從圖11中，可以得到電流與UV裂解的二茂鐵分子的關(guān)系的標(biāo)定曲線。從圖9的200秒處的點(diǎn)得出每個(gè)濃度下的數(shù)值(i/A)。所得的標(biāo)定曲線在圖12中顯示。顆粒數(shù)量與i/A(UV裂解的二茂鐵分子)的關(guān)系曲線清楚地顯示這兩個(gè)參數(shù)間的很好的相關(guān)性。這在圖13中顯示。該標(biāo)定曲線(圖12)使得可以將圖10中的來自400nm珠子的UV裂解的二茂鐵分子產(chǎn)生的電流轉(zhuǎn)換成濃度，因此可以得到如圖14中所示的UV裂解的二茂鐵(μM)與珠子濃度的關(guān)系曲線。利用圖14可以計(jì)算每個(gè)400nm珠子上UV可裂解的二茂鐵分子的數(shù)量的近似值。計(jì)算如下所示用圖14的22μM的值。每ml中顆粒的數(shù)量＝每ml2.74E+09-流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得的數(shù)量每μL中顆粒的數(shù)量＝每μL2.74E+06每17μL中顆粒的數(shù)量＝1.16E+08每μM分子的數(shù)量＝6.02E+17因此每ml中分子的數(shù)量＝6.02E+14因此每μL中分子的數(shù)量＝6.02E+11因此每17μL中分子的數(shù)量＝1.02E+14因此在17μL中在22μM下＝2.25E+14個(gè)FcPEG分子每個(gè)顆粒FcPEG分子的大約數(shù)量＝2.25E+14/1.16E+08＝每個(gè)顆粒4.83E+06這個(gè)大約的數(shù)量是一個(gè)低估值，因?yàn)樵?00秒的點(diǎn)處電流仍然在增加。并且必須注意到僅僅是UV可裂解二茂鐵分子與400nm珠子偶聯(lián)。一旦抗體也與400nm珠子偶聯(lián)，UV可裂解的二茂鐵分子的數(shù)量將會(huì)明顯地減小。3.4二茂鐵分子在薄層室(thinlayercell)/毛細(xì)管填充裝置中的UV裂解二茂鐵分子從400nm珠子上的UV裂解已經(jīng)在前文證明，然而進(jìn)行這些測(cè)量是把總體積為17μL的溶液滴加到絲網(wǎng)印刷電極上。在3.4節(jié)我們證明使用薄層室/毛細(xì)管填充裝置進(jìn)行的非常相似的測(cè)量。如材料和方法部分所述，用雙面膠帶和條狀蓋在絲網(wǎng)印刷電極上構(gòu)造薄層室/毛細(xì)管填充裝置。結(jié)果的總結(jié)在圖15中顯示。相同數(shù)據(jù)經(jīng)過重新標(biāo)度在圖16中顯示。該簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)證明UV裂解能夠在薄層室/毛細(xì)管填充裝置中用小體積的樣品實(shí)現(xiàn)，雖然所用6μL體積的樣品中大約僅2μL覆蓋電極。另外，通過改變LED輸入電壓并因此改變UV光的量，可改變裂解的量。3.5把UV可裂解的二茂鐵分子和抗體都偶聯(lián)到膠乳顆粒上嘗試兩種相反的策略把UV可裂解的分子和抗體(在這個(gè)例子中是3299)都偶聯(lián)到膠乳顆粒上-第一種方法把抗體與載體偶聯(lián)之后再連接UV可裂解的二茂鐵分子。-第二種方法連接UV可裂解的二茂鐵分子之后偶聯(lián)抗體。3.5.1方法1偶聯(lián)抗體之后偶聯(lián)UV可裂解的分子需要再次考慮表面修飾以使珠子偶聯(lián)的抗體和UV可裂解的分子最多。這個(gè)方法中使用的表面修飾的一個(gè)例子在圖17中顯示。與抗體和UV可裂解的二茂鐵分子的偶聯(lián)通過4個(gè)步驟實(shí)現(xiàn)，其使用與上述的過程相同的化學(xué)作用把UV可裂解的二茂鐵分子連接于膠乳顆粒上。第1、2步和UV可裂解的分子9的脫保護(hù)也在這一節(jié)中說明。在第3步中，按照?qǐng)D示3.7修飾的3299抗體被結(jié)合到連接在珠子上的馬來酰亞胺基上。因?yàn)榇罅康鸟R來酰亞胺基官能團(tuán)存在于該顆粒表面并且因?yàn)榭贵w的巨大體積，預(yù)計(jì)剩下的馬來酰亞胺基仍然可以在第4步與UV可裂解的二茂鐵分子偶聯(lián)。圖示3.7試劑和條件a)SAMSA、DMF、PBS；b)EDTA(0.1M)、羥基胺(1M)、PBS。3.5.2方法2偶聯(lián)UV可裂解的分子之后偶聯(lián)抗體這個(gè)方法使用的表面修飾的一個(gè)例子在圖18中顯示。對(duì)UV可裂解的二茂鐵分子和3299抗體的偶聯(lián)通過6個(gè)步驟實(shí)現(xiàn)，其使用的化學(xué)作用涉及記載把UV可裂解的二茂鐵連接于膠乳顆粒(A)的節(jié)中和上述方法1中所用的化學(xué)作用。第1、2步和UV可裂解的分子9的脫保護(hù)在上文關(guān)于A的節(jié)中進(jìn)行了說明?？贵w的修飾在方法1中說明。這里使用的策略包含同時(shí)連接UV可裂解的二茂鐵分子和一個(gè)第二雙官能團(tuán)連接體，以在膠乳的表面引入可利用的羧基官能團(tuán)，以便進(jìn)一步偶聯(lián)抗體。為了達(dá)到這個(gè)目的選擇HSPEG4CO2H。在此階段，第二層的氨基葡聚糖通過酰胺鍵被偶聯(lián)到膠乳上，然后是交聯(lián)劑GMBS的連接以結(jié)合修飾的3299。3.6當(dāng)抗體也偶聯(lián)上后對(duì)每個(gè)400nm珠子上UV可裂解的二茂鐵分子數(shù)量的研究用與3.3節(jié)中所述相同的測(cè)量方法和步驟測(cè)定當(dāng)抗體也偶聯(lián)到400nm珠子上的時(shí)候UV可裂解的二茂鐵分子的數(shù)量。特別檢驗(yàn)了兩種方法，第一種是先偶聯(lián)3299(抗hCG)抗體再偶聯(lián)UV可裂解的二茂鐵分子，第二種相反方案，先偶聯(lián)UV可裂解的二茂鐵分子再偶聯(lián)抗體。結(jié)果被總結(jié)在圖19和圖20中。然后，用200秒處的i/A值計(jì)算每個(gè)珠子上UV可裂解的二茂鐵分子的數(shù)量。結(jié)果總結(jié)在表3.1中。表3.1因此，首先在400nmTRL珠子上偶聯(lián)UV可裂解的二茂鐵分子然后偶聯(lián)抗體獲得每個(gè)400nm珠子上最大數(shù)量的UV可裂解的二茂鐵分子。有意思的是，在圖19中顯示的計(jì)時(shí)電流法測(cè)量過程中，LED輸入電壓在測(cè)量開始大約504秒時(shí)被從22mV調(diào)到38mV。清晰地觀察到如所預(yù)期的速率的變化，如圖21中所突出顯示的，這證實(shí)了前面的觀察結(jié)果(見圖15)。3.7設(shè)計(jì)捕獲相/區(qū)如在簡(jiǎn)介部分所知，捕獲相/區(qū)必須包括至少2個(gè)明確限定的部件一個(gè)表面和一個(gè)生物識(shí)別部分，該生物識(shí)別部分能夠被動(dòng)地吸收在表面上或者在表面修飾后共價(jià)連接在表面上。制備的捕獲相的一個(gè)例子顯示在圖22中。在這個(gè)例子中，我們選擇用硫醚鍵將3468抗體共價(jià)連接經(jīng)過修飾的20μm珠子?？贵w的偶聯(lián)起始于市售的基于聚苯乙烯的20μm的顆粒，通過2個(gè)步驟完成。在第1步中，馬來酰亞胺基通過吸收被引入到F108-PMPI(合成見以下圖示3.8)珠子的表面，所述珠子是一種三嵌段聚合體洗滌劑。然后將根據(jù)3.5.1節(jié)的圖示3.7修飾的抗體3468結(jié)合到該馬來酰亞胺官能團(tuán)上。圖示3.7F108-PMPI的合成3.8用IMF3用計(jì)時(shí)電流法進(jìn)行測(cè)量的hCG“濕分析”進(jìn)行一種濕分析，其中將20μm顆粒、400nm顆粒和hCG標(biāo)準(zhǔn)樣品(0或400mIU)預(yù)混合大約30分鐘(更詳細(xì)內(nèi)容見材料和方法部分)。計(jì)時(shí)電流法測(cè)量(見圖23和24)用IMF3裝置(見材料和方法部分)進(jìn)行。每個(gè)濃度僅進(jìn)行一次測(cè)量，因?yàn)?00nm顆粒(抗hcg抗體、UV可裂解二茂鐵分子)和最終的UV可裂解的二茂鐵分子供應(yīng)量有限。將來的研究將會(huì)在能夠獲取這些顆粒之后報(bào)道。然而，0和400mIUhCG標(biāo)準(zhǔn)樣品之間很明顯有很大不同，這在圖24中有更清晰的顯示。用0hCG在UV光源開啟時(shí)觀察到電流的最初升高，接著是電流的降低。在對(duì)比研究中觀察到同樣的電流的最初升高，接著是電流的繼續(xù)升高并在大約117秒的點(diǎn)處開始降低。這說明該溶液正在耗盡UV可裂解的二茂鐵分子。3.9UV可裂解的二茂鐵分子的選擇有幾種不同類型的二茂鐵分子可被選擇進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量。優(yōu)選的分子是二茂鐵PEG，因?yàn)橹暗膶?shí)驗(yàn)鑒定其特征有利于蛋白質(zhì)、血漿或血液溶液中進(jìn)行的電化學(xué)測(cè)量。測(cè)量這類樣品中電化學(xué)標(biāo)記物的問題之一是電化學(xué)標(biāo)記物與蛋白質(zhì)分子特別是人血清白蛋白(HSA)的結(jié)合并因此損失信號(hào)。一個(gè)先前的研究二茂鐵分子與HSA結(jié)合的研究被總結(jié)在圖25中。合成了一系列的被二茂鐵標(biāo)記的脂肪酸探針，其包含二茂鐵、一個(gè)連接體、一個(gè)增溶間隔基(spacer)、一個(gè)第二連接體和一個(gè)碳長度不同的脂肪酸。碳長度的變化方案包括3個(gè)(化合物4)、6個(gè)(化合物6)、9個(gè)(化合物)、11個(gè)(化合物2)和16個(gè)(化合物10)碳原子，所述碳原子數(shù)目包括末端羧基的碳(圖示3.8)。循環(huán)伏安法被用來在HSA存在或者不存在的情況下測(cè)量被二茂鐵標(biāo)記的脂肪酸探針的濃度，使得可以計(jì)算結(jié)合百分比。圖3.24清晰地表明被二茂鐵標(biāo)記的脂肪酸探針物質(zhì)(25μM)與HSA(500μM)的結(jié)合百分比可通過變化碳鏈的長度的方法進(jìn)行控制。有意思的是，發(fā)現(xiàn)0個(gè)碳的對(duì)照分子二茂鐵甲醇與HSA的結(jié)合相對(duì)較強(qiáng)，50％地結(jié)合HSA。目前，我們不確定二茂鐵結(jié)合HSA的位置，并且我們不打算研究這個(gè)，盡管認(rèn)為可能涉及其中一個(gè)藥物結(jié)合位點(diǎn)并且這是正在進(jìn)行的工作的主題。當(dāng)二茂鐵通過一個(gè)PEG連接體分子結(jié)合到一個(gè)短碳鏈上，該鏈將阻止二茂鐵結(jié)合HSA，這可能是因?yàn)榭臻g位阻或二茂鐵上電荷的改變，或者綜合二種原因。圖示3.8被二茂鐵標(biāo)記的脂肪酸探針的一般結(jié)構(gòu)3.10UV裂解的二茂鐵分子的電化學(xué)測(cè)量現(xiàn)在沒有嘗試進(jìn)行對(duì)UV裂解的二茂鐵分子的電化學(xué)測(cè)量技術(shù)的優(yōu)化。計(jì)時(shí)電流法被應(yīng)用于整個(gè)研究之中是因?yàn)槠湎鄬?duì)簡(jiǎn)單的測(cè)量而且也能提供有質(zhì)量的數(shù)據(jù)，例如給出電位電化學(xué)檢測(cè)早期發(fā)展中必須的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。然而有許多其它電化學(xué)測(cè)量方法能夠?qū)ΧF分子進(jìn)行更靈敏的測(cè)量。以前的研究已經(jīng)確定了多種電化學(xué)技術(shù)可以用于提高測(cè)量靈敏度。例如已經(jīng)用叉指形微電極陣列進(jìn)行二茂鐵分子的高靈敏度測(cè)量?？偨Y(jié)的結(jié)果在圖中顯示，靈敏度為300nM(測(cè)量技術(shù)的靈敏度，并非針對(duì)所有與之相關(guān)的檢測(cè))。相似地，已經(jīng)研究了差示脈沖測(cè)量可作為一種可能的測(cè)量二茂鐵分子的方法。結(jié)果總結(jié)在圖28中。另外，以前的研究顯示二茂鐵分子可以在高氟化樹脂包被的電極中聚集。特別地，高氟化樹脂包被電極時(shí)的反向峰值電流(reversepeakcurrent)比未包被電極時(shí)的大。這可能是由于信號(hào)分子在高氟化樹脂中的聚集所致。為了證實(shí)這一點(diǎn)，進(jìn)行了溶出伏安法，其中電位從0V掃描到信號(hào)分子被氧化的電位，然后在保持兩分鐘后掃描回來。從掃描回來得到的電流可以總結(jié)出信號(hào)分子在用水流延的高氟化樹脂包被中顯著地聚集。在用乙醇流延的高氟化樹脂中沒能發(fā)現(xiàn)這種聚集(見圖29和30)。高氟化樹脂膜(用水流延)除了具有二茂鐵聚集性質(zhì)之外，也顯示出能夠在尿酸和抗壞血酸的存在下測(cè)量二茂鐵化合物。這些化合物是血液中發(fā)現(xiàn)的兩種主要的電化學(xué)干擾物。高氟化樹脂膜使尿酸/抗壞血酸的電流貢獻(xiàn)累加到所測(cè)的二茂鐵電流上，而不出現(xiàn)“居間”現(xiàn)象，即在尿酸/抗壞血酸的存在下所測(cè)的二茂鐵電流大于分別測(cè)定的二茂鐵和尿酸/抗壞血酸電流的和。但該電流仍然是累加的電流，并且需要進(jìn)行尿酸/抗壞血酸電流貢獻(xiàn)的背景測(cè)量以進(jìn)行背景校正。材料和方法所有濕敏感型的反應(yīng)在氮?dú)夥障掠煤娓傻牟Ａ髅蠛蜔o水溶劑進(jìn)行。除非另有說明，試劑從供應(yīng)商處獲得并且使用時(shí)不作進(jìn)一步純化。反應(yīng)通過使用Kieselgel60F254板的UV檢測(cè)的TLC進(jìn)行監(jiān)測(cè)。閃式柱色譜用硅膠60進(jìn)行。1HNMR譜用BrukerAMX-300或AVANCE400在300MHz或400MHz下被記錄。13CNMR譜在75MHz或100MHz下被記錄。相對(duì)積分、峰裂數(shù)(s單峰、d雙峰、t三重峰、m多重峰)和偶合常數(shù)，單位為Hz，在可能存在的地方被標(biāo)出。用Micromass的QuattroLC儀器(ES)獲得質(zhì)譜。第6步的反應(yīng)在黑暗中進(jìn)行。終產(chǎn)物和所有中間體均避光保存。2.1合成UV可裂解的二茂鐵分子第1步合成5-甲基-2-硝基-苯甲酰氯1在溶于20ml無水二氯甲烷中的5-甲基-2-硝基苯甲酸(1.50g，8.28*10-3摩爾)的溶液中加入兩滴的無水DMF和亞硫酰氯(1.82ml，2.48*10-2摩爾)。室溫下攪拌該溶液30分鐘。然后蒸發(fā)溶劑并且將殘留物溶于20ml乙醚中，再次除去溶劑。粗品中間體1不經(jīng)過純化被使用。第2步合成乙氧基鎂丙二酸二乙酯制備一種由在10ml無水甲苯中的鎂屑(0.294g，1.21*10-2摩爾)、丙二酸二乙酯(1.84ml，1.21*10-2摩爾)、乙醇(1.21*10-2摩爾)組成的反應(yīng)混合物。將該混合物加熱至回流1小時(shí)30分。在這個(gè)過程中大部分的鎂被消耗。直接使用這個(gè)物料。注使用干燥管。如果10分鐘后反應(yīng)沒有開始(自持的劇烈的回流)，將4滴四氯化碳加入至混合物中。第3和4步合成1-(5-甲基-2-硝基-苯基)-乙酮3將中間體1溶解在5ml的無水甲苯中并將其加入到中間體2的溶液中。該反應(yīng)混合物回流30分鐘。然后蒸發(fā)溶劑，然后將45ml的6M的硫酸加入到殘留物中。該混合物回流3h。在冷卻之后，將該混合物倒入一個(gè)分液漏斗中并且用乙醚萃取。經(jīng)堿洗后，有機(jī)相用水洗然后用硫酸鈉干燥，過濾并且在減壓下除去溶劑，獲得1.365g(經(jīng)過四步后產(chǎn)率92％)橙色油狀產(chǎn)物。該物質(zhì)可以直接在下一步中使用。1HNMR(CDCl3，300MHz)δH2.39(s，3H，CH3)，2.45(s，3H，CH3)，7.12(1H，m，ArH)，7.29-7.32(m，1H，ArH)，7.98-8.02(m，1HArH).13CNMR(CDCl3，75.56MHz)δC21.2(CH3)，30.0(CH3)，124.2，127.5，130.g，137.9，143.0，146.0(Ar)，200.4(CO).第5步合成1-(5-溴甲基-2-硝基-苯基)-乙酮4將4ml無水四氯化碳中的1-(5-甲基-2-硝基苯基)-乙酮3(0.700g，3.91*10-3摩爾)、N-溴代琥珀酰亞胺(0.765g，4.30*10-3摩爾)和過氧化苯酰(10mg)的混合物加熱至回流1小時(shí)30分。然后將該混合物冷卻、過濾并蒸發(fā)至干。用柱色譜(梯度己烷/乙酸乙酯，100％的己烷至80％的己烷)純化產(chǎn)物，得到0.603g(60％)的標(biāo)題化合物。1HNMR(CDCl3，300MHz)δH2.53(s，3H，CH3)，4.48(s，CH2Br)，7.41(m，1H，ArH)，7.60(m，1H，ArH)，8.04(m，1H，ArH).13CNMR(CDCl3，75.56MHz)δC30.0(CH3)，37.3(CH2Br)，125.0，127.8，131.0，138.3，144.8，147.6(Ar)，199.4(CO).m/z(+ES)279.9[M+Na]+.第6步合成1-(5-溴甲基-2-硝基-苯基)乙醇5反應(yīng)在黑暗中進(jìn)行以避免與UV的任何接觸。將固體的硼氫化鈉(0.081g，2.13*10-3摩爾)快速加入到冰冷的1-(5-溴甲基-2-硝基-苯基)-乙酮4(0.500g，1.94*10-3摩爾)的二氧雜環(huán)己烷(4ml)和甲醇(6ml)溶液中。0℃下攪拌30分鐘后，剩余的硼氫化鈉通過加入丙酮停止反應(yīng)。然后蒸發(fā)溶劑。將粗產(chǎn)物溶于二氯甲烷，用HCl/水洗滌并最后用鹽水洗滌。然后，有機(jī)相經(jīng)硫酸鈉干燥、過濾并蒸發(fā)至干。用柱色譜(1)己烷/乙酸乙酯90/10、2)己烷/乙酸乙酯75/25)純化產(chǎn)物，得到0.353g(70％)的標(biāo)題化合物。1HNMR(CDCl3，300MHz)δH1.54(m，3H，CH3CH)，4.49(s，CH2Br)，5.43(m，1H，CHCH3)，7.45(m，1H，ArH)，7.85-7.88(m，2H，ArH).13CNMR(CDCl3，75.56MHz)δC24.4(CH3CH)，38.5(CH2Br)，66.5(CH3CH)，125.1，128.1，128.6，141.8，143.7(Ar).m/z(+ES)281.9[M+Na]+.第7步合成硫代乙酸S-[3-(1-羥基-乙基)-4-硝基-苯基]酯6反應(yīng)在黑暗中進(jìn)行以避免與UV的任何接觸。向溶于5ml無水DMF的1-(5-溴甲基-2-硝基-苯基)乙醇5(0.350g，1.35*10-3摩爾)的溶液中加入硫代乙酸鉀(0.170g，1.49*10-3摩爾)。室溫下攪拌該混合物2個(gè)小時(shí)。然后將該溶液在水和二氯甲烷之間分配。之后該有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)至干。用柱色譜(梯度己烷/乙酸乙酯，100％的己烷至70％的己烷)純化產(chǎn)物，得到為0.242g(70％)的標(biāo)題化合物。1HNMR(CDCl3，300MHz)δH1.55(d，J＝6.3Hz，3H，CH3CH)，2.36(s，3H，CH3CO)，4.14(s，2H，CH2S)，5.41(m，1H，CH3CH)，7.31-7.34(m，1H，ArH)，7.75(m，1H，ArH)，7.83-7.86(m，1H，ArH).13CNMR(CDCl3，75.56MHz)δC24.2(CH3CH)，30.3和32.8(CH2S+CH3CO)，65.6(CH3CH)，124.9，127.9，128.4，141.5，144.4(Ar)，194.5(SCO).m/z(+ES)278[M+Na]+.第8步合成硫代乙酸3-[1-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基氧基羰基氧基)乙基]-4-硝基苯甲酯7反應(yīng)在黑暗中進(jìn)行以避免與UV的任何接觸。向溶于3ml無水乙腈的硫代乙酸S-[3-(1-羥基-乙基)-4-硝基-芐基]酯6(0.220g，8.66*10-4摩爾)的溶液中加入三乙胺(2當(dāng)量)。然后加入N’，N’-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(0.288g，1.126*10-3摩爾)。在0℃下攪拌該混合物30分鐘，之后在室溫下放置過夜。然后在減壓條件下蒸發(fā)溶劑。用柱色譜(梯度己烷/乙酸乙酯，100％的己烷至40％的己烷)純化產(chǎn)物，得到0.171g(50％)的標(biāo)題化合物。1HNMR(CDCl3，400MHz)δH1.75(D，J＝6.4Hz，3H，CH3CH)，2.32(s，3H，CH3CO)，2.77(s，4H，CH2琥珀酰亞胺基)，4.16(s，2H，CH2S)，6.38(m，1H，CH3CH)，7.40，7.61，7.94(m，ArH).13CNMR(CDCl3，100MHz)δC21.9(CH3CH)，25.4(CH2琥珀酰亞胺基)，30.1和32.5(CH2S+CH3CO)，75.8(CH3CH)，125.2，127.1，129.4，136.1，145.4，150.5(Ar)，165.5，169.0，194.2(CO).m/z(+ES)419.1[M+Na]+.第9步合成硫代乙酸S-[3-(1-{2[2-(2-二茂鐵羰基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲酰基氧基}-乙基)-4-硝基-芐基]酯9反應(yīng)在黑暗中進(jìn)行以避免與UV的任何接觸。將硫代乙酸3-[1-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基氧基羰基氧基)-乙基]-4-硝基苯甲酯7(0.150g，3.80*10-4摩爾)溶解于無水二氯甲烷中，并加入到攪拌的8(0.164g，4.56*10-4摩爾)的無水二氯甲烷溶液中。然后加入三乙胺(1.2當(dāng)量)。在室溫下攪拌該混合物過夜。有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)至干。用以下洗脫液通過柱色譜純化產(chǎn)物洗脫液1)乙酸乙酯/己烷(30/70)、2)乙酸乙酯/己烷(60/40)、3)100％乙酸乙酯，得到0.097g(40％)的標(biāo)題化合物。產(chǎn)物在4℃避光保存。1HNMR(CDCl3，400MHz)δH1.59(d，J＝6.5Hz，3H，CH3CH)，2.35(s，3H，CH3CO)，3.33(m，2H，CH2NH)，3.50-3.60(m，10H，CH2O+CH2NH)，4.11(s，2H，CH2S)，4.20(m，5H，Cp)，4.33(m，2H，Cp)4.67(m，2H，Cp)，5.30(br，1H，NH)，6.22(m，2H，CH3CH+NH)，7.31(m1H，ArH)，7.52(m，1H，ArH)，7.85(m，1H，ArH).13CNMR(CDCl3，100MHz)δC22.1(CH3CH)，30.2和32.7(CH2S+CH3CO)，39.2和40.7(CH2NH)，68.1-75.9(幾個(gè)信號(hào)，Cp+CH2O+CHCH3)，124.9，127.4，128.4，139.0，144.1，146.8(Ar)，155.2(CO氨基甲酸酯)，170.3(COCp)，194.1(SCO).m/z(+ES)664.2[M+Na]+.第10步合成N-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙基}二茂鐵酰胺8向二茂鐵甲酸(0.500g，2.17*10-3摩爾)的無水二氯甲烷溶液中加入1-羥基苯并三唑水合物(0.326g，2.87*10-3摩爾)。在室溫下攪拌10分鐘后加入EDCI(0.457g，2.87*10-3摩爾)和三乙胺(2.2當(dāng)量)。在室溫下攪拌該混合物30分鐘。然后在0℃把該溶液逐滴加到2，2′-(亞乙二氧基)雙-(乙胺)(3.21g，2.17*10-2摩爾)的溶液中。在室溫下攪拌該混合物過夜。在過濾后將濾液洗滌三次，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)至干。用柱色譜(洗脫液二氯甲烷/甲醇/三乙胺，85/10/5)純化產(chǎn)物，得到0.312g(40％)的標(biāo)題化合物。1HNMR(CDCl3，300MHz)δH2.87(m，2H，CH2NH2)，3.48-3.61(m，10H，CH2O+CH2NH)，4.17(m，5H，Cp)，4.29(m，2H，Cp)，4.69(m，2H，Cp)，6.38(br，1H，NH).13CNMR(CDCl3，75.56MHz)δC39.0(CH2NH2)，41.2(CH2NH)，68.0-75.8(幾個(gè)信號(hào)，Cp+CH2O)，170.1(CO).m/z(+ES)383[M+Na]+.2.2將UV可裂解的二茂鐵分子偶聯(lián)至顆粒上2.2.1用氨基葡聚糖包被400nmTRL珠子(具有CHO官能團(tuán))/膠乳理論濃度為0.3％固體向懸浮于392.5μlMES(pH6.0，50mM)中的400nmTRL珠子(具有CHO官能團(tuán)，187.5μl，1.6％w/v)的懸浮液中加入400μl的氨基葡聚糖溶液，所述氨基葡聚糖溶液通過在600μl的MES(pH6.0，50mM)中溶解3mg的氨基葡聚糖得到。該懸浮液經(jīng)臺(tái)式旋渦儀(benchvortex)攪拌，然后加入20μl的NaBH3CN(1M)的溶液。該膠乳在室溫下攪拌(立式圓筒形混合儀(end-over-endmixer))保溫過夜。然后將該懸浮液離心(15,500rpm，15℃)20分鐘。棄去上清液，加入1ml的MES(pH6.0，50mM)，沉淀物用臺(tái)式旋渦儀和超聲波浴器重新懸浮。然后將該懸浮液離心(15,500rpm，15℃)20分鐘。棄去上清液。該洗滌步驟再重復(fù)2次。最后，將沉淀物重新懸浮于1ml的MES(pH6.0，50mM)中，聲波處理并在4℃下保存。氨基葡聚糖包被的膠乳的終濃度理論上是0.3％(w/v)。2.2.2UV可裂解的二茂鐵分子的連接反應(yīng)在黑暗中進(jìn)行以避免與UV的任何接觸。2.2.2.1引入交聯(lián)劑(馬來酰亞胺基丁脫基氧基-琥珀酰亞胺酯)將氨基葡聚糖-膠乳懸浮液(1ml，根據(jù)2.2.1節(jié)制備)離心(15,500rpm，15℃)20分鐘。棄去上清液，沉淀物用臺(tái)式旋渦儀和超聲波浴器重新懸浮于900μl的PBS(pH7.0)中。將含5mgGMBS交聯(lián)劑的100μlDMF溶液加入到該膠乳中并且將懸浮液在室溫下攪拌(立式圓筒形混合儀)保溫45分鐘。然后離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液，將沉淀物用臺(tái)式旋渦儀和超聲波浴器重新懸浮于1mlPBS(pH7.0)中。然后離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。將沉淀物重新懸浮于325μl的PBS(pH7.0)中。然后，加入(攪拌)175μl的DMF，之后加入500μl的脫保護(hù)的UV可裂解的二茂鐵分子(UV可裂解的二茂鐵分子9的脫保護(hù)根據(jù)后文2.2.2.2節(jié)的表述進(jìn)行)的溶液。在聲處理之后在室溫下將該膠乳攪拌(立式圓筒形混合儀)保溫過夜。然后離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液，加入1ml的含35％DMF的PBS溶液，沉淀物用臺(tái)式旋渦儀和超聲波浴器重新懸浮。在室溫下攪拌30分鐘以后，離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液。該洗滌步驟再重復(fù)2次。然后，將沉淀物重新懸浮于含20％DMF的PBS溶液中，經(jīng)聲波處理。在室溫下攪拌20分鐘以后，離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液。該洗滌步驟再重復(fù)1次。然后，將沉淀物重新懸浮于1ml的PBS中，聲波處理并且離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液。最終將沉淀物重新懸浮于1ml的PBS中，進(jìn)行聲處理并在4℃下在暗處保存。2.2.2.2UV可裂解的二茂鐵分子9的脫保護(hù)將UV可裂解的二茂鐵分子9(3mg，4.68*10-6摩爾)溶解在500μl的甲醇中。加入400μl的PBS、40μl的EDTA(0.1M)和最終80μl的羥基胺.HCl(1M)。將該混合物在室溫下攪拌30分鐘。然后加入二氯甲烷(4ml)。將該混合物倒入一個(gè)分液漏斗，收集有機(jī)相并在減壓條件下除去溶劑。然后將該脫保護(hù)的UV可裂解的二茂鐵分子溶解于200μl的DMF中。然后加入300μl的PBS(pH7.0)(如果溶液變渾濁可以再加入幾滴的DMF)，該溶液可以直接使用。2.3把UV可裂解的二茂鐵分子和3299抗體都偶聯(lián)于膠乳上反應(yīng)在黑暗中進(jìn)行以避免與UV的任何接觸。2.3.1先偶聯(lián)3299抗體再偶聯(lián)UV可裂解的二茂鐵分子[3299指的是用于檢測(cè)孕激素hCG(人絨毛膜促性腺激素)的抗-αhCG的克隆數(shù)]將氨基葡聚糖-膠乳懸浮液(1ml，根據(jù)2.2.1節(jié)制備)離心(15,500rpm，15℃)20分鐘。棄去上清液，沉淀物用臺(tái)式旋渦儀和超聲波浴器重新懸浮于900μl的PBS(pH7.0)中。將5mgGMBS交聯(lián)劑的100μlDMF溶液加入到該膠乳中并且在室溫下將該懸浮液攪拌(立式圓筒形混合儀)保溫45分鐘。然后離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液，將沉淀物重新懸浮于1ml的PBS(pH7.0)中并進(jìn)行聲處理。然后離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。然后將沉淀物用臺(tái)式旋渦儀和超聲波浴器重新懸浮于858μl的PBS(pH7.0)中。然后加入142μl的修飾的3299抗體(按照后文2.3.3節(jié)的敘述制備)且在室溫下將該膠乳攪拌(立式圓筒形混合儀)保溫1小時(shí)30分。然后離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液，將沉淀物重新懸浮于1ml的PBS(pH7.0)中并進(jìn)行聲處理。然后離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液并將沉淀物用臺(tái)式旋渦儀和超聲波浴器重新懸浮于325μl的PBS(pH7.0)中。然后加入(攪拌)175μl的DMF，接著加入500μl的脫保護(hù)的UV可裂解的二茂鐵分子的溶液(根據(jù)2.2.2.2節(jié)的敘述進(jìn)行UV可裂解的二茂鐵分子的脫保護(hù))。在聲處理后將該懸浮液室溫下攪拌(立式圓筒形混合儀)保溫過夜。然后離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液，加入1ml的含35％DMF的PBS溶液，重新懸浮(聲處理)沉淀物。在室溫下攪拌30分鐘以后，離心(15,500rpm，15℃)該懸浮液20分鐘。棄去上清液。該洗滌步驟再重復(fù)2次。然后，將沉淀物用臺(tái)式旋渦儀和超聲波浴器重新懸浮于含20％DMF的PBS溶液中。在室溫下攪拌30分鐘以后，離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液。該洗滌步驟再重復(fù)1次。然后，將沉淀物重新懸浮于1ml的PBS中，用聲波處理并且離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液。最終將沉淀物重新懸浮于1ml的PBS中，進(jìn)行聲處理并在4℃黑暗保存。2.3.2先偶聯(lián)UV可裂解的二茂鐵分子再偶聯(lián)3299抗體將1ml的氨基葡聚糖-膠乳懸浮液(根據(jù)2.2.1節(jié)制備)離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)。棄去上清液，將沉淀物用臺(tái)式旋渦儀和超聲波浴器重新懸浮于900μl的PBS(pH7.0)中。將5mg的GMBS交聯(lián)劑的100μlDMF溶液加入到該膠乳中并且在室溫下將該懸浮液攪拌(立式圓筒形混合儀)保溫45分鐘。然后離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液，將沉淀物重新懸浮于1ml的PBS(pH7.0)中并進(jìn)行聲處理。離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液，然后將沉淀物用臺(tái)式旋渦儀和超聲波浴器重新懸浮于325μl的PBS(pH7.0)中。然后加入(攪拌)175μl的DMF，之后加入500μl的脫保護(hù)的UV可裂解的二茂鐵連接體(基于9計(jì)為4.68*10-6摩爾)(UV可裂解的二茂鐵9的脫保護(hù)根據(jù)2.2.2.2節(jié)的敘述完成)的溶液。在聲處理后，將該膠乳在室溫下攪拌5分鐘。然后加入44μl的巰基-dPEG4-酸(3.54*10-2摩爾/l)溶液并在室溫下攪拌(翻轉(zhuǎn)混合儀(endovermixer))保溫該懸浮液過夜。然后離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液，加入1ml的含35％DMF的PBS溶液，將沉淀物用臺(tái)式旋渦儀和超聲波浴器重新懸浮。在室溫下攪拌30分鐘以后，離心(15,500rpm，15℃)該懸浮液20分鐘。棄去上清液。該洗滌步驟再重復(fù)2次。然后，將沉淀物重新懸浮于含20％DMF的PBS溶液中并進(jìn)行聲處理。在室溫下攪拌30分鐘以后，離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液。該洗滌步驟再重復(fù)1次。然后，將沉淀物重新懸浮于1ml的PBS中，聲波處理并且離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液，將沉淀物重新懸浮(聲處理)于500μl的MES(50mM，pH6.0)中。向該懸浮液中加入含5mgEDCI的150μlMES溶液和含2mgNHS的150μlMES溶液同時(shí)進(jìn)行攪拌。室溫下攪拌(立式圓筒形混合儀)5分鐘后，然后加入含2mg氨基葡聚糖的200μlMES溶液。該膠乳在室溫下攪拌保溫過夜。然后離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液，將沉淀物用臺(tái)式旋渦儀和超聲波浴器重新懸浮于1ml的MES中。離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液并且將沉淀物重新懸浮(聲處理)于900μl的PBS(pH7.0)中。然后，將含5mgGMBS的100μlDMF溶液加入到該懸浮液中，然后在室溫下攪拌45分鐘。然后離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液，將沉淀物用臺(tái)式旋渦儀和超聲波浴器重新懸浮于1ml的PBS(pH7.0)中。離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液，將沉淀物重新懸浮(聲波處理)于750μl的PBS(pH7.0)中。接著，將250μl的修飾的3299抗體(根據(jù)2.3.3節(jié)的敘述制備)加入到懸浮液中并且在室溫下攪拌(翻轉(zhuǎn)混合儀)保溫該膠乳過夜。然后離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液。棄去上清液，將沉淀物重新懸浮于1ml的PBS中并進(jìn)行聲處理。然后離心(15,500rpm，15℃，20分鐘)該懸浮液并棄去上清液。該洗滌步驟再重復(fù)2次。最后，將沉淀物重新懸浮(聲處理)于1ml的PBS中。2.3.33299抗體的制備把1ml的32994抗體(3.41mg/ml)上樣到一個(gè)用30mlPBS平衡的Nap10柱上。然后在柱子上加入1.5mlPBS并收集。蛋白質(zhì)濃度用UV分光光度計(jì)在280nm下測(cè)量向100μl的抗體溶液加入900μlPBS。該1∶10的稀釋液給出的吸光度是0.297→C＝0.297*10(稀釋度)/1.4＝2.12mg/ml。向1.4ml的3299溶液(2.97mg，1.98*10-8摩爾)中加入15μl的含8mg/ml的SAMSA的DMF溶液。在室溫下攪拌該混合物過夜。向400μl的3299/SAMSA溶液中加入35μl的EDTA(0.1M)和65μl的羥基胺.HCl(1M)。在室溫下攪拌該混合物10分鐘，然后將其上樣到15mlPBS平衡的Nap5柱子。然后將1ml的PBS加入到該柱子并收集。脫保護(hù)的抗體不能儲(chǔ)存，需要立即使用。2.4捕獲相2.4.1F108-PMPI的合成向溶于10ml無水苯中的F108(1.13g，7.80*10-5摩爾)溶液中加入PMPI(50mg，2.34*10-4摩爾)。在室溫下攪拌該溶液過夜。然后把該溶液倒入600ml的乙醚中同時(shí)攪拌。通過過濾收集沉淀并真空干燥。然后，將該固體溶解于8ml的無水苯中，并且用乙醚再沉淀2次。然后，將該產(chǎn)物在高真空下干燥并在4℃下氮?dú)庵斜４妗?.4.2將3468抗體偶聯(lián)到膠乳——理論上膠乳濃度為1％固體(3468抗體指一種抗-βhCG)。向100μl的基于聚苯乙烯的20μm顆粒(10％的固體)中加入900μl去離子水(膠乳濃度現(xiàn)在為1％固體)。然后，離心(13,500rpm，15℃)該懸浮液10分鐘。棄去上清液并且將沉淀物用臺(tái)式旋渦儀和超聲波浴器重新懸浮于1ml去離子水中。這個(gè)洗滌步驟再重復(fù)兩次。然后將沉淀物重新懸浮于500μl去離子水中。加入F108-PMPI(5mg于500μl去離子水中)并且在室溫下攪拌(立式圓筒形混合儀)該懸浮液45分鐘。然后，離心(13,500rpm，15℃，10分鐘)該懸浮液。棄去上清液并且將沉淀物重新懸浮于1ml的去離子水中。離心(13,500rpm，15℃，10分鐘)該懸浮液。棄去上清液并且將沉淀物重新懸浮于500μl的PBS(pH7.0)中。然后加入500μl的修飾的3468抗體(根據(jù)下文2.4.3節(jié)的敘述制備)并且將該膠乳在室溫下攪拌保溫過夜。然后，離心(13,500rpm，15℃，10分鐘)該懸浮液。棄去上清液，將沉淀物用臺(tái)式旋渦儀和超聲波浴器重新懸浮在1ml的PBS中。離心(13,500rpm，15℃，10分鐘)該懸浮液。棄去上清液。該洗滌步驟再重復(fù)2次。最后，將沉淀物重新懸浮于1ml的PBS中，4℃下保存。2.4.3制備修飾的3468抗體把1ml的3468抗體(2.1mg/ml)上樣到一個(gè)用30mlPBS(pH7.0)平衡的Nap10柱上。然后在柱子上加入1.5mlPBS(pH7.0)并收集。蛋白質(zhì)濃度用UV分光光度計(jì)在280nm下測(cè)量向100μl的抗體溶液中加入900μlPBS(pH7.0)。該1∶10的稀釋液給出的吸光度是0.221→C＝0.221*10(稀釋度)/1.4＝1.578mg/ml。向1.4ml的3468溶液(2.21mg，1.47*10-8摩爾)中加入12μl的含8mg/ml的SAMSA的DMF溶液?；旌衔镌谑覝叵聰嚢柽^夜。向900μl的3468/SAMSA溶液中加入35μl的EDTA(0.1M)和65μl的羥基胺.HCl(1M)。該混合物在室溫下攪拌10分鐘，然后上樣到30ml的PBS平衡的Nap10柱子上。然后，將1.5ml的PBS加入該柱子上并收集。脫保護(hù)的抗體不能儲(chǔ)存，需要立即使用。2.5光分解2.5.1溶液中的UV可裂解的二茂鐵分子的光分解向溶解于250μl甲醇的UV可裂解的二茂鐵9(0.7mg，1.09*10-6摩爾)溶液中加入250μl的PBS。將30μl的該溶液用B100A型UV以365nm波長和10”處8,900μW/cm2的強(qiáng)度下照射。該UV在距離溶液大約為15cm的位置施加。裂解后每兩分鐘進(jìn)行一次TLC。應(yīng)用的洗脫液乙酸乙酯/己烷(80/20)和DCM/MeOH/Et3N(85/10/5)。2.5.2UV可裂解的二茂鐵分子從膠乳顆粒上的光裂解用B100A型UV燈以365nm波長和10”處8,900μW/cm2的強(qiáng)度下對(duì)不同濃度的珠子進(jìn)行5分鐘的照射。該UV在距離溶液大約為15cm的位置施加。珠子濃度a)50μl的珠子(理論上0.3％的固體)+10μl的PBSb)25μl的珠子(理論上0.3％的固體)+25μl的PBSc)10μl的珠子(理論上0.3％的固體)+40μl的PBS循環(huán)伏安法在每個(gè)溶液的照射前和照射后通過將17μl的該溶液施加到絲網(wǎng)印刷電極(碳工作電極和對(duì)電極以及銀/氯化銀參比電極)上實(shí)施。2.6第3.3節(jié)的方法把17μL用UV可裂解的二茂鐵化合物敏化的400nm(％固體物)TRL顆粒加到絲網(wǎng)印刷電極上(碳工作電極和對(duì)電極以及銀/氯化銀參比電極)。溶液覆蓋工作電極、對(duì)電極和參比電極。一旦將上述溶液施加到電極上就開始計(jì)時(shí)電流法測(cè)量并在大約50秒鐘后開啟UV光源(綠色LED，360nm波長)。LED的輸入電壓是20mV且該LED正好位于電極的上方。這個(gè)方法在幾種不同濃度的400nm的珠子上重復(fù)，所用的濃度為每ml6.8E+09、2.74E+09、1.37E+09、6.85E+08、3.43E+08、1.71E+08、8.56E+07、4.28E+07個(gè)。一個(gè)UV可裂解的二茂鐵分子的標(biāo)定曲線通過對(duì)已知濃度的UV可裂解的二茂鐵化合物(預(yù)先合成的)實(shí)施與上述相同的測(cè)量獲得。這里使用的濃度是100、50、25、12.5、6.25和3.125μM。計(jì)時(shí)電流法測(cè)量參數(shù)如下。第一條件電位(firstconditioningpotential)＝0V平衡時(shí)間＝4秒間隔時(shí)間＝1秒電位階躍數(shù)＝10.42V電位300秒持續(xù)時(shí)間2.7第3.4節(jié)的方法一個(gè)薄層室/毛細(xì)管填充裝置以如下方式構(gòu)建。將雙面膠帶(編號(hào)7840，adhesiveresearch)置于絲網(wǎng)印刷電極(碳工作電極和對(duì)電極以及銀/氯化銀參比電極)上，在這之上放上一個(gè)玻璃條狀蓋形成一個(gè)90μm毛細(xì)縫隙。將6μL的樣品溶液(400nm珠子，PBS)施加到該毛細(xì)填充裝置上并進(jìn)行計(jì)時(shí)電流法測(cè)量(與實(shí)驗(yàn)1的步驟相同)。變化LED的輸入電壓(22和38mV)。2.8第3.8節(jié)的方法將50μL(％固體)的3468(抗hCG)/UV可裂解的二茂鐵分子敏化的400nm珠子與50μLhCG標(biāo)準(zhǔn)品(0或400mIU)和75μL(％固體)的用3299(抗hCG)抗體敏化的20μm珠子混合30分鐘(用平板振蕩器攪拌)。以下面的方式構(gòu)建一個(gè)包含免疫過濾器3(IMF3)裝置的微流體裝置。將雙面膠帶(編號(hào)7840，adhesiveresearch)置于IMF3裝置的過濾區(qū)域和毛細(xì)通道的上面和周圍。將絲網(wǎng)印刷電極(聚酯基質(zhì)、碳工作電極、參比電極和對(duì)電極)放置于膠帶上形成微流體裝置。將20μL的保溫的樣品溶液施用到該微流體裝置上并通過一個(gè)凝膠吸收皿(gelblotsink)抽吸流過裝置，該凝膠吸收皿施用在實(shí)際的免疫過濾器的末端。然后將10μL的PBS洗液抽過該裝置并且最后加入2.5μL的“再懸浮”PBS。進(jìn)行計(jì)時(shí)電流法測(cè)量，電化學(xué)條件如前面所述。LED輸入電壓是22mV。權(quán)利要求1.一種測(cè)定流體樣品中分析物存在或含量的方法，其包含(a)將一種流體樣品與一種包含多個(gè)可裂解物質(zhì)分子的結(jié)合試劑接觸并且其中所述物質(zhì)當(dāng)被裂解的時(shí)候能夠用電化學(xué)的方法測(cè)出；(b)將形成的所有的結(jié)合試劑-分析物復(fù)合體與未結(jié)合的結(jié)合試劑分離；(c)從固定化的結(jié)合試劑-分析物復(fù)合體上裂解該可裂解物質(zhì)；和(d)用電化學(xué)的方法檢測(cè)該裂解的物質(zhì)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述結(jié)合試劑-分析物復(fù)合體通過把結(jié)合試劑-分析物復(fù)合體固定在捕獲相中與未結(jié)合的結(jié)合試劑分離。3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述結(jié)合試劑包含至少106個(gè)可裂解物質(zhì)分子。4.根據(jù)上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中所述可裂解物質(zhì)是可光裂解的或者是可酸裂解的。5.根據(jù)上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中所述可裂解物質(zhì)當(dāng)從結(jié)合試劑上裂解下來的時(shí)候顯示電化學(xué)的活性。6.根據(jù)權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的方法，其中所述可裂解物質(zhì)在從結(jié)合試劑上裂解下來后可以變成電化學(xué)活性的物質(zhì)。7.根據(jù)權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的方法，其中所述可裂解物質(zhì)在從結(jié)合試劑上裂解下來后產(chǎn)生變得有電化學(xué)活性的其它物質(zhì)。8.根據(jù)上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中所述可裂解物質(zhì)當(dāng)連接于結(jié)合試劑的時(shí)候沒有電化學(xué)活性。9.根據(jù)上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法試劑，其中所述可裂解物質(zhì)包括由二茂鐵、硝基苯酚、氨基苯酚、氫醌、水楊酸或磺基水楊酸衍生的部分。10.根據(jù)上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中所述可裂解物質(zhì)包括由二茂鐵乙醛衍生的部分。11.根據(jù)上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中所述可裂解物質(zhì)包括由乙二醇衍生的一個(gè)或多個(gè)部分。12.根據(jù)上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)合試劑包含一個(gè)中央核心。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述中央核心是一個(gè)聚合物球。14.根據(jù)上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)合試劑包含至少一個(gè)樹枝狀部分或聚合物部分。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述可裂解物質(zhì)連接于樹枝狀部分或聚合物部分。16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述樹枝狀部分或聚合物部分連接于中央核心上。17.根據(jù)權(quán)利要求14至16的任一項(xiàng)的方法，其中所述樹枝狀部分或聚合物部分在可裂解物質(zhì)的外表面上。18.根據(jù)權(quán)利要求14至17的任一項(xiàng)的方法，其中所述聚合物部分由葡聚糖衍生而來。19.根據(jù)上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中所述電化學(xué)方法包含一個(gè)電極。20.一種適用于免疫分析的結(jié)合試劑，所述結(jié)合試劑如權(quán)利要求1至18的任何一項(xiàng)所限定。21.一種結(jié)合試劑在免疫分析中的用途，所述結(jié)合試劑如權(quán)利要求1至18的任何一項(xiàng)所限定。22.一種用于測(cè)量樣品中分析物的含量或存在的檢測(cè)試劑盒，包含(a)一種如權(quán)利要求1至18的任何一項(xiàng)中所限定的結(jié)合試劑；(b)一個(gè)捕獲相，其包含一個(gè)含有一種試劑的載體，所述試劑能夠結(jié)合或連接結(jié)合試劑-分析物復(fù)合體；和(c)一個(gè)能夠在可裂解物質(zhì)被裂解時(shí)檢測(cè)該可裂解物質(zhì)的電極，以提供待測(cè)分析物存在或含量的指示。全文摘要一種測(cè)定流體樣品中分析物存在或含量的方法，其包含(a)將一種流體樣品與一種包含多個(gè)可裂解物質(zhì)分子的結(jié)合試劑接觸并且其中所述可裂解物質(zhì)裂解時(shí)能夠用電化學(xué)的方法測(cè)出；(b)把形成的所有的結(jié)合試劑-分析物復(fù)合體與未結(jié)合的結(jié)合試劑分離；(c)由固定化的結(jié)合試劑-分析物復(fù)合體中裂解出可裂解物質(zhì)；和(d)用電化學(xué)的方法檢測(cè)裂解的片斷。文檔編號(hào)G01N33/543GK101184996SQ200680019004公開日2008年5月21日申請(qǐng)日期2006年3月31日優(yōu)先權(quán)日2005年3月31日發(fā)明者D·E·威廉斯,P·洛,C·J·斯萊文,A-C·郝維,S·J·卡萊爾,A·湯姆森申請(qǐng)人:因韋爾尼斯醫(yī)藥瑞士股份有限公司