專利名稱：鈉診斷/測定試劑盒及鈉的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鈉診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定鈉濃 度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血清中鈉離子含量(簡稱"血鈉")在臨床上有著非常重要的意義，
醫(yī)學(xué)上有三個決定水平，依次為水平1——115mmo1/1，水平2—— 135mmo1/1，水平3——150mmo1/1。當(dāng)患者血鈉濃度等于或低于水平1 時，可出現(xiàn)神志不清、疲勞、惡心、頭痛、嘔吐和厭食等癥狀，表明 機體內(nèi)水的比例大于鈉，應(yīng)采用相應(yīng)治療措施；當(dāng)血鈉濃度低于水平 2時，應(yīng)査找低鈉血癥的原因，進一步測定血清滲透壓、血鉀并進行 尿液分析，以確定診斷；當(dāng)血鈉濃度高于水平3時，應(yīng)檢査其它試驗 項目，尋找導(dǎo)致高鈉血癥的原因。
現(xiàn)有技術(shù)中測定鈉離子含量的常用方法有火焰光度計法、離子 選擇電極法、化學(xué)測定法、原子分光光度法、酶動力學(xué)法等。
火焰光度計法——1950年開始使用并一直沿用至今，可檢測血清、 尿液、腦脊液及胸腹水中的Na+和K+，是一種發(fā)射光譜分析法，其結(jié) 果準確可靠，廣為臨床采用。該方法分為內(nèi)標準法和外標準法兩種。 外標準法操作誤差較大， 一般不采用?，F(xiàn)在主要使用內(nèi)部標準法，即 向標本及標準液中加進相同濃度的內(nèi)部標準元素鋰或銫進行測定，操 作時，將含鋰的溶液作為稀釋液，同時測定K+、 Na+和Li+的濃度， 以標本與標準液的Na+7Li+與K"VLi+比值，計算Na+、 K+濃度。由于 血清稀釋倍數(shù)大，血清蛋白質(zhì)粘性的影響幾乎可以忽略不計。
離子選擇電極法——簡稱ISE法，是采用靈敏的特定專用電極， 在專用儀器上進行血清和尿等體液中的K+、 Na+的測定，因標本用量 少，快速準確，幾乎有取代其它方法的趨勢。其測定原理是，用離子 選擇電極與參比電極組合起來，浸泡在待測標本溶液中進行檢測。目 前已有的電極種類有①玻璃膜電極，感應(yīng)材料為玻璃薄膜，有PH 電極、K+電極和Na+電極；②固相膜電極，由難溶性金屬物質(zhì)加壓成 型，以固體膜或單日膜作為感應(yīng)膜，有C卜電極和F-電極；③液態(tài)膜 電極，將環(huán)氧樹脂或內(nèi)裝聚氯乙稀作為感應(yīng)膜，有C^+電極；④用纈 氨霉素膜制成的K+電極。上述電極均有一定的使用壽命，因為電極使 用一段時間后就會自動老化，有效期長短不一。目前離子選擇電極法 應(yīng)用也較為普遍，但是電極成本昂貴。
此外，化學(xué)測定法主要利用復(fù)環(huán)王冠化合物如穴冠醚或球冠醚， 作為離子載體進行測定。由于大環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)有空穴，分子內(nèi)部的氧原子 有未共用電子對可與金屬離子結(jié)合，根據(jù)空穴大小，可選擇性結(jié)合不 同直徑的金屬離子，從而達到測出離子濃度的目的；原子分光光度法 也可用于檢測血清中K+、 Na+，但操作繁雜，誤差較大，不及火焰光 度法簡便。
酶法測定鈉離子含量的方法，與火焰光度計法或離子選擇電極法 都有較好的一致性，這種方法抗干擾性強、穩(wěn)定性好，但用生化分析 儀不能同時測定鈉離子和鉀離子各自的含量，導(dǎo)致這種方法不能得到 推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計量/ 連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的 變化，得以測定鈉濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的鈉診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或 半、全自動生化分析儀上進行鈉濃度測定，而且測定速度快、準確度 高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明鈉濃度測定方法原理如下:
乳糖+水 β-半乳糖苷酶/N+ 葡萄糖+半乳糖
葡萄糖+腺苷三磷酸己糖激酶葡萄糖-6-磷酸
+腺苷二磷酸
葡萄糖-6-磷酸+輔酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶
葡糖酸內(nèi)酯磷酸+還原型輔酶
這個方法應(yīng)用需要鈉離子激活的(3-半乳糖苷酶(lactase ; EC 3.2丄108)酶(偶)聯(lián)己糖激酶(hexokinase; EC 2.7.1.1 ; EC2.7丄2)、 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase; EC 1 1.1.49 ) 酶促反應(yīng)速率比色法。β-半乳糖苷酶酶解乳糖反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖，再通 過(偶)聯(lián)合己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在 340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)， 從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量 340nm處吸光度上升的速度，可以測算鈉的濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明鈉診斷/測定 試劑盒較為理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L輔酶 3 mmol/L
乳糖 20 mmol/L
腺苷三磷酸 6 mmol/L
氯化鎂 6 mmol/L
P-半乳糖苷酶 10000 U/L
己糖激酶 10000 U/L
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 10000 U/L
本發(fā)明的鈉診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化鎂、P-半乳 糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化鎂。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、p-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸
脫氫酶。
輔酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化鎂、(3-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡 萄糖-6-磷酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以 是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直 接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸。 試劑2
緩沖液、乳糖、氯化鎂。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、(3-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸 脫氫酶。，
輔酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化鎂、p-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡 萄糖-6-磷酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試 劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定鈉濃度的方法，其輔酶可 以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的鈉診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100廳ol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
乳糖 20 mmol/L腺苷三磷酸6 mmol／L。氯化鎂6 mmol／L。p．半乳糖苷酶10000 U／L，己糖激酶10000 U／L，葡萄糖．6一磷酸脫氫酶1 0000 U／L。
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37~C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度≤O．1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鈉樣品與試劑的體積比例為1／25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鈉的濃度大小。實施例二本實施例的鈉診斷／測定試劑為雙試劑，包括試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100 mmol／L，穩(wěn)定劑50 mmol／L，輔酶3 mmol／L。乳糖10 mmol／L，腺苷三磷酸9 mmol／L，氯化鎂 3 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
P-半乳糖苷酶 16000 U/L
己糖激酶 16000 U/L
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 16000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時間10分鐘，起始
吸光度≤0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鈉樣品
與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5,反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，
延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化
分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鈉的濃
度大小。
實施例三
本實施例的鈉診斷/測定試劑為三試劑，包括: 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100 mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
腺苷三磷酸12 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
乳糖 30 mmol/L
氯化鎂 4 mmol/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
P-半乳糖苷酶 20000 U/L
己糖激酶 8000 U/L
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 8000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定鈉濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時 間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測鈉樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方 向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘 左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鈉的濃 度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用 。
權(quán)利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法的鈉的濃度測定方法，其方法原理如下乳糖+水 β-半乳糖苷酶/Na+ 葡萄糖+半乳糖葡萄糖+腺苷三磷酸 己糖激酶 葡萄糖-6-磷酸 +腺苷二磷酸葡萄糖-6-磷酸+輔酶 葡萄糖-6-磷酸脫氧酶 葡糖酸內(nèi)酯磷酸+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出鈉的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種鈉診斷/測定試劑盒，主要成分包括: 緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶 乳糖緩沖液20 500 mmolA。穩(wěn)定劑1--50 mmolA。輔酶1--6 mmolA，乳糖1--50 mmol／L。腺苷三磷酸112 mmol／L。氯化鎂1--10 mmol／L。β一半乳糖苷酶1 000--80000 U/L。
己糖激酶1000--80000 U/L。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶1 000--80000 U/L。
其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鈉診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化鎂、β-半乳糖 苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鈉診斷/測定試劑盒，其特征在于:由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化鎂、P-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化鎂組成；試劑2， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、β-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫 酶組成。輔酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化鎂、β-半乳糖苷酶、己糖 激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鈉診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化鎂、β-半乳糖 苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸組成；試劑2，由緩沖液、乳 糖、氯化鎂組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、β-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成。輔酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯 化鎂、β-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶在試劑l、 試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鈉診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1﹪-100﹪體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鈉診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定鈉濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、乳糖、腺苷三磷酸、氯化鎂、β-半乳糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出鈉的濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結(jié)果。
文檔編號G01N33/84GK101173930SQ20061009730
公開日2008年5月7日 申請日期2006年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月30日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司