專利名稱：含陽離子型生物相容性聚合物的傳感器酶膜及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于電化學生物傳感器及其制備技術領域，特別是涉及一種含陽離子型生物相容性聚合物的電化學生物傳感器酶功能敏感膜及其制備方法。
背景技術：
電化學生物傳感器是一門由生物、化學、物理、醫(yī)學、電子技術等多種學科互相滲透成長起來的高新技術，具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、能在復雜的體系中進行在線連續(xù)監(jiān)測的特點。電化學生物傳感器的高度自動化、微型化與集成化，減少了對使用環(huán)境和技術的要求，適合野外現(xiàn)場分析的需求，在生物、醫(yī)學、環(huán)境監(jiān)測、食品、醫(yī)藥及軍事等領域有著重要應用價值，已引起世界各國的極大關注。
通常生物物質(zhì)固定化后的活性決定著傳感器的靈敏度、穩(wěn)定性和使用壽命等性能，因此選擇具有良好生物相容性的酶載體來固定化酶是電化學生物傳感器研究中的重要內(nèi)容。聚合物材料具有良好的生物相容性，在電化學生物傳感器領域具有十分廣闊的應用前景。
在文獻(1)Anal.Chem.，2002，741597中，Arkady A.Karyakin等人用含有1％的全氟磺酸聚合物(Nafion)的乙醇-水(乙醇含量＞85％)混合溶液把葡萄糖氧化酶固定于沉積有普魯士藍的電極表面制成葡萄糖氧化酶膜，以該酶膜制作的電化學生物傳感器對葡萄糖響應的線性范圍為0.1μM～1mM，最低檢測限為0.1μM，靈敏度為0.05A M-1cm-2。
在文獻(2)Biosens.Bioelectron.，1996，11103中，Haiying Liu等人用聚酯磺酸聚合物(Eastman AQ)、牛血清蛋白和戊二醛把葡萄糖氧化酶固定在玻碳電極表面制成酶膜，以該酶膜制作的電化學生物傳感器對葡萄糖的響應時間＜40秒，表觀米氏常數(shù)為23.5mM。
在文獻(3)The Analyst，1998，1231995中，Qing Deng等人用接枝共聚物聚乙烯醇接枝-4乙烯吡啶把葡萄糖氧化酶固定在沉積有普魯士藍膜層的感光石墨電極表面，得到的生物傳感器對葡萄糖的響應時間＜20秒，線性響應范圍為5μM～4.5mM，最低檢測限為0.5μM，靈敏度為1.14mA M-1cm-2，表觀米氏常數(shù)為18±0.2mM。
以上用于固定化酶的聚合物的價格都非常昂貴，不利于所得電化學生物傳感器的商業(yè)化；另外，它們都帶有負電荷，屬于負離子型聚合物，不利于固定荷負電的生物活性物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含陽離子型生物相容性聚合物的電化學生物傳感器酶功能敏感膜及其制備方法。將價格低廉的新型陽離子型生物相容性聚合物引入到電化學生物傳感器敏感膜中，提供一種含陽離子型生物相容性聚合物的電化學生物傳感器酶功能敏感膜及其制備方法。利用陽離子型生物相容性聚合物帶有正電荷、具有良好的水溶性、水溶液具有適于酶生存的pH范圍、聚合物中含有大量氫鍵等特性，縮短傳感器的響應時間，擴大線性響應范圍，提高靈敏度及穩(wěn)定性等，從而提高傳感器的綜合性能指標。
本發(fā)明提供的含陽離子型生物相容性聚合物的電化學生物傳感器酶功能敏感膜，是由生物活性物質(zhì)、陽離子型生物相容性聚合物和高分子成膜物質(zhì)組成，其中生物活性物質(zhì)含量是0.1～5.0mg/cm2，陽離子型生物相容性聚合物為0.05～2.0mg/cm2，其余為高分子成膜物質(zhì)。
本發(fā)明所述的生物活性物質(zhì)為葡萄糖氧化酶、辣根過氧化酶、酪氨酸酶、細胞色素C、血紅蛋白、肌紅蛋白中的任意一種；所述的陽離子型生物相容性聚合物為陽離子纖維素(INCI編號聚季銨鹽-10)或瓜爾膠羥丙基三甲基氯化銨(INCI命名陽離子瓜爾膠)中的任意一種；所述的高分子成膜物質(zhì)為聚乙烯醇縮丁醛(PVB)、殼聚糖(Chitosan)中的任意一種。
本發(fā)明含陽離子型生物相容性聚合物的生物傳感器酶功能敏感膜的制備方法是將濃度為0.2％～2.0％(m/v)的陽離子型生物相容性聚合物的二次蒸餾水溶液與濃度為1～100mg/mL的生物活性物質(zhì)的二次蒸餾水溶液按體積比為1∶1～7∶1的比例混合均勻，將混合液5～20μL滴涂在潔凈的固體電極(Φ＝3～5mm)表面，在2～8℃冰箱中干燥10～30小時，然后將固體電極浸入到濃度為0.5～5.0％(m/v)的高分子成膜物質(zhì)溶液中保持1～20分鐘，用二次蒸餾水洗掉固定不牢固的酶，在2～8℃冰箱中放置10～30小時使溶劑全部揮發(fā)，即在固體電極表面形成一層含陽離子型生物相容性聚合物酶功能敏感膜。
上述的高分子成膜物質(zhì)溶液中聚乙烯醇縮丁醛的溶劑為無水乙醇，殼聚糖的溶劑為含質(zhì)量分數(shù)為0.5～2％的醋酸二次蒸餾水溶液；固體電極為玻碳電極、鉑盤電極、金盤電極中的一種。
本發(fā)明的效果可以從利用本發(fā)明含陽離子型生物相容性聚合物的葡萄糖氧化酶敏感膜制做的電化學生物傳感器看出。將含陽離子纖維素的葡萄糖氧化酶敏感膜修飾的玻碳電極作為工作電極，鉑絲電極作為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極組成葡萄糖氧化酶電化學生物傳感器。將葡萄糖氧化酶傳感器的三電極體系置于pH值為5.5～8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，采用CHI660B電化學工作站進行電化學表征。采用i-t法測試電極對β-D葡萄糖的電化學響應，由圖1可以看出，含陽離子纖維素的葡萄糖氧化酶敏感膜對β-D葡萄糖響應迅速，響應時間＜5秒，當信噪比為3時，檢出限為7.7μM；由校正曲線(圖2)得出該傳感器的線性范圍為0.07～13mM葡萄糖(線性相關系數(shù)0.9993)，靈敏度為4.54mA M-1cm-2；該傳感器具有良好的長期穩(wěn)定性，干態(tài)保存56天后電極對0.5mM葡萄糖的響應電流僅下降了25％，如圖3所示。
采用不同聚合物固定葡萄糖氧化酶制備的敏感膜的響應時間、線性范圍及表觀米氏常數(shù)等主要性能的對照見下表表1.不同聚合物固定葡萄糖氧化酶制備的敏感膜的性能比較

注表觀米氏常數(shù)越小說明酶與固定化載體的親和力越強，酶存在狀態(tài)越接近游離狀態(tài)，越有利于酶活的保持。
由表1可以看出，采用本發(fā)明方法制備的含陽離子纖維素的葡萄糖氧化酶敏感膜的線性范圍與文獻相當，但在響應時間和與酶之間的親和力方面明顯優(yōu)于文獻所用聚合物制備的酶敏感膜，并且本發(fā)明采用的陽離子型生物相容性聚合物更加廉價。此外，陽離子型生物相容性聚合物帶有正電荷，與帶負電荷的生物活性物質(zhì)之間有較強的靜電作用力，可以提高酶功能敏感膜的穩(wěn)定性。


圖1為本發(fā)明葡萄糖氧化酶電極的電流-時間響應曲線。其中，橫坐標-時間t(單位秒)，縱坐標-響應電流i(單位μA)。曲線A-含生物相容性聚合物的葡萄糖傳感器對葡萄糖做的電流-時間響應曲線，曲線B-其中一個階梯的放大圖。
圖2為本發(fā)明葡萄糖氧化酶電極的校正曲線。橫坐標-β-D葡萄糖濃度c(單位mM)，縱坐標-響應電流i(單位μA)，曲線A-校正曲線，曲線B-校正曲線的線性擬合。
圖3為本發(fā)明葡萄糖氧化酶電極的穩(wěn)定性曲線。橫坐標-時間t(單位天)，縱坐標-響應電流i(單位μA)。
具體實施例方式
實施例1第一步稱取10mg陽離子纖維素溶于1mL二次蒸餾水中配成濃度為1％(m/v)的溶液(pH＝5.8)；第二步稱取10mg的47U/mg葡萄糖氧化酶(等電點為4.9)溶于0.1mL二次蒸餾水中配成100mg/mL的酶溶液；第三步取10μL上述酶溶液與50μL上述陽離子纖維素溶液混合均勻得到混合液，取10μL混合液滴加在潔凈的玻碳電極(Φ＝3mm)表面，待其在4℃冰箱下自然晾干后，再將電極置于2％聚乙烯醇縮丁醛無水乙醇溶液中1分鐘，取出用二次蒸餾水沖洗掉固定不牢固的酶，在4℃冰箱中揮發(fā)掉溶劑，在固體載體表面形成一層含陽離子纖維素的復合酶功能敏感膜，其中生物活性物質(zhì)含量是2.4mg/cm2，陽離子型生物相容性聚合物為1.18mg/cm2，其余為高分子成膜物質(zhì)。用0.1M，pH＝7.0的磷酸鹽緩沖溶液沖洗電極，然后將修飾好的電極保存在4℃冰箱中。
以修飾玻碳電極為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，實驗溫度為25±1℃，測試體系為0.1M，pH＝7.0的磷酸緩沖溶液，用i-t法檢測電極對底物β-D葡萄糖的響應，該生物傳感器的響應時間小于5秒，根據(jù)信噪比大于3的原則，測得酶電極的最低檢測限為7.7μM葡萄糖；線性范圍為0.07～13M葡萄糖(線性相關系數(shù)0.9993)，靈敏度為4.54mAM-1cm-2；表觀米氏常數(shù)為1.48μM；電極穩(wěn)定性保持2個月以上。
實施例2第一步稱取15mg陽離子瓜爾膠溶于1mL二次蒸餾水中配成濃度為1.5％(m/v)的溶液(pH＝8.9)；第二步稱取10mg的250U/mg辣根過氧化酶(等電點為7.2)溶于1mL二次蒸餾水中配成10mg/mL的酶溶液；第三步取10μL上述酶溶液與60μL上述陽離子纖維素溶液混合均勻得到混合液，取15μL混合液滴加在潔凈的鉑盤電極(Φ＝5mm)表面，待其在4℃冰箱下自然晾干后，再將電極置于3％聚乙烯醇縮丁醛無水乙醇溶液中10分鐘。取出用二次蒸餾水沖洗掉固定不牢固的酶，6℃冰箱中揮發(fā)掉溶劑，在鉑盤電極表面形成一層含陽離子瓜爾膠的復合酶功能敏感膜，其中生物活性物質(zhì)含量是0.11mg/cm2，陽離子型生物相容性聚合物為0.98mg/cm2，其余為高分子成膜物質(zhì)。用0.1M，pH＝6.5的磷酸鹽緩沖溶液沖洗電極，然后將修飾好的電極保存在6℃冰箱中。
以修飾鉑盤電極為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，實驗溫度為25±1℃，測試體系為0.1M，pH＝6.5的磷酸緩沖溶液，用i-t法檢測電極對底物過氧化氫的響應，該生物傳感器的響應時間小于20秒，根據(jù)信噪比大于3的原則，測得酶電極最低檢測限為1.5μM過氧化氫；線性范圍為0.01～115.1mM(線性相關系數(shù)為0.99925)，靈敏度為1.54mAM-1cm-2；電極穩(wěn)定性保持2個月以上。
實施例3第一步稱取5mg陽離子瓜爾膠溶于1mL二次蒸餾水中配成濃度為0.5％(m/v)的溶液(pH＝8.0)；第二步稱取8mg血紅蛋白(等電點為7.0)溶于1mL二次蒸餾水中配成8mg/mL的酶溶液；第三步取10μL上述酶溶液與40μL上述陽離子瓜爾膠溶液混合均勻得到混合液，取8μL混合液滴加在潔凈的金盤電極(Φ＝3mm)表面，待其在4℃冰箱下自然晾干后，再將電極置于1％殼聚糖醋酸(1％m/v)溶液中5分鐘。取出用二次蒸餾水沖洗掉固定不牢固的酶，3℃冰箱下?lián)]發(fā)掉溶劑，在金盤電極表面形成一層含陽離子瓜爾膠的復合酶功能敏感膜，其中生物活性物質(zhì)含量是0.15mg/cm2，陽離子型生物相容性聚合物為0.45mg/cm2，其余為高分子成膜物質(zhì)。用0.1M，pH＝7.0的磷酸鹽緩沖溶液沖洗電極，然后將修飾好的電極保存在3℃冰箱中。
以修飾金盤電極為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，實驗溫度為25±1℃，測試體系為0.1M，pH＝6.5的磷酸緩沖溶液，用i-t法檢測電極對底物過氧化氫的響應，該生物傳感器的響應時間小于10秒，根據(jù)信噪比大于3的原則，測得酶電極最低檢測限為7.5μM過氧化氫；線性范圍為0.03～3.8mM(線性相關系數(shù)為0.9991)，靈敏度為0.835mAM-1cm-2；電極穩(wěn)定性保持2個月以上。
實施例4第一步稱取20mg陽離子纖維素溶于1mL二次蒸餾水中配成濃度為2％(m/v)的溶液(pH＝7.0)；第二步稱取8mg酪氨酸酶(等電點為5.6)溶于0.1mL二次蒸餾水中配成80mg/mL的酶溶液；第三步取10μL上述酶溶液與50μL上述陽離子纖維素溶液混合均勻得到混合液，取15μL混合液滴加在潔凈的玻碳電極(Φ＝5mm)表面，待其在4℃冰箱下自然晾干后，再將電極置于2％殼聚糖醋酸(2％m/v)溶液中7分鐘。取出用二次蒸餾水沖洗掉固定不牢固的酶，4℃冰箱下?lián)]發(fā)掉溶劑，在玻碳電極表面形成一層含陽離子纖維素的復合酶功能敏感膜，其中生物活性物質(zhì)含量是1.02mg/cm2，陽離子型生物相容性聚合物為1.27mg/cm2，其余為高分子成膜物質(zhì)。用0.1M，pH＝7.0的磷酸鹽緩沖溶液沖洗電極，然后將修飾好的電極保存在4℃冰箱中。
以修飾金盤電極為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，實驗溫度為25±1℃，測試體系為0.1M，pH＝7.0的磷酸緩沖溶液，用i-t法檢測電極對底物兒茶酚的響應，該生物傳感器的響應時間小于8秒，根據(jù)信噪比大于3的原則，測得酶電極最低檢測限為0.5μM兒茶酚；線性范圍為0.0005～0.16mM(線性相關系數(shù)為0.999)，靈敏度為6.35mAM-1cm-2；電極穩(wěn)定性保持2個月以上。
權利要求
1.一種含陽離子型生物相容性聚合物的酶功能敏感膜，其特征在于由生物活性物質(zhì)、陽離子型生物相容性聚合物和高分子成膜物質(zhì)組成，其中生物活性物質(zhì)含量是0.1～5.0mg/cm2，陽離子型生物相容性聚合物為0.05～2.0mg/cm2，其余為高分子成膜物質(zhì)；所述的生物活性物質(zhì)為葡萄糖氧化酶、辣根過氧化酶、酪氨酸酶、細胞色素C、血紅蛋白、肌紅蛋白中的任意一種；所述的陽離子型生物相容性聚合物為陽離子纖維素或瓜爾膠羥丙基三甲基氯化銨中的任意一種；所述的高分子成膜物質(zhì)為聚乙烯醇縮丁醛、殼聚糖中的任意一種。
2.一種制備如權利要求1所述的含陽離子型生物相容性聚合物的酶功能敏感膜的方法，其特征在于工藝步驟為將濃度為0.2％～2.0％(m/v)的陽離子型生物相容性聚合物的二次蒸餾水溶液與濃度為1～100mg/mL的生物活性物質(zhì)的二次蒸餾水溶液按體積比為1∶1～7∶1的比例混合均勻，將混合液5～20μL滴涂在潔凈的固體電極Φ＝3～5mm表面，在2～8℃冰箱中干燥10～30小時，然后將固體電極浸入到濃度為0.5～5.0％(m/v)的高分子成膜物質(zhì)溶液中保持1～20分鐘，用二次蒸餾水洗掉固定不牢固的酶，在2～8℃冰箱中放置10～30小時使溶劑全部揮發(fā)，在固體電極表面形成一層含陽離子型生物相容性聚合物的酶功能敏感膜。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于高分子成膜物質(zhì)溶液為聚乙烯醇縮丁醛溶液、殼聚糖溶液中的任意一種，聚乙烯醇縮丁醛溶液的溶劑為無水乙醇，殼聚糖溶液的溶劑為含質(zhì)量分數(shù)為0.5～2％的醋酸二次蒸餾水溶液。
4.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所用固體電極為玻碳電極、鉑盤電極、金盤電極中的一種。
全文摘要
含陽離子型生物相容性聚合物的電化學生物傳感器酶功能敏感膜及其制備方法，屬于電化學生物傳感器及其制備技術領域。該膜由陽離子型生物相容性聚合物、生物活性物質(zhì)及高分子成膜物質(zhì)組成。該敏感膜的制備方法是將陽離子型生物相容性聚合物與生物活性物質(zhì)分別配成溶液并均勻混合，然后滴涂于固體電極表面，待干燥后浸入高分子成膜物質(zhì)溶液中固定，揮發(fā)掉溶劑后在固體電極表面得到一層含陽離子型生物相容性聚合物的酶功能敏感膜。利用陽離子型生物相容性聚合物帶有正電荷、易溶于水、含有大量氫鍵等特性，可以縮短傳感器的響應時間，提高傳感器的靈敏度及穩(wěn)定性，從而提高傳感器的綜合性能指標。
文檔編號G01N27/30GK1885020SQ200610089578
公開日2006年12月27日 申請日期2006年7月4日 優(yōu)先權日2006年7月4日
發(fā)明者楊文勝, 楊秀雙, 段雪 申請人:北京化工大學