專(zhuān)利名稱(chēng)：亞鐵離子診斷/測(cè)定試劑盒及亞鐵離子的濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種亞鐵離子診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè) 定亞鐵離子濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鐵和總鐵結(jié)合力在人體代謝過(guò)程中極為重要。鐵是人體正常生理過(guò)
程中不可缺少的物質(zhì)。人體含鐵約3 5g，其中70%存在于紅細(xì)胞血紅 蛋白中；25%分布在單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(即網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，肝、脾、 骨髓中鐵蛋白和含鐵血黃素)；4. 9％分布于肌紅蛋白、細(xì)胞色素、含 鐵的酶；0. 1 %為循環(huán)血漿中的鐵。
人體內(nèi)的鐵來(lái)源于食物，主要在十二指腸和小腸上部被吸收。體內(nèi) 鐵以鐵蛋白和含鐵血黃素形成貯存在骨髓、脾和肝臟內(nèi)。有少量鐵與 血漿轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，通過(guò)血漿輸送至各組織，被利用或被貯存。
血清鐵的測(cè)定主要是用分光光度法，其次是原子吸收法。后者由于 靈敏度不高及基底的干擾，比分光光度法可靠性差。分光光度法應(yīng)用 一類(lèi)含-N-C-C:N-結(jié)構(gòu)的生色原，與亞鐵形成五元環(huán)，產(chǎn)生紫紅色。 較早使用的有聯(lián)吡啶和紅移菲羅啉；近來(lái)多推薦靈敏度較高的亞鐵嗪。 此外，尚有應(yīng)用鉻天青S與高鐵的反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic
Colorimetric Method)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定亞鐵離子濃度的方法，同時(shí)， 本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的亞鐵離子診斷/測(cè)定試劑盒，采用該 試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行亞 鐵離子濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的 推廣應(yīng)用。
本發(fā)明亞鐵離子濃度測(cè)定方法原理如下
煙酸+輔酶+水煙酸脫氫酶/F^ 6-羥基煙酸+還原型輔酶 這種方法應(yīng)用需要亞鐵離子激活的煙酸脫氫酶(nicotinate dehydrogenase; nicotinic acid hydroxylase; EC 1.17.1.5)酶促反應(yīng)速率 比色法。煙酸脫氫酶酶解煙酸并同時(shí)將輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰) 還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型 輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度上升的 速度，可以測(cè)算亞鐵離子的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性?xún)煞矫婢C合考 慮，無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明亞鐵離子診 斷/測(cè)定試劑盒較為理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
煙酸 20 mmol/L
煙酸脫氫酶 12000 U/L
本發(fā)明的亞鐵離子診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、煙酸、煙酸脫氫酶。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、煙酸。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、煙酸脫氫酶。
輔酶、煙酸、煙酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試 劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。
試劑2
緩沖液、煙酸。
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、煙酸脫氫酶。
輔酶、煙酸、煙酸脫氫酶在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以 不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配 制成液體試劑，直接使用。
無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定亞鐵離子濃度的方法，其
輔酶可以是NADP+ 、 NAD+或thio- NAD+中的 一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例一
本實(shí)施例的亞鐵離子診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3 mmol/L
煙酸 20 mmol/L
煙酸脫氫酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C,反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)亞鐵離 子樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延 遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出亞鐵離 子的濃度大小。
實(shí)施例二
本實(shí)施例的亞鐵離子診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液100 mmol/L 穩(wěn)定劑50 mmol/L
輔酶3 mmol/L
煙酸 30 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑50 mmol/L
煙酸脫氫酶10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C,反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)亞鐵離 子樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5,反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上 升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約l分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出亞鐵離 子的濃度大小。
實(shí)施例三
本實(shí)施例的亞鐵離子診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括
試劑1
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
100mmol/L
穩(wěn)定劑
50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
煙酸 12 mmol/L
試劑3
(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
煙酸脫氫酶 24000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定亞鐵離子濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C， 反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波 長(zhǎng)405nm，被測(cè)亞鐵離子樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為 4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約l分鐘左右， 檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出亞鐵離 子的濃度大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí) 施例類(lèi)同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，釆用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分 析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種酶比色法的亞鐵離子的濃度測(cè)定方法，其方法原理如下煙酸+輔酶+水 煙酸脫氫酶/Fe2+ 6-羥基煙酶+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，測(cè)算出亞鐵離子的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種亞鐵離子診斷/測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20~~500 mmol/L穩(wěn)定劑50 mmol/L輔酶1-6 mmol/L煙酸1-50 mmol/L煙酸脫氫酶1000-80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述亞鐵離子診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、煙酸、煙酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述亞鐵離子診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、煙酸、煙酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑 1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、煙酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、煙酸脫氫酶組成。輔酶、煙酸、煙酸脫氫酶在試劑1或試劑 2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述亞鐵離子診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、煙酸、煙酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑 1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶組成；試劑2，由緩沖液、煙酸組成； 試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、煙酸脫氫酶組成。輔酶、煙酸、煙酸 脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。 6.根據(jù)權(quán)利要求2所述亞鐵離子診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還 包括穩(wěn)定劑1—4000mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法技術(shù)的亞鐵離子診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定亞鐵離子濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、煙酸、煙酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的速度，從而測(cè)算出亞鐵離子的濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過(guò)紫外/可見(jiàn)光分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果。
文檔編號(hào)G01N33/90GK101173951SQ20061009730
公開(kāi)日2008年5月7日 申請(qǐng)日期2006年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月30日
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