專利名稱：利用抗－robo1抗體診斷和治療癌癥的制作方法
交叉引用本發(fā)明涉及用于診斷和治療癌癥的方法和用于監(jiān)測肝炎惡化的方法，以及涉及細胞生長抑制劑和抗癌劑。
背景技術：
在果蠅的遺傳篩選研究中，ROBO1已鑒定為調(diào)節(jié)軸突中線交叉的分子，并且在后來的研究中已報道作為用于裂隙蛋白(Slit protein)的受體而起作用(Kidd等，Cell，92，205-215，1998，Wang等，Cell，96，771-784，1999，Kidd等，Cell，96，785-794，1999，Brose等，96，795-806，1999)。此外，關于ROBO1和癌癥之間的關系，在肺癌中，其中人ROBO1基因所在的染色體區(qū)域3p12為高度缺陷型的，而在乳腺癌和腎癌中，表達受到ROBO1啟動子區(qū)域甲基化等等的抑制，顯示腫瘤抑制基因可能性(Dallol等，Oncogene，21，3020-3028，2000)。實際上，氣管上皮細胞增生已通過缺失位于ROBO1N-末端的第一個免疫球蛋白區(qū)域而在小鼠中觀察到，其類似于肺癌患者中確定的ROBO1基因的最小缺陷(Xian J等，PNAS，98，15062-15066，2001)。此外，還報道ROBO1在癌新血管中表達，以及，其，在癌細胞側面上作為ROBO1的配體的Slit2提高的表達誘導癌的新血管形成，逆向指導癌的生長(Wang等，Cancer Cell，4，19-29，2003)。
其間，根據(jù)作為ROBO1配體的Slit2基因表達也在許多癌癥類型中受甲基化等等抑制的事實，以及通過強迫Slit2表達或通過提高Slit2在肺癌細胞、乳腺癌細胞和大腸癌細胞中觀察到生長抑制作用以及凋亡誘導作用的事實，Slit2，其為ROBO1的配體，也認為是腫瘤抑制基因(Dallol等，Cancer Research，62，5874-5880，2002，Dallol等，CancerResearch，63，1054-1058，2003)。然而，在該報告中，實際上Slit2的細胞生長抑制作用通過哪個受體發(fā)生并不清楚，使得ROBO1和癌癥之間的關系也不完全清楚。
在作為日本死亡主要原因的癌癥死亡當中，原發(fā)肝細胞癌，2001年在男性中占據(jù)第三位(13％)而在女性中占據(jù)第四位(9.0％)，是一種具有預后不良的癌癥類型(摘自″Population Dynamics Statistics″，Statistics and Information Department，Minster′s Secretariat，Ministry ofHealth，Labour[A3]和Welfare)。由于病毒感染慢性患者每年都在增長以及其中許多病例引起肝硬化，和隨后引起肝細胞癌，對在從肝硬化至肝細胞癌的階段早期的診斷方法以及對肝細胞癌的治療存在非常強的需求，并且認為沒有突破性的解決方法，則在未來的10至15年中死亡數(shù)量將有遞增的趨勢。
關于肝細胞癌診斷方法，在基于如GOP/GTP、堿性磷酸酶、白蛋白等等或腫瘤標志物AFP(α-甲胎蛋白)的血清值生化數(shù)據(jù)的綜合評價以及診斷圖象，如有必要，通過針刺活檢取得少量組織碎片后，基于病理判斷證實該診斷。目前，腫瘤標志物尤其用于肝細胞癌的診斷，并且雖然其中最常用的甲胎蛋白(AFP)的陽性率對肝細胞癌患者為6至7％，其有時對慢性肝病患者或懷孕女性也是陽性的。此外，雖然肝癌腫瘤標志物PIVKA-II的陽性率稍低于50％，對肝細胞癌的特異性認為高于AFP，使得目前實際上主要為這兩種檢查。不論那種情況，由于假陽性或雙陰性情況的存在，期待具有高特異性的腫瘤標志物的存在。
通過針刺活檢收集的樣品的組織學檢查為證實肝臟疾病診斷的重要檢查。尤其，由于所收集的量可能是有限的，需要有更明確的診斷技術。期待開發(fā)針對肝癌-特異性表達的抗原的抗體，如允許不只是鑒定病理特征，而且從非-癌組織早期鑒定肝細胞癌。
在肝臟疾病診斷和監(jiān)測的現(xiàn)狀中轉變至炎癥、纖維化以及惡性轉化經(jīng)由多種標志物的檢查和活檢的檢查而診斷。在許多肝癌患者中，從病毒感染轉變至肝炎、慢性肝炎、肝硬化并且隨后至肝癌。因此，允許進行肝臟疾病診斷和監(jiān)測的方法的發(fā)展不僅在保健經(jīng)濟中，而且在減輕患者負擔和獲得準確的醫(yī)療指導中是有用的。
關于肝細胞癌的治療，許多醫(yī)療設施主要集中在三種治療上外科切除，經(jīng)導管動脈栓塞術治療和經(jīng)皮乙醇注射治療。各種方法都有利弊，并且即使選擇經(jīng)導管動脈栓塞術治療，其具有相對廣泛的應用范圍和存活率的優(yōu)點，目前認為完全治愈的比率在10％的水平，使得這種情況下對新治療有著巨大需求。
雖然對肝細胞癌還沒有臨床場所的應用實例，在乳腺癌或淋巴瘤等等中，經(jīng)由針對癌特異性腫瘤抗原的單克隆抗體的靶向治療，響應速率已通過不同于化療劑常規(guī)治療的作用機理而得到提高。關于這些抗體藥物的作用機理，利用經(jīng)效應細胞的抗體依賴的細胞毒性(ADCC)或經(jīng)補體的補體-依賴的細胞毒性(CDC)，以及通過該抗體本身功能的激動劑作用，或該抗體的中和能力。目前，由于分子治療已在臨床場所中開始應用，認為在將來對應用這些分子治療以及針對靶向腫瘤特異性表達的分子的肝癌細胞的抗體藥物治療的期望是巨大的。
下列為相關的現(xiàn)有技術文獻WO99/20764；WO98/48051；WO01/46697；WO03/29488；WO01/00828；WO01/57207；WO01/92581；WO02/04514；WO02/14500；WO02/29103。
概要本發(fā)明的目的為提供用于診斷和治療癌癥的新方法，以及新的細胞生長抑制劑和抗癌劑，并且此外提供用于診斷和監(jiān)測肝臟疾病的方法。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)ROBO1在癌細胞如肝細胞癌、肺癌、乳腺癌、子宮癌、胃癌、腦腫瘤、大腸癌等等中高表達。此外，他們發(fā)現(xiàn)當測量抗-ROBO1抗體的補體-依賴的細胞毒性(CDC)時，該抗-ROBO1抗體具有針對表達ROBO1的細胞的CDC活性。其間，他們發(fā)現(xiàn)血液中ROBO1的濃度隨著肝臟疾病的惡化而提高。根據(jù)上述觀察，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)抗-ROBO1抗體在ROBO1的表達提高的癌癥，首先為肝細胞癌的診斷、預防和治療中的有效性，并且此外發(fā)現(xiàn)用于診斷和監(jiān)測肝臟疾病的方法，而完成本發(fā)明。
本發(fā)明提供了以ROBO1蛋白的檢測為特征的癌癥診斷方法。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選檢測ROBO1蛋白的胞外區(qū)。此外，本發(fā)明的方法優(yōu)選利用識別ROBO1蛋白的抗體進行。優(yōu)選在本發(fā)明的中，檢測血液、血清或血漿中的ROBO1蛋白或分離自細胞的ROBO1蛋白。
在另一個方面，本發(fā)明提供癌癥的診斷方法，包括下列步驟(a)從受試者收集樣品的步驟和(b)檢測包含在所收集樣品中的ROBO1蛋白的步驟。
在另一個方面，本發(fā)明提供用于診斷癌癥的試劑盒，包含結合ROBO1蛋白的抗體。優(yōu)選，癌癥為肝細胞癌。此外優(yōu)選在本發(fā)明的試劑盒中，抗體為結合ROBO1蛋白胞外區(qū)的抗體。
在另一個方面，本發(fā)明提供包含作為有效成分的結合ROBO1的抗體的藥物組合物。此外，本發(fā)明提供包含作為有效成分的結合ROBO1的抗體的細胞生長抑制劑。此外，本發(fā)明提供包含作為有效成分的結合ROBO1的抗體的抗癌劑。優(yōu)選，結合ROBO1的抗體為具有細胞毒性的抗體。此外，優(yōu)選癌癥為肝細胞癌。
此外在另一個方面，本發(fā)明提供用于治療由異常的細胞生長引起的疾病的方法，包括將包含作為有效成分的結合ROBO1的抗體的藥物組合物施予需要治療的患者。此外本發(fā)明提供用于治療癌癥的方法，包括將包含作為有效成分的結合ROBO1的抗體的藥物組合物施予需要治療的患者。優(yōu)選，癌癥為肝細胞癌。
在另一個方面，本發(fā)明提供通過將表達ROBO1的細胞與結合ROBO1的抗體接觸而誘導引入表達ROBO1的細胞的細胞損傷的方法。此外，本發(fā)明提供通過將表達ROBO1的細胞與結合ROBO1的抗體接觸而抑制表達ROBO1的細胞的生長的方法。優(yōu)選，結合ROBO1的抗體為具有細胞毒性的抗體。此外優(yōu)選，表達ROBO1的細胞為癌細胞。
此外在另一個方面，本發(fā)明提供結合ROBO1并且具有針對表達ROBO1的細胞的細胞毒性的抗體。
此外在另一個方面，本發(fā)明提供用于監(jiān)測肝炎惡化的試劑盒，包含抗-ROBO1抗體。優(yōu)選該抗-ROBO1抗體為特異性識別ROBO1的抗體。優(yōu)選本發(fā)明的試劑盒預測從肝炎或肝硬化至肝癌的轉變。在優(yōu)選的方面，本發(fā)明的試劑盒包含固定于支持物上的第一抗-ROBO1抗體和用標記物標記的第二抗-ROBO1抗體。
此外在另一個方面，本發(fā)明提供用于監(jiān)測肝炎惡化的方法，其測量檢驗樣品中的ROBO1。優(yōu)選，檢驗樣品中的ROBO1利用抗-ROBO1抗體測量。優(yōu)選該抗-ROBO1抗體為特異性識別ROBO1的抗體。此外優(yōu)選檢驗樣品為血液、血清或血漿。優(yōu)選本發(fā)明的監(jiān)測方法預測從肝炎或肝硬化至肝癌的轉變。在優(yōu)選的方面，本發(fā)明的監(jiān)測方法利用固定于支持物上的第一抗-ROBO1抗體和用標記物標記的第二抗-ROBO1抗體進行。


圖1顯示利用基因芯片U133的ROBO1基因表達分析的結果。圖1a正常組織/非-癌部位中的ROBO1基因表達分析；圖1b臨床樣品中的ROBO1基因表達分析；圖1c-癌細胞系中的基因表達分析；
圖2顯示利用基因芯片U95的ROBO1基因表達分析的結果。
圖3顯示通過全長ROBO1基因的瞬時表達的COS7細胞和HEK293細胞裂解物Western分析的結果，以及其培養(yǎng)物上清的Western分析的結果；圖4顯示在肝癌細胞系裂解物中利用抗-ROBO1單克隆抗體A7241A的Western分析結果；圖5顯示對肝細胞癌石蠟制備物利用抗-ROBO1單克隆抗體A7241A的免疫組織染色分析的結果；圖6顯示對患者血清中可溶的ROBO1利用抗-ROBO1單克隆抗體A7261A的Western分析結果；圖7顯示在強制表達全長ROBO1基因的HEK293細胞裂解物中利用sROBO1免疫的兔血清的Western分析結果；圖8顯示在強制表達全長ROBO1基因的HEK293細胞裂解物中利用sROBO1免疫的兔血清的FACS分析結果；圖9顯示在HepG2細胞裂解物中利用sROBO1免疫的兔血清的FACS分析結果；圖10顯示利用兔抗-sROBO1抗體的酶免疫分析的ROBO1測量的標準曲線；圖11顯示ROBO1濃度和肝臟疾病嚴重程度之間的相互關系；圖12顯示肝臟疾病患者ROBO1濃度的變化；圖13顯示抗-ROBO1抗血清針對表達ROBO1-的HEK293細胞的CDC活性的測量結果；圖14顯示抗-ROBO1單克隆抗體針對表達ROBO1的HEK293細胞的CDC活性的測量結果；圖15顯示抗-ROBO1單克隆抗體針對表達ROBO1的Alexander細胞的CDC活性的測量結果；和圖16顯示抗-ROBO1單克隆抗體針對表達ROBO1的HEK293細胞的ADCC活性的測量結果。
詳細說明本發(fā)明的方法通過ROBO1蛋白的檢測表征。ROBO1(Roundabout1)為軸突指導受體蛋白，其氨基酸序列和編碼其的基因序列已以變體1的GenBank ID NM_002941(SEQ.ID9和10)和變體2的GenBankID NM_133631(SEQ.ID11和12)公開。本發(fā)明中，ROBO1蛋白用來包括全長蛋白質(zhì)和其片段。片段為包含ROBO1蛋白質(zhì)任何區(qū)域的多肽，并且可能不具有天然ROBO1蛋白的功能。片段的實例不受限制，并且可引用包含ROBO1蛋白胞外區(qū)的片段。ROBO1蛋白的胞外區(qū)相當于SEQ.ID11氨基酸序列中的1-859位。此外，跨膜區(qū)域相當于SEQ.ID11氨基酸序列中的860-880位(Sundaresan，等，Molecular andCellular Neuroscience 11，29-35，1998)。
本發(fā)明中，在肝細胞癌中發(fā)現(xiàn)ROBO1的表達以非常高的頻率在基因水平和蛋白質(zhì)水平得到促進。此外，根據(jù)臨床樣品和其他癌種類癌細胞系的分析，表達得到促進的可能性不僅在肝細胞癌中，而且在肺癌、乳腺癌、子宮癌、胃癌、腦腫瘤、大腸癌等等中呈現(xiàn)。另外，顯示利用ROBO1的特異性單克隆抗體的免疫組織診斷是可能的。另外，發(fā)現(xiàn)ROBO1在體內(nèi)發(fā)生脫落(shedding)排出，以及可溶的ROBO1(sROBO1)存在于癌癥患者的血液中。也就是說，sROBO1可用作為癌癥的血清診斷標志物。
ROBO1的檢測雖然本發(fā)明中檢測的ROBO1蛋白優(yōu)選為人ROBO1蛋白，任何ROBO1都是可以的，而沒有限制，如犬ROBO1、貓ROBO1、小鼠ROBO1和倉鼠ROBO1。
本發(fā)明中，檢測包括定量或非-定量檢測，并且例如非-定量檢測的實例包括僅關于ROBO1蛋白是否存在的測量，關于給定量或更多量的ROBO1蛋白是否存在的測量，ROBO1蛋白量與其他樣品(例如，對照樣品等)的量相比的測量等等，而定量檢測的實例包括ROBO1蛋白濃度的測量，ROBO1蛋白量的測量等等。
雖然檢驗樣品不受特別限制，只要其為可能包含ROBO1蛋白的樣品，但優(yōu)選收集自活生物體如哺乳動物的樣品，并且更優(yōu)選收集自人的樣品。具體的檢驗樣品實例包括例如，血液、間質(zhì)組織液體、血漿、血管外液體、腦脊液、滑膜液、胸膜液、血清、淋巴、唾液、尿等等，優(yōu)選血液、血清或血漿。另外，本發(fā)明的檢驗樣品也包括獲自例如細胞培養(yǎng)液的檢驗樣品的樣品，這些細胞收集自活生物體。
所診斷的癌癥并不特別受限制且可以是任何癌癥，并且具體地可引用肝癌、胰腺癌、肺癌、大腸癌、乳腺癌、腎癌、腦腫瘤、子宮癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤等等。優(yōu)選肝癌，尤其優(yōu)選肝細胞癌。
本發(fā)明中，當在檢驗樣品中檢測ROBO1蛋白時，如果測定檢驗樣品中檢測的ROBO1蛋白的量與陰性對照或健康受試者相比很大，該受試者確定為患有癌癥或具有發(fā)展癌癥的高可能性。
另外，肝臟疾病的惡化可通過測量肝臟疾病患者的ROBO1蛋白濃度而監(jiān)測。
通過由細胞釋放并且存在于血液中的ROBO1蛋白的檢測表征的診斷方法可引用作為本發(fā)明診斷方法的優(yōu)選方式。尤其優(yōu)選包含存在于血液中的ROBO1蛋白胞外區(qū)的片段的檢測。
雖然用于檢測檢驗樣品中包含的ROBO1蛋白的方法并無特別的限制，優(yōu)選通過利用抗-ROBO1抗體的免疫方法的檢測。免疫方法的實例包括例如，放射免疫測定法、酶免疫測定法、熒光免疫測定法、發(fā)光免疫測定法、免疫沉淀方法、免疫比濁法、蛋白質(zhì)印跡、免疫染色、免疫擴散法等等，優(yōu)選酶免疫測定法，并且尤其優(yōu)選酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)(例如，夾心ELISA)。上述免疫方法，如ELISA，可由本領域技術人員根據(jù)熟知的方法進行。
例如，通過將抗-ROBO1抗體固定于支持物上，添加檢驗樣品至此，進行溫育以使抗-ROBO1抗體和ROBO1蛋白結合，隨后進行洗滌，并且檢測通過抗-ROBO1抗體結合至支持物的ROBO1蛋白而檢測檢驗樣品中ROBO1蛋白的方法可用作利用抗-ROBO1抗體的常規(guī)檢測方法。
本發(fā)明中用于固定抗-ROBO1抗體的支持物的實例可包括例如，不溶的多糖如瓊脂糖和纖維素，合成樹脂如硅樹脂、聚苯乙烯樹脂、聚丙烯酰胺樹脂、尼龍樹脂和聚碳酸酯樹脂，以及不溶的支持物如玻璃。這些支持物可以如珠或平板的形式利用。在珠的情況下，可利用用此珠填充的柱等。在平板的情況下，可利用多孔平板(96-孔多孔平板等)，生物傳感器芯片等等。關于抗-ROBO1抗體與支持物的結合，通過通常利用如化學鍵或物理吸附方法的結合是可能的。市場上可買到的支持物可用于所有這些支持物。
抗-ROBO1抗體和ROBO1蛋白的結合通常在緩沖溶液中進行。例如，磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液溶液、檸檬酸緩沖溶液、硼酸鹽緩沖溶液、碳酸鹽緩沖溶液等等用作緩沖溶液。另外，關于溫育條件，在經(jīng)常使用的條件例如4℃至室溫下進行1小時至24小時的溫育。溫育后的洗滌可以是任意的，只要其不阻止ROBO1蛋白和抗-ROBO1抗體的結合，并且例如使用含有表面活性劑如Tween20等的緩沖溶液。
在本發(fā)明的ROBO1蛋白檢測方法中，除檢驗樣品外可設立對照樣品，檢驗樣品中需要ROBO1蛋白的檢測。對照樣品的實例包括不含有ROBO1蛋白的陰性對照樣品以及包含ROBO1蛋白的陽性對照樣品等。在這種情況下，可通過與從不含ROBO1蛋白的陰性對照樣品獲得的結果以及從含有ROBO1蛋白的陽性對照樣品獲得的結果作比較而在檢驗樣品中檢測ROBO1蛋白。另外，可制備具有濃度變化梯度的一系列對照樣品，獲得作為數(shù)值的每一對照樣品的檢測結果，構建標準曲線，并且基于標準曲線，根據(jù)檢驗樣品的數(shù)值定量檢測檢驗樣品中含有的ROBO1蛋白。
利用用標記物標記的抗-ROBO1抗體的方法可用作檢測通過抗-ROBO1抗體結合至支持物的ROBO1蛋白的優(yōu)選方式。例如，檢驗樣品與固定在支持物上的抗-ROBO1抗體接觸，并且洗滌后利用特異性識別ROBO1蛋白的標記的抗體進行檢測。
抗-ROBO1抗體的標記可通過通常已知的方法進行。本領域技術人員熟知的標記物質(zhì)可用作標記物，如熒光染料、酶、輔酶、化學發(fā)光物質(zhì)和放射性物質(zhì)，并且具體的實例包括放射性同位素(32P、14C、125I、3H、131I等等)、熒光素、羅丹明、丹磺酰氯、傘形酮、螢光素酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、辣根過氧化酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖類氧化酶、微過氧化物酶、生物素等等。當利用生物素作為標記物時，添加生物素化的抗體后，優(yōu)選進一步添加與酶如堿性磷酸酶偶聯(lián)的親和素親和素蛋白。眾所周知的方法可用于標記物和抗-ROBO1抗體的結合，如戊二醛方法、馬來酰亞胺方法、吡啶基二硫化物方法和高碘酸方法。
具體地，含有抗-ROBO1抗體的溶液添加至支持物如平板以將抗-ROBO1抗體固定在支持物上。洗滌平板后，其用例如BSA、明膠、白蛋白等封閉以阻止蛋白質(zhì)的非特異性結合。再次洗滌平板，將檢驗樣品添加至該平板。溫育后，洗滌該平板，并且添加標記的抗-ROBO1抗體。在充分溫育后，洗滌平板并且檢測保留在平板上的標記的抗-ROBO1抗體。檢測可通過本領域技術人員熟知的方法進行，并且例如在通過放射性物質(zhì)標記的情況下，檢測可通過液體閃爍或RIA方法進行。在通過酶標記的情況下，添加底物并且可利用光度計檢測到該底物的酶催化修飾例如顏色。具體的底物實例包括2，2-偶氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、1，2-苯二胺(鄰苯二胺)、3，3’，5，5’-四甲苯(TMB)等等。在熒光物質(zhì)的情況下檢測可利用分光熒光計。
利用生物素-標記的抗-ROBO1抗體和親和素蛋白的方法可用作本發(fā)明ROBO1蛋白檢測方法的特別優(yōu)選的方式。
具體地，含有抗-ROBO1抗體的溶液添加至支持物如平板以將抗-ROBO1抗體固定在支持物上。洗滌平板后，用例如BSA、膠質(zhì)、白蛋白等封閉以阻止蛋白質(zhì)的非特異性結合。再次洗滌平板，檢驗樣品添加至該平板。溫育后，洗滌該平板，并且添加生物素化的抗-ROBO1抗體。充分溫育后，洗滌平板，并且添加與酶如堿性磷酸酶或過氧化物酶偶聯(lián)的親和素蛋白。溫育后，洗滌平板，添加對應于偶聯(lián)至親和素蛋白的酶的底物，并且用作為指示的該底物的酶催化修飾等檢測ROBO1蛋白。
利用一種或多種特異性識別ROBO1蛋白的一抗以及一種或多種特異性識別一抗的二抗的方法可用作本發(fā)明ROBO1蛋白檢測方法的另一種方式。
例如，檢驗樣品與固定在支持物上的一種或多種抗-ROBO1抗體接觸，溫育后洗滌，并且用一抗-ROBO1抗體以及特異性識別該一抗的一種或多種二抗檢測洗滌后結合的ROBO1蛋白。在這種情況下，二抗優(yōu)選用標記物標記。
利用凝集反應的檢測方法可用作本發(fā)明ROBO1蛋白檢測方法的另一種方式。在所述的方法中，可利用帶有致敏的抗-ROBO1抗體的載體檢測ROBO1。任何載體可用作使該抗體致敏的載體，只要其不溶，不引起非特異性的反應，并且是穩(wěn)定的。例如，可利用乳膠顆粒、皂土、火棉膠、高嶺土、固定的綿羊紅細胞等等，優(yōu)選利用乳膠顆粒。例如，聚苯乙烯膠乳顆粒、苯乙烯-丁二烯共聚物乳膠顆粒、聚乙烯基甲苯乳膠顆粒等等可用作乳膠顆粒，優(yōu)選利用聚苯乙烯膠乳顆粒。致敏的顆粒與樣品混合并且攪拌規(guī)定的持續(xù)時間。由于樣品中含有的抗-ROBO1抗體濃度越高顆粒的凝集程度越大，可通過直接觀察凝集而檢測ROBO1。另外，通過用分光光度計等測量由凝集引起的混濁的檢測也是可能的。
利用例如使用表面胞質(zhì)團共振現(xiàn)象的生物傳感器的方法可用作本發(fā)明ROBO1蛋白檢測方法的另一種方式。利用表面胞質(zhì)團共振現(xiàn)象的生物傳感器可利用少量蛋白并且未標記，以表面胞質(zhì)團共振信號實時觀察蛋白質(zhì)之間的相互作用。例如，ROBO1蛋白和抗-ROBO1抗體的結合可利用生物傳感器如BIAcore(由Amersham Biosciences制造)檢測。具體地，檢驗樣品與傳感器芯片接觸，其中已固定抗-ROBO1抗體，并且結合抗-ROBO1抗體的ROBO1蛋白可以作為共振信號的變化而檢測。
本發(fā)明的檢測方法還可以利用各種自動檢測裝置而自動化，其允許一次進行大量樣品的檢測。
本發(fā)明的另一個目的是提供檢測檢驗樣品中ROBO1蛋白用于癌癥診斷的的診斷藥物或試劑盒；而該診斷藥物或試劑盒包含至少一種抗-ROBO1抗體。如果該診斷藥物或試劑盒以EIA方法如ELISA方法為基礎，可包括使抗體固相的載體，并且該抗體可預結合至載體。如果該診斷藥物或試劑盒以利用載體如乳膠的凝集方法為基礎，則可包括帶有吸附的抗體的載體。另外，該試劑盒可適當包含封閉溶液、反應溶液、反應終止溶液、處理樣品的試劑等等。
抗-ROBO1抗體的制備只要用于本發(fā)明的抗-ROBO1抗體特異性結合ROBO1蛋白就可以，而不管其來源、類型(單克隆的、多克隆的)和其形態(tài)。具體地，可利用熟知的抗體如小鼠抗體、大鼠抗體、人抗體、嵌合抗體和人源化抗體。雖然抗體可以是多克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體。
用于本發(fā)明的抗-ROBO1抗體可利用眾所周知的方法制備為多克隆或單克隆抗體。尤其是，源自哺乳動物的單克隆抗體優(yōu)選作為用于本發(fā)明的抗-ROBO1抗體。源自哺乳動物的單克隆抗體包括通過雜交瘤產(chǎn)生的，以及通過經(jīng)遺傳工程方法用含有抗體基因的表達載體轉化的宿主產(chǎn)生的。
產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤基本上可利用熟知的技術以下列方式制備。即，可通過利用ROBO1作為致敏性抗原，按照常規(guī)免疫方法免疫此，通過常規(guī)的細胞融合方法用眾所周知的親本細胞融合獲得的免疫細胞，并且通過常規(guī)的篩選法篩選產(chǎn)生單克隆抗體的細胞而制備。
具體地，只要如下制備單克隆抗體就可以。首先，通過表達以GenBank登錄號BF059159(NM_133631)公開的ROBO1基因/氨基酸序列而獲得用作致敏性抗原以獲得抗體的ROBO1。即，在將編碼ROBO1的基因序列插入熟知的表達載體系統(tǒng)并且轉化合適的宿主細胞后，通過眾所周知的方法從該宿主細胞內(nèi)或從培養(yǎng)物上清內(nèi)純化目的人ROBO1蛋白。此外，也可純化和利用天然的ROBO1。
然后，純化的ROBO1蛋白用作致敏性抗原。或者，來自ROBO1的部分肽也可用作致敏性抗原。在這種情況下，部分肽可根據(jù)人ROBO1的氨基酸序列通過化學合成獲得，或其也可以通過將部分ROBO1基因整合入表達載體并且表達而獲得；此外，其也可以通過用蛋白酶分解天然的ROBO1而獲得。用作部分肽的ROBO1的區(qū)域和大小不受限制。
雖然用致敏性抗原免疫的哺乳動物并不特別受限制，優(yōu)選考慮和用于細胞融合的親本細胞相容性的選擇，并且通常使用嚙齒類例如，小鼠、大鼠和倉鼠，或兔、猴等等。
致敏性抗原免疫動物按照眾所周知的方法進行。例如，常規(guī)方法通過將致敏性抗原經(jīng)腹膜內(nèi)或皮下注射入哺乳動物而進行免疫。具體地，作為所需要的，合適量的常規(guī)佐劑，例如弗氏完全佐劑與稀釋至合適量并且用PBS(磷酸緩沖鹽水)、生理鹽水等懸浮的致敏性抗原混合，并且在乳化后每4至21天數(shù)次給予哺乳動物。另外，用致敏性抗原免疫期間也可利用合適的載體。如果具有特別小分子的部分肽用作致敏性抗原，則免疫之前與載體蛋白如白蛋白和鑰孔血藍素偶聯(lián)為合乎需要的。
以這種方法免疫哺乳動物并且證實血清中所想要的抗體水平提高后，從哺乳動物收集免疫細胞并且經(jīng)過細胞融合，優(yōu)選的免疫細胞尤其是脾細胞。
哺乳動物骨髓瘤細胞用作親本細胞，其為待與上述免疫細胞融合的另一參與者。對于該骨髓瘤細胞，最佳利用多種眾所周知的細胞系例如，P3(P3x63Ag8.653)(J.Immnol.(1979)123，1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.和Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.等，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.等，Nature(1978)276，269-270)、FO(de St.Groth，S.F.等，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.等，Nature(1979)277，131-133)等等。
上述免疫細胞和骨髓瘤細胞的細胞融合可基本上按照眾所周知的方法，例如Kohler和Milstein等的方法(Kohler.G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等等進行。
更具體地，上述細胞融合例如在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)溶液中存在細胞融合促進劑時進行。例如聚乙二醇(PEG)、日本血細胞凝集病毒(HVJ)等等用作融合促進劑，并且此外依照要求也可添加佐劑如二甲亞砜并且用于提高融合效率。
所用的免疫細胞和骨髓瘤細胞比例可任意設定。例如，相對于骨髓瘤細胞免疫細胞優(yōu)選為1至10倍?？衫糜糜诩毎诤系呐囵B(yǎng)液，例如RPMI1640培養(yǎng)液和MEM培養(yǎng)液，其最適用于骨髓瘤細胞系的生長，此外可利用用于這類細胞培養(yǎng)物的常規(guī)培養(yǎng)液；另外也可結合利用血清液替換物如胎牛血清(FCS)。
關于細胞融合，規(guī)定量的上述免疫細胞和骨髓瘤細胞在上述培養(yǎng)液中充分混合，并且以通常30至60％(w/v)的濃度添加預熱至37℃左右的PEG溶液(例如平均分子量范圍1000至6000)以及隨后混合以形成目的融合細胞(雜交瘤)。然后，通過重復連續(xù)添加合適培養(yǎng)液的操作以及通過離心除去上清，除去雜交瘤生長不想要的細胞融合劑等。
以這種方法獲得的雜交瘤通過在常規(guī)選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)而選擇，例如HAT培養(yǎng)液(包含次黃嘌呤、氨基喋呤和脫氧胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)液)。上述HAT培養(yǎng)液中的培養(yǎng)持續(xù)足以使除了雜交瘤外的細胞(未融合的細胞)死亡(通常，幾天至幾個星期)的一段時間。隨后，進行常規(guī)的極限稀釋法，并且進行篩選和單克隆化產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤。
要注意的是識別ROBO1的抗體的制備也可利用國際公開WO03/104453中所述的方法制備。
對于目的抗體的篩選和單克隆化，進行以熟知的抗原抗體反應為基礎的篩選法就可以了。例如，抗原可結合至載體，如由聚苯乙烯制成的珠或市場上可買到的96-孔微量滴定板，并且與雜交瘤培養(yǎng)物上清反應，并且在洗滌載體后酶標記的二抗等可進行反應以確定與致敏性抗原反應的目的抗體是否包含在培養(yǎng)物上清中。產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤可通過極限稀釋法等克隆。在這種情況下，利用用于免疫的抗原作為抗原就足夠了。
此外，除了將抗原免疫非人動物并且獲得上述雜交瘤外，還可能在體外使人淋巴細胞對ROBO1致敏，將致敏淋巴細胞與具有永久分裂能力的人源骨髓瘤細胞融合，并且獲得具有結合ROBO1的活性的所需人抗體(參考日本專利公開No.H1-59878)。此外，用作抗原的ROBO1可給予具有人抗體基因庫整體的轉基因動物以獲得產(chǎn)生抗-ROBO1抗體的細胞，并且從因其永生化而產(chǎn)生的細胞獲得抗ROBO1的人抗體(參考國際公開WO94/25585、WO93/12227、WO92/03918和WO94/02602)。
以這種方法制備的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可在常規(guī)培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)，并且另外可在液氮中保存很長時間。
為了從雜交瘤獲得單克隆抗體，采用根據(jù)常規(guī)方法培養(yǎng)雜交瘤，以及該抗體作為其培養(yǎng)物上清而獲得的方法，或雜交瘤給予到與其相容的哺乳動物并且在該動物中生長，以及該抗體作為其腹水而獲得的方法。前者方法適合于獲得高純度的抗體，相反后者方法適合于抗體的大規(guī)模生產(chǎn)。
本發(fā)明中，通過從雜交瘤克隆抗體基因，整合該基因至合適的載體，導入構建體至宿主，并且利用重組技術產(chǎn)生的重組抗體可用作單克隆抗體(例如，參考Vandamme，A.M.等，Eur.J.Biochem.(1990)192，767-775，1990)。具體地，從產(chǎn)生抗-ROBO1抗體的雜交瘤分離編碼抗-ROBO1抗體可變(V)區(qū)的mRNA。關于mRNA的分離，通過熟知的方法制備總RNA，例如胍超速離心方法(Chirgwin，J.M.等，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC方法(Chomczynski，P.等，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等等，并且利用mRNA純化試劑盒(由Pharmacia制造)等制備目的mRNA。另外，也可利用QuickPrep mRNA純化試劑盒(由Pharmacia制造)直接制備mRNA。
從獲得的mRNA，利用逆轉錄酶合成抗體V區(qū)的cDNA。cDNA的合成利用AMV逆轉錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒(由SeikagakuCorporation制造)等進行。另外，利用5’-Ampli FINDER RACE試劑盒(由Clontech制造)的5’RACE方法(Frohman，M.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002，Belyavsky，A.等，Nucleic AcidsRes.(1989)17，2919-2932)和PCR等可用于進行cDNA的合成和擴增。
從獲得的PCR產(chǎn)物純化目的DNA片段并且與載體DNA連接。另外，從其制備重組載體，導入大腸桿菌等，并且選擇菌落以制備所想要的重組載體。隨后，目的DNA的堿基序列通過熟知的方法驗證，例如雙脫氧核苷酸鏈終止方法等。在獲得編碼目的抗-ROBO1抗體V區(qū)的DNA后，整合入含有編碼所想要的抗體恒定區(qū)(C區(qū))DNA的表達載體中。
為了制造用于本發(fā)明的抗-ROBO1抗體，抗體基因整合入表達載體以使其在表達調(diào)控區(qū)例如增強子和啟動子的控制下表達。然后，用該表達載體轉化宿主細胞以表達抗體。
關于抗體基因的表達，編碼抗體重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA可分別整合入表達載體中并且共轉化宿主細胞，或編碼H鏈和L鏈的DNA可整合入單獨的表達載體中并且轉化宿主細胞(參考國際公開WO94/11523)。
當抗體基因暫時分離并且導入合適的宿主以制備抗體時，可使用合適的宿主和表達載體的組合。當利用真核細胞作為宿主時，可利用動物細胞、植物細胞和真菌細胞。已知的動物細胞為(1)哺乳動物細胞，例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼倉鼠腎)、HeLa和Vero，(2)兩棲動物細胞，例如爪蟾卵母細胞，或(3)昆蟲細胞，例如sf9、sf21、Tn5等等。已知的植物細胞為煙草屬的，例如源自Nicotiana煙草的細胞，其能進行愈傷組織培養(yǎng)就可以。已知的真菌細胞為酵母，例如酵母屬，如釀酒酵母(Saccharomyces serevisiae)，絲狀真菌，例如曲霉屬(Aspergillus genus)，如黑曲霉(Aspergillus niger)等等。利用原核細胞時，有使用細菌細胞的生產(chǎn)系統(tǒng)。已知的細菌細胞為大腸桿菌(E.coli)和枯草芽孢桿菌。目的抗體基因通過轉化導入這些細胞，通過體外培養(yǎng)轉化的細胞獲得抗體。
另外，對于重組抗體的產(chǎn)生，不僅可利用上述的宿主細胞而且可利用轉基因動物。例如，抗體基因插入在乳汁中特異性產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(山羊β酪蛋白等等)的基因中間并且作為融合基因制備。含有該具有插入抗體基因的融合基因的DNA片段注射入山羊胚胎中，并且胚胎導入雌性山羊。從接受了胚胎的山羊產(chǎn)下的轉基因山羊或其后代產(chǎn)生的乳汁中獲得所想要的抗體。另外，為了使從轉基因山羊產(chǎn)生的含有所想要的抗體的乳汁量增加，可以對轉基因山羊使用適當?shù)募に?Ebert，K.M.等，Bio/Technology)(1994)12，699-702)。
本發(fā)明中，為了降低針對人的異種抗原性等，可利用人工改變的重組抗體，例如嵌合抗體、人源化抗體等。這些改變的抗原可利用已知的方法制造。嵌合抗體為包括來自人以外的哺乳動物，例如小鼠的抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)以及來自人抗體的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的抗體，并且可通過將編碼小鼠抗體可變區(qū)的DNA和編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接，整合入表達載體，并且導入宿主和通過宿主產(chǎn)生而獲得。
對于嵌合抗體和人源化抗體的C區(qū)，利用來自人抗體的C區(qū)，例如可利用用于重鏈的Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4，以及用于輕鏈的Cκ和Cλ。另外，人抗體的C區(qū)可經(jīng)修飾以改良抗體或提高其生產(chǎn)的穩(wěn)定性。
嵌合抗體包括來自人以外哺乳動物來源的抗體的可變區(qū)以及源自人抗體的恒定區(qū)。其間，人源化抗體包括來自人以外哺乳動物來源的互補決定區(qū)，以及源自人抗體的框架區(qū)和C區(qū)。由于在人體中降低的抗原性，人源化抗體作為本發(fā)明治療劑的有效成分是有效的。
人源化抗體亦稱改造的人抗體，是將人以外的哺乳動物，例如小鼠抗體的互補性決定區(qū)(CDR)移植入人抗體的互補決定區(qū)后形成的抗體，其所用的常規(guī)重組技術也是已知的。具體地，通過PCR法由末端含有重疊部分而產(chǎn)生的多種寡核苷酸合成設計為能連接小鼠抗體的CDR和人抗體的框架區(qū)(FR)的DNA序列。獲得的DNA與編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接，然后整合入表達載體，并且導入宿主和通過宿主表達以獲得抗體(參考歐洲專利EP239400和國際公開WO96/02576)。
選擇通過CDR連接的人抗體框架區(qū)以使互補決定區(qū)形成良好的抗原結合位點。根據(jù)需要，可取代抗體可變區(qū)中框架區(qū)的氨基酸以使改造的人抗體的互補決定區(qū)形成合適的抗原結合位點(Sato，K.等，Cancer Res，1993，53，851-856)。
另外，獲得人抗體的方法也是已知的。例如，還可以用所想要的抗原或表達所想要的抗原的細胞體外致敏人淋巴細胞，將致敏的淋巴細胞與人骨髓瘤細胞，例如U266融合，并且獲得具有結合該抗原活性的所需人抗體(參考日本專利公開No.H1-59878)。另外，具有人抗體基因完整庫的轉基因動物可用所需抗原免疫以獲得所需的人抗體(參考國際公開WO93/12227、WO92/03918和WO94/02602、WO94/25585、WO96/34096和WO96/33735)。另外，通過淘洗(panning)利用人抗體文庫獲得人抗體的技術也是已知的。例如，通過噬菌體展示方法將人抗體的可變區(qū)作為單鏈抗體(scFv)表達在噬菌體表面上，可選擇結合該抗原的噬菌體。編碼結合該抗原的人抗體可變區(qū)的DNA可通過分析所選擇的噬菌體的基因而確定。如果結合抗原的scFv的DNA序列已知，可產(chǎn)生合適的表達載體的序列，并且獲得人抗體。這些方法為大家所熟知，并且可參考國際公開WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438和WO95/15388。
用于本發(fā)明的抗體不限于完整的抗體分子，只要其結合ROBO1，可以是來自抗體或其修飾體的片段，并且包括二價抗體和單價抗體。例如，抗體片段的實例包括Fab、F(ab’)2、Fv、具有一個Fab和完整Fc的Fab/c，或具有與合適的接頭連接的重鏈或輕鏈的Fv的單鏈Fv(scFv)。
抗體片段或者通過用酶，例如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶處理抗體以產(chǎn)生抗體片段，或者通過構建編碼這些抗體片段的基因，并且導入表達載體，隨后在合適的宿主細胞中表達(例如，參考Co，M.S.等，J.Immunol.(1994)152，2968-2976，Better，M.& Horwitz，A.H.Methodsin Enzymology(1989)178，476-496，Academic Press，Inc.，Plueckthun，A.& Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476-496，AcademicPress，Inc.，Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663，Rousseaux，J.等，Methods in Enzymology(1989)121，663-669，Bird，R.E.等，TIBTECH(1991)9，132137)。
scFv通過連接抗體H鏈的V區(qū)和L鏈的V區(qū)獲得。該scFv中，H鏈的V區(qū)和L鏈的V區(qū)通過接頭連接，優(yōu)選肽接頭(Huston，J.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，1988，85，5879 5883)。scFv中H鏈的V區(qū)和L鏈的V區(qū)可源自任何本說明書中作為抗體描述的那些。包括例如范圍在3-25個殘基的任何單鏈肽用作連接V區(qū)的肽接頭。通過從編碼上述抗體的H鏈或H鏈V區(qū)的DNA以及編碼L鏈或L鏈V區(qū)的DNA中擴增，這些序列的全部或編碼所需氨基酸序列的DNA部分用作模板，通過利用限定其兩端的引物對，隨后進一步結合和擴增編碼肽接頭部分的DNA以及限定其兩端的引物對以使其可與每一H鏈和L鏈連接的PCR方法獲得編碼scFv的DNA。另外，一旦產(chǎn)生編碼scFv的DNA，含有這些的表達載體以及由該表達載體轉化的宿主可用常規(guī)方法獲得；另外，scFv可用常規(guī)方法利用該宿主獲得。這些抗體片段可由宿主通過獲得和表達上述基因而產(chǎn)生。
連接至不同分子，如聚乙二醇(PEG)的抗體也可用作修飾的抗體。另外，細胞毒性物質(zhì)如放射性同位素、化療劑、源自細菌的毒素等等也可連接至該抗體。所述修飾的抗體可通過對獲得的抗體進行化學修飾而獲得。值得注意的是本領域中已建立了抗體的修飾方法。這些抗體也包括在本發(fā)明的“抗體”中。
另外，用于本發(fā)明的抗體可以是雙特異性抗體。雙特異性抗體可以是具有識別ROBO1分子上不同表位的抗原結合位點，或識別ROBO1的一個抗原結合位點和識別細胞毒性物質(zhì)如放射性物質(zhì)、化療劑或細胞來源的毒素的另一個抗原結合位點的雙特異性抗體。在這種情況下，細胞毒性物質(zhì)可直接對表達ROBO1的細胞起作用以特異性地對腫瘤細胞造成損傷并且抑制腫瘤細胞的生長。雙特異性抗體可通過連接來自兩種抗體的HL對而產(chǎn)生，或通過融合產(chǎn)生不同單克隆抗體的雜交瘤并且生成產(chǎn)生雙特異性抗體的融合細胞而獲得。另外，雙特異性抗體還可通過遺傳工程技術產(chǎn)生。
如上述構建的抗體基因可通過眾所周知的方法表達并且獲得。在哺乳動物細胞的情況下，可功能性地連接通常所用的有效啟動子，所要表達的抗體基因，其3’側下游的polyA信號，并表達。例如，人巨細胞病毒早早期啟動子/增強子可用作啟動子/增強子。
另外，本發(fā)明中所用的可用于抗體表達的其他啟動子/增強子包括病毒啟動子/增強子如來自逆轉錄病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿猴病毒40(SV40)的或源自哺乳動物細胞如人延伸因子1α(HEF1α)的啟動子/增強子等等。
當利用SV40啟動子/增強子時基因表達可很容易地通過Mulligan等的方法進行(Nature(1979)277，108)，以及當利用HEF1α啟動子/增強子時通過Mizushima等的方法進行(Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)。
在大腸桿菌的情況下，可功能性地連接通常所用的有效啟動子，用于抗體分泌的信號序列和所要表達的抗體基因以表達該基因。例如，lacz啟動子和araB啟動子可用作啟動子。當利用lacz啟動子時可通過Ward等的方法(Nature(1098)341，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427)表達，或當利用araB啟動子時通過Better等的方法(Science(1988)240，1041-1043)。
關于用于抗體分泌的信號序列，當生產(chǎn)是在大腸桿菌周質(zhì)中時，只要利用pelB信號序列(Lei，S.P.等J.Bacteriol.(1987)169，4379)就可以。隨后，分離在周質(zhì)中產(chǎn)生的抗體后，在使用前適當重構(重新折疊)抗體結構。
關于復制起點，可利用源自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等等的那些；另外，表達載體可包含氨基糖苷類轉移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等等，作為選擇性標記以擴增宿主細胞系統(tǒng)中的基因拷貝數(shù)。
任何表達系統(tǒng)，例如真核細胞或原核細胞系統(tǒng)可用于制造用于本發(fā)明中的抗體。例如，動物細胞如建立的哺乳動物細胞系統(tǒng)、昆蟲細胞系統(tǒng)、絲狀真菌細胞酵母細胞等等可用作真核細胞，并且例如，細菌細胞如大腸桿菌細胞可用作原核細胞。
優(yōu)選，用于本發(fā)明的抗體在哺乳動物細胞中表達，例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK、Vero或HeLa細胞。
然后，體外或體內(nèi)培養(yǎng)轉化的宿主細胞以產(chǎn)生目的抗體。宿主細胞的培養(yǎng)按照熟知的方法進行。例如，DMEM、MEM、RPMI1640和IMDM可用作培養(yǎng)液，并且可結合利用血清補充液如胎牛血清(FCS)。
如上述表達和產(chǎn)生的抗體可通過用于常規(guī)蛋白質(zhì)純化的熟知的方法純化。例如，抗體可通過適當?shù)剡x擇和組合親和柱如Protein A柱、層析柱，過濾，超濾，鹽析，透濾等等而分離和純化(Antibodies ALaboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold Spring HarborLaboratory，1988)。
熟知的方法可用于抗體的抗原結合活性的測量(Antibodies ALaboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold Spring HarborLaboratory，1988)。例如，可利用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)、EIA(酶免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)或熒光免疫等等。
藥物組合物從另一個角度，本發(fā)明的特征為含有作為有效成分結合ROBO1的抗體的藥物組合物。另外，本發(fā)明的特征為含有作為有效成分結合ROBO1的抗體的細胞生長抑制劑，尤其是抗癌劑。
本發(fā)明中，“含有作為有效成分結合ROBO1的抗體”指包含抗-ROBO1抗體作為主要的有效組分，并且并不限制抗-ROBO1抗體的含量比例。
本發(fā)明的細胞生長抑制劑中含有的抗體并無特別限制，只要其結合ROBO1。優(yōu)選，其為特異性結合ROBO1的抗體，并且更優(yōu)選其為具有細胞毒性的抗體。另外，用于本發(fā)明的抗體可以是具有修飾的糖鏈的抗體。眾所周知抗體的細胞毒性可通過修飾糖鏈而提高。例如，具有修飾的糖基化的抗體(WO99/54342等等)，缺乏添加至糖鏈的巖藻糖的抗體(WO00/61739、WO02/31140等等)，具有對分(bisecting)GlcNAc的糖鏈的抗體(WO02/79255等等)等稱為具有修飾的糖鏈的抗體。
關于本發(fā)明中的細胞毒性，可引用例如抗體-依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)活性、補體-依賴的細胞毒性(CDC)活性等等。本發(fā)明中，CDC活性指應歸于補體系統(tǒng)的細胞毒性，ADCC活性指當抗體特異性附著至靶細胞的，即通過Fcγ受體結合其Fc部分的Fcγ受體載體細胞(免疫細胞等等)的細胞表面抗原時，對靶細胞造成損傷的活性。
抗-ROBO1抗體是否具有ADCC活性，或是否具有CDC活性可通過熟知的方法測量(例如，Current protocols in Immunology，Chapter7.Immunologic studies in humans，Editor，John E，Coligan等，Wiley &Sons，Inc.，(1993)等等)。
具體地，首先進行效應細胞、補體溶液和靶細胞的制備。
(1)效應細胞的制備從CBA/N小鼠等取出脾臟，并且在RPMI1640培養(yǎng)基中(GIBCO制造)分離脾細胞。在含有10％胎牛血清(FBS，HyClone制造)的相同的培養(yǎng)基中洗滌后，以5×106/ml的濃度制備細胞而制備效應細胞。
(2)補體溶液的制備幼兔補體(CEDARLANE制造)在含有10％FBS的培養(yǎng)基中(GIBCO制造)稀釋10倍以制備補體溶液。
(3)靶細胞的制備表達ROBO1的細胞(用編碼ROBO1的基因轉化的細胞，肝癌細胞、肺癌細胞、乳腺癌細胞、子宮癌細胞、胃癌細胞、大腸癌細胞等等)通過與0.2mCi的鉻酸鈉-51Cr(Amersham Pharmacia Biotech制造)一起在含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)一小時而經(jīng)放射性標記。放射性標記后，細胞用含有10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌三次，以2×105/ml的濃度制備細胞而制備靶細胞。
然后，進行ADCC活性或CDC活性的測量。在ADCC活性測量的情況下，50μl每種靶細胞和抗-ROBO1抗體加至96-孔U底平板(Beckton Dickinson制造)，并且在冰上反應15分鐘。此后，添加100μl效應細胞，并且培養(yǎng)在二氧化碳溫箱中進行4小時?？贵w的終濃度為0或10μg/ml。培養(yǎng)后，回收100ul上清，并且用γ粒子計數(shù)管測量放射性(COBRAIIAUTO-GMMA，MODEL D5005，Packard InstrumentCompany制造)。細胞毒性(％)可根據(jù)(A-C)/(B-C)×100確定，[其中A代表樣品中的放射性(cpm)，B代表其中添加1％NP-40(Nakarai制造)的樣品中的放射性(cpm)，并且C代表僅含有靶細胞的樣品的放射性(cpm)。
其間，在CDC活性測量的情況下，50μl每種靶細胞和抗-ROBO1抗體加至96-孔平底平板(Beckton Dickinson制造)，并且在冰上反應15分鐘。此后，添加100μl補體溶液，并且培養(yǎng)在二氧化碳溫箱中進行4小時?？贵w的終濃度為0或3μg/ml。培養(yǎng)后，回收100μl上清，并且用γ粒子計數(shù)管測量放射性。細胞毒性可以與ADCC活性測量同樣的方式確定。
抗-ROBO1抗體抑制其增殖的細胞并無特別限制，如果其為表達ROBO1的細胞，并且優(yōu)選癌細胞，且更優(yōu)選肝癌細胞、肺癌細胞、乳腺癌細胞、子宮癌細胞、胃癌細胞、腦腫瘤細胞和大腸癌細胞。因此，抗-ROBO1抗體可以治療和預防由細胞生長引起的疾病的目的而利用，所述疾病例如肝細胞癌、肺癌、乳腺癌、子宮癌、胃癌、腦腫瘤、大腸癌等等。
本發(fā)明的細胞生長抑制劑和抗癌劑的口服和腸胃外給藥都是可行的，優(yōu)選腸胃外給藥，并且具體地，可引用注射劑的類型、鼻給藥劑的類型、肺給藥劑的類型、經(jīng)皮給藥的類型等等。作為注射劑類型的實例，全身或局部給藥是可行的，例如通過靜脈注射、肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、皮下注射等等。另外，可根據(jù)患者的年齡和癥狀適當選擇給藥方法。關于劑量，例如，其可選擇在每次給藥每公斤體重0.0001mg至1000mg的范圍內(nèi)?；蛘撸鐒┝靠蛇x擇在每一患者0.001至100000mg/體重的范圍內(nèi)。然而，本發(fā)明的治療劑不限于這些劑量。
本發(fā)明的細胞生長抑制劑和抗癌劑可根據(jù)常規(guī)方法(例如，Remington’s Pharmaceutical Science，最新版，Mark Publishing Company，Easton，U.S.A)配制，并且還可包含醫(yī)學上可接受的載體和添加劑。例如可引用表面活性劑、稀釋劑、著色劑、香料、防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖液、懸浮劑、等滲劑、結合物、崩解劑、潤滑劑、流動性增進劑、調(diào)味劑等等，可適當利用其他常規(guī)使用的載體并且不限于這些。具體地，可引用輕的無水硅酸、乳糖、晶狀纖維素、甘露糖醇、淀粉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥基丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯醇縮乙醛二乙胺乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、中鏈脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯硬蓖麻油60、白糖、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機鹽等等。
另外，本發(fā)明提供通過將表達ROBO1的細胞與結合ROBO1的抗體接觸而在表達ROBO1的細胞中誘發(fā)損傷的方法或抑制細胞生長的方法。結合ROBO1的抗體為如上所述作為本發(fā)明細胞生長抑制劑中包含的結合ROBO1的抗體。由抗-ROBO1抗體結合的細胞無特別限制，只要該細胞表達ROBO1，優(yōu)選癌細胞，更優(yōu)選肝癌細胞、肺癌細胞、乳腺癌細胞、子宮癌細胞、胃癌細胞、腦腫瘤細胞和大腸癌細胞。
本說明書中明確引用的所有專利和參考文獻內(nèi)容的全部在此引用作為本說明書的一部分。另外，日本專利申請No.2004-102862、2004-227899和2005-004024的說明書和附圖內(nèi)容的全部在此引用作為本說明書的一部分，其為用作本申請優(yōu)先權基礎的申請。
實施例本發(fā)明用下列實施例作進一步描述；然而這些實施例并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1每一癌癥種類中ROBO1的mRNA表達分析1-1.利用基因芯片的ROBO1基因表達分析為了搜索癌細胞中表達被促進的基因，利用和檢驗表1中顯示的通過利用ISOGEN(Nippon Gene制造)的常規(guī)方法從各種提取的組織制備的各種RNA以及總RNA。
表1.用于ROBO1基因表達分析的組織和細胞系基因表達分析利用上述總RNA的每種10ng進行，按照ExpressionAnalysis Technique Manual(Affymetryx制造)經(jīng)GeneChip U-133(Affimetrix制造)分析。當搜查到具有對總基因設定100表達分值的平均值的基因時，其在癌細胞中表達提高，相比健康的肝臟(9.1)，很顯然在中等-分化的肝細胞癌(236.4)中ROBO1mRNA(探針I(yè)D213194 at HG-U133A)顯著提高26倍，以及在不充分-分化的肝細胞癌(563)中的顯著提高62倍。另外，在大腸癌中ROBO1mRNA的表達也提高，相比健康大腸(21.4)，原發(fā)大腸癌的八例中五例具有兩倍或更多的提高。另外，相比健康肝臟和大腸，大腸癌轉移的肝癌七例中的三例也顯著提高。另外，相比健康肺，ROBO1提高兩倍或更多的一個病例也存在肺小細胞癌(圖1a、b)。
癌細胞系的分析中，U251中ROBO1的表達顯示100的分值，其為源自人腦腫瘤的細胞系，Alexander、HLE、HuH6、HuH7和HepG2，其源自人肝癌細胞系，Lu1320和H522，其源自人肺癌細胞系，以及Hela，其源自人子宮頸癌等等，顯示ROBO1的表達不僅在以上所示的肝細胞癌、大腸癌和肺癌中得到提高的可能性，而且在各種各樣的癌癥如腦腫瘤和子宮頸癌中提高(圖1c)。
另外，以上述同樣的方式在完全-分化的、中等-分化的(歸因于HBV或HCV病毒感染)和不充分-分化的肝細胞癌中對肝細胞癌，以及以上述同樣的方式對肝炎部位、肝硬化部位，其為非-癌癥部位，以及健康肝臟利用GeneChipTM HG-U95B Target(Affymetryx[A39])進行分析。從提取的組織制備總RNA，每個來自三個病例，并且混合來自三個病例的5μg的每種總RNA，且經(jīng)過GeneChip分析。以標準化至100的總芯片分值的平均值顯示值。
因此，與健康肝臟和非-癌部位非常低的量相反，對于ROBO1基因(探針I(yè)D55461_at_HG-U95B)，從完全-分化的肝細胞癌至不充分-分化的肝細胞癌觀察到表達的顯著增加，并且很明顯肝細胞癌中表達提高(圖2)。
實施例21-2.通過定量PCR的ROBO1mRNA表達分析利用從健康肝臟、肝炎部位和肝硬化部位，以及提取自肝癌和相同組織的非-癌部位的組織制備的RNA進行定量PCR。即，利用逆轉錄酶Superscript II(GIBCO BRL制造)從制備自每種組織的總RNA合成的單-鏈cDNA作為模板DNA，用iCycleriQ實時PCR分析系統(tǒng)(BIO-RAD制造)進行PCR反應以定量mRNA表達的表達量。對ROBO1的引物設計根據(jù)GenBank ID(NM_133631)進行。準備包含500mM KCl，100mM Tris-HCl(pH8.3)，20mM MgCl2，0.1％明膠，1.25mM每種dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，1μL pf每種單鏈cDNA，5pmol每種ROBO1正向引物(SEQ.ID1)和ROBO1反向引物(SEQ.ID2)，0.75μL的SYBR Green I(1000倍稀溶液，Takara Shuzo制造)，0.25μL重組Taq聚合酶混合物(FGPluthero，Rapid purificationof high-activity TaqDNA polymerase，Nucl.Acids.Res.1993 214850-4851.)的每種25μL PCR反應溶液后，首先，在94℃進行初次變性3分鐘，并且進行40次包括94℃15秒，63℃15秒以及72℃30秒的循環(huán)。利用與iCycler iQ實時分析系統(tǒng)關聯(lián)的軟件計算每種原本制備物中表達的量。另外，以各個RNA表達的人β-肌動蛋白基因的量也利用人β-肌動蛋白特異的正向引物(SEQ.ID3)和反向引物(SEQ.ID4)以上述同樣的方式分析，并且用人β-肌動蛋白(ROBO1/β-肌動蛋白x100)的分析結果校正的ROBO1分析結果用作表達的ROBO1mRNA量。
因此，與GeneChip分析的結果類似，健康肝臟和肝炎部位，以及肝硬化部位中幾乎觀察不到ROBO1mRNA的表達；相反，在許多肝細胞癌部位中觀察到ROBO1mRNA表達提高。尤其，比較相同組織內(nèi)的癌癥部位和非-癌部位，所分析9例的8例中表達提高兩倍或更多(表2)。
表2.通過定量PCR分析的ROBO1基因表達提高率定量PCR分析(對照β-肌動蛋白(％))

具有兩倍或更多差異的對8例實施例3抗-ROBO1抗體的制備為了闡明利用抗-ROBO1抗體檢測癌癥是否可行，產(chǎn)生抗-ROBO1抗體。
3-1.抗原的制備3-1-1.ROBO1cDNA的分離為了進行ROBO1的表達，首先如下分離ROBO1cDNA。按照上述方法從Hep3B細胞制備單鏈cDNA，并且以此為模板，利用引物RBV2F-TA(SEQ.ID5)和RBR-TA(SEQ.ID6)通過PCR方法進行擴增。引物RBV2F-TA設計成能與ROBO1基因(GenBankNM_133631)的5’-端雜交，并且RBR-TA設計成能雜交至3’-端。通過按照LA-PCR試劑盒(TAKARA制造)的方案制備反應溶液，并且首先在95℃進行初次變性兩分鐘，在72℃進行30次包括94℃15秒，63℃15秒，和72℃5分鐘的循環(huán)，并且隨后在包括72℃10分鐘的條件下進行最后的延伸而進行PCR方法。結果，成功檢測到對應于預測ROBO1序列的接近大約5kb的條帶。當通過PCR方法獲得特異性擴增的片段通過TA克隆方法插入pcDNA3.1/V5-His TOPO(Invitrogen制造)，并且通過已建立的方法驗證堿基序列時，顯然所分離的cDNA為ROBO1的cDNA。
3-1-2.表達ROBO1N末端部位的重組桿狀病毒的制備關于包含ROBO1N-末端至第一個免疫球蛋白區(qū)(Ig1)的區(qū)域，其作為與桿狀病毒膜蛋白gp64的融合蛋白表達。即，用上述ROBO1cDNA作為模板，編碼包含ROBO1N-末端至第一個免疫球蛋白區(qū)(Ig1)區(qū)域的基因通過利用RB_BVF引物(SEQ.ID7)和RB_BVR引物(SEQ.ID8)的PCR方法擴增，隨后插入pGEM-Te載體(Promega制造)。通過已建立的方法驗證堿基序列后，用限制性核酸內(nèi)切酶KpnI片段切割的基因片段插入pBucSurf載體(Novagen制造)以構建轉移載體ROBO1N/pBS。隨后，利用限制性核酸內(nèi)切酶BplI(Fermentas制造)切割4μg ROBO1N/pBS并且線性化后，其與Bac-N-Blue DNA一起按照Invitrogen的說明書導入Sf9細胞以制備表達ROBO1-Ig1和gp64融合蛋白的重組桿狀病毒。
添加如上制備的重組病毒以獲得MOI為5以感染Sf9細胞(2×106細胞/mL)，其隨后在27℃培養(yǎng)3天。培養(yǎng)3天后從培養(yǎng)物上清回收表達ROBO1-Ig1和gp64融合蛋白的出芽桿狀病毒(BV)。即，培養(yǎng)溶液在800xg離心15分鐘并且除去細胞以及細胞碎片，隨后回收的培養(yǎng)物上清在45,000xg離心30分鐘。沉淀重懸于PBS，通過在800xg進一步離心除去細胞組分，上清在45,000xg再次離心，獲得的沉淀用PBS懸浮以用作BV組分，并且用作用免疫的抗原。
3-2抗-ROBO1單克隆抗體的制備利用通過上述方法制備的表達ROBO1-Ig1的BV作為抗原產(chǎn)生抗-ROBO1單克隆抗體。即，相當于1mg蛋白質(zhì)量的表達ROBO1-Ig1的BV和200ng百日咳毒素的混合物懸浮在PBS中，并且通過皮下注射入gp64轉基因小鼠(WO03/104453)而進行首次免疫。在后來的免疫中，僅皮下注射相當于500μmg蛋白質(zhì)量的表達ROBO1-Ig1的BV。作為最終的免疫，經(jīng)血管內(nèi)給予250μg表達ROBO1-Ig1的BV，此后3天，從小鼠分離脾細胞，并且按照常規(guī)方法進行與小鼠P3U1細胞的細胞融合以建立雜交瘤細胞。通過ELISA進行產(chǎn)生抗-ROBO1抗體的雜交瘤細胞的選擇，其中用于免疫的抗原，表達ROBO1-Ig1的BV為固相的。對于ELISA方法，表達ROBO1-Ig1的BV在4℃置于96-孔平底平板中(Falcon制造)一晝夜以使終濃度變?yōu)?0μg/ml，此后包含40％Block Ace試劑(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd制造)的TBS緩沖溶液用于封閉，隨后添加雜交瘤培養(yǎng)上清，反應在室溫下進行1小時。然后，標記HRP的抗小鼠IgG抗體(Jackson制造)在室溫下反應1小時，洗滌4次后，3，3’，5，5’-四甲苯(TMB)試劑(Sigma制造)在室溫下反應1小時。用0.5N硫酸終止反應，并且用微量培養(yǎng)板讀板器Multickan JX(Labsystems制造)測量在492nm下的光密度。
結果，成功建立產(chǎn)生結合ROBO1的單克隆抗體的雜交瘤細胞A7241A以及A7225A。通過硫酸銨沉淀方法從產(chǎn)生雜交瘤細胞的培養(yǎng)物上清制備每種單克隆抗體。
實施例4利用抗-ROBO1抗體檢測ROBO1蛋白質(zhì)分子為了驗證通過以上描述制備的抗-ROBO1抗體的反應性，利用來自強制表達ROBO1的細胞系以及來自各種癌細胞系的細胞裂解物進行ROBO1的檢測。首先，通過利用強制表達ROBO1的HEK293細胞的Western分析驗證抗-ROBO1抗體A7241A的反應性。具有上述插入到pcDNA3.1/V5-His TOPO(Invitrogen制造)中的編碼ROBO1的cDNA的全長ROBO1基因表達載體(ROBO1/pcDNA3.1)用作動物細胞表達載體。然后，作為陰性對照的1μg ROBO1/psDNA3.1或pcDNA3.1(模擬物)利用FuGene6試劑(Roche Diagnostics制造)導入5×104COS7細胞或2×105HEK293細胞以瞬時表達ROBO1。在導入表達載體三天后回收細胞，并且培養(yǎng)的細胞溶于RIPA緩沖溶液中(150mM氯化鈉，1％NP-40，0.5％脫氧膽酸，0.1％SDS，50mM三-羥甲氨基甲烷羥基氨基甲烷鹽酸鹽(pH8.0))以制備細胞裂解物。
相當于3μg蛋白質(zhì)量的每種裂解物經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠，并且在通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)后，轉移至Hybond-P(AmershamBioscience制造)。隨后，當利用抗-His抗體(Sigma制造)或A7241A抗體(1μg/mL)作為一抗，并且利用HRP標記的抗鼠IgG抗體(Jackson制造)作為二抗的ECL plus(Amersham Bioscience制造)進行檢測時，檢測到與抗-His抗體特異反應的大約260kd分子量的條帶。雖然這可認為是全長ROBO1，用抗-ROBO1抗體A7241A還在細胞裂解物中觀察到相同分子量的條帶。根據(jù)上述結果，抗-ROBO1抗體A7241A顯示能特異性檢測全長ROBO1蛋白。另外，對于A7241A還檢測到具有小分子量的一些條帶，由于這些條帶用抗-His抗體檢測不到，考慮其可能是缺乏C-末端的降解產(chǎn)物，并且事實上在培養(yǎng)物上清中檢測到大約120kd分子量的條帶(圖3)。雖然全長ROBO1所估計的分子量為190kd，由于糖鏈修飾等等，認為其在比250kd預染的分子量標志物(Bio-Rad制造)更高的位置(大約260kd)檢測到。另外，雖然還在利用pcDNA3.1的HEK293細胞模擬檢驗中檢測到認為是ROBO1的條帶，根據(jù)ROBO1在胎兒階段表達的事實，認為其是由于ROBO1通過HKE293細胞表達的原因，該細胞源自人胚腎。
然后，對來自各種癌細胞系的細胞裂解物進行Western分析。結果，僅在具有高mRNA表達分值的細胞系中成功檢測到認為是全長ROBO1的大約260kd分子量的條帶，與GeneChip U133分析結果一致(圖4)。另外，以同樣的方式檢測到多個具有小分子量的條帶的事實提示，取決于細胞系，糖鏈中的連接數(shù)是不同的，或由于降解產(chǎn)物或剪接的差異，存在具有不同分子量的ROBO1。
另外，當在培養(yǎng)物上清以及表達ROBO1的癌細胞系中驗證可溶ROBO1片段的檢測是否可行時，與強制表達細胞的培養(yǎng)物上清的相同分子量的條帶也通過抗-ROBO1抗體在高表達ROBO1的肝癌細胞系培養(yǎng)物上清中檢測(圖3)。
根據(jù)上述結果，清楚ROBO1單克隆抗體A7241A可特異性檢測ROBO1，并且通過GeneChip分析的mRNA表達程度與ROBO1蛋白表達程度匹配。另外，根據(jù)利用抗-ROBO1抗體的檢查，清楚了可溶ROBO1片段存在于表達ROBO1的細胞的培養(yǎng)物上清中，強烈提示可通過檢測可溶的ROBO1而測定癌細胞的存在與否。
實施例5肝細胞癌的免疫組織染色利用抗-ROBO1單克隆抗體進行肝細胞癌臨床樣品的免疫組織學染色分析。
切至4μm的來自肝細胞癌提取組織的固定石蠟包埋制備物的切片附著于載玻片上，并且在37℃充分干燥16小時左右。進行通過在100％二甲苯中每次5分鐘浸泡三次的脫蠟，隨后通過在100％乙醇中5分鐘以及在70％乙醇5分鐘浸泡三次的脫水。隨后，在50mM TBS緩沖溶液(50mM Tris，pH7.4，150mM NaCl)中洗滌5分鐘三次后，通過在檸檬酸鹽緩沖液(10mM，pH7.0)中120℃反應10分鐘進行抗原的活化。隨著抗原的活化，利用TBS緩沖溶液進行三次洗滌，每次5分鐘，隨后，稀釋至10μg/mL的A7241A抗體在室溫下反應一小時。然后，通過用0.3％過氧化氫在室溫下作用15分鐘滅活內(nèi)源的過氧化物酶。在用TBS緩沖溶液再洗滌三次后，作為二抗的ENVISION+kit/HRP(DAKO制造)作用一小時。用TBS緩沖溶液每次5分鐘洗滌三次后，DAB(3，3’-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽)用于染色。另外，蘇木精用于核的對比染色。
結果，如圖5所示，根據(jù)肝細胞癌通過抗-ROBO1抗體特異性染色的事實，顯然肝細胞癌中ROBO1蛋白的表達特異性地提高。另外，顯示抗-ROBO1抗體可用于高表達ROBO1的癌癥的免疫組織化學診斷，如肝細胞癌。
實施例6肝細胞癌患者血清中可溶ROBO1蛋白(sROBO1)的檢測根據(jù)實施例4的結果表明ROBO1蛋白的片段作為可溶ROBO1釋放和存在的事實，考慮可能是可溶ROBO1蛋白(sROBO1)存在于具有ROBO1高表達的癌癥患者，如肝細胞癌患者血清中，該片段認為可用作診斷標志物。因此，通過利用A7241A抗體的Western分析檢驗來自24個肝細胞癌患者，6個肝硬化患者和6個肝炎患者的每一血清中可溶ROBO1的存在。如上所述進行SDS-PAGE以及Western分析，利用5μl每一患者的血清，并且肝癌細胞系Alexander(ALX)的培養(yǎng)物上清用作陽性對照。結果，如圖6所示，與肝硬化和肝炎患者血清中的未檢出相反，24例的23例中在肝細胞癌患者血清中檢測到sROBO1。根據(jù)上述，顯示sROBO1也存在于患有表達ROBO1的癌癥的患者血清中，并且同時，作為表達ROBO1的癌癥如肝細胞癌的血清診斷標志物，sROBO1的檢測顯示是非常有效的。
實施例7可溶ROBO1(sROBO1-His)的制備如下所述制備具有添加至ROBO1胞外區(qū)C-末端的His-tag的可溶ROBO1(sROBO1-His)。
ROBO1cDNA用作模板，利用引物RBV2F-TA(SEQ.ID.13)和引物RB_SH_TA(SEQ.ID14)通過PCR方法擴增編碼胞外區(qū)的基因。PCR產(chǎn)物直接插入pBlueBack4.5-TOPO載體并且進行序列分析后，產(chǎn)生具有正確堿基序列的轉移載體sROBO1/pBB。利用4μgsROBO1/pBB，通過與實施例3類似的方法產(chǎn)生重組桿狀病毒。
然后，如下所述制備sROBO1-His。即，用表達sROBO1-His的重組桿狀病毒感染2×106/mL Sf9細胞以使MOI變成5，在27℃培養(yǎng)3天，回收其培養(yǎng)物上清。利用Ni-NTA superflow(QIAGEN)按照內(nèi)附的方案純化培養(yǎng)物上清中包含的sROBO1-His。利用Centircon-10(Amicon制造)，并且緩沖液更換為PBS而濃縮純化產(chǎn)物以制備sROBO1-His。
實施例8來自sROBO1免疫的兔血清的評估8-1.通過Western分析檢測ROBO1蛋白質(zhì)分子新西蘭白兔(10周大小的雌性，Clea Japan生產(chǎn))通過以100μg/0.5mL/動物懸浮于PBS中的純化的sROBO1抗原與0.5mL弗氏完全佐劑(DIFCO制造)混合形成乳劑而皮下注射而給予而，進行首次免疫。接著，以2周的時間間隔，懸浮于PBS中的純化的sROBO1抗原100μg/0.5rnL通過與0.5mL弗氏完全佐劑混合形成乳劑而皮下注射而進行總共四次免疫。在每次免疫之前以及第三次和免疫后進行血液的采集，并且通過ELISA方法測定sROBO1抗體水平的增加。即，sROBO1固定于ELISA聚苯乙烯平板板上，并且兔抗血清的稀釋行反應后，與辣根過氧化酶標記的抗兔IgG抗體(Cappel制造)反應并且用3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺試劑(TMB試劑；Cytech制造)顯色以測定抗體效價。驗證抗體水平的增加后，采集全血以獲得抗-ROBO1兔抗血清。
通過利用來自sROBO1免疫的兔血清的Western分析進行全長ROBO1分子的檢測。如上所述利用RIPA緩沖溶液從強制表達全長ROBO1的HEK293細胞制備的相當于10μg蛋白質(zhì)量的細胞裂解物經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠，并且分離蛋白質(zhì)后，轉移至Hybond-P(Amersham Bioscience制造)。隨后，當利用來自sROBO1免疫兔的100倍稀釋的血清作為一抗，并且利用HRP標記的抗兔IgG抗體(Amersham Bioscience制造)作為二抗的ECL plus(AmershamBioscience制造)進行檢測時，與陽性對照A7241A抗體類似，可檢測到認為是全長ROBO1分子的大約260kd分子量的條帶(圖7)。根據(jù)上述結果，來自sROBO1免疫兔的血清顯示能通過Western分析檢測全長ROBO1分子。
8-2.通過FACS分析檢測ROBO1蛋白為了評估來自sROBO1免疫的兔血清是否可檢測細胞表面的ROBO1，利用強制表達ROBO1的HEK293細胞進行FACS分析。即，強制表達ROBO1的HEK293細胞或陰性對照HEK293細胞懸浮于FACS溶液中(含有1％白蛋白和0.1％NaN3的PBS)。來自sROBO1免疫的兔血清添加至該細胞懸液且在4℃反應60分鐘，在用FACS溶液洗滌兩次后，添加FITC標記的抗兔F(ab)2抗體(DAKO制造)并且在4℃反應30分鐘。隨后，用FACS溶液洗滌兩次后，用FACScalibur(Beckton Dickinson制造)按照所用的指南進行FACS分析?？?V5-tag抗體(Invtrogen制造)用作本實驗的陽性對照，并且FITC標記的抗小鼠IgG抗體(Jackson制造)用作其二抗。因為V5-tag添加至ROBO1胞內(nèi)區(qū)的C末端，當使用一抗時利用含有0.1％皂甙的FACS溶液以使該抗體能檢測胞內(nèi)V5-tag。
結果，如圖8所示，與陽性對照抗-V5抗體的峰移位類似，還在sROBO1-免疫兔的血液中檢測到僅在強制表達ROBO1的HEK293細胞中的特異性的峰移位。
另外，如圖9所示，當按照如上所述相同的方法在內(nèi)在表達ROBO1的肝癌細胞系HepG2細胞中進行FACS分析時，在sROBO1免疫兔的血清中觀察到特異性的峰移位，表明也可檢測細胞表面上具有原始結構的ROBO1分子。
實施例9抗人ROBO1兔多克隆抗體的純化上述制備自sROBO1免疫兔血清的抗人ROBO1兔多克隆抗體，如下列所述通過具有固相ROBO1的親和層析進行純化。即，按照內(nèi)附的文本利用CNBr-活化的Sepharose 4B(Amasham Pharmacia Biotec#17-0430-02)，并且按照內(nèi)附的文件每1mL凝膠固定0.7mg純化的sROBO1-His抗原而產(chǎn)生sROBO1-His親和柱。隨后，按照常規(guī)方法從實施例8中獲得的兔血清純化抗-ROBO1兔多克隆抗體。
實施例10通過ELISA建立ROBO1測量系統(tǒng)以及檢測血液中的ROBO1利用實施例9中獲得的抗-ROBO1兔多克隆抗體構建ELISA檢測系統(tǒng)。即，抗-ROBO1兔多克隆抗體以5μg/mL的濃度稀釋于PBS中，并且每孔50μL分配入96-孔免疫-平板板中。在2至8℃過夜后，平板用含有0.05％Tween20的PBS洗滌三次，用每孔150μL免疫測定穩(wěn)定劑(ABI#10-601-001)進行包被一小時。此后，棄去溶液，在37℃干燥兩小時以轉變平板為固相抗-ROBO1平板抗體平板。關于用于檢測的生物素化的抗-ROBO1抗體，利用pH8.5的50mM碳酸鹽緩沖溶液制備分別為0.12mg/mL和46μg/mL的抗-ROBO1兔多克隆抗體和硫代-NHS-LC-生物素(Pierce#21335)，并且經(jīng)室溫下兩小時。未反應的生物素試劑利用PD-10(Pharmacia#17-0851-01)除去，并且通過用含有30％小牛血清的PBS稀釋至1μg/mL而制備生物素化的抗-ROBO1抗體。進一步，利用在含有30％小牛血清的tris-羥甲氨基甲烷緩沖的生理鹽水中稀釋至3μg/mL的鏈親和素標記的過氧化物酶(Vector#SA-5004)檢測生物素化的抗-ROBO1抗體，并且TMB試劑(Cytech#TM490041)用作過氧化物酶的檢測底物以及TMB終止試劑(Cytech#TSB999)用作底物反應的終止試劑。
然后，在來自72例健康受試者，79例肝癌患者，67例肝硬化/慢性肝炎患者以及22例其他癌癥患者的血消中測量ROBO1濃度。當測量ROBO1濃度時純化的sROBO1-His用作標準品。血清或sROBO1-His分別用含有20％兔血清以及1％BSA的tris-羥甲-氨基甲烷緩沖溶液稀釋90倍，并且每種100μL分配入上述抗體固相平板板的每個孔中。在室溫下溫育兩小時后，每種25μL生物素化的抗-ROBO1抗體分配入每個孔中。此外，在室溫下溫育兩小時后，除去每孔的反應溶液，分配100μl每種鏈親和素標記的過氧化物酶試劑。在室溫下溫育30分鐘后，平板用含有0.05％Tween20的PBS洗滌平板5次。分配100μL每種TMB試劑入每孔，并且在室溫下溫育30分鐘后，添加100μL TMB終止試劑，以及用EIA平板板讀數(shù)器(Corona Electric Co.，#MTP-120)測量450nm波長的吸收。主意630nm的波長用作參照。
結果，當利用sROBO1-His時，觀察到吸收值濃度-依賴的提高；此外，通過每個標準濃度吸收值的回歸確定每種血清中的濃度(圖10)。結果顯示在表3、4、5和6中。
表3.健康受試者血液中ROBO1的濃度



表4.肝癌患者血液中ROBO1的濃度




注意表中的空白表示“未測量的”。
表5.肝硬化和慢性肝炎患者血液中ROBO1的濃度



注意表中的空白表示“未測量的”。
表6.肝癌以外癌癥患者血液中ROBO1的濃度

根據(jù)72例健康受試者血清中ROBO1濃度的測量平均值和標準偏差為36ng/mL和8ng/mL的事實，81ng/mL，其為平均值+(6×標準偏差)，作為邊界值。結果，所有健康受試者例的血清樣品在該邊界值下；相反，肝癌患者樣品、肝硬化/慢性肝炎患者樣品和其他癌癥患者樣品中分別顯示46％(79例中的36例)、22％(67例中的15例)和9％(22例中的2例)的值不小于邊界值，而這些樣品認為是ROBO1陽性的。其間，根據(jù)通常用作肝癌診斷方法的AFP陽性率在肝癌患者樣品和肝硬化/慢性肝炎患者樣品中分別為46％(59例中的27例)和15％(52例中的8例)的事實，肝癌診斷中的靈敏度和特異性大約位于AFP和ROBO1之間。然而，根據(jù)32例AFP陰性肝癌患者樣品中存在10例ROBO1陽性樣品，而且在這10例中的5例PIVKA也是陰性的的事實，認為通過利用ROBO1，在通過現(xiàn)有診斷方法的不能診斷為肝癌的情況中診斷也成為可能。事實上，通過聯(lián)合使用ROBO1將AFP單獨檢測的46％的陽性率提高至63％。
根據(jù)上述，在肝癌的診斷中，ROBO1測量系統(tǒng)具有與目前應用的AFP測量系統(tǒng)大致等價的性能，可通過與現(xiàn)有癌癥標志物的聯(lián)合使用建立高靈敏度和特異性的癌癥診斷方法。
另外，按照表3、4、5和6中顯示的疾病值繪圖的結果在圖11中顯示。健康受試者(NHS)、慢性肝炎(CH)、肝硬化(LC)和肝癌(HCC)血清中的ROBO1濃度的平均值分別為34.8、39.3、74.0和84.4ng/mL。根據(jù)該結果，清楚的是來自每一組健康受試者、慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者的血清中ROBO1的濃度隨著肝臟疾病惡化成比例提高。
然后，為了確定對于每個個體ROBO1濃度是否也在實時測量中變化，在肝癌發(fā)病之前收集的血樣中進行ROBO1濃度的測量。結果，觀察到在3例中2例中血液中ROBO1濃度隨惡化成比例提高(圖12)。雖然在一例中沒有觀察到與惡化成比例的提高，根據(jù)該值比健康受試者高30至40ng/ml的事實，推測已達到最大值。
這些結果表明患者中不僅肝癌的診斷而且肝臟疾病范圍的診斷可通過實時測量，即通過監(jiān)測肝臟疾病血清中的ROBO1濃度而完成。
實施例11補體-依賴的細胞毒性(CDC活性)的測量產(chǎn)生人白蛋白veronal緩沖液(HAVB)溶解12.75gNaCl(特級，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，0.5625g巴比妥鈉(特級，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)和0.8625g巴比妥(特級，Wako Pure Chemical Industries，.)于Milli Q水中并且補至200mL后，進行高壓滅菌處理(121℃，20分鐘)。添加100mL體積高壓滅菌的熱Milli Q水并且驗證pH7.43(推薦pH7.5)。此用作5×veronal緩沖液。0.2205g量的CaCl2·2H2O(特級，Junsei ChemicalCo.，Ltd.)溶于50mL Milli Q水以達到0.03mol/L，其用作CaCl2溶液。1.0165g量的MgCl2·6H2O(特級，Junsei Chemical Co.，Ltd.)溶于50mLMilli Q水以達到0.1mol/L，其用作MgCl2溶液。100mL體積的5Xveronal緩沖液，4mL人血清白蛋白(25％Buminate(注冊商標)，250mg/mL人血清白蛋白濃縮物，Baxter)，2.5mL CaCl2溶液，2.5mLMgCl2溶液，0.1gKCl(特級，Junsei Chemical Co.，Ltd.)以及0.5g葡萄糖(D(+)-葡萄糖，無水葡萄糖，特級，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)溶于Milli Q水中，并且得到的溶液加至500mL。此用作HAVB。過濾除菌后，溶液在5℃的設定溫度保存。
靶細胞的制備在補充10％FBS(Thermo Trace)和0.5mg/mL遺傳霉素(Geneticin)(GIBCO)的DMEM培養(yǎng)基(SIGMA)中培養(yǎng)強制表達ROBO1的HEK293細胞，利用細胞分離緩沖溶液(GIBCO)從平板板分離，以96-孔U平板底平板(BECTON DICKINSON)的每孔1×104細胞/孔分配，并且培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后，添加5.55MBq鉻-51，在5％二氧化碳的溫箱中進行37℃培養(yǎng)一小時，該細胞用HAVB洗滌兩次，并且添加50μLHAVB以獲得靶細胞。
幼兔補體的制備幼兔補體(BABY RABBIT COMPLEMENT，CEDARLANE)，其在使用前立即制備，在檢查的時候溶于每瓶1mL可注射蒸餾水中(FusoPharmaceutical Industries，Ltd.)，用作補體溶液。
鉻釋放檢驗(CDC活性)抗-ROBO1抗血清(抗-ROBO1兔多克隆抗體)用HAVB稀釋至獲得50倍-以及500倍-抗體溶液。50μL體積的每種抗體溶液添加至靶細胞，其隨后放于冰上15分鐘。然后，100μg/mL每種補體溶液添加至每孔(最終的抗體稀釋比200倍和2000倍)，并且37℃放于5％的二氧化碳溫箱中90分鐘。平板板離心分離后，從每孔回收100μL每種上清，并且用γ粒子計數(shù)器測量放射性。根據(jù)下列公式確定特定的鉻釋放率特定的鉻釋放率(％)＝(A-C)/(B-C)×100其中A代表孔中的放射性(cpm)，B代表其中100μL2％NP-40水溶液(Nonidet P-40，Nacalai Tesque Co，Ltd.)和50μL HAVB添加至靶細胞的孔中的放射性(cpm)平均值，以及C代表其中150μL HAVB添加至靶細胞的孔中的放射性(cpm)平均值。檢驗一式三份進行，并且對CDC活性(％)計算平均值和標準偏差。
結果在圖13中顯示。顯然，抗-ROBO1抗血清，即抗-ROBO1多克隆抗體呈現(xiàn)對表達ROBO1的HEK293細胞的劑量-依賴的CDC活性。注意當利用兔的免疫前血清時，未證實CDC活性，與不添加抗體類似。
實施例12結合ROBO1胞外區(qū)的單克隆抗體的產(chǎn)生
12-1.表達ROBO1 N末端部位的重組桿狀病毒的產(chǎn)生存在于ROBO1胞外區(qū)的粘連蛋白III區(qū)域(FnIII)作為與桿狀病毒膜蛋白gp64的融合蛋白表達。即，通過用上述ROBO1cDNA作為模板，利用gp4F引物(SEQ.ID15)和gp4R引物(SEQ.ID16)的PCR方法擴增編碼ROBO1第三個粘連蛋白區(qū)域的基因，隨后插入pGEM-Te載體中(Promega制造)。通過已建立的方法驗證堿基序列后，用限制性核酸內(nèi)切酶KpnI切割的基因片段插入pBucSurf載體(Novagen制造)以構建轉移載體ROBO1gp4/pBS。隨后，利用限制性核酸內(nèi)切酶BplI(Fermentas制造)切割4μg ROBO1gp4/pBS并且線性化后，其與Bac-N-Blue DNA一起按照Invitrogen的說明書導入Sf9細胞以制備表達ROBO1的FnIII和gp64融合蛋白的重組桿狀病毒。
SEQ.ID15GGTACCCGCACCCAGTGCCCCACCCCAAGGSEQ.ID16GGTACCGCATCTGAAATCTGCTGAGCGAGG添加如上制備的重組病毒以感染Sf9細胞(2×106細胞/mL)以使MOI為5，其隨后在27℃培養(yǎng)3天。培養(yǎng)3天后從培養(yǎng)物上清回收表達ROBO1-FnIII和gp64融合蛋白的出芽桿狀病毒(BV)。即，培養(yǎng)溶液在800xg離心15分鐘并且除去細胞以及細胞碎片，并且隨后回收的培養(yǎng)物上清在45,000xg離心30分鐘。沉淀懸浮于PBS并且在800xg進一步離心除去細胞組分，并且通過在45,000xg再次離心上清而獲得的沉淀懸浮于PBS中作為BV組分，且用作免疫的抗原。
12-2.抗-ROBO1單克隆抗體的產(chǎn)生通過上述方法制備的表達ROBO1-FnIII的BV用作抗原以產(chǎn)生抗-ROBO1單克隆抗體。即，相當于1mg蛋白質(zhì)量的表達ROBO1-FnIII的BV和200ng百日咳毒素的混合物懸浮在PBS中，通過皮下注射入gp64轉基因小鼠(WO03/104453)而進行首次免疫。在后來的免疫中，僅皮下注射相當于500μmg蛋白質(zhì)量的表達ROBO1-FnIII的BV。作為最終的免疫，經(jīng)血管內(nèi)給予250μg表達ROBO1-Ig1的BV，此后3天，從小鼠分離脾細胞，并且按照常規(guī)方法進行與小鼠NS-1細胞的細胞融合以建立雜交瘤細胞。通過ELISA進行產(chǎn)生抗-ROBO1抗體的雜交瘤細胞的選擇，其中用于免疫的抗原的表達ROBO1-FnIII的BV為固相的。對于ELISA方法，表達ROBO1-FnIII的BV在4℃置于96-孔平底平板中(Falcon制造)一晝夜以使終濃度變?yōu)?0μg/ml，此后包含40％Block Ace試劑(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd制造)的TBS緩沖溶液用于封閉，隨后添加雜交瘤培養(yǎng)上清，反應在室溫下進行1小時。然后，HRP標記的抗鼠IgG抗體(Jackson制造)在室溫下反應1小時，洗滌4次后，3，3’，5，5’-四甲苯(TMB)試劑(Sigma制造)在室溫下反應1小時。用0.5N硫酸終止反應，并且用微量培養(yǎng)板讀數(shù)器MultickanJX(Labsystems制造)測量492nm的光密度。
結果，成功建立產(chǎn)生結合ROBO1的單克隆抗體的雜交瘤細胞B2318C。通過硫酸銨沉淀方法從產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞的培養(yǎng)物上清制備單克隆抗體。
實施例13補體-依賴的細胞毒性(CDC活性)的測量與實施例11類似，進行人白蛋白veronal緩沖液(HAVB)的產(chǎn)生，靶細胞制備物的制備，以及幼兔補體的制備。
B2318C抗體(抗-ROBO1單克隆抗體)用HAVB稀釋，每種50μL添加至靶細胞，其放于冰上15分鐘。然后，100μg/mL每種補體溶液添加至每孔(制備以使抗體終濃度為1μg/mL和10μg/mL)，并且37℃放于5％的二氧化碳溫箱中90分鐘。平板離心分離后，從每孔回收100μL每種上清，并且用γ粒子計數(shù)器測量放射性。根據(jù)下列公式確定特定的鉻釋放率特定的鉻釋放率(％)＝(A-C)/(B-C)×100其中A代表孔中的放射性(cpm)，B代表其中100μL2％NP-40水溶液(Nonidet P-40，Nacalai Tesque Co，Ltd.)和50μLHAVB添加至靶細胞的孔中的放射性(cpm)平均值，以及C代表其中150μL HAVB添加至靶細胞的孔中的放射性(cpm)平均值。檢驗一式三份進行，并且對CDC活性(％)計算平均值和標準偏差。
結果在圖14中顯示。顯然，B2318C抗體，即抗-ROBO1單克隆抗體呈現(xiàn)對表達ROBO1的HEK293細胞劑量-依賴的CDC活性。
另外當在也為肝癌細胞系的Alexander(PLC/PRF/5)細胞上嘗試CDC活性檢驗時，顯然B2318C抗體，即抗-ROBO1單克隆抗體，類似于對表達ROBO1的HEK293細胞的作用，表現(xiàn)出劑量-依賴的CDC活性。
實施例14利用小鼠骨髓來源的效應細胞測量ADCC活性14-1.小鼠骨髓來源的效應細胞溶液的制備從SCID小鼠(10周大小的雄性，Clea Japan)的股骨收集骨髓細胞，懸浮以獲得10％FBS/RPMI1640培養(yǎng)基中5×105細胞/mL，添加小鼠GM-CSF(PeproTech)和人IL-2(PeproTech)以分別達到10ng/mL和50ng/mL，細胞在37℃，5％的二氧化碳溫箱中培養(yǎng)5天。培養(yǎng)后，用刮器刮落細胞，用培養(yǎng)基洗滌一次，懸浮以達到10％FBS/RPMI1640培養(yǎng)基中5×106/細胞/mL，其用作小鼠骨髓來源的效應細胞溶液。
14-2靶細胞的制備強制表達ROBO1的HEK293細胞在含有10％FBS(ThermoTrace制造)和500ng/mL遺傳霉素(Invitrogen)的DMEM培養(yǎng)基(Sigma制造)中傳代培養(yǎng)，利用細胞解離緩沖液(Invitrogen)與培養(yǎng)皿分離，以96-孔U底平板(Falcon)的每孔1×104細胞/孔分配，并且培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后，在37℃，5％二氧化碳溫箱中進行添加5.55MBq鉻-51的培養(yǎng)四小時，該細胞用培養(yǎng)基洗滌三次，添加50μL10％的FBS/RPMI1640培養(yǎng)基以獲得靶細胞。
14-3.鉻釋放檢驗(ADCC活性)50μL體積的B2318C抗體(抗-ROBO1單克隆抗體)溶液添加至靶細胞，其隨后放于冰上15分鐘，隨后添加100μL小鼠骨髓-來源的效應細胞溶液(5×105細胞/孔)，并且細胞在37℃，5％二氧化碳溫箱中培養(yǎng)4小時(制備以使最終的抗體濃度為1μg/mL和10μg/mL)。此后，進行平板的離心分離，并且用γ粒子計數(shù)器測量100μL培養(yǎng)上清中的放射性。根據(jù)下列公式確定特定的鉻釋放率特定的鉻釋放率(％)＝(A-C)×100/(B-C)其中A代表孔中的放射性(cpm)平均值，B代表其中100μL2％NP-40水溶液(Nonidet P-40，代碼No.252-23，Nacalai Tesque Co，Ltd.)和50μL10％的FBS/RPMI培養(yǎng)基添加至靶細胞的孔中的放射性(cpm)平均值，以及C代表其中150μL10％的FBS/RPMI培養(yǎng)基添加至靶細胞的孔中的放射性(cpm)平均值。檢驗一式三份進行，并且對ADCC活性(％)計算平均值和標準偏差。
結果在圖16中顯示。顯然，B2318C抗體，即抗-ROBO1單克隆抗體呈現(xiàn)對表達ROBO1的HEK293細胞劑量-依賴的ADCC活性。
根據(jù)上述，證實了利用抗-ROBO1單克隆抗體對表達ROBO1的癌細胞的治療有效性。
本發(fā)明在癌癥的診斷和治療，以及肝炎惡化的監(jiān)測中是有效的。
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權利要求
1.一種癌癥診斷方法，其特征是檢測ROBO1蛋白的。
2.根據(jù)權利要求1的診斷方法，其中檢測ROBO1蛋白的胞外區(qū)。
3.根據(jù)權利要求1的診斷方法，其中利用識別ROBO1蛋白的抗體。
4.根據(jù)權利要求1的診斷方法，其中檢測血液中、血清中或血漿中的ROBO1蛋白。
5.根據(jù)權利要求1的診斷方法，其中檢測從細胞分離的ROBO1蛋白。
6.一種癌癥診斷方法，包括(a)從受試者收集樣品的步驟，和(b)檢測包含在所收集樣品中的ROBO1蛋白的步驟。
7.根據(jù)權利要求6的診斷方法，其中從受試者收集的樣品為血液、血清或血漿。
8.根據(jù)權利要求6的診斷方法，其中檢測ROBO1蛋白的胞外區(qū)。
9.根據(jù)權利要求6的診斷方法，其中利用識別ROBO1蛋白的抗體。
10.用于診斷癌癥的試劑盒，包含結合ROBO1蛋白的抗體。
11.根據(jù)權利要求10的試劑盒，其中癌癥為肝細胞癌。
12.根據(jù)權利要求10或11的試劑盒，其中該抗體為結合ROBO1蛋白胞外區(qū)的抗體。
13.藥物組合物，包含作為有效成分的結合ROBO1的抗體。
14.細胞生長抑制劑，包含作為有效成分的結合ROBO1的抗體。
15.抗癌劑，包含作為有效成分的結合ROBO1的抗體。
16.根據(jù)權利要求15的抗癌劑，其中結合ROBO1的抗體為具有細胞毒性的抗體。
17.根據(jù)權利要求15或16的抗癌劑，其中該癌癥為肝細胞癌。
18.用于治療由異常細胞生長引起的疾病的方法，包括將包含作為有效成分的結合ROBO1的抗體的藥物組合物施予需要治療的患者。
19.用于治療癌癥的方法，包括將包含作為有效成分的結合ROBO1的抗體的藥物組合物施予需要治療的患者。
20.根據(jù)權利要求18或19的方法，其中該癌癥為肝細胞癌。
21.一種在表達ROBO1的細胞中引起細胞損傷的方法，其通過將表達ROBO1的細胞與結合ROBO1的抗體接觸。
22.一種抑制表達ROBO1的細胞生長的方法，其通過將表達ROBO1的細胞與結合ROBO1的抗體接觸。
23.根據(jù)權利要求21或22的方法，其中結合ROBO1的抗體為具有細胞毒性的抗體。
24.根據(jù)權利要求21至23任何一項的方法，其中表達ROBO1的細胞為癌細胞。
25.一種抗體，其結合ROBO1并且對表達ROBO1的細胞具有細胞毒性。
26.一種用于監(jiān)測肝炎惡化的試劑盒，包含抗-ROBO1抗體。
27.根據(jù)權利要求26的試劑盒，其中抗-ROBO1抗體為特異性識別ROBO1的抗體。
28.根據(jù)權利要求26或27的試劑盒，其預測從肝炎或肝硬化至肝癌的轉變。
29.根據(jù)權利要求26至28任何一項的試劑盒，包含固定于支持物上的抗-ROBO1第一抗體和用標記物標記的抗-ROBO1第二抗體。
30.用于監(jiān)測肝炎惡化的方法，其特征是測量檢驗樣品中的ROBO1。
31.根據(jù)權利要求30的監(jiān)測方法，其中抗-ROBO1抗體用于測量檢驗樣品中的ROBO1。
32.根據(jù)權利要求31的監(jiān)測方法，其中抗-ROBO1抗體為特異性識別ROBO1的抗體。
33.根據(jù)權利要求30至32任何一項的監(jiān)測方法，其中檢驗樣品為血液、血清或血漿。
34.根據(jù)權利要求30至33任何一項的監(jiān)測方法，其預測從肝炎或肝硬化至肝癌的轉變。
35.根據(jù)權利要求30至34任何一項的監(jiān)測方法，其利用固定于支持物上的抗-ROBO1第一抗體和用標記物標記的抗-ROBO1第二抗體。
全文摘要
公開了特征在于檢測ROBO1蛋白的診斷癌癥的方法。另外，公開了包含作為有效成分的結合ROBO1的抗體的藥物組合物，細胞生長抑制劑和抗癌劑。進一步，公開了通過將表達ROBO1的細胞與結合ROBO1的抗體接觸，而在表達ROBO1的細胞中誘導細胞毒性的方法以及抑制表達ROBO1的細胞生長的方法。此外，公開了通過檢測ROBO1蛋白而用于監(jiān)測肝炎惡化的方法。
文檔編號G01N33/576GK101014860SQ20058001049
公開日2007年8月8日 申請日期2005年3月31日 優(yōu)先權日2004年3月31日
發(fā)明者油谷浩幸, 筆寶義隆, 渡邊亮, 深山正久, 伊藤行夫, 新井正廣, 伊藤浩孝, 大友俊彥, 舟橋真一, 木下恭子 申請人:中外制藥株式會社, 油谷浩幸, 株式會社英仙蛋白質(zhì)科學