專利名稱：亞鐵離子診斷/測定試劑盒及亞鐵離子濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種亞鐵離子診斷/測定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定 亞鐵離子濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景鐵和總鐵結(jié)合力在人體代謝過程中極為重要。鐵是人體正常生理過程中不可缺少的物質(zhì)。人體含鐵約3 5g，其中70%存在于紅細(xì)胞血紅蛋白 中；25%分布在單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(即網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，肝、脾、骨髓中鐵 蛋白和含鐵血黃素)；4. 9%分布于肌紅蛋白、細(xì)胞色素、含鐵的酶；0. 1 %為循環(huán)血槳中的鐵。人體內(nèi)的鐵來源于食物，主要在十二指腸和小腸上部被吸收。體內(nèi)鐵 以鐵蛋白和含鐵血黃素形成貯存在骨髓、脾和肝臟內(nèi)。有少量鐵與血漿轉(zhuǎn) 鐵蛋白結(jié)合，通過血漿輸送至各組織，被利用或被貯存。血清鐵的測定主要是用分光光度法，其次是原子吸收法。后者由于靈 敏度不高及基底的干擾，比分光光度法可靠性差。分光光度法應(yīng)用一類含 -N-C-C-N-結(jié)構(gòu)的生色原，與亞鐵形成五元環(huán)，產(chǎn)生紫紅色。較早使用的 有聯(lián)吡啶和紅移菲羅啉；近來多推薦靈敏度較高的亞鐵嗪。此外，尚有應(yīng) 用鉻天青S與高鐵的反應(yīng)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測 定亞鐵離子濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的亞鐵離 子診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全 自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行亞鐵離子濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高， 因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。本發(fā)明亞鐵離子濃度測定方法原理如下順烏頭酸+水 烏頭酸酶 檸檬酸檸檬酸檸檬酸裂解酶乙酸+草酰乙酸草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶 L-蘋果酸+輔酶 這種方法應(yīng)用需要亞鐵離子激活的烏頭酸酶(aconitase ; EC4.2丄3) 酶(偶)聯(lián)檸檬酸裂解酶(citrate lyase ; EC4丄3.6)、蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase ; EC Ll.1.37)酶促反應(yīng)速率比色法。烏頭酸酶在亞鐵離 子激活下酶解順烏頭酸產(chǎn)生檸檬酸，再通過(偶)聯(lián)合檸檬酸裂解酶、蘋 果酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成 為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm 處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算 亞鐵離子的濃度大小。實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明亞鐵離子診斷/測定 試劑盒較為理想緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 還原型輔酶500 mmol/L0.25 mmol/L順烏頭酸 烏頭酸酶10 mmol/L 6000 U/L 12000 U/L蘋果酸脫氫酶 18000 U/L本發(fā)明的亞鐵離子診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、順烏頭酸、烏頭酸酶、檸檬酸裂解 酶、蘋果酸脫氫酶。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑-試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、順烏頭酸。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、烏頭酸酶、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶。 還原型輔酶、順烏頭酸、烏頭酸酶、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶在 試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加 水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、烏頭酸酶。還原型輔酶、順烏頭酸、烏頭酸酶、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶在 試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在 使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定亞鐵離子濃度的方法，其還 原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一本實(shí)施例的亞鐵離子診斷/測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 順烏頭酸 烏頭酸酶檸檬酸裂解酶 12000 U/L蘋果酸脫氫酶 18000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使 用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。500 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 6000 U/L在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸 光度1.8土0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測亞鐵離子樣 品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間 大約2分鐘左右，檢測時(shí)間3分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分 析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出亞鐵離子的 濃度大小。 實(shí)施例二本實(shí)施例的亞鐵離子診斷/測定試劑為雙試劑，包括試劑1三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶順烏頭酸100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 10 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L烏頭酸酶 6000 U/L檸檬酸裂解酶 蘋果酸脫氫酶12000U/L18000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8土0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測亞鐵離子樣 品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))， 延遲時(shí)間大約2分鐘左右，檢測時(shí)間3分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分 析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出亞鐵離子的 濃度大小。 實(shí)施例三本實(shí)施例的亞鐵離子診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L還原型輔 順烏頭酸0.25 mmol/L10 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L檸檬酸裂解酶12000U/L18000 U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑100mmol/L500 mmol/L烏頭酸酶6000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。測定亞鐵離子濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37-C，反應(yīng) 時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長 405nm，被測亞鐵離子樣品與試劑1 、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5， 反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約2分鐘左右，檢測時(shí)間3 分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分 析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出亞鐵離子的 濃度大小。申請人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實(shí)施例類 同，不另一一例舉?？傊?，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析 儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的亞鐵離子濃度測定方法，其方法原理如下順烏頭酸+水烏頭酸酶檸檬酸檸檬酸檸檬酸裂解酶乙酸+草酰乙酸草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶L-蘋果酸+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出亞鐵離子的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種亞鐵離子診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩(wěn)定劑 l一 4000mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L順烏頭酸 1——50mmol/L烏頭酸酶 1000——80000 U/L檸檬酸裂解酶 1000——80000 U/L蘋果酸脫氫酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述亞鐵離子診斷/測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、順烏頭酸、烏頭酸酶、擰檬酸裂解 酶、蘋果酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述亞鐵離子診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、順烏頭酸、烏頭酸酶、梓檬酸裂解 酶、蘋果酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原 型輔酶、順烏頭酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、烏頭酸酶、檸 檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶組成。還原型輔酶、順烏頭酸、烏頭酸酶、 檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述亞鐵離子診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、順烏頭酸、烏頭酸酶、檸檬酸裂解 酶、蘋果酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原 型輔酶、順烏頭酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、檸檬酸裂解酶、 蘋果酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、烏頭酸酶組成。還 原型輔酶、順烏頭酸、烏頭酸酶、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶在試 劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述亞鐵離子診斷/測定試劑盒，其特征在于還包 括穩(wěn)定劑14000 mmol/L或0.in/。-100。/c)體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸 銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的亞鐵離子診斷/測定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定亞鐵離子濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、順烏頭酸、烏頭酸酶、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑混合，使之發(fā)生酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出亞鐵離子的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101324622SQ20071002338
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司