專利名稱：：基于金屬螯合脂質(zhì)的促凝血?jiǎng)┑闹谱鞣椒獎(jiǎng)?duì)相關(guān)申請(qǐng)的引用本申請(qǐng)要求2005年2月16日提交的名稱為"通用的促凝血?jiǎng)?，，的美?guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/653,695的權(quán)益，通過引用將其全部?jī)?nèi)容合并在此，除了與本申請(qǐng)不一致之處。聯(lián)邦政府贊助的研究或開發(fā)本申請(qǐng)得到以下研究撥款和合同的部分資助國(guó)家衛(wèi)生研究院(NHLBI)撥款No.ROlHL47104。美國(guó)政府在這項(xiàng)發(fā)明中可以享有某些權(quán)利。背景僅僅列出凝結(jié)因子和Ca^的凝結(jié)級(jí)聯(lián)的示意圖在圖15中示出。在該圖中，各種凝結(jié)因子通過它們的羅馬數(shù)字來指明(即，因子vn通過vn來指明)。當(dāng)血液和某些人工表面之間發(fā)生接觸時(shí)，血液凝固的內(nèi)在途徑(也稱為接觸途徑)被啟動(dòng)。在發(fā)生引起組織因子(也鑒定為因子III)暴露的血管損傷時(shí)，血液凝固的外在途徑(也稱為組織因子途徑)被啟動(dòng)。點(diǎn)線箭頭代表在外在和內(nèi)在途徑之間的交叉點(diǎn)。這兩個(gè)途徑在因子X向Xa的活化之處匯合。因子Xa在因子VII到Vila的進(jìn)一步活化中起到作用?；钚缘囊蜃覺a水解并活化凝血酶原成為凝血酶。然后凝血酶活化因子XI、VIII和V,促進(jìn)級(jí)聯(lián)。最終，凝血酶的作用是將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為血纖蛋白，其形成凝塊。組織因子是一種細(xì)胞表面蛋白，其在正常的止血和各種血栓性的疾病中是觸發(fā)血液凝固系統(tǒng)的原因[1，2]。組織因子通過緊密地結(jié)合以及變構(gòu)地活化凝結(jié)因子VIIa(VIIa)來實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，所述凝結(jié)因子VIIa(VIIa)是一種血漿絲氨酸蛋白酶。組織因子和VIIa的1:1復(fù)合物(TF:VIIa)是血液凝固的組織因子途徑中的第一個(gè)酶，Vila作為催化亞單位起作用、組織因子作為調(diào)節(jié)亞單位起作用。當(dāng)TF:VIIa經(jīng)由有限的蛋白水解作用活化兩種血漿絲氨酸蛋白酶酶原(凝血因子IX和X)時(shí)，凝結(jié)級(jí)聯(lián)由此被觸發(fā)，最終引起由血纖蛋白凝塊和活化的血小板組成的止血栓塞的形成。野生型人類組織因子(TF)是261或263個(gè)氨基酸的單多肽鏈，含有四個(gè)半胱氨酸殘基，其形成兩個(gè)二硫鍵。它是一種I型整合膜蛋白，是指它的N-末端位于細(xì)胞外側(cè)，它的C-末端在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。TF具有單個(gè)3爭(zhēng)膜結(jié)構(gòu)域，其將蛋白質(zhì)錨定在質(zhì)膜中。TF的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域是結(jié)合于并且變構(gòu)地活化Vila的部分。TF的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?qū)τ赥F促凝血活性是可有可無的，但是TF的膜錨定對(duì)于完整的TF活性是必需的[3]。已經(jīng)通過重組手段產(chǎn)生了既不具有跨膜結(jié)構(gòu)域也不具有細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的截短的、可溶形式的組織因子(sTF)[3-7]。不同于膜錨定TF，sTF是高度水溶性的[5，8]。雖然sTF保持了結(jié)合Vila并且變構(gòu)地活化它的能力(通過小的、肽基-酰胺底物的水解來測(cè)量的)，sTF具有大大地降低的促凝血活性[4，5，9,10]。已經(jīng)顯示了，sTF在支持酶原因子VII向活性酶形式Vila轉(zhuǎn)化方面是選4奪性缺陷的[9,11]。(促進(jìn)因子VII向VIIa轉(zhuǎn)變的能力是TF的重要功能之一[12]。這種功能的喪失解釋了sTF對(duì)正常人類血漿的低促凝血活性[9])。sTF的獨(dú)特的缺陷已經(jīng)被利用來創(chuàng)建凝結(jié)分析，所述分析定量血漿Vila水平而不受酶原因子VII的干擾[13]。另一方面，sTF促凝血活性中的這種缺陷意味著在標(biāo)準(zhǔn)的凝結(jié)分析如凝血酶原時(shí)間(PT)分析中它不能替代膜錨定的TF。由于sTF的溶解性質(zhì)，相比膜錨定的TF,sTF顯著地更容易表達(dá)、純化和處理。在用于產(chǎn)生sTF的某些表達(dá)系統(tǒng)中，sTF的分泌被靶向Eco//的周質(zhì)間隙，一種容許形成二硫鍵的氧化環(huán)境[6]。通過滲透休克容易地從Eco/Z的周質(zhì)間隙釋放sTF，此外，sTF不需要任何特殊條件來維持水溶性。利用工程化到sTF的N-末端上的肽表位(HPC4表位)，sTF可以通過免疫親和層析從五.co"釋放物中純化[6]。在存在鈣離子的情況下，sTF-HPC4融合蛋白以高親和性與固定的HPC4抗體結(jié)合。在洗滌免疫親和珠子之后，使用EDTA洗脫純化的sTF。表達(dá)產(chǎn)量是每升Eco//培養(yǎng)物大約20mgsTF。與sTF相比，重組的、膜錨定的組織因子(rTF)在Eco//細(xì)胞中以低得多的水平表達(dá)，在純化過程的所有階段，rTF更難以處理。用于sTF的相同的目標(biāo)載體被用于rTF的Eco//表達(dá)。(它將rTF的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域靶向周質(zhì)間隙，而膜錨定物保持嵌入在Eco"的內(nèi)膜中。)從Eco"提取rTF需要細(xì)菌的完全溶解。還需要使用洗滌劑，用于從所述膜提取rTF，以及保持rTF溶解。rTF的純化使用與純化sTF相同的免疫親和層析方法來實(shí)現(xiàn)，不同之處是洗滌劑(一般地，0.1%TritonX-100)被加入到rTF所暴露的所有溶液中。在五.co〃表達(dá)系統(tǒng)中rTF的表達(dá)產(chǎn)量是每升Eco/!'培養(yǎng)物大約1mg,其比sTF的產(chǎn)量至少低20倍。凝血酶原時(shí)間(PT)測(cè)試;陂廣泛用于監(jiān)視通過香豆素的口腔抗凝治療，作為血液凝固系統(tǒng)的一般性篩選測(cè)試，并作為特定因子分析的基礎(chǔ)。PT測(cè)原)、VII和X的血漿水平，并取決于兩種非維生素K依賴性蛋白質(zhì)一一因子V和纖維蛋白原一一的水平。香豆素治療對(duì)抗維生素K羧化酶/還原酶循環(huán)，因而抑制谷氨酸殘基向Y-羧基谷氨酸的翻譯后轉(zhuǎn)變。維生素K依賴性凝結(jié)因子在它們的Gla結(jié)構(gòu)域中含有必需的Y-羧基谷氨酸殘基。接受香豆素治療的患者將因而產(chǎn)生具有降低的促凝血活性的低度羧基化的維生素K依賴性凝結(jié)因子。這延長(zhǎng)了PT時(shí)間，主要由于因子II、VII和X的水平的降低。使用香豆素的成功的口腔抗凝治療需要小心監(jiān)視患者的PT時(shí)間，以實(shí)現(xiàn)有效水平的抗凝作用同時(shí)最小化出血并發(fā)癥(由Hirsh等人綜述[14])。PT測(cè)試是通過將檸檬酸化的血漿樣品與凝血活酶試劑混合以及測(cè)量形成凝塊的時(shí)間而進(jìn)行的。凝血活酶試劑中的活性成分是組織因子。在1990年純化的TF變?yōu)榭色@得之前，凝血活酶試劑由人類或動(dòng)物來源的相對(duì)粗的組織提取液制成。近年來，已經(jīng)使用高度純化的rTF來制備凝血活酶試劑，其完全由限定的成分組成[15，16]。重組凝血活酶試劑潛在地優(yōu)于組織衍生的試劑，因?yàn)樗鼈兊慕M成以及由此的它們的性質(zhì)更容易由生產(chǎn)廠家來控制。為了制備重組的凝血活酶試劑，將rTF重構(gòu)到由合適的磷脂混合物組成的單層磷脂泡嚢內(nèi)。(TF重構(gòu)到磷脂泡嚢中有時(shí)稱為"重脂質(zhì)化(relipidation)"。)為了在血液凝結(jié)中有效地起作用，所述泡嚢必須含有具有凈負(fù)電荷的一些磷脂，絲氨酸磷脂是最有效的帶負(fù)電磷脂。各種方法可以用于將rTF摻入到磷脂泡嚢中(由Smith和Morrissey討論[17])。觸發(fā)血液凝固的第二種途徑是內(nèi)在的或接觸途徑。當(dāng)血漿接觸某些人工的表面，例如玻璃、硅土或高嶺土?xí)r，這種非組織因子依賴性途徑被活化。當(dāng)激肽釋放酶原、高分子量激肽原和因子XII暴露于帶負(fù)電的表面時(shí)，這種接觸途徑被啟動(dòng)。這引起起始復(fù)合物的形成，所述起始復(fù)合物致使因子XII經(jīng)由有限的蛋白水解作用轉(zhuǎn)變成它的活性酶形式，因子XIIa。然后因子Xlla在4丐依賴性反應(yīng)中將因子XI轉(zhuǎn)化成XIa，其隨后增殖凝結(jié)級(jí)聯(lián)，最終引起凝血酶的產(chǎn)生和血纖蛋白的聚合來產(chǎn)生凝塊。為了測(cè)量患者中所有止血相關(guān)的凝結(jié)因子的水平，必須進(jìn)行兩種凝結(jié)測(cè)試。一種是早先提及的PT測(cè)試，另一種是活化部分凝血活酶時(shí)間(aPTT)測(cè)試。由于PT測(cè)試使用了組織因子來活化凝結(jié)級(jí)聯(lián)，它對(duì)于外在途徑中的凝結(jié)因子是敏感的。aPTT測(cè)試使用人工的凝結(jié)活化劑(例如高嶺土或硅土)，因而對(duì)于內(nèi)在途徑中的改變是敏感的。沒有一種測(cè)試對(duì)于所有止血相關(guān)的凝結(jié)因子是敏感的，因而為了確定患者不具有出血體質(zhì)(例如，在手術(shù)之前)，必須使用兩種測(cè)試來評(píng)估患者血漿的凝結(jié)能力。此外，aPTT測(cè)試;故廣泛地用于監(jiān)視肝素治療，并且也是其他臨床的凝結(jié)分析的基礎(chǔ)，例如對(duì)于抗磷脂抗體綜合癥和狼瘠抗凝劑的分析。商業(yè)性aPTT試劑的性質(zhì)因生產(chǎn)廠家的不同而不同，特別是關(guān)于使用了哪種人工的凝結(jié)活化劑。aPTT分析也被證明難以標(biāo)準(zhǔn)化。寡聚組氨酸標(biāo)簽，一般由摻入到重組蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端的幾個(gè)連續(xù)的組氨酸殘基組成，被廣泛地用來便于這種蛋白質(zhì)的純化[19]。含有這樣的寡聚組氨酸標(biāo)簽的重組融合蛋白將以合理地高的親和性結(jié)合過渡金屬離子，例如Ni+2。這種性質(zhì)可以被采用，用于使用金屬螯合基團(tuán)的衍生物例如附著于固相支持物的氮基三乙酸(NTA)的親和純化。NTA將螯合鎳離子，以一定方式呈現(xiàn)它們，使得結(jié)合的Ni"仍然可以與重組蛋白質(zhì)的寡聚組氨酸標(biāo)簽緊密地相互作用。然后可以使用咪唑特異性地洗脫結(jié)合到固定的NTA-Ni"復(fù)合物上的重組融合蛋白。鎳螯合脂質(zhì)DOGS-NTA-Ni(l,2-二油?；?sn-甘油基-3-[(N(5-氨基-l-羧基戊基)亞氨基二乙酸)琥珀酰]鎳鹽)是商業(yè)上可獲得的。DOGS-NTA-Ni含有附著于二油?；?甘油酯的結(jié)合鎳的NTA部分。DOGS-NTA-Ni主要被結(jié)構(gòu)生物學(xué)家使用來在人工的膜表面上產(chǎn)生寡聚組氨酸標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)的二維晶體，以通過電子晶體成像來獲得結(jié)構(gòu)信息[20]。概述在第一個(gè)方面，本發(fā)明是一種凝血活酶試劑，包含(i)活化的sTF，(ii)金屬螯合脂質(zhì)，(iii)選自N產(chǎn)、Cu2+、Co"和其混合物的金屬離子，以及(iv)磷脂。在第二個(gè)方面，本發(fā)明是一種aPTT試劑，包含(i)金屬螯合劑，(ii)選自N產(chǎn)、Cu"和其混合物的金屬離子，以及(iii)磷脂。在第三個(gè)方面，本發(fā)明是一種活化的sTF。在第四個(gè)方面，本發(fā)明是組合PT和aPTT測(cè)試試劑盒，包含(l)活化的sTF，(ii)金屬螯合脂質(zhì)，(iii)選自N產(chǎn)、Cu"和其混合物的金屬離子，以及(iv)磷脂。在第五個(gè)方面，本發(fā)明是一種用于促進(jìn)凝結(jié)的組合物，包括(i)金屬螯合劑，(ii)選自Ni2+、Cu2+、Co2+、Zn2+和其混合物的金屬離子，以及(iii)任選地，包含TF的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和具有至少2個(gè)組氨酸殘基的寡聚組氨酸部分的活化的sTF。定義Ni-NTA-DOGS或DOGS-NTA陽Ni是指1,2-二油?；玸n-甘油基-3-[(N(5墨氨基-l-羧基戊基)亞氨基二乙酸)琥珀酰](鎳鹽)。NTA-DOGS或DOGS-NTA是指1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-[(N(5-氨基-1-羧基戊基)亞氨基二乙酸)琥珀酰]。VII或因子VII是指凝結(jié)因子VII(酶原)。Vila或因子Vila是指凝結(jié)因子VIIa(活性酶)。X或因子X是指凝結(jié)因子X(酶原)。Xa或因子Xa是指凝結(jié)因子Xa(活性酶)。vm或因子vni是指凝結(jié)因子vm(酶原)。IX或因子IX是指凝結(jié)因子IX(酶原)。XI或因子XI是指凝結(jié)因子XI(酶原)。XIa或因子XIa是指凝結(jié)因子XIa(活性酶)。XII或因子XII是指凝結(jié)因子XII(酶原)。XIIa或因子XIIa是指凝結(jié)因子XIIa(活性酶)。PK是指激肽釋放酶原。HK是指高分子量激肽原。PNP是指混合的正常血漿。NTA是指氮基三乙酸或氮基三乙酸部分。rTF是指重組的、膜錨定的組織因子。sTF是指可溶的組織因子，一種既不具有跨膜結(jié)構(gòu)域也不具有細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的截短的、可溶形式的組織因子[3-7]。TF:VIIa是指組織因子和因子Vila的復(fù)合物。aPTT是一種含有血液凝固的接觸途徑的活化劑、用于aPTT測(cè)試的試劑。金屬螯合脂質(zhì)是一種與金屬螯合部分共價(jià)結(jié)合的脂質(zhì)部分，例如NTA-脂質(zhì)(例如，NTA-DOGS)。金屬螯合劑含有共價(jià)結(jié)合的金屬螯合部分，例如金屬螯合脂質(zhì)(例如，NTA-DOGS)和NTA珠子。His是指組氨酸部分或殘基。寡聚組氨酸是含至少兩個(gè)組氨酸殘基的部分。優(yōu)選的，所述組氨酸殘基是連續(xù)的，在這種情況下，寡聚組氨酸也可以表示為(His)n，其中n優(yōu)選至少是2，更優(yōu)選是2-10。FVII是指展現(xiàn)了人類因子VII的因子VII凝結(jié)活性的任何蛋白質(zhì)。通過在以下的分析中比較得出與人類因子VII相同的凝結(jié)時(shí)間所需的蛋白質(zhì)的數(shù)量，來確定蛋白質(zhì)的因子VII凝結(jié)活性50pl檸檬酸化的缺乏因子VII的血漿，與人類因子VII或所述蛋白質(zhì)一同，在37。C在比色杯中孵育2分鐘，此后通過添加100pl預(yù)暖的凝血活酶試劑來啟動(dòng)凝結(jié)，使用血凝度計(jì)，例如ST4血凝度計(jì)(DiagnosticaStago,Parsippany，NJ)來測(cè)量凝塊形成的時(shí)間。優(yōu)選地選擇人類因子VII的數(shù)量和凝血活酶試劑的種類來得到10-15秒的凝結(jié)時(shí)間。實(shí)現(xiàn)給定凝結(jié)時(shí)間的人類因子VII的摩爾數(shù)量除以得到相同凝結(jié)時(shí)間的蛋白質(zhì)的摩爾數(shù)量，這得出了所述蛋白質(zhì)的相對(duì)因子VII凝結(jié)活性。優(yōu)選地，F(xiàn)VII具有人類因子VII的至少1%的凝結(jié)活性。FVII包括，例如，天然的人類因子VII、天然的人類因子VIIa、重組的人類因子VII[33]和Vila,和其他哺乳動(dòng)物因子VII和VIIa(例如天然的兔因子VII和天然的兔因子VIIa)。"因子Vila等價(jià)量"是指與特定數(shù)量的天然人類因子Vila具有相同凝結(jié)活性的存在的FVII的數(shù)量。例如，"FVII的lOng因子VIIa等價(jià)量"是指與10ng天然人類因子Vila具有相同凝結(jié)活性的存在的FVII的數(shù)量?；罨膕TF是指任何肽、蛋白質(zhì)或多肽，其在C-末端包括金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，(His)n，其中n是2-10)，在含有pH7.4的50mMTris-HCl緩沖液的100mMNaCl溶液中具有的溶解度是sTF的溶解度的至少10%,以及一種試劑，其含有活化的sTF(l嗎/ml)、金屬(IO^M)和15%螯合所述金屬的金屬螯合脂質(zhì)、5%PS、40%PE和40%PC(到總脂質(zhì)濃度100pM),用作凝血活酶試劑(預(yù)熱到37。C的100iil試劑與混合自正常個(gè)體的50nl血漿混合)在1分鐘內(nèi)引起凝結(jié)。實(shí)例包括sTF(His)6、sTF-5AA-(His)6和sTF-2(His)5。金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域是以下部分，其在含有pH7.4的50mMTris-HCl緩沖液的100mMNaCl溶液中以至少(His)2的親和性結(jié)合金屬。實(shí)例包括(His)n,其中n是2-10。TF是指任何組織因子蛋白，例如rTF和天然的哺乳動(dòng)物組織因子。凝血活酶試劑是指任何試劑，其含有TF并且當(dāng)預(yù)熱到37。C的100pl所述試劑與混合自正常個(gè)體的50|11血漿混合時(shí)將在1分鐘內(nèi)引起凝結(jié)；當(dāng)純凈并且加熱到37。C時(shí)在2分鐘內(nèi)不凝結(jié)。附圖的簡(jiǎn)要說明圖1是sTF的C-末端以及寡聚組氨酸標(biāo)記的三種變體的氨基酸序列，和編碼這些氨基酸序列的核普酸序列。不同于sTF的序列以下劃線表示，組氨酸殘基以斜體表示。圖2A、2B和2C是顯示在使用0.3pg/mlsTF(His)6和100SUV的PT分析中脂質(zhì)組合物對(duì)凝結(jié)時(shí)間的影響的圖表。A:含有5%PS、15%DOGS-NTA-Ni以及變化數(shù)量的PE的泡嚢；B:含有15%DOGS-NTA-Ni、40%PE以及變化數(shù)量的PS的泡嚢；C:含有5%PS、30%PE以及變化數(shù)量的DOGS-NTA-Ni的泡嚢。圖3是在采用0.3嗎/mlsTF(His)6和變化濃度的12.5。/。Ni-脂質(zhì)的PT分析中凝結(jié)時(shí)間對(duì)總脂質(zhì)濃度的依賴性的圖表。圖(三角形)的PT分析中TF活性的圖表。x-軸上標(biāo)出的TF濃度是在稀釋的試劑中的濃度。圖5是在存在15。/。Ni-脂質(zhì)的情況下VIIa與sTF(His)6相互作用的結(jié)合等溫線的圖表。圖6是sTF(His)6/15%Ni-脂質(zhì)PT試劑與商業(yè)上可獲得的PT試劑的比較結(jié)果的柱形圖。使用混合的正常血漿(PNP)或各種缺乏因子的血漿測(cè)量凝結(jié)時(shí)間。圖7A、7B和7C是顯示在使用100SUV的aPTT分析中脂質(zhì)組合物對(duì)凝結(jié)時(shí)間的影響的圖表。A:含有5。/。PS、15%DOGS-NTA-Ni以及變化數(shù)量的PE的泡嚢；B:含有15%DOGS-NTA-Ni、40。/。PE以及變化數(shù)量的PS的泡嚢；C:含有5%PS、40%PE以及變化數(shù)量的DOGS-NTA-Ni的泡嚢。圖8是在aPTT分析中凝結(jié)時(shí)間對(duì)總磷脂濃度(15%Ni-脂質(zhì))的依賴性的圖表。圖9是在使用15。/。Ni-脂質(zhì)與混合的正常血漿的aPTT分析中變化的預(yù)孵育時(shí)間(在添加鈣離子之前)對(duì)凝結(jié)時(shí)間的影響的圖表。圖10是在aPTT分析中對(duì)于正常的混合血漿(圓圈)對(duì)比缺乏VIII的血漿(三角形)的15%Ni-脂質(zhì)的凝結(jié)活性的圖表。圖11是15%Ni-脂質(zhì)aPTT試劑與商業(yè)上可獲得的aPTT試劑的比較結(jié)果的柱形圖。使用混合的正常血漿(PNP)或各種缺乏因子的血漿在aPTT分析中測(cè)量凝結(jié)時(shí)間。圖12A和12B是使用含有變化濃度的NiS04(圓圈)、CuS04(菱形)、CoCl2(三角形)或ZnCl2(空心倒三角形)的改變的凝血活酶試劑進(jìn)行的PT分析的凝結(jié)時(shí)間的圖表。在x-軸上標(biāo)出的金屬離子濃度是在改變的試劑中采用的濃度。A和B是相同數(shù)據(jù)、在不同的金屬離子濃度范圍上的曲線。圖12C是使用含有變化濃度的NiS04(圓圈)、CuS04(菱形)、CoCl2(三角形)或ZnCb(空心倒三角形)的改變的試劑進(jìn)行的aPTT分析的凝結(jié)時(shí)間的圖表。在x-軸上顯示的金屬離子濃度是在改變的試劑中采用的濃度。圖13是在PT分析中sTF(His)6(正方形)、sTF-2(His)5(菱形)和sTF-5AA-(His)6(倒三角形)的凝結(jié)時(shí)間的圖表。每種類型的TF與含有提高比例的DOGS-NTA-Ni的SUV孵育。圖14是在存在15%Ni-脂質(zhì)的情況下VIIa與不同類型的TF的相互作用的結(jié)合等溫線的圖表，其中所述TF的類型如下sTF(His)6(正方形)、sTF-2(His)5(菱形)和sTF-5AA-(His)6(倒三角形)。圖15是凝結(jié)級(jí)聯(lián)的示意圖。圖16(a)和16(b)是顯示關(guān)于sTF-5AA-(His)6提高Vila活化X的速率的能力的ECso的圖表。變化濃度的純化sTF或sTF-5AA-(His)6在96孔平板中孵育，所述平板預(yù)先用10%DOGS-NTA-Ni、20%PS、70。/。PC的混合物(實(shí)心符號(hào))或20%PS、80%PC的混合物(空心符號(hào))包被；使用40nMX測(cè)量Xa產(chǎn)生的初始速率，表示為用1nMsTF-5AA-(His)6在包被含有DOGS-NTA-Ni的脂質(zhì)混合物的孑L中觀察到的活性的百分比。(a)sTF-5AA-(His)6(圓圈)或sTF(正方形)提高Vila活化X的速率的能力的濃度依賴性。(b)畫面(a)的sTF-5AA-(His)6數(shù)據(jù)是用從0延伸到50nM的x-軸標(biāo)繪的。圖17是在聚苯乙烯血凝度計(jì)比色杯的孔中干燥的sTF-5AA-(His)6連同脂質(zhì)混合物的凝結(jié)活性的圖表。每個(gè)孔的干燥的脂質(zhì)數(shù)量在x-軸上給出。每個(gè)孔還容納50^等分量的20nMsTF-5AA-(His)6。使用混合的正常人血漿測(cè)定凝結(jié)時(shí)間。脂質(zhì)混合物是NiPCPSPE(實(shí)心圓圏)；PCPS(空心倒三角形)；PCPSPE(空心正方形)和MPCPS^空心菱形)。圖18是在每個(gè)孔包被有200nmolNiPCPSPE的血凝度計(jì)比色杯中sTF-5AA-(His)6的凝結(jié)活性的圖表。在添加血漿和鈣離子來啟動(dòng)凝結(jié)之前，用反應(yīng)孔孵育濃度增加的sTF-5AA-(His)6(實(shí)心圓圈)或單一濃度的sTF(4800nM;空心倒三角形)。在x-軸上標(biāo)出的濃度是指添加到每個(gè)孔中的50(il等分量中sTF或sTF-5AA-(His)6的濃度。詳細(xì)說明一般地，重組TF必須含有跨膜結(jié)構(gòu)域或等效的膜錨定結(jié)構(gòu)域以表達(dá)完全的促凝血活性并因而適合于在重組凝血活酶試劑中使用。然而，與sTF相比，rTF以低得多的水平表達(dá)，更加難以純化并且更難以處理rTF。此外，rTF重構(gòu)到磷脂泡嚢中是費(fèi)勞力的。因此我們?cè)O(shè)法開發(fā)一種重組TF形式，其具有STF的所有期望的表達(dá)、處理和溶解度特征，但是其將在血漿凝結(jié)測(cè)試中展現(xiàn)與重新脂質(zhì)化的rTF可比較的促凝血活性。將金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如寡聚組氨酸標(biāo)簽連接到sTF的C-末端容許蛋白質(zhì)結(jié)合含有金屬螯合脂質(zhì)的磷脂泡囊。由于野生型TF的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的C-末端部分經(jīng)由短肽序列連接到跨膜結(jié)構(gòu)域[18]，因此將寡聚組氨酸標(biāo)簽連接到sTF的C-末端(任選地，具有間隔基，例如其他氨基酸殘基)容許當(dāng)經(jīng)由與金屬螯合脂質(zhì)螯合的金屬結(jié)合到磷脂表面時(shí)被適當(dāng)?shù)囟ㄏ?。與金屬螯合脂質(zhì)例如DOGS-NTA-Ni螯合的金屬可以容易地?fù)饺氲搅字p分子層中，容許金屬結(jié)合重組蛋白質(zhì)例如活化的sTF的金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此外，還發(fā)現(xiàn)的是按這種方式與泡嚢結(jié)合的活化的sTF基本上表現(xiàn)出類似膜錨定的rTF的性質(zhì)，并且具有與rTF可比較的促凝血活性。還發(fā)現(xiàn)的是已經(jīng)固定在固相支持物上的含有鎳螯合脂質(zhì)的膜雙分子層可以有效地從粗混合物捕獲活化的sTF,在一個(gè)筒單的步驟中同時(shí)純化蛋白質(zhì)并將它錨定在膜上。此外，將活化的sTF的高度活性制備物結(jié)合到含有金屬螯合脂質(zhì)的固定的磷脂雙分子層上的能力可以用于制備護(hù)理時(shí)的臨床凝結(jié)分析，其中凝結(jié)的活化劑附著于芯片表面。高活性的PT試劑(凝血活酶試劑)可以在存在磷脂泡嚢(例如，含有10%DOGS-NTA-Ni、5%PS、30%PE和55%PC)的情況下使用活化的sTF例如sTF(His)6或sTF-5AA-(His)6制備。除了產(chǎn)生有效的凝血活酶試劑之外，還發(fā)現(xiàn)的是即使在不存在任何組織因子的情況下，在磷脂泡嚢中具有N產(chǎn)或Cu"的金屬螯合脂質(zhì)例如DOGS-NTA-Ni也是血液凝固的接觸途徑的非常強(qiáng)的活化劑。這些磷脂泡嚢可以用作診斷和治療試劑。它們可以充當(dāng)化學(xué)上定義的aPTT試劑中的活性成分。它們也可以用于治療患者中的出血事件。PT試劑(凝血活酶試劑)可以在存在金屬螯合脂質(zhì)的情況下從活化的sTF制備，所述金屬螯合脂質(zhì)結(jié)合了金屬離子，優(yōu)選過渡金屬離子，例如Ni2+、Cu2+、ZnlCo2+，其中N產(chǎn)和C是最有效的。高度活性的aPTT試劑可以從金屬螯合劑制備，所述金屬螯合劑結(jié)合了金屬離子，優(yōu)選過渡金屬離子，例如N產(chǎn)、Cu2+、Zn2lCo2+，其中N產(chǎn)是最有效的。金屬螯合劑包括NTA珠子和金屬螯合脂質(zhì)。金屬螯合脂質(zhì)的實(shí)例包括l-棕櫚?；?2-[8-[(E，E)-2',4'-己二烯?；趸鵠辛?；鵠-sn-甘油基-3-N-[ll-[N',N'-二[羧曱基]亞氨基]-3,6，9-三氧雜十一烷?；鵠磷脂酰乙醇胺(其通過亞氨二乙酸(IDA)部分螯合例如Cu)[35]、脂質(zhì)二硬脂酰亞氨基-二乙酸鹽(DSIDA)(其螯合例如Cu)[36]，和1，2-二油酰-sn-甘油基-3-[(N-(5-氨基-l-羧基戊基)亞氨基二乙酸)丁二?；鵠(銨鹽)(DOGS-NTA)(其螯合例如Ni)。活化的sTF優(yōu)選包括TF的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和具有至少2個(gè)組氨酸殘基、更優(yōu)選具有2-10個(gè)組氨酸殘基的寡聚組氨酸部分。優(yōu)選地，所述組氨酸殘基是連續(xù)的。更優(yōu)選的，活化的sTF包括(His)n，其中n是2-10，更優(yōu)選4_6。活化的sTF的實(shí)例包括sTF(His)6、sTF-5AA-(His)6和sTF-2(His)5。PT測(cè)試試劑盒包括凝血活酶試劑。aPTT測(cè)試試劑盒包括aPTT試劑。任選地，含有Ca"的試劑、緩沖液和/或防腐劑可以被包括在任一試劑盒中。類似地，用于PT測(cè)試和aPTT測(cè)試的組合試劑盒將包括以下試劑，其可以形成aPTT試劑的凝血活酶試劑，例如N產(chǎn)和/或Cu"以及金屬螯合脂質(zhì)，其中單獨(dú)封裝活化的sTF。用于外在途徑(PT)或內(nèi)在途徑(aPTT)的凝結(jié)分析的實(shí)例包括PT分析可以含有寡聚組氨酸標(biāo)記的sTF以及與NTA-脂質(zhì)組合的N產(chǎn)或Cu2+;aPTT分析可以含有與NTA-脂質(zhì)組合的Ni2+。同時(shí)有力地活化外在和內(nèi)在凝結(jié)途徑的制劑的實(shí)例(例如，作為治療劑)可以使用寡聚組氨酸標(biāo)記的sTF與N產(chǎn)或Cu"以及NTA-脂質(zhì)組合來制備。用于組合PT測(cè)試和aPTT測(cè)試的試劑盒的實(shí)例包括三個(gè)試劑瓶，以下列為試劑A、B和C，在每種情況下，之后是它們的內(nèi)含物的列表。所述瓶子可以含有這些成分作為已經(jīng)制成的溶液，或者它們可以被凍干。在后一的情況中，通過添加適當(dāng)體積的水來產(chǎn)生標(biāo)明的組分終濃度，可以復(fù)原(reconstitute)i式齊寸。試劑A(a)100iiMNi-脂質(zhì)(b)任選的適合的緩沖液(例如，25mMTris-HCl緩沖液，pH7.4)(c)任選的防腐劑(例如，0.1%w/vNaN3)試劑B(d)l到100nM活化的sTF(e)任選的25mMCaCl2(f)任選的適合的緩沖液(例如，25mMTris-HCl緩沖液，pH7.4)(g)任選的穩(wěn)定劑(例如，0.1%w/v牛血清白蛋白)(h)任選的防腐劑(例如，0.1%w/vNaN3)試劑C(任選的)(i)水中的25mMCaCl2(j)任選的防腐劑(例如，0.1%w/vNaN3)PT分析(半自動(dòng)化的)1.將等體積的試劑A和B混合在一起來制成凝血活酶試劑。2.吸取50^檸檬酸化的血漿到血凝度計(jì)比色杯中。3.孵育120秒以確保血漿達(dá)到37°C。4.添加100ial凝血活酶試劑，混合，并測(cè)量從添加凝血活酶試劑的時(shí)間點(diǎn)至凝結(jié)形成的時(shí)間?？蛇x擇的PT分析(完全自動(dòng)化的)。1.吸取50nl檸檬酸化的血漿到血凝度計(jì)比色杯中。2.脬育120秒以確保血漿達(dá)到37°C。3.添加50|il試劑A,隨后立即添加50|il試劑B?；旌?。測(cè)量從添加試劑B的時(shí)間點(diǎn)至凝結(jié)形成的時(shí)間。這個(gè)版本的分析可以適合于自動(dòng)化的血凝度計(jì)，其中在步驟3中添加試劑A和B之間的延滯應(yīng)當(dāng)盡可能短。aPTT分析1.吸取50|il檸檬酸化的血漿到血凝度計(jì)比色杯中。2.添加50pi試劑A?；旌?。3.在37。C孵育180秒。4.添加50^試劑C,混合，測(cè)量從添加試劑C的時(shí)間點(diǎn)至凝結(jié)形成的時(shí)間?？梢孕纬芍委熃M合物，從而通過用所述組合物接觸來自傷口的血液或接觸傷口來停止傷口的出血。所述組合物可以含有啟動(dòng)內(nèi)在途徑、外在途徑或兩者所需的組分。所述組分可以與在凝血活酶試劑、aPTT試劑或兩者中使用的那些相同。取決于傷口的位置，所述治療劑組合物可以是各種形式局部用組合物、鼻部噴霧、栓劑、嗽口水、可注射組合物、繃帶和傷口敷料。治療組合物優(yōu)選是無菌的，并且可以含有防腐劑。治療組合物可以以包括單位劑型的各種形式施用，并且可以與各種的藥學(xué)上可接受的載體組合。這些載體包括固體稀釋劑或填充物，無菌的含水介質(zhì)以及各種無毒的有機(jī)溶劑。此外，口腔組合物(包括嗽口水、灌有治療組合物的襯墊或藥簽)可以適當(dāng)?shù)丶犹鸷?或調(diào)味?？噹Ш蛡诜罅峡梢院袧駶?rùn)或干燥(凍干)形式的組合物。鼻部噴霧可以含有濕潤(rùn)或干燥粉末形式的組合物，以及其他常規(guī)的添加劑和/或載體，例如在美國(guó)專利No.6,815,424中描述的那些。嗽口水含有濕潤(rùn)形式的組合物，任選含有嗽口水常用的其他成分。實(shí)例包括在美國(guó)專利No.5,945,087和美國(guó)專利No.5,338,538中描述的那些。可注射形式可以包括藥學(xué)上可接受的載體。可注射組合物可以被注射到任何體腔中，但一般不是靜脈注射。局部用組合物可以是濕潤(rùn)或干燥粉末形式，并且可以包括局部可接受的載體。這種表面可接受的載體的實(shí)例可以在2000年10月26日公開的國(guó)際專利公開WO00/62742;美國(guó)專利Nos.5,691,380;5,968,528;4,139,619和4,684,635中找到。適合的局部可接受的載體以及其他藥學(xué)載體也在Remington'sPharmaceuticalSciences,17thed.，MackPublishingCompany,Easton，Pa.(19卯)中描述了，這是本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)參考書。優(yōu)選地，所述凝血活酶試劑含有Ca2+，或者Ca^可以僅在使用所述試劑之前添加。Ca^可以在試劑盒中與凝血活酶試劑一起提供，每個(gè)部分單獨(dú)地封裝，任選每種試劑是干燥的形式。Ca^優(yōu)選作為CaCl2添加。Ca^的數(shù)量?jī)?yōu)選是1-100mM，更優(yōu)選5-75mM，進(jìn)一步優(yōu)選15-50mM，包括20mM、25mM、30mM、35mM、40mM和45mM。離子強(qiáng)度可以通過添加鹽來調(diào)節(jié)，例如堿金屬和堿土金屬鹽，包括卣化物、硫酸鹽、硝酸鹽和醋酸鹽，例如NaCl和KCl。優(yōu)選，所述鹽以0-200mM、10-150mM、15-125mM，更優(yōu)選25-100mM的數(shù)量存在。優(yōu)選地，所述凝血活酶試劑不含有因子II、因子X、肌動(dòng)蛋白、己糖激酶和堿性磷酸酶中的一種或多種。缺乏肌動(dòng)蛋白、己糖激酶和堿性磷酸酶表明所述凝血活酶試劑不含有組織提取物(雖然組織因子本身可以是從凝血活酶試劑含有重脂質(zhì)化為磷脂的TF，例如磷脂酰膽堿(PC)、絲氨酸磷脂(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)。所述磷脂的至少一部分是帶有凈負(fù)電荷的磷脂，例如PS、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酸(PA)和磷脂酰肌醇(PI)。優(yōu)選地，PS的數(shù)量是總磷脂含量的5-50%，更優(yōu)選為10-40%，包括15%、20%、25%、30%和35%。PE的數(shù)量?jī)?yōu)選是總磷脂含量的0-50%,更優(yōu)選為5-40%，包括10%、15%、20%、25%、30%和35%。優(yōu)選地，磷脂含量的其余部分由中性的磷脂例如PC組成，例如，其占總磷脂含量的0-95%，更優(yōu)選為40-90%，包括45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%和85%。凝血活酶試劑的國(guó)際靈敏度指數(shù)(ISI)值優(yōu)選是0.6到2，更優(yōu)選為0.8到1.5,進(jìn)一步優(yōu)選為0.8到1.2，最優(yōu)選為0.9到1.1。做為選擇，優(yōu)選地，凝血活酶試劑的ISI值最多是1.5或最多是1.2。凝血活酶試劑的ISI值應(yīng)當(dāng)通過WHO批準(zhǔn)的方法來確定[34]。通過凍干、噴霧干燥或其他適合的蛋白質(zhì)干燥方法，可以以干燥的形式提供凝血活酶試劑。所述試劑可以在長(zhǎng)條或其他固相支持物上干燥，可以作為試劑盒來提供，其具有單獨(dú)封裝而提供的組分、或封裝到2個(gè)或多個(gè)包裝內(nèi)的組分的集合。一些或所有的組分可以以干燥形式來提供，其他組分在鹽水或生理學(xué)的緩沖液中提供。本發(fā)明的凝血活酶試劑可以含有添加的FVII。向凝血活酶試劑中添加微小數(shù)量的因子VIIa可以用于最小化對(duì)因子VII的敏感性，以及進(jìn)一步操縱對(duì)其他因子的響應(yīng)。在2004年8月31日提交的Morrissey等人的名稱為"THROMBOPLASTINREAGENTS"的美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/931,282中更完整地解釋了這一點(diǎn)。可以使用任何FVII，包括任何哺乳動(dòng)物因子VII或VIIa(例如人類、兔、大鼠、牛，等等)。優(yōu)選地，所述凝血活酶試劑含有添加的因子VIIa，更優(yōu)選人類因子VIIa。FVII可以重組地制備[33]。優(yōu)選地，存在的FVII的數(shù)量低于在正常個(gè)體的血漿中存在的因子VII或因子Vila的數(shù)量，包括在缺乏因子II和因子X的血漿中存在的因子VII或Vila的數(shù)量。存在的FVII的數(shù)量?jī)?yōu)選是0.1到10納克/毫升(ng/ml)因子VIIa當(dāng)量、1到6ng/ml因子Vila當(dāng)量，或2.5到5ng/ml因子Vila當(dāng)量，更優(yōu)選是至少1ng/ml或至少2.5ng/ml因子Vila當(dāng)量。做為選擇，F(xiàn)VII的數(shù)量可以以皮摩爾(pM)數(shù)量來表示；例如1-1000pM因子Vila當(dāng)量、50-400pM因子Vila當(dāng)量，優(yōu)選是至少150pM因子Vila當(dāng)量或至少200pM因子Vila當(dāng)量。凝血活酶試劑可以用來監(jiān)測(cè)任何抗凝血藥物治療。以下的表A列出了多種這樣的藥物。表A:可以使用凝血活酶試劑監(jiān)測(cè)的抗凝血藥物<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>1:FDA批準(zhǔn)在人類中使用2:在臨床試驗(yàn)中評(píng)估但尚未批準(zhǔn)3:仍在開發(fā)中(僅進(jìn)行動(dòng)物研究)實(shí)施例除非另有說明，以下研究使用sTF(His)6進(jìn)行，并且采用由Bio-Bead法制備的suv。用于改變的凝血活酶試劑的磷脂sTF(His)6的促凝血性質(zhì)首先通過測(cè)定在PT分析中產(chǎn)生最短凝結(jié)時(shí)間的磷脂組成來研究。系統(tǒng)地改變SUV中的PE、PS、PC和DOGS-NTA-Ni的比例，測(cè)試它們?cè)谥С终；旌系难獫{的凝結(jié)方面的有效性。使用SUV(100nM脂質(zhì))和0.3嗎/mlsTF(His)6的混合物來形成用于PT凝結(jié)分析的改變的凝血活酶試劑。當(dāng)SUV含有12。/。Ni-脂質(zhì)(40。/c)PE、5%PS、12%DOGS-NTA-Ni和43%PC)時(shí)，使用這些試劑獲得了最短的凝結(jié)時(shí)間(圖2)。還研究了產(chǎn)生最短凝結(jié)時(shí)間的SUV濃度。使用PT分析和0.3昭/mlsTF(His)6，改變含有12.5%DOGS-NTA-Ni的總磷脂的濃度。隨著SUV濃度提高，凝結(jié)時(shí)間變得更短，在大約100pM磷脂處到達(dá)平臺(tái)期(圖3)。寡聚組氨酸標(biāo)記的sTF的性質(zhì)在存在含有10%DOGS-NTA-Ni、5%PS、30%PE和55%PC的磷脂泡嚢(稱為10。/。Ni-脂質(zhì))時(shí)，將sTF(His)6和sTF-5AA-(His)6的凝結(jié)活性與存在PCPS泡嚢和重脂質(zhì)化到PCPS泡嚢中的rTF的情況下sTF的活性相比較。制備含有TF和磷脂的凝血活酶試劑，并稀釋至TF的各種濃度。稀釋的凝血活酶試劑然后用于PT分析(圖4)。四種改變的凝血活酶試劑如下制備1.重脂質(zhì)化到PCPS泡嚢(30pM)中的100ng/mlrTF，2.1000ng/mlsTF(His)6加10%Ni-脂質(zhì)(IOOjiM)，3.1000ng/mlsTF-5AA-(His)6加10%Ni-脂質(zhì)(IOO|iM),和4.10,000ng/mlsTF加PCPS泡嚢(IOOpM)。凝血活酶試劑在TA(pH7.5的50mMTris-HCl緩沖液、0.1。/。牛血清白蛋白、0.1%NaN3)中稀釋來改變TF的濃度。產(chǎn)生50秒凝結(jié)時(shí)間的TF濃度被用于比較不同的凝血活酶制備物的活性(表1)。sTF(His)6和sTF-5AA-(His)6的促凝血活性顯著地高于sTF。sTF-5AA-(His)6是更具活性的變體，具有rTF的活性的IO倍之內(nèi)的促凝血活性。將sTF(His)6變構(gòu)地活化Vila的能力與sTF和rTF/PCPS相比較。sTF(His)6也能夠完全地變構(gòu)活化VIIa(數(shù)據(jù)未顯示)。表1:在PT分析中多種形式的重組組織因子的凝結(jié)活性<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>**凝結(jié)數(shù)據(jù)來自圖1研究sTF-(His)6與Vila結(jié)合得有多么牢固。膜錨定的rTF和sTF在它們對(duì)VIIa的結(jié)合親和性方面顯著不同。VIIa極其緊密地結(jié)合已經(jīng)重脂質(zhì)化到PCPS泡嚢中的rTF，iQ值低于50pM[4]。另一方面，Vila明顯更弱地結(jié)合sTF,IQ值是大約2到5nM[4]。對(duì)于Vila與rTF/PCPS的結(jié)合，在存在PCPS泡嚢的情況下與sTF的結(jié)合，以及在存在Ni-脂質(zhì)的情況下與sTF(His)6的結(jié)合，測(cè)定KJ直(表2;對(duì)于在存在Ni-脂質(zhì)的情況下Vila與sTF(His)6的結(jié)合的典型結(jié)合等溫線，參見圖5。)表2.Vila與多種形式的重組人類組織因子的結(jié)合的離解常數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*具有15mol%Ni-NTA-DOGS的SUV與文獻(xiàn)值相一致，對(duì)于Vila與rTF/PCPS結(jié)合獲得的Kj直為40pM，對(duì)于Vila與sTF結(jié)合獲得的IQ值為7nM。這確認(rèn)了早先的報(bào)道，Vila結(jié)合rTF/PCPS的親和性比其結(jié)合sTF的親和性高大約100倍。有趣地，發(fā)現(xiàn)在存在Ni-脂質(zhì)的情況下Vila以非常高的親和性結(jié)合sTF(His)6。使用通過Bio-Bead法制備的磷脂泡嚢進(jìn)行在這項(xiàng)研究中到此為止提及的實(shí)驗(yàn)。使用通過超聲處理或擠出制備的泡嚢進(jìn)行類似的凝結(jié)實(shí)驗(yàn)，得到類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。因而，所有三種類型的泡嚢都支持了sTF(His)6的凝結(jié)活性。與擠出或超聲化的泡嚢相比，通過Bio-Bead法制備的泡嚢支持了最高的活性(最短的凝結(jié)時(shí)間)。寡聚組氨酸標(biāo)記的sTF和Ni-脂質(zhì)作為PT試劑主要的目標(biāo)是產(chǎn)生可以在PT分析中作為凝血活酶試劑的可溶形式的TF。為了測(cè)試這一點(diǎn)，產(chǎn)生改變的凝血活酶試劑，含有以下的最終濃度3)ig/mlsTF(His)6和100)iM15。/。Ni-脂質(zhì)。然后在PT分析中比較這種試劑和商業(yè)上可獲得的凝血活酶試劑STA-NeoplastineClPlus(DiagnosticaStago)。使用混合的正常血漿以及許多缺乏因子的血漿來比較使用這兩種試劑時(shí)的凝結(jié)時(shí)間(圖6)。(所述缺乏因子的血漿是缺乏因子V、VII、VIII、IX、X、XI、XII、激肽釋放酶原(PK)或高分子量激肽原(HK)的)。如PT分析所預(yù)料的，使用缺乏因子V、VII或X的血漿時(shí)，兩種試劑都展現(xiàn)了延長(zhǎng)的凝結(jié)時(shí)間，然而對(duì)于內(nèi)在途徑的凝結(jié)因子(因子VIII、IX、XI、XII、PK或HK)的缺乏不敏感。用于aPTT分析的磷脂發(fā)現(xiàn)在某些情況下Ni-脂質(zhì)本身是促凝血的，甚至在缺乏sTF(His)6的情況下。進(jìn)一步的研究表明，Ni-脂質(zhì)是血液凝固的接觸途徑的強(qiáng)力活化劑，特別是當(dāng)在添加鈣離子之前在37。C與血漿預(yù)孵育2到4分鐘時(shí)(參見圖9)。(在以上呈現(xiàn)的PT測(cè)試數(shù)據(jù)中，Ni-脂質(zhì)不與血漿預(yù)孵育，因而血液凝固的接觸途徑未被活化到任何顯著的程度。)在以下的系列實(shí)驗(yàn)中探索了Ni-脂質(zhì)活化接觸途徑的能力。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，通過改變PS、PE、PC和DOGS-NTA-Ni的含量，在aPTT分析中考察了Ni-脂質(zhì)促凝血活性的磷脂依賴性(圖7)。使用由15%D0GS-NTA-Ni、5%PS、40%PE和40%PC組成的SUV(稱為15%Ni-脂質(zhì))獲得了最短的凝結(jié)時(shí)間。然后，使用15。/。Ni-脂質(zhì)在aPTT分析中考察了磷脂濃度對(duì)凝結(jié)時(shí)間的影響(圖8)。在100|iM或高于100的磷脂濃度處獲得了最短的凝結(jié)時(shí)間。Ni-脂質(zhì)與血漿的預(yù)孵育時(shí)間(添加鈣離子之前)對(duì)于aPTT分析的性能是重要的(圖9)。在缺乏預(yù)孵育時(shí)，凝結(jié)時(shí)間是非常長(zhǎng)的(>100秒)。Ni-脂質(zhì)與血漿的最佳預(yù)孵育持續(xù)時(shí)間是2到4分鐘，此后凝結(jié)時(shí)間變得更長(zhǎng)。這種特性是aPTT試劑的典型特性，與商業(yè)上可獲得的aPTT分析是可比較的。為了確定Ni-脂質(zhì)的促凝血活性是由于接觸途徑的活化而導(dǎo)致的，使用正常的和缺乏因子VIII的血漿重復(fù)基于Ni-脂質(zhì)的aPTT分析(圖10)。使用提高的15。/。Ni-脂質(zhì)濃度，正常血漿的凝結(jié)時(shí)間顯著地縮短，而在測(cè)試的所有泡嚢濃度下在這些分析中缺乏因子VIII的血漿的凝結(jié)時(shí)間顯著地延長(zhǎng)。這表明，Ni-脂質(zhì)的促凝血活性取決于血液凝固的內(nèi)在途徑。Ni-脂質(zhì)作為aPTT試劑使用正?；旌系难獫{和缺乏各種單個(gè)的凝結(jié)因子的血漿在aPTT分析中測(cè)試Ni-脂質(zhì)的促凝血活性，與商業(yè)上可獲得的aPTT試劑相比較(圖11)。對(duì)于Ni-脂質(zhì)試劑，使用含有15%DOGS-NTA-Ni、5%PS、40%PE和40%PC的50iiM磷脂泡嚢。商業(yè)上可獲得的aPTT試劑是STA-PTT-Automate5(DiagnosticaStago)。選擇50Ni-脂質(zhì)濃度，因?yàn)樗a(chǎn)生了正常的混合血漿的基線aPTT凝結(jié)，這類似于市售aPTT試劑與正常的混合血漿的凝結(jié)時(shí)間。通過在37。C孵育50(ilaPTT試劑與50|il血漿3分鐘，然后通過添加50^預(yù)暖的25mMCaCl2啟動(dòng)凝結(jié)，來進(jìn)行aPTT分析(圖11)。如所預(yù)料的，兩種試劑的凝結(jié)時(shí)間對(duì)于因子VII的缺乏不敏感，因子VII對(duì)于血液凝固的外在途徑而言是特異性的。還如預(yù)料的是，當(dāng)血漿缺乏任何以下凝結(jié)因子時(shí)，使用這兩種試劑的凝結(jié)時(shí)間延長(zhǎng)因子V、VIII、IX、X、XI、XII、激肽釋放酶原或高分子量激肽原。這證實(shí)了Ni-脂質(zhì)通過血液凝固的接觸途徑活化凝結(jié)級(jí)聯(lián)。這些結(jié)果還表明，基于Ni-脂質(zhì)的aPTT試劑具有與商業(yè)上可獲得的aPTT試劑的性質(zhì)高度可比較的性質(zhì)。Ni-脂質(zhì)作為接觸活化劑的金屬離子特異性在這個(gè)系列實(shí)驗(yàn)中，測(cè)試了當(dāng)與NTA-DOGS結(jié)合時(shí)其他多種過渡金屬支持新的PT和aPTT分析的能力。通過制備含有以下mol。/。脂質(zhì)15%NTA-DOGS、50/0PS、40%PE、40%PC的混合的磷脂泡嚢(使用Bio-Bead法)來進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。這些混合的磷脂泡嚢(在此稱為NTA-脂質(zhì))然后用于aPTT和PT分析中。改變的凝血活酶試劑含有變化濃度的指定金屬鹽、NTA-脂質(zhì)(IOO|iM脂質(zhì))、30ng/mlsTF-5AA-(His)6、0.004。/。(w/v)牛血清白蛋白、0.08%(w/v)疊氮化鈉和pH7.4的16mMHepes緩沖液。改變的aPTT試劑含有變化濃度的指定金屬鹽、NTA-脂質(zhì)(IOOpM脂質(zhì))、0.08。/。(w/v)疊氮化鈉和pH7.4的16mMHepes緩沖液。使用含有30ng/mlsTF-5AA-(His)6和變化濃度的NiS04、CoCl2、CuS04、ZnCl2、FeS04、CdCl2、CrCl2、AgN03或MnCl2的改變的凝血活酶試劑在存在NTA-脂質(zhì)的情況下進(jìn)行PT分析(圖12)。(對(duì)于這組實(shí)驗(yàn)選擇低濃度的sTF-5AA-(His)6(30ng/ml)，從而在金屬離子濃度變化時(shí)可以獲得易于觀察的凝結(jié)時(shí)間范圍。在更典型的PT分析中，應(yīng)當(dāng)使用更高濃度的sTF-5AA-(His)6，產(chǎn)生的正常的混合血漿的凝結(jié)時(shí)間在10到15秒的范圍內(nèi)。)當(dāng)包括在改變的凝血活酶試劑中時(shí)，在這項(xiàng)PT分析中，某些測(cè)試的金屬離子(Fe2+、Cd2+、Cr2+、Ag+和Mn2+)在從0到90nM的濃度范圍展現(xiàn)了延長(zhǎng)的凝結(jié)時(shí)間(>200秒)(數(shù)據(jù)未顯示)。Zi^+顯示了一些活性(參見圖12)。相比之下，當(dāng)添加到改變的凝血活酶試劑中時(shí)，Ni2+、Cu"和Co"都以濃度依賴性的方式顯著地縮短了凝結(jié)時(shí)間(圖12)。使用10CuS04或NiS04獲得了最短的凝結(jié)時(shí)間(<30秒)，表明Cu"和N產(chǎn)在這個(gè)分析系統(tǒng)中具有可比較的活性。然而，在低于10nM的金屬離子濃度下，相比012+，N產(chǎn)支持了更短的凝結(jié)時(shí)間(圖12B)。當(dāng)添加到改變的凝血活酶試劑中時(shí)，0)2+在所測(cè)試的其他金屬是唯一能夠?qū)T凝結(jié)時(shí)間縮短到低于IOO秒的金屬。然而，所測(cè)試的Co"濃度都不支持如使用Cu"或N產(chǎn)的最佳濃度所觀察到的那么短的凝結(jié)時(shí)間。使用含有變化濃度的NiS04、CoCl2、CuS04、ZnCl2、FeS04、CdCl2、CrCl2、AgN03或MnCl2的改變的aPTT試劑在存在NTA-脂質(zhì)的情況下進(jìn)行aPTT分析(圖12C)。當(dāng)以0到90的濃度范圍添加到改變的aPTT試劑中時(shí)，幾種測(cè)試的金屬離子(Fe2+、Cd2+、Cr2+、Ag+和Mn2+)都展現(xiàn)了延長(zhǎng)的凝結(jié)時(shí)間(>200秒)(數(shù)據(jù)未顯示)。Co"和Zn"顯示了一些活性(參見圖12C)。相比之下，在存在NTA-脂質(zhì)的情況下，N產(chǎn)和Cu"都以濃度依賴性方式顯著縮短了凝結(jié)時(shí)間(圖12C)。與Cu"相比，在這個(gè)分析中N產(chǎn)實(shí)質(zhì)上表現(xiàn)得更好。當(dāng)以10到25jaM的濃度摻入到改變的aPTT試劑中時(shí)，N產(chǎn)展現(xiàn)了最大的活性(最短的凝結(jié)時(shí)間)。與其他固定的支持物結(jié)合的N產(chǎn)通過活化血液凝固的接觸途徑展現(xiàn)了促凝血;舌'l"生。通過寸吏用NiSepharose6FastFlowJ朱子(AmershamBiosciences)測(cè)試了這一點(diǎn)，其含有螯合到共價(jià)附著于交聯(lián)的瓊脂糖珠子上的NTA部分的N產(chǎn)離子(Ni-NTA珠子)。使用96-孔平板讀數(shù)器測(cè)試Ni-NTA珠子的促凝血活性，因?yàn)榄傊侵樽痈蓴_ST4血凝度計(jì)中的球承載檢測(cè)系統(tǒng)。作為比較物，在這個(gè)相同的測(cè)試系統(tǒng)中測(cè)試了15。/。Ni-脂質(zhì)的能力。含有15。/。Ni-脂質(zhì)的樣品幾乎立即凝結(jié)(太快而不能通過微平板讀數(shù)器測(cè)量)，表明它們作為接觸途徑活化劑的優(yōu)勢(shì)(數(shù)據(jù)未顯示)。不存在活化劑時(shí)血漿的凝結(jié)時(shí)間是311秒(表3)。Ni-NTA珠子將血漿的凝結(jié)時(shí)間縮短到126秒，雖然顯著縮短了，但是它比使用15。/。Ni-脂質(zhì)時(shí)所觀察到的凝結(jié)時(shí)間實(shí)質(zhì)上更長(zhǎng)。這表明Ni-NTA珠子具有可測(cè)量的促凝血活性，但這也表明它們不如Ni-脂質(zhì)。作為對(duì)照物來確定瓊脂糖珠子本身不是促凝血性的，通過暴露于EDTA來對(duì)等分量的珠子剝離掉結(jié)合的鎳離子(隨后通過大量洗滌來除去EDTA)。這些剝離的NTA珠子展現(xiàn)了可忽略的促凝血活性。表3.在存在活化凝結(jié)的多種形式的Ni-NTA的情況下混合的正常血漿的凝結(jié)時(shí)間<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>Ni-NTA珠子可以用于耗盡血漿的接觸因子由于Ni-脂質(zhì)活化接觸途徑，接觸途徑中的至少一種因子必須是Ni2+-結(jié)合蛋白。進(jìn)行初步研究來確定正常的混合血漿是否可以通過吸附于Ni-NTA珠子上來耗盡接觸途徑中的因子。在環(huán)境溫度下將血漿與Ni-NTA珠子孵育30分鐘，然后通過過濾從血漿中除去珠子(耗盡的血漿)。使用改變的PT分析(用rTF/PCPS作為凝血活酶試劑)和aPTT分析(使用DiagnosticaStagoaPTT試劑)測(cè)量了耗盡的血漿的凝結(jié)時(shí)間。將耗盡的血漿的凝結(jié)時(shí)間與使用正常的混合血漿(未用Ni-NTA珠子處理)的凝結(jié)時(shí)間相比較(表4)。在PT分析中，耗盡的血漿的凝結(jié)時(shí)間比正常血漿短。在aPTT分析中，耗盡血漿的凝結(jié)時(shí)間實(shí)質(zhì)上長(zhǎng)于正常的混合血漿。這個(gè)結(jié)果表明，通過吸附到Ni-珠子上，血漿中的關(guān)鍵的接觸因子可以被耗盡。表4.使用PT和aPTT分析比較耗盡的血漿和混合的正常血漿的凝結(jié)時(shí)間PT(秒)aPTT(秒)混合的正常血漿16.2±0.235.2±1.5耗盡的血漿16.2士0.283.7±17.6其他的寡聚組氨酸標(biāo)記的sTF變體還使用了兩種新的寡聚組氨酸標(biāo)記的sTF變體sTF-2(His)5和sTF-5AA-(His)6(氨基酸序列參見圖l)進(jìn)行了研究。使用由變化數(shù)量的DOGS-NTA-Ni組成的50SUV(5%PS、30%PE,且余量由PC組成)，用所有三種形式的寡聚組氨酸標(biāo)記的sTF(0.15嗎/ml)進(jìn)行了PT分析(圖13)。這些研究顯示，sTF-2(His)s構(gòu)建體相對(duì)于sTF(His)6具有降低的促凝血活性，而sTF-5AA-(His)6構(gòu)建體相對(duì)于sTF(His)6具有提高的促凝血活性。使用早期用于測(cè)量sTF(His)6的&值的相同條件，也測(cè)量了每種變體對(duì)Vila的結(jié)合親和性(對(duì)于結(jié)合等溫線參見圖14,KJ直參見表5)。這些研究表明，sTF-2(His)5構(gòu)建體比sTF(His)6構(gòu)建體更微弱地結(jié)合因子VIIa。相比之下，sTF-5AA-(His)6構(gòu)建體比sTF(His)6構(gòu)建體明顯更緊密地結(jié)合因子VIIa。這些結(jié)果表明sTF-5AA-(His)6構(gòu)建體優(yōu)于sTF(His)6構(gòu)建體。表5.Vila與組氨酸標(biāo)記的sTF變體的結(jié)合的離解常數(shù)TFA(pM)sTF(His)6169sTF-2(His)5440sTF-5AA-(His)631當(dāng)Vila與TF結(jié)合時(shí)，它的X活化速率顯著地提高了，因此這可以用于方便地顯示TF:VIIa復(fù)合物的形成。使用這種方法，發(fā)現(xiàn)VIIa以極其高的親和性與sTF-5AA-(His)6加NiPCPS(含有15%DOGS-NTA-Ni、65%PC、20%PS的磷脂泡嚢)的組合相結(jié)合，&為10.8pM(表6)。這基本上相等于它對(duì)PCPS脂質(zhì)體中重組膜結(jié)合組織因子(membTF)的親和性(ig=10.0pM)。因而，當(dāng)分離的TF外結(jié)構(gòu)域經(jīng)由與金屬螯合脂質(zhì)的相互作用附著于膜表面時(shí)，它的VIIa結(jié)合能力與跨越脂質(zhì)雙分子層的membTF是不可區(qū)分的。TF:VIIa功能的嚴(yán)格測(cè)試是關(guān)于它支持它的天然蛋白質(zhì)底物X的活化的能力。這需要將TF摻入到合適的磷脂膜(即，含有帶負(fù)電的磷脂的膜)中。另一方面，即使在存在PCPS脂質(zhì)體的情況下，分離的TF外結(jié)構(gòu)域支持了比membTF低幾個(gè)數(shù)量級(jí)的X活化速率，因?yàn)閟TF沒有錨定在膜中[4，9]。在相同濃度的酶(500pMVIIa)、輔助因子(4pMTF)和脂質(zhì)體(50總脂質(zhì))的情況下，比較了各種形式的TF支持X的活化的能力。sTF-5AA-(His)6和NiPCPS的組合支持了Vila的X活化速率，所述X活化速率與4吏用PCPS脂質(zhì)體中的membTF所獲得的X活化速率是可比較的。兩種形式的TF:VIIa復(fù)合物的kcat值是相似的，而結(jié)合到sTF-5AA-(His)6加NiPCPS的VIIa對(duì)X的Km實(shí)際上低于PCPS中的membTF，產(chǎn)生了稍微高的總體催化效率(kcat/Km)。結(jié)合于sTF-5AA-(His)6的Vila的高酶活性取決于鎳螯合脂質(zhì)和sTF上的寡聚組氨酸標(biāo)簽，因?yàn)榛旌蟬TF-5AA-(His)6與PCPS脂質(zhì)體或者混合sTF與NiPCPS脂質(zhì)體支持了可忽略的Vila活化X的速率。TF的其他功能是促進(jìn)反應(yīng)中VII的自動(dòng)活化，這取決于TF的表面密度[25,50]。相比之下，sTF不能支持這個(gè)反應(yīng)[ll]。在相同的TF表面密度的條件下，PCPS中的membTF和sTF-5AA-(His)6加NiPCPS都以可比較的速率常數(shù)支持了VII自動(dòng)活化(表6)。結(jié)合在一起，這些發(fā)現(xiàn)顯示，TF外結(jié)構(gòu)域共價(jià)附著于膜錨定物來實(shí)現(xiàn)TF活性的野生型水平不是必需的；sTF經(jīng)由金屬螯合脂質(zhì)對(duì)膜表面的可逆性附著與常規(guī)的膜錨定在功能上是等效的。表6:TF:VIIa復(fù)合物的結(jié)合和動(dòng)力學(xué)常數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>sTF-5AA-(His)6aNiPCPS脂質(zhì)體10.&±4.238±3.83.3±0.4387.1±12.32.9(土0.37)x107STF-5AA-(His)6b固定的10%DOGS-NTA-風(fēng)20%PS，70%PCn.dc66±6.44.1±1.463,1±22.3n.dc純化的蛋白質(zhì)。b從粗的培養(yǎng)物上清液捕獲的。e沒有測(cè)定。如上所述的實(shí)驗(yàn)使用了純化的sTF-5AA-(His)6。據(jù)推理，含有DOGS-NTA-Ni的固定的脂質(zhì)雙分子層應(yīng)當(dāng)能夠從粗的混合物捕獲sTF-5AA-(His)6，在一個(gè)快速的步驟中同時(shí)分離和膜錨定這種蛋白質(zhì)。雖然在我們的co//表達(dá)系統(tǒng)中sTF-5AA-(His)6的表達(dá)是靶向周質(zhì)間隙的，但是顯著的數(shù)量在過夜培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中積累一般是通過ELISA測(cè)量的55(ig/ml(2.0|iM)sTF-5AA-(His)6。因而，粗培養(yǎng)物上清液用緩沖液稀釋十倍，并在聚苯乙烯96孔平板的反應(yīng)孔中孵育，所述反應(yīng)孔預(yù)先用含有DOGS-NTA-Ni、PS和PC的脂質(zhì)混合物包被。在洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)之后，反應(yīng)孔用VIIa處理，并且測(cè)量X活化速率。由于在缺乏TF和合適的磷脂膜的情況下Vila是X的不良活化劑，這種分析是對(duì)固定的脂質(zhì)捕獲sTF-5AA-(His)6的能力、以及產(chǎn)生的TF:VIIa:膜復(fù)合物的功能狀態(tài)的嚴(yán)格的測(cè)試。發(fā)現(xiàn)的是，當(dāng)按這種方式從培養(yǎng)物上清液捕獲sTF-5AA-(His)6時(shí)，sTF-5AA-(His)6有力地支持了VIIa對(duì)X的活化，其表觀Km和U直與PCPS脂質(zhì)體中的membTF的Km和k^值是可比較的(表6)。在這些分析條件之下，支持X活化的半最大速率所需的純化的sTF-5AA-(His)6的濃度(EC5Q)是6.2士4.1nM(圖16),比我們的E.coli培養(yǎng)物上清液中的sTF-5AA-(His)6濃度低兩個(gè)數(shù)量級(jí)以上。sTF上的寡聚組氨酸標(biāo)簽和鎳螯合脂質(zhì)的存在都是所需的，因?yàn)閟TF-5AA-(His)6與固定的PCPS的組合或者sTF與固定的鎳螯合脂質(zhì)混合物的組合都不產(chǎn)生可檢測(cè)水平的X活化，甚至在sTF濃度高達(dá)1nM時(shí)(圖16)。DOGS-NTA-Ni和磷脂的混合物在聚苯乙烯血凝度計(jì)比色杯的反應(yīng)孔中干燥下來，洗滌比色杯來除去任何未固定的脂質(zhì)，然后向反應(yīng)孔添加sTF-5AA-(His)6。隨后通過向反應(yīng)孔添加鈣離子和血漿來進(jìn)行凝結(jié)測(cè)試。發(fā)現(xiàn)的是，在每個(gè)孔已經(jīng)容納了200到800nmolNiPCPSPE(包含10%DOGS-NTA隱Ni、47.5%PC、12.5%PS、30%PE的磷脂泡嚢)的比色杯中使用20nMsTF-5AA-(His)6可實(shí)現(xiàn)低于25秒的凝結(jié)時(shí)間(圖17)。使用其他脂質(zhì)組合物來進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，將它們都以每個(gè)反應(yīng)孔單一數(shù)量的脂質(zhì)(200nmol)干燥在比色杯反應(yīng)孔上。當(dāng)脂質(zhì)缺乏DOGS-NTA-Ni(PCPS或PCPSPE;圖17)時(shí)觀察到明顯更長(zhǎng)的凝結(jié)時(shí)間。含有DOGS-NTA-Ni但是缺少PE的脂質(zhì)混合物具有適度延長(zhǎng)的凝結(jié)時(shí)間(NiPCPS"圖17)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，固定的NiPCPSPE和sTF-5AA-(His)6的組合起到了強(qiáng)力的凝血活酶試劑的作用。這些實(shí)驗(yàn)還表明，DOGS-NTA-Ni是sTF-5AA-(His)6有效地用作促凝血試劑所需的，以及PE增強(qiáng)了sTF-5AA-(His)6的促凝血活性但不是絕對(duì)必需的。研究了凝結(jié)時(shí)間對(duì)sTF-5AA-(His)6濃度的依賴性。使用每孔200nmol的干燥NiPCPSPE，我們發(fā)現(xiàn)，使用從4.8到4800nM的sTF-5AA-(His)6濃度范圍獲得了低于20秒的凝結(jié)時(shí)間(圖18)。使用48nMsTF-5AA-(His)6在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中獲得了最短的凝結(jié)時(shí)間(16.3秒)。相比之下，沒有寡聚組氨酸標(biāo)簽的sTF展現(xiàn)了長(zhǎng)得多的凝結(jié)時(shí)間，即使在非常高的濃度使用時(shí)(4800nM;圖18)。這表明，sTF-5AA-(His)6的寡聚組氨酸標(biāo)簽是它在存在固定的NiPCPSPE的情況下用作有效的凝血活酶試劑所需的。才才津牛禾p方法——混合的正常人類血漿和缺乏各個(gè)因子的血漿(缺乏因子V、VII、VIII、IX、X、XI、XII或激肽釋放酶原)購自GeorgeKingBio-Medical。缺乏激肽原(HK)的血漿購自AffinityBiologicals。雞蛋磷脂酰膽堿(PC)、豬腦絲氨酸磷脂(PS)、牛肝臟磷脂酰乙醇胺(PE)和DOGS-NTA-Ni購自AvantiPolarLipids,Inc.。所提供的脂質(zhì)溶于氯仿中，在氮?dú)庵性?20°C保存直到需要時(shí)。Chromozymt-PA(N-曱磺酰-0-1^-017-八巧-4-苯基重氮酸乙酸鹽(1^^11化(16acetate))購自RocheAppliedScience。S-2222購自DiaPharma。Bio-BeadsSM-2吸附劑購自BioRadLaboratories,八乙二醇單十二烷基醚((:12￡8)購自Fluka。重組人類Vila購自AmericanDiagnostica,血漿書亍生的因子X來自EnzymeResearchLaboratories。商業(yè)的PT試劑(STA-NeoplastineCIPlus)和aPTT試劑(STA-PTT-Automate5)購自DiagnosticaStago。NiSepharose6FastFlow珠子購自AmershamBiosciences,如先前描述的，重組人類rTF和sTF在E.coli細(xì)胞中表達(dá)并純化[6，21]。牛血清白蛋白(BSA)來自Calbiochem(LaJolla，CA)。ST4血凝度計(jì)比色杯和STart4血凝度計(jì)來自DiagnosticaStago(Parsippany，NJ)。SpectrozymeXa底物(曱氧羰基-D-環(huán)己基甘氨酰-Gly-Arg-4-硝基苯胺乙酸鹽(nitroanilideacetate))和重組人類Vila來自AmericanDiagnostica,Inc.(Stamford,CT)。純化的血漿衍生的VII、X和因子Xa(Xa)來自EnzymeResearchLaboratories(SouthBend,IN)。防沫劑C來自Sigma(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。,果逸我^標(biāo)記》"7F的斜務(wù)——通過突變含有sTF的序列的載體來產(chǎn)生三種不同形式的寡聚組氨酸標(biāo)記的sTF。用于在￡.co//中產(chǎn)生變體的表達(dá)載體是質(zhì)粒pET26b(+)(Novagen)的變化形式。所有三種形式編碼以下的氨基酸序列(從N-末端到C-末端列出)1.細(xì)菌前導(dǎo)肽(pelB)，用于將重組蛋白質(zhì)靶向Eco"的周質(zhì)間隙。在蛋白質(zhì)的合成期間通過E.coli細(xì)胞除去pe舊前導(dǎo)肽。2.短肽表位(AEDQVDPRLIDGKS)，位于在成熟的重組sTF的N-末端，用于使用固定的HPC4抗體的親和純化。許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)顯示，這個(gè)存在于sTF的N-末端的短肽對(duì)于它的功能是沒有影響的問。3.人類TF的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，由成熟的人類TF序列的氨基酸1-217或1-219組成(根據(jù)MorrisseyWa/.來編號(hào)[22])。所述三種變體的sTF的C-末端的序列是不同的(圖1)。sTF(His)6用六個(gè)組氨酸殘基替換了sTF的最后兩個(gè)氨基酸。sTF-2(His)5類似于sTF(His)6，不同之處是sTF-2(His)5含有五個(gè)組氨酸殘基、八個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的間隔基和另外五個(gè)組氨酸殘基。sTF-5AA-(His)6保留了sTF的最后兩個(gè)氨基酸，然后含有5個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的間隔基，隨后是六個(gè)組氨酸殘基。所有三種變體都在Eco/ZBL21(DE3)細(xì)胞中表達(dá)，并使用HPC4免疫親和柱來純化，如先前對(duì)sTF所描述的[6]，有以下的微小改變。如先前在Rezaie,W中描述的通過離心獲得細(xì)菌團(tuán)粒。>使用細(xì)胞洗滌緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.5，30mMNaCl，0.5mMEDTA，pH8.0)洗滌團(tuán)粒，如先前描述的離心，洗滌并離心第二次。再次將洗滌的團(tuán)粒懸浮在原生質(zhì)球緩沖液(100mMTris-HCl，pH8.0，0.5mMEDTA,pH8.0,1mMMgCl2，500mM蔗糖)加0.2mMPMSF中。通過離心收集團(tuán)粒并在環(huán)境溫度孵育10分鐘。再次將團(tuán)粒懸浮在冷的H20中，并在水上孵育5分鐘。將MgCl2以1mM的最終濃度添加到懸浮液中，再次離心懸浮液。如先前描述的收集上清液并層析[6]。遂#辨務(wù)--h的單層磷脂泡嚢(SUV)通過三種不同的方法制備。在所有三種方法中，在干燥氮?dú)饬髦懈稍锟偣?.6mmol的期望的脂質(zhì)混合物，隨后在高真空下額外干燥1小時(shí)以除去任何痕量的氯仿。除非另作說明，采用Bio-Bead法來制備磷脂泡嚢[17]。在這種情況下，再次將干燥的脂質(zhì)混合物懸浮在1mlHBS(20mMHEPES-NaOH緩沖液pH7.4，100mMNaCl，0.1。/。NaN3)加6mMC12E8f，在室溫下保持40分鐘。然后通過在室溫下孵育溶液與400mgBio-Beads1.5小時(shí)來除去CI2E8[17]。制備泡嚢的另外兩種方法是超聲處理和擠出。對(duì)于這兩種方法中的任一種，再次將干燥的脂質(zhì)混合物懸浮在1mlHBS中，得到2.6mM的最終脂質(zhì)濃度。然后在缸式超聲波儀(bathsonicator)中超聲處理混濁的脂質(zhì)懸浮液直到它們?cè)谝曈X上變得澄清從而產(chǎn)生SUV,或者使用AvestinLiposoFast泡嚢擠出機(jī)重復(fù)地通過100nm聚碳酸酯過濾器擠出。在所有情況下，脂質(zhì)混合物由變化數(shù)量的PS、DOGS-NTA-Ni、PE和產(chǎn)生等于2.6mmol總脂質(zhì)含量的足量PC組成。由20mol%PS和80mol%PC組成的SUV稱為PCPS。除非另作說明，含有5%PS、40%PE和變化數(shù)量的DOGS-NTA-Ni和PC的SUV被稱為Ni-脂質(zhì)，并通過它們的DOGS-NTA-Ni含量來指明。因而，15。/。Ni-脂質(zhì)是指含有5%PS、40%PE、15%DOGS-NTA-Ni和40%PC的SUV。凝j&活凝試浙——為了制備常規(guī)的凝血活酶試劑，如所描述的，以磷脂比rTF為8700:1的摩爾比將rTF重脂質(zhì)化到由20mol%PS、80mol%PC組成的磷脂泡囊中(rTF/PCPS)[17,23]。然后將rTF/PCPS制備物在TBSA(50mMTris-HCl緩沖液，pH7.5，100mMNaCl，0.1%牛血清白蛋白，0.1%NaN3)中稀釋到期望的最終rTF濃度。為了制備改變的凝血活酶試劑，將SUV與sTF或寡聚組氨酸標(biāo)記的sTF變體之一在TA(50mMTris-HCl緩沖液，pH7.5，0.1%牛血清白蛋白，0.1%NaN3)中稀釋到期望的濃度。P71凝潛為Vf——通過將50jil25mMCaCl2和50|il稀釋的凝血活酶試劑移液到血凝度計(jì)比色杯中并容許混合物加熱到37。C保持2分鐘，在ST4型血凝度計(jì)(DiagnosticaStago)中進(jìn)行PT分析。然后通過將50pl預(yù)熱的、混合的正常血漿移液到比色杯中來啟動(dòng)凝結(jié)，并記錄形成凝塊的時(shí)間。a尸7T凝結(jié)分浙——aPTT凝結(jié)分析也在ST4型血凝度計(jì)(DiagnosticaStago)中進(jìn)行。通過將50plaPTT試劑和50pl混合的正常血漿移液到血凝度計(jì)比色杯中并將混合物在37。C孵育3分鐘來進(jìn)行aPTT分析。然后將50pi預(yù)熱的25mMCaCb移液到比色杯中，記錄形成凝塊的時(shí)間。的f——通過生色分析測(cè)量因子Vila的酶活性來確定TF變構(gòu)活化因子Vila的能力。在HBSAC(HBS加0.1%牛血清白蛋白和5mMCalC12)中制備含有Vila和各種濃度的TF(或sTF)的反應(yīng)混合物。通過在平底96孔平板中添加生色底物Chromozymt-PA(ChtPA)來啟動(dòng)反應(yīng)。所有形式的TF的典型反應(yīng)條件都是15nMVIIa、0-50nMTF(rTF在PCPS泡嚢中重脂質(zhì)化；將sTF變體以50磷脂的最終濃度與磷脂泡嚢混合)，和HBSAC中的lmMChtPA，最終體積為100pl。在VERSAmax微平板讀數(shù)器(MolecularDevices)中在環(huán)境溫度監(jiān)視八4()5的變化，每30秒讀取讀數(shù)，持續(xù)20分鐘。潛合7F的&的Wi/J1——使用X活化速率的TF依賴性提高作為TF:VIIa復(fù)合物形成的指示來測(cè)量VIIa對(duì)各種形式的TF的結(jié)合親和性。通過采用Fiore"a/.的連續(xù)生色分析來測(cè)量X被TF:VIIa復(fù)合物的活化[9]。在HBSAC中制備含有Vila與rTF/PCPS或sTF+SUV的反應(yīng)混合物。通過向平底96孔平板中添加X和生色底物S-2222的混合物來啟動(dòng)反應(yīng)。在VERSAmax微平板讀數(shù)器(MolecularDevices)中在環(huán)境溫度監(jiān)視A4D5的變化，每15秒進(jìn)行采樣，持續(xù)20分鐘。如所描述的通過對(duì)八4()5數(shù)據(jù)擬合二階多項(xiàng)式來確定X活化的起始速率[9，24]。如所描述的[24]對(duì)速率數(shù)據(jù)擬合配體結(jié)合二次方程式來得到VIIa與TF結(jié)合的表觀KJ直。對(duì)于使用重脂質(zhì)化的rTF的實(shí)驗(yàn)，在HBSAC中含有0.25pMVila和20nMX的典型的反應(yīng)混合物與濃度增加的rTF/PCPS孵育。對(duì)于使用sTF的實(shí)驗(yàn)，改變反應(yīng)混合物以含有400pMVIIa、100PCPS泡嚢、20nMX和變動(dòng)的sTF濃度。對(duì)于使用寡聚組氨酸標(biāo)記形式的sTF的實(shí)驗(yàn)，改變反應(yīng)混合物以含有10pMVIIa、Ni-脂質(zhì)(50總脂質(zhì))、20nMX和變化濃度的寡聚組氨酸標(biāo)記的sTF變體。^"f^^炎器哞對(duì)凝塊形4的^f——在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將補(bǔ)充有50PCPS泡嚢的混合的正常血漿與各種數(shù)量的Ni-NTA珠子(NiSepharose6FastFlow)在TA中混合,并在37。C孵育3分鐘。將這種混合物的80(il等分量添加到平底96孔平板中的20pl預(yù)熱的(37。C)53mMCaCl2中。在VERSAmax微板讀數(shù)器中在37。C溫度監(jiān)視A4。5的變化持續(xù)20分鐘，每30秒進(jìn)行測(cè)量。達(dá)到半最大吸光度的時(shí)間被用作凝結(jié)時(shí)間。炎^7廟l資沐的^fI活/A。使用如下修改的不連續(xù)生色分析[4]在多孔平板中在環(huán)境溫度下測(cè)量X活化的起始速率HBSAC中的反應(yīng)混合物含有500pMVIIa、變動(dòng)的X以及PCPS中的4pMmembTF(加50pMPCPS)或4pMsTF-5AA-(His)6加50|iMNiPCPS。在變動(dòng)的時(shí)間，在4。C將20pl等分量轉(zhuǎn)移到含有100pl停止緩沖液I(40mMMes-NaOHpH5.8,12mMEDTA,50mMNaCl，0.25%TritonX-100，0.1%NaN3,0.0120/0防沫劑C)的96孔平板中。在將停止的反應(yīng)加熱到室溫之后，通過添加HBSAC中的60nl1.5mMSpectrozymeXa加0.6MTricine隱NaOHpH8.4并定量A405的變化來檢測(cè)Xa。通過與使用純化的Xa得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來確定產(chǎn)生的Xa數(shù)量。炎^^定的y^資的^子義活化。在環(huán)境溫度進(jìn)行所有步驟。在硼硅酸鹽玻璃試管中在柔和的干燥氮?dú)饬飨赂稍镏|(zhì)混合物來除去溶劑(氯仿)，然后以2mM的總脂質(zhì)濃度溶解在正己烷中。96孔聚苯乙烯平板(Costar卯18高結(jié)合力平板，Corning,Inc.,Coming,NY)的每個(gè)反應(yīng)孔容納60nmol總脂質(zhì)，容許己烷在通風(fēng)櫥中蒸發(fā)。然后用100|ilTBSA(50mMTris-HClpH7.5,100mM,0.02%NaN3，1%牛血清白蛋白)孵育反應(yīng)孔1小時(shí)，吸出并用TBS(沒有白蛋白的TBSA)洗滌三次。用HBSA(沒有4丐的HBSAC)中100[al指定濃度的sTF或sTF-5AA-(His)6孵育反應(yīng)孔1小時(shí)，吸出并用TBS洗滌三次。用HBSAC中的100^5pM因子Vila將育反應(yīng)孔1hr，之后通過添加100^1mMSpectrozymeXa底物和指定的X濃度HBSAC來啟動(dòng)反應(yīng)。確定A柳的變化，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來確定產(chǎn)生的Xa數(shù)量。西子打/《動(dòng)活化。基本上如所描述的測(cè)量VII自動(dòng)活化的速率[25]。等摩爾濃度的VII和TF(各15nM)在37。C在HBSAC中孵育。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將20(il等分量轉(zhuǎn)移到含有60^停止緩沖液II(O.lMTricine-NaOH,pH8.4，6.7mMCaCl2,0.1%牛血清白蛋白，0.1%TritonX-IOO，0.05%NaN3和100nMsTF)的96孔平板。添加20等分量的5mMChromozymt-PA底物，在環(huán)境溫度監(jiān)視A4Q5的變化。如所描述的確定二維二級(jí)速率常數(shù)(k2D)[25]。7F凝潛為、浙。在LowSaltTBSA(含有10mMNaCl而不是100mMNaCl的TBSA))中，使用PCPS、NiPCPS或NiPCPSPE脂質(zhì)體中的membTF來制備用于凝結(jié)分析的凝血活酶試劑，向所述LowSaltTBSA中額外添加合適的脂質(zhì)體來達(dá)到100的總脂質(zhì)濃度。含有sTF或sTF-5AA-(His)6的凝血活酶試劑類似地在LowSaltTBSA力a100PCPS、NiPCPS或NiPCPSPE脂質(zhì)體中制備。在STart4血凝度計(jì)(DiagnosticaStago,Parsippany,NJ)中進(jìn)行凝結(jié)分析。簡(jiǎn)要地，各自50(il等分量的25mMCaCl2和凝血活酶試劑在37。C在血凝度計(jì)比色杯中一同孵育120秒。然后添加50^等分量的預(yù)熱的集中的正常人類血漿，測(cè)量凝塊形成的時(shí)間。通過修改凝結(jié)分析來最后添加血漿，接觸途徑的活化被最小化，凝結(jié)時(shí)間取決于TF活性。TF活性的單位被定義為在最終的150)il凝結(jié)反應(yīng)中產(chǎn)生50秒凝結(jié)時(shí)間的TF的數(shù)量。炎^^定的廟^資的凝潛為Vi——首先在硼硅酸鹽玻璃試管中在柔和的干燥氮?dú)饬飨赂稍锫确轮械闹|(zhì)混合物來除去溶劑，之后將干燥的脂質(zhì)以0.3到5.3mM的總脂質(zhì)濃度重新溶解在正己烷中。完全的脂質(zhì)混合物被稱為NiPCPSPE,由10%DOGS-NTA-Ni、12.5%PS、30%PE和47.5%PC組成。還制備缺乏這些組分中的每一種組分的脂質(zhì)混合物用于對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其組成如下含有12.5%PS、30%PE和57.5°/。PC的PCPSPE;含有10%DOGS-NTA-Ni、12.5%PS和77.5%PC的NiPCPS*;以及含有12.5%PS和87.5%PC的PCPS。ST4比色杯的每個(gè)孔容納150W存在于己烷中的脂質(zhì)溶液(每個(gè)孔含有50到800nmol總脂質(zhì))。然后容許己烷在通風(fēng)櫥中在室溫下完全地蒸發(fā)。接下來，用TBS(50mMTris-HClpH7.5,100mMNaCl和0.02%NaNO洗滌反應(yīng)孔三次。然后每個(gè)反應(yīng)孔容納50|il存在于TA(50mMTris-HClpH7.5，0.1%BSA，0.1%NaN0中的指定濃度的sTF或sTF-5AA-(His)6的溶液，之后用石蠟封口膜覆蓋反應(yīng)孔，在室溫下孵育1小時(shí)。然后從比色杯上移除石蠟封口膜，將它們轉(zhuǎn)移到已經(jīng)預(yù)熱到37。C的STart4血凝度計(jì)上。每個(gè)反應(yīng)孔添加50^等分量的25mMCaCl2，將比色杯在37。C孵育2分鐘，之后添加50pl等分量的預(yù)熱的(37。C)混合的正常人類血漿，測(cè)量凝塊形成的時(shí)間。參考文獻(xiàn)1MorrisseyJH.TissuefactorandfactorVIIinitiationofcoagulation.In:ColmanRW,HirshJ,MarderVJ，ClowesAW，GeorgeJN,editors.HemostasisandThrombosis:BasicPrinciplesandClinicalPractice.Philadelphia:LippincottWilliams&Wilkins，2001:89-101.2CamererE，PrydzH.Notesonthecellbiologyoftissuefactor,//aewoytos^1996;26:25-30.3PaborskyLR，CarasIW,FisherKL,GormanCM.Lipidassociation,butnotthetransmembranedomain,isrequiredfortissuefactoractivity.Substitutionofthetransmembranedomainwithaphosphatidylinositolanchor.J"CTzem1991;266:21911-21916.4NeuenschwanderPF，MorrisseyJH.Rolesofthemembrane-interactiveregionsoffactorVilaandtissuefactor.ThefactorVilaGladomainisdispensableforbindingtotissuefactorbutimportantforactivationoffactorX.J飾/C/zem1994;269:8007-8013.5WaxmanE,RossJBA,LaueTM,GuhaA，ThiruvikramanSV，LinTC，KonigsbergWH，NemersonY.Tissuefactoranditsextracellularsolubledomain:TherelationshipbetweenintermolecularassociationwithfactorVilaandenzymaticactivityofthecomplex,j5/oc/z柳^^y1992;31:3998-4003.6RezaieAR，EsmonCT，MorrisseyJH.ExpressionandPurificationofRecombinantSolubleTissueFactor.UnitedStatespatent5,298,599.Theentirecontentsofthispatentareherebyincorporatedbyreference.7ShigematsuY,MiyataT,HigashiS,MikiT,SadlerJE,IwanagaS.ExpressionofhumansolubletissuefactorinyeastandenzymaticpropertiesofitscomplexwithfactorVila.J編CTzem1992'，267:21329-21337.8WaxmanE,LawsWR,LaueTM，NemersonY，RossJBA.HumanfactorVilaanditscomplexwithsolubletissuefactor:Evaluationofasymmetryandconformationaldynamicsbyultracentrifugationandfluorescenceanisotropydecaymethods.腸c/z醒'勿1993;32:3005-3012.9FioreMM,NeuenschwanderPF,MorrisseyJH.ThebiochemicalbasisfortheapparentdefectofsolublemutanttissuefactorinenhancingtheproteolyticactivitiesoffactorVila.CTzem1994;269:143-149.10RufW,RehemtullaA，MorrisseyJH,EdgingtonTS.Phospholipid-independentand-dependentinteractionsrequiredfortissuefactorreceptorandcofactorfunction.C7zew1991;266:2158-2166.11NeuenschwanderPF，MorrisseyJH.DeletionofthemembraneanchoringregionoftissuefactorabolishesautoactivationoffactorVIIbutnotcofactorfunction.Analysisofamutantwithaselectivedeficiencyinactivity.J編C/z纖1992;267:14477-14482.12NemersonY,RepkeD.TissuefactoracceleratestheactivationofcoagulationfactorVII:Theroleofabifunctionalcoagulationcofactor.T7zr函61985;40:351-358.13MorrisseyJH,MacikBG，NeuenschwanderPF，CompPC.QuantitationofactivatedfactorVIIlevelsinplasmausingatissuefactormutantselectivelydeficientinpromotingfactorVIIactivation.1993;81:734-744.14HirshJ，F(xiàn)usterV,AnsellJ，HalperinJLAmericanHeartAssociation/AmericanCollegeofCardiologyFoundationguidetowarfarintherapy.Ocw/加ow2003;107:1692-1711.15BaderR,MannucciPMM，TripodiA,HirshJ，KellerF,SollederEM，HawkinsP，PengM,PelzerH,TeijidorLM，RamirezIF,KoldeH-J.MulticentricevaluationofanewPTreagentbasedonrecombinanthumantissuefactorandsyntheticphospholipids,77zr畫6//aemos^1994;71:292-299.16TripodiA，ArbiniA,ChantarangkulV，MannucciPM.Recombinanttissuefactorassubstituteforconventionalthromboplastinintheprothrombintimetest.77zram6//ae歸W1992;67:42-45.17SmithSA，MorrisseyJH.Rapidandefficientincorporationoftissuefactorintoliposomes./7T^謹(jǐn)6/foe歸5t2004;2:1155-1162.18BannerDW，D'ArcyA，Ch6neC，WinklerFK,GuhaA，KonigsbergWH，NemersonY，KirchhoferD.ThecrystalstructureofthecomplexofbloodcoagulationfactorVilawithsolubletissuefactor.1996;380:41-46.19TerpeK.Overviewoftagproteinfusions:frommolecularandbiochemicalfundamentalstocommercialsystems.5/otec/Mo/2003;60:523-533.20DarstSA.Anewtwistonproteincrystallization./VocAto/爿cad<SW1998;95:7848-7849.21NeuenschwanderPF,Bianco-FisherE,RezaieAR,MorrisseyJH.PhosphatidylethanolamineaugmentsfactorVila-tissuefactoractivity:Enhancementofsensitivitytophosphatidylserine.B/oc/ze脂's^y1995;34:13988-13993.22MorrisseyJH,FakhraiH,EdgingtonTS.MolecularcloningofthecDNAfortissuefactor,thecellularreceptorfortheinitiationofthecoagulationproteasecascade.0〃1987;50:129-135.23SmithSA,MorrisseyJH.Propertiesofrecombinanthuman//a謹(jǐn)W2004;2:1610-1616.24FioreMM,NeuenschwanderPF,MorrisseyJH.Anunusualantibodythatblockstissuefactor/factorVilafunctionbyinhibitingcleavageonlyofmacromolecularsubstrates.1992;80:3127-3134.25NeuenschwanderPF,FioreMM,MorrisseyJH.FactorVIIautoactivationproceedsviainteractionofdistinctprotease-cofactorandzymogen-cofactorcomplexes.Implicationsofatwo-dimensionalenzymekineticmechanism.C7zem1993;268:21489-21492.26LauerSA,NolanJP.DevelopmentandcharacterizationofNi-NTA-bearingmicrospheres.Cytome^y2002;48:136-145.27CornellBA，KrishnaG，OsmanPD,PaceRD，WieczorekL.Tethered-bilayerlipidmembranesasasupportformembrane-activepeptides.SocTram2001'，29:613-617.28GemmellCH,TurittoVT，NemersonY.FlowasaregulatoroftheactivationoffactorXbytissuefactor.飾w/1988;72:1404-1406.29GemmellCH,NemersonY,TurittoV.Theeffectsofshearrateontheenzymaticactivityofthetissuefactor-factorVilacomplex.M/cravosc1990;40:327-340.30MorrisseyJH.Tissuefactor:anenzymecofactorandatruereceptor.77z謂Z7/7aewa^2001;86:66-74.31MassignonD,MoulsmaM，BondonP,DebizeG，AbidiH，ButtinT,BonC,PilloncheryG，CoeurP.Prothrombintimesensitivityandspecificitytomildclottingfactordeficienciesoftheextrinsicpathway:evaluationofeightcommercialthromboplastins,r/2rom61996;75:590-594.32KitchenS，JenningsI,WoodsTA，WalkerID，PrestonFE.Tworecombinanttissuefactorreagentscomparedtoconventionalthromboplastinsfordeterminationofinternationalnormalisedratio:athirty-three-laboratorycollaborativestudy.TheSteeringCommitteeoftheUKNationalExternalQualityAssessmentSchemeforBloodCoagulation.77z;x>w61996;76:372-376.33Kemball-CookG,GarnerI，ImanakaY，NishimuraT,O'BrienDP,TuddenhamEG,McVeyJH.High-levelproductionofhumanbloodcoagulationfactorsVIIandXIusinganewmammalianexpressionvector.Ge亂1994Feb25;/M0:275-9.34VanDenBesselaar,A.M.，Tripodi,A.，Poller,L.WHOguidelinesforthromboplastinsandplasmausedtocontroloralanticoagulationtherapy.Annex3.^^W//ea/AOg朋Tec/zWe/Ser1999;889:64-93.35Jeong,S.W.,O'Brien,D.F.J(>gC/em.2001Jul13;66(14):4799-802.36M.S.Kent，H.Yim,D.Y.Sasaki,J.Majewski,G.S.Smith,K.Shin,S.Satija,andB.M.Ocko丄awg畫,r2002;18(9)pp3754_3757.37Nilsson,J.,Persson，B.,andvonHeijne,G.(2005)Comparativeanalysisofaminoaciddistributionsinintegralmembraneproteinsfrom107genomes,7V她/似60，606-616.38Wallin，E，，andvonHeijne，G.(1998)Genome-wideanalysisofintegralmembraneproteinsfromeubacterial,archaean,andeukaryoticorganisms,7，1029-1038.39Jones,D.T.(1998)Dotransmembraneproteinsuperfoldsexist,Fi^S281-285.40Seddon，A.M.,Curnow,P.，andBooth,P.J.(2004)Membraneproteins,lipidsanddetergents:notjustasoapopera,歷0c/2/w.—.爿"a7<5(5<5，105-117.41Morrissey,J.H.(2001)in/Tewoy^whaw<iT7zrom6os7'5v5as7'c/V/w一/es<3"<iC〃m.ca/尸raWce(Colman，R.，Hirsh,J.,Marder，V.,Clowes,A.,andGeorge,J.，Eds.)pp89-101,LippincottWilliamsandWilkins.42Morrissey,J.H.，Neuenschwander,P.F.，Huang,Q.，McCallum,C.D.，Su,B.，andJohnson,A.E.(1997)FactorVila-tissuefactor:functionalimportanceofprotein-membraneinteractions,r/7r函6.Z/aewoW.7S,112-116.43Rezaie，A.R.,Fiore,M.M.，Neuenschwander,P.F.,Esmon，C.T.,andMorrissey,J.H.(1992)Expressionandpurificationofasolubletissuefactorfusionproteinwithanepitopeforanunusualcalcium-dependentantibody,尸rate/wP腦/j，453-460.44Linkins,LA.，andWeitz，J.L(2005)Newanticoagulanttherapy,Jmw.紐Md56,63-77.45Lazarus,R.A.,Olivero，A.G.,Eigenbrot，C.,andKirchhofer,D.(2004)InhibitorsofTissueFactor*FactorVilaforanticoagulanttherapy,CWr.A/oiCTze附."，2275-2290.46Kubalek，E.W.，LeGrice,S.F.,andBrown,P.0.(1994)Two-dimensionalcrystallizationofhistidine-tagged,HIV-1reversetranscriptasepromotedbyanovelnickel-chelatinglipid,/Sfrw".7/3,117-123.47Chikh，G.G.,Li，W.M.，Schutze-Redelmeier，M.P.,Meunier，J.C.，andBally，M.B.(2002)Attachinghistidine-taggedpeptidesandproteinstolipid-basedcarriersthroughuseofmetal畫ion-chelatinglipids,勿a"67，204-212.48Groves,J.T,，andDustin，M.L.(2003)Supportedplanarbilayersinstudiesonimmunecelladhesionandcommunication,J"/m扁wo/.Me//zo<is19-32.49Morrissey，J.H.，F(xiàn)air,D.S.，andEdgington，T.S.(1988)Mo薦lonalantibodyanalysisofpurifiedandcell-associatedtissuefactor,T7zr畫6.Wes.52，247-261.50Nakagaki，T.，F(xiàn)oster,D.C.,Berkner，K.L.，andKisiel,W.(1991)Initiationoftheextrinsicpathwayofbloodcoagulation:evidenceforthetissuefactordependentautoactivationofhumancoagulationfactorVII,&'oc/zem^^yM，10819-10824.51Gemmell，C.H.，Broze,G.J.,Jr"Turitto,V.T.，andNemerson,Y.(1990)Utilizationofacontinuousflowreactortostudythelipoprotein-associatedcoagulationinhibitor(LACI)thatinhibitstissuefactor,76,2266-2271.52Repke，D.,Gemmell,C.H.，Guha,A.，Turitto，V.T.，Broze,GJ.，Jr.，andNemerson,Y.(1990)Hemophiliaasadefectofthetissuefactorpathwayofbloodcoagulation:effectoffactorsVIIIandIXonfactorXactivationinacontinuous-flowreactor,/Voc.TVa"5W.t/.爿S7，7623-7627.權(quán)利要求1.一種凝血活酶試劑，包含(i)活化的sTF，(ii)金屬螯合脂質(zhì)，(iii)金屬離子，和(iv)磷脂。2.權(quán)利要求1的凝血活酶試劑，其中所述活化的sTF包含TF的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和具有至少2個(gè)組氨酸殘基的寡聚組氨酸部分。3.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的凝血活酶試劑，其中所述活化的sTF選自sTF(His)6、sTF-5AA-(His)6和sTF-2(His)5。4.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的凝血活酶試劑，進(jìn)一步包括(v)Ca^。5.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的凝血活酶試劑，進(jìn)一步包括(vi)因子VII。6.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的凝血活酶試劑，其中所述金屬離子選自Ni2+、Cu2+、Zn2+、Co2+和其混合物。7.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的凝血活酶試劑，其中所述金屬螯合脂質(zhì)是NTA-DOGS。8.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的凝血活酶試劑，其中所述磷脂包含PS。9.上迷權(quán)利要求中任一項(xiàng)的凝血活酶試劑，其中所迷寡聚組氨酸部分包含(His)n，其中n是2-10。10.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的凝血活酶試劑，進(jìn)一步包括(iv)Ca2+，和(v)因子VII，其中所述金屬螯合脂質(zhì)是NTA-DOGS，以及所述磷脂包含PC和PS。11.一種aPTT試劑，包含(i)金屬螯合劑，(ii)金屬離子，和(iii)磷脂。12.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的aPTT試劑，其中所述金屬螯合劑是金屬螯合脂質(zhì)。13.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的aPTT試劑，進(jìn)一步包含Ca"。14.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的aPTT試劑，其中所述金屬螯合脂質(zhì)是NTA-DOGS。15.活化的sTF。16.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的活化的sTF，包含TF的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和具有至少2個(gè)組氨酸殘基的寡聚組氨酸部分。17.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的活化的sTF，選自sTF(His)6、sTF-5AA-(His)6和sTF-2(His)5。18.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的活化的sTF，其中所述寡聚組氨酸部分包含(His、，其中n是2-10。19.一種組合的PT和aPTT測(cè)試試劑盒，包含(i)活化的sTF，(ii)金屬螯合脂質(zhì)，(iii)金屬離子，和(iv)磷脂。20.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合的PT和aPTT測(cè)試試劑盒，其中所述活化的sTF包含TF的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和具有至少2個(gè)組氨酸殘基的寡聚組氨酸部分。21.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合的PT和aPTT測(cè)試試劑盒，其中所述活化的sTF選自sTF(His)s、sTF-5AA-(His)6和sTF-2(His)5。22.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合的PT和aPTT測(cè)試試劑盒，進(jìn)一步包含Ca2+。23.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合的PT和aPTT測(cè)試試劑盒，進(jìn)一步包含因子VII。24.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合的PT和aPTT測(cè)試試劑盒，其中所述金屬離子選自Ni2+、Cu2+、Zn2+、C()2+和其混合物。25.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合的PT和aPTT測(cè)試試劑盒，其中所述金屬螯合脂質(zhì)是NTA-DOGS。26.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合的PT和aPTT測(cè)試試劑盒，其中所述磷脂包含PS。27.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合的PT和aPTT測(cè)試試劑盒，進(jìn)一步包含(iv)Ca2+，和(v)因子VII，其中所述金屬螯合脂質(zhì)是NTA-DOGS,以及所述磷脂包含PS和PC。28.—種用于促進(jìn)凝結(jié)的組合物，包含(i)金屬螯合劑，(ii)金屬離子，和(iii)任選地，包含TF的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和具有至少2個(gè)組氨酸殘基的寡聚組氨酸部分的活化的sTF。29.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用于促進(jìn)凝結(jié)的組合物，其中存在所述活化的sTF,并且所述活化的sTF選自sTF(His)6、sTF-5AA-(His)6和sTF-2(His)5,以及所述金屬螯合劑是金屬螯合脂質(zhì)。30.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用于促進(jìn)凝結(jié)的組合物，其中所述金屬螯合脂質(zhì)是NTA-DOGS。31.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用于促進(jìn)凝結(jié)的組合物，其中所述金屬離子選自N產(chǎn)、Cu2+、Zn2+、Cq2+和其混合物。32.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用于促進(jìn)凝結(jié)的組合物，其中所述組合物選自局部用組合物、鼻部噴霧、栓劑、嗽口水、可注射組合物、繃帶和傷口敷料。33.—種施用抗凝血藥物的方法，包含向需要的患者施用抗凝血藥物，以及測(cè)量使用上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的凝血活酶試劑的患者的凝結(jié)時(shí)間。34.—種確定患者是否具有出血特質(zhì)的方法，包括使用上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合的PT和aPTT測(cè)試試劑盒通過PT測(cè)試和aPTT測(cè)試來測(cè)量患者的凝結(jié)時(shí)間。35.—種停止或減緩傷口出血的方法，包括用上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物接觸來自所述傷口的血液。36.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的凝血活酶試劑，進(jìn)一步包含一種固相支持物，其中所述磷脂和所述金屬螯合脂質(zhì)位于所述固相支持物的表面上。37.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的凝血活酶試劑，進(jìn)一步包含固相支持物，其中所述磷脂和所述金屬螯合脂質(zhì)位于所述固相支持物的表面上。38.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的凝血活酶試劑，其中所述固相支持物包含聚苯乙烯。39.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的aPTT試劑，進(jìn)一步包含一種固相支持物，其中所述磷脂和所述金屬螯合脂質(zhì)位于所述固相支持物的表面上。40.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的aPTT試劑，進(jìn)一步包含固相支持物，其中所述磷脂和所述金屬螯合脂質(zhì)位于所述固相支持物的表面上。41.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的aPTT試劑，其中所述固相支持物包含聚笨乙蹄。42.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合的PT和aPTT測(cè)試試劑盒，進(jìn)一步包括(viii)固相支持物，其中所述磷脂和所述金屬螯合位于所述固相支持物的表面上。43.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的凝血活酶試劑，進(jìn)一步包含固相支持物，其中所述磷脂和所述金屬螯合脂質(zhì)位于所述固相支持物的表面上。44.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的凝血活酶試劑，其中所述固相支持物包含聚苯乙烯。45.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的aPTT試劑，其中所述金屬離子選自Ni2+、Cu2+、Zn2+、Co2+和其混合物。全文摘要一種凝血活酶試劑，包含(i)活化的sTF，(ii)金屬螯合脂質(zhì)，(iii)金屬離子，和(iv)磷脂?；罨膕TF優(yōu)選包含TF的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和具有至少2個(gè)，更優(yōu)選2-10個(gè)組氨酸殘基的寡聚組氨酸部分。優(yōu)選地，所述組氨酸殘基是連續(xù)的。金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域例如寡聚組氨酸標(biāo)簽連接至sTF的C-末端允許蛋白質(zhì)結(jié)合含有金屬螯合脂質(zhì)的磷脂泡囊。所述活化sTF和金屬螯合脂質(zhì)的金屬復(fù)合物具有sTF的所有期望的表達(dá)、處理和溶解性特性，并在血漿凝結(jié)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出可與重脂質(zhì)化rTF相比較的促凝血活性。而且，發(fā)現(xiàn)在有些情況下，Ni-脂質(zhì)本身是促凝血的，甚至在不存在活化sTF的情況下。進(jìn)一步的研究表明，Ni-脂質(zhì)是血液凝結(jié)的接觸途徑的有效活化劑。文檔編號(hào)G01N33/86GK101151533SQ200680010365公開日2008年3月26日申請(qǐng)日期2006年2月10日優(yōu)先權(quán)日2005年2月16日發(fā)明者埃米莉·凱賴斯泰什·沃特斯,詹姆斯·亨利·莫里西申請(qǐng)人:伊利諾斯大學(xué)理事會(huì)