專利名稱：癌癥疾病改善抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥疾病改善抗體(CDMAB)的分離和制備以及這些CDMAB在治療和診斷過程中的應(yīng)用，選擇性地與一種或多種化療試劑組合應(yīng)用。本發(fā)明進一步涉及運用本發(fā)明的CDMAB進行的結(jié)合實驗。
背景技術(shù)：
每個患有癌癥的個體是獨特的，正如人的身份有所不同，其所患癌癥不同于其它癌癥。盡管如此，目前的治療采用相同的方法治療患有同類癌癥處于同樣階段的所有患者。這些患者中至少有30％在一線治療(first line treatment)中失敗，由此造成更多輪次的治療，增加了治療失敗、癌癥轉(zhuǎn)移和最終死亡的可能性。治療的最佳方法是針對特定個體定制療法。當(dāng)前唯一的定制療法是外科手術(shù)?；熀头暖煵荒茚槍颊哌M行設(shè)計，而手術(shù)本身在大多數(shù)病例中不足以治愈癌癥。
伴隨著單克隆抗體的出現(xiàn)，發(fā)展定制療法的可能性變得更加現(xiàn)實，因為各抗體可以導(dǎo)向單個抗原決定簇。進一步地，制備導(dǎo)向一群抗原決定簇的抗體組合成為可能，這些抗原決定簇唯一地定義了特定個體的癌癥。
在認(rèn)識到癌細(xì)胞和正常細(xì)胞之間的顯著差異在于癌細(xì)胞含有轉(zhuǎn)化細(xì)胞所特有的抗原后，科學(xué)界長期認(rèn)為可以設(shè)計單克隆抗體通過與這些癌抗原的特異結(jié)合專一地作用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞；由此產(chǎn)生信念認(rèn)為單克隆抗體可以作為“魔術(shù)子彈”去除癌細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明公開的方法分離出的單克隆抗體已經(jīng)顯示能夠以有利于患者的方式改善癌癥疾病的進程，例如通過降低腫瘤負(fù)荷。這些單克隆抗體在此被稱作癌癥疾病改善抗體(CDMAB)或“抗癌”抗體。
當(dāng)前，癌癥患者的治療選擇通常很少。統(tǒng)一而嚴(yán)格的癌癥治療方法在整體存活和發(fā)病率方面有所改善。然而，對于特定個體，這些改善了的統(tǒng)計數(shù)字和他們個人情況的改善沒有必然關(guān)聯(lián)。
因此，如果采用方法學(xué)使得操作者能夠在同組患者中獨立于其他患者治療每一例癌癥，該方法學(xué)將允許針對每個人進行獨特設(shè)計的治療。理想地，這樣的治療過程將提高治愈率，產(chǎn)生更好的效果，由此滿足長期需要。
歷史上，多克隆抗體在人癌癥的治療中已取得了有限的成功。已經(jīng)采用人血漿對淋巴瘤和白血病進行了治療，但是幾乎沒有長期的緩解或應(yīng)答。此外，該方法缺乏可重復(fù)性，和化療相比沒有額外的益處。已經(jīng)采用人全血、黑猩猩血清、人血漿和馬血清對實體瘤如乳腺癌、黑素瘤和腎細(xì)胞癌進行了治療，相應(yīng)產(chǎn)生了無法預(yù)測和無效的結(jié)果。
已經(jīng)進行了很多用單克隆抗體治療實體瘤的臨床實驗。在20世紀(jì)80年代針對人乳腺癌進行了至少4次臨床實驗，用針對特定抗原或基于組織選擇性的抗體在至少47名患者中只產(chǎn)生了1名應(yīng)答者。直到1998年才使用人源化抗Her 2抗體結(jié)合順鉑進行了成功的臨床實驗。在該實驗中對37名患者的應(yīng)答進行了觀察，其中大約四分之一有部分應(yīng)答率，另一半具有較慢或穩(wěn)定的疾病進程。
研究結(jié)直腸癌的臨床實驗采用了針對糖蛋白和糖脂靶點的抗體。諸如對腺癌有一定專一性的17-1A抗體，已經(jīng)進入了二期臨床，在60多名患者中只有1名產(chǎn)生了部分應(yīng)答。在其它實驗中，在附加使用環(huán)磷酰胺的方法中，17-1A的使用在52名患者中只產(chǎn)生了一個完全應(yīng)答和兩個微弱應(yīng)答。其它使用17-1A的實驗產(chǎn)生的效果相似。起初被批準(zhǔn)用來成像的人源化鼠單克隆抗體的使用同樣不能引起腫瘤的消退。迄今為止還沒有能夠有效治療結(jié)直腸癌的抗體。同樣的，對于肺癌、腦癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌的治療效果均不能令人滿意。用抗GD3單克隆抗體治療黑素瘤已經(jīng)取得了有限的成功。因此，可以看出盡管有成功的小動物實驗，這些實驗是人臨床試驗的前提，但已測試的抗體大部分還是無效的。
現(xiàn)有專利美國專利號5,750,102公開了一種用MHC基因轉(zhuǎn)染患者腫瘤細(xì)胞的方法，MHC基因可以從患者的細(xì)胞或組織克隆。隨后用這些轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對患者進行預(yù)防接種。
美國專利號4,861,581公開的方法包括的步驟有獲取對哺乳動物腫瘤和正常細(xì)胞的一種細(xì)胞內(nèi)組分而非胞外組分具有專一性的單克隆抗體；標(biāo)記單克隆抗體；將標(biāo)記后的抗體與接受治療的哺乳動物組織進行接觸以殺死腫瘤細(xì)胞；以及通過測定標(biāo)記抗體與降解的腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)組分的結(jié)合確定療效。在制備針對人胞內(nèi)抗原的抗體時，專利權(quán)人認(rèn)識到惡性細(xì)胞代表了這類抗原的便捷來源。
美國專利號5,171,665提供了一種全新抗體及該抗體的制備方法。特別地，該專利對一種單克隆抗體的形成進行了指導(dǎo)，該單克隆抗體可以和人腫瘤相關(guān)蛋白抗原發(fā)生很強地結(jié)合，例如結(jié)腸癌和肺癌，但和正常細(xì)胞的結(jié)合程度小得多。
美國專利號5,484,596提供了一種癌癥治療的方法，該方法包括從人癌癥患者體內(nèi)手術(shù)去除腫瘤組織；處理腫瘤組織獲得腫瘤細(xì)胞；照射腫瘤細(xì)胞，使其可以存活但不再是致瘤的；以及采用這些細(xì)胞為患者制備疫苗，該疫苗能夠抑制原發(fā)瘤的復(fù)發(fā)并同時抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。該專利對與腫瘤細(xì)胞表面抗原反應(yīng)的單克隆抗體的開發(fā)進行了指導(dǎo)。如第4列第45行及其以后所述，專利權(quán)人用內(nèi)源性腫瘤細(xì)胞開發(fā)單克隆抗體，在人腫瘤形成中形成有活性的專一免疫療法。
美國專利號5,693,763提供了人癌癥特征性的糖蛋白抗原，且其不依賴于其來源的上皮組織。
美國專利號5,783,186提出了誘導(dǎo)Her2表達細(xì)胞凋亡的抗Her2抗體，生成抗體的雜交瘤細(xì)胞系，用抗體和含有所述抗體的藥物組合物治療癌癥的方法。
美國專利號5,849,876描述了新的雜交瘤細(xì)胞系，該細(xì)胞系可生成從腫瘤和非腫瘤組織源中純化出的粘蛋白抗原的單克隆抗體。
美國專利號5,869,268提出了人淋巴細(xì)胞的生成方法，該淋巴細(xì)胞產(chǎn)生專一針對目標(biāo)抗原的抗體，生產(chǎn)單克隆抗體的方法以及用這種方法生產(chǎn)的單克隆抗體。該專利特別提到一種抗-HD人單克隆抗體的制備，該抗體可用于癌癥的診斷和治療。
美國專利號5,869,045涉及與人體癌癥細(xì)胞反應(yīng)的抗體、抗體片段、抗體偶聯(lián)物和單鏈免疫毒素。這些抗體的功能機制是雙重的，分子與人癌表面上的細(xì)胞膜抗原反應(yīng)，進一步地抗體在結(jié)合之后能夠內(nèi)化進癌細(xì)胞，使它們特別適于形成抗體-藥物和抗體-毒素偶聯(lián)物。在特定濃度下未修飾的抗體同樣具有明顯的細(xì)胞毒性。
美國專利號5,780,033公開了自身抗體在腫瘤治療和預(yù)防中的應(yīng)用。但是，該抗體是源自老年哺乳動物的抗細(xì)胞核自身抗體。在該例中，自身抗體據(jù)稱是免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一類天然抗體。因為自身抗體來自“老年哺乳動物”，因此不要求自身抗體真正來自接受治療的患者。此外該專利公開了老年哺乳動物中的天然和單克隆抗核自身抗體，以及制備單克隆抗核自身抗體的雜交瘤細(xì)胞系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明者此前已被授予名為“個性化的患者專一性抗癌抗體(Individualized Patient Specific Anti-Cancer Antibodies)”的美國專利6,180,357，該專利提出了個性化定制的用于治療癌癥疾病的抗癌抗體的選擇方法。為了本文的目的，術(shù)語“抗體”和“單克隆抗體”(mAb)可交替使用來指雜交瘤(例如鼠或人的)生成的完整的免疫球蛋白、免疫偶聯(lián)物和合適的由免疫球蛋白衍生出的免疫球蛋白片段和重組蛋白，如嵌合的和人源化免疫球蛋白、F(ab’)和F(ab’)2片段、單鏈抗體、重組免疫球蛋白可變區(qū)(Fv)等。進一步地，將標(biāo)準(zhǔn)的化療模式例如放射核與本發(fā)明的CDMAB偶聯(lián)由此關(guān)注所述化療的應(yīng)用也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。CDMAB還可以與毒素、細(xì)胞毒成份或酶如生物素偶聯(lián)酶偶聯(lián)。
本申請使用‘357專利中生產(chǎn)患者專一性抗癌抗體的方法分離雜交瘤細(xì)胞系，這些細(xì)胞系編碼癌癥疾病改善單克隆抗體。這些抗體可以專一性地針對一種腫瘤制備，由此使得癌癥治療的定制成為可能。在本申請全文中，具有殺死細(xì)胞(細(xì)胞毒性的)或抑制細(xì)胞生長(抑制細(xì)胞生長的)性質(zhì)的抗癌抗體在此后將被稱作細(xì)胞毒性的。這些抗體可用于幫助癌癥的定級和診斷，也可用于腫瘤轉(zhuǎn)移的治療。
個性化抗癌治療的前景將給患者的管理方式帶來改變?？赡艹霈F(xiàn)的臨床情景是在腫瘤出現(xiàn)時獲取并儲存腫瘤樣品。通過這個樣品，可以用一組既存的癌癥疾病改善抗體檢測腫瘤的類型?；颊邔闯Ｒ?guī)定級但是適用的抗體可以用于對患者進一步的定級。可以用存在的抗體立即對患者進行治療，且/或可以使用在此概述的方法或通過噬菌體表面展示文庫結(jié)合在此公開的篩選方法制備一組腫瘤專一抗體。將生成的所有抗體加入抗癌抗體文庫，因為其它腫瘤可能與正在接受治療的腫瘤存在部分相同的抗原決定簇。根據(jù)本方法生產(chǎn)的抗體可用于治療任意數(shù)量患者的癌癥疾病，如果這些患者的癌癥可以與這些抗體結(jié)合。
基本使用美國專利6,180,370的方法，在用患者肺腫瘤活檢細(xì)胞使小鼠免疫之后，獲得小鼠單克隆抗體H460-16-2。H460-16-2抗原在來自不同組織的廣泛的人細(xì)胞系的細(xì)胞表面表達。乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(MB-231)是經(jīng)測試的2種癌細(xì)胞系中唯一對H460-16-2細(xì)胞毒效應(yīng)敏感的細(xì)胞系。
在細(xì)胞培養(yǎng)中H460-16-2對MB-231細(xì)胞的細(xì)胞毒性結(jié)果通過在其被移植進小鼠時對這些細(xì)胞的抗腫瘤活性得以進一步延伸。在乳腺癌體內(nèi)模型中，人MB-231細(xì)胞被移植進免疫缺陷小鼠后頸部的皮膚下，因為這些小鼠由于缺乏某些免疫細(xì)胞不能拒絕人腫瘤細(xì)胞。臨床前異種移植腫瘤模型被認(rèn)為是治療功效的有效預(yù)測。小鼠中的異種移植物生長為實體瘤，形成間質(zhì)、中央壞死和新生血管。哺乳動物腫瘤細(xì)胞系MB-231已被評為免疫缺陷小鼠的體內(nèi)異種移植模型。MB-231腫瘤的成功移植或“獲取率”以及腫瘤對標(biāo)準(zhǔn)化療試劑的敏感性說明其是合適的模型。在異種移植腫瘤模型中，母細(xì)胞系及細(xì)胞系的變體已被用于異種移植腫瘤模型對廣泛的治療試劑進行評估。
在人乳腺癌的預(yù)防性體內(nèi)模型中，在腫瘤細(xì)胞移植前1天用H460-16-2對小鼠給藥并在隨后的7周每周注射。在治療期間，H460-16-2治療比同型對照抗體顯著更有效地(p＜0.0001)抑制腫瘤生長，同型對照抗體在結(jié)構(gòu)和大小上與H460-16-2相同但不能結(jié)合MB-231細(xì)胞。在治療期結(jié)束時，接受H460-16-2的小鼠其腫瘤生長只有對照組的1.3％。在治療后的后續(xù)期間，H460-16-2的治療效應(yīng)繼續(xù)維持，且直到測量期結(jié)束，治療組的平均腫瘤體積一直顯著地小于對照組。使用存活作為抗體效應(yīng)的衡量指標(biāo)，據(jù)估計在治療后的70天，H460-16-2治療組中的死亡風(fēng)險是抗體緩沖液對照組的大約71％(p＝0.028)。這些數(shù)據(jù)說明H460-16-2治療與對照治療組相比具有存活益處。由于沒有誘導(dǎo)任何毒性跡象，包括體重降低和臨床痛苦，H460-16-2治療似乎是安全的。因此，H460-16-2治療是有效的，因為在完善的人乳腺癌模型中它與對照治療組相比延緩了腫瘤的生長并提高了存活。這些結(jié)果也是可重復(fù)的，因為在另一個此類研究中觀察到相似的發(fā)現(xiàn)且暗示其與人癌癥治療的關(guān)聯(lián)和益處。
除了乳腺癌的預(yù)防性體內(nèi)腫瘤模型，H460-16-2在體內(nèi)成熟腫瘤的模型中證明了對MB-231細(xì)胞的抗腫瘤活性。在該異種移植腫瘤模型中，MB-231乳腺癌細(xì)胞被皮下移植進免疫缺陷小鼠由此在抗體治療前腫瘤達到臨界尺寸。將H460-16-2的治療和標(biāo)準(zhǔn)化療藥物順鉑比較，比較顯示順鉑和H460-16-2治療組和接受抗體稀釋緩沖液或同型對照抗體治療的組相比具有顯著小的平均腫瘤體積(p＜0.001)。H460-16-2治療介導(dǎo)了大約為順鉑化療2/3的腫瘤抑制但沒有順鉑治療中觀察到的顯著的體重降低(p＜0.003)和臨床痛苦。H460-16-2的抗腫瘤活性及其最小化的毒性使其成為一種具有吸引力的抗癌治療試劑。
在治療后階段，H460-16-2顯示了顯著的存活益處(p＜0.02)，因為在治療后的＞70天，H460-16-2組的死亡風(fēng)險是同型對照抗體組的一半。觀察到的存活益處持續(xù)到治療后的120天，其時相比于67％的H460-16-2治療組，100％的同型對照和順鉑治療小鼠死亡。和同型對照抗體組相比，通過以26％的比例延緩腫瘤生長，H460-16-2維持對腫瘤的抑制。在治療后的31天，H460-16-2通過以相對于同型對照組48％的比例減慢腫瘤生長從而限制腫瘤體積，這和在治療結(jié)束時觀察到的49％的降低相當(dāng)。在乳腺癌的成熟腫瘤模型中，這些結(jié)果意味著H460-16-2在治療期以外維持腫瘤抑制的滑力且證明了抗體在哺乳動物體內(nèi)降低腫瘤負(fù)荷和提高存活的能力。
通過免疫組織化學(xué)(IHC)染色，用H460-16-2對取自多個器官的小鼠組織切片染色以在不同組織的各細(xì)胞型中定位H460-16-2抗原。與H460-16-2在體內(nèi)對MB-231細(xì)胞的腫瘤抑制效應(yīng)相一致，H460-16-2抗原在從皮下移植了MB-231細(xì)胞的未經(jīng)治療的小鼠中獲得的腫瘤組織切片中大量表達。在小鼠正常組織中必須表達H460-16-2抗原以支持小鼠成為H460-16-2毒性的合適模型。觀察到H460-16-2抗原在小鼠中呈現(xiàn)有限的表達模式，因為該抗原僅在腎臟和卵巢表達。為了證實小鼠是毒性的合適模型，在正常的人組織中需要有相似的抗原表達。
為了臨床實驗和驗證合適的毒性動物模型，確定了H460-16-2對正常人組織的專一性。通過H460-16-2的IHC染色，大部分組織沒有表達H460-16-2抗原，包括要害器官如肝臟、腎臟、心臟和肺。H460-16-2對皮膚、輸尿管、胃和前列腺發(fā)生了染色，并對唾液腺發(fā)生了強染色。組織染色的結(jié)果意味著H460-16-2呈現(xiàn)對各種細(xì)胞類型的受限結(jié)合但與浸潤巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和纖維原細(xì)胞結(jié)合。因此，數(shù)據(jù)顯示小鼠可能不是毒性的最佳模型，因為盡管小鼠和人都呈現(xiàn)了有限的H460-16-2組織表達，兩物種之間染色陽性的組織并不相同。
H460-16-2抗原的定位及其在乳腺癌患者中的普遍性對評價H460-16-2免疫治療對患者的益處和設(shè)計有效臨床實驗是重要的。為了弄清H460-16-2抗原在癌癥患者乳腺腫瘤中的表達，對來自50個乳腺癌患者的腫瘤組織樣品中H460-16-2抗原的表達進行了篩選。研究結(jié)果顯示64％的組織為H460-16-2抗原染色陽性。在患者樣品中H460-16-2的表達似乎對癌細(xì)胞具有專一性因為染色限制在惡性細(xì)胞。相反，H460-16-2對乳腺癌患者9個正常組織樣品中的2個發(fā)生了染色。乳腺腫瘤中H460-16-2抗原的表達似乎主要定位在惡性細(xì)胞的細(xì)胞膜上，使其成為具有吸引力的治療靶點?；诖萍に睾驮型荏w在乳腺腫瘤中的表達對H460-16-2的表達進行了進一步的評估，這兩種激素受體在乳腺腫瘤的發(fā)展、治療和預(yù)后中發(fā)揮重要作用。在H460-16-2抗原表達和雌激素或孕酮受體表達之間沒有明顯的關(guān)聯(lián)性。當(dāng)根據(jù)腫瘤的階段或癌癥發(fā)展的程度分析腫瘤時，結(jié)果暗示更高的腫瘤階段伴隨著更強的陽性表達的趨勢，但結(jié)果受到樣品數(shù)量少的局限。
為了進一步延伸H460-16-2的潛在治療益處，確定了在各種人癌癥組織中抗原的頻率和定位。除了乳腺癌，一些癌癥類型是H460-16-2抗原陽性的。陽性的人癌癥類型包括皮膚(1/2)、肺(4/4)、肝臟(2/3)、胃(4/5)和腎臟(3/3)。一些癌癥不表達抗原；這些癌癥包括卵巢(0/3)、腎上腺(0/2)和小腸(0/1)。和人乳腺腫瘤組織一樣，定位主要發(fā)生在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜上。因此，除了H460-16-2抗體在體外與癌細(xì)胞系結(jié)合，有證據(jù)說明抗原在人體中表達，并在多種癌癥類型中表達?？傊?，該數(shù)據(jù)說明H460-16-2抗原是癌癥相關(guān)抗原且在人體中表達，且其是病理相關(guān)癌癥靶點。此外，該數(shù)據(jù)還證明H460-16-2抗體與人癌癥組織的結(jié)合，且該數(shù)據(jù)可被合適地用于診斷性、治療預(yù)測性或預(yù)后性分析。此外，該抗原的細(xì)胞膜定位對細(xì)胞的癌狀態(tài)具有指示性，因為在大部分非惡性細(xì)胞中沒有抗原的表達，并且該觀察允許該抗原的應(yīng)用，允許其基因或衍生物、其蛋白或衍生物被用于診斷性、治療預(yù)測性或預(yù)后性分析。
原始數(shù)據(jù)顯示H460-16-2識別的抗原可能是一種已知為96kDa熱休克蛋白(gp96)的腫瘤排斥抗原的變體。這一點得到生化研究的支持，生化研究顯示與gp96反應(yīng)的單克隆抗體識別與H460-16-2結(jié)合的蛋白。通過使用H460-16-2和抗gp96抗體對小鼠組織的IHC分析，gp96抗原似乎比H460-16-2抗原更廣泛地表達。這些結(jié)果與對正常人組織的IHC染色結(jié)果相似，因為H460-16-2抗原和gp96抗原相比在更小的一組細(xì)胞上表達。人乳腺腫瘤組織的IHC分析說明gp96抗原更加普遍，大約84％的樣品為抗gp96抗體染色陽性。gp96抗原相比H460-16-2表達也不同，其在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜都呈現(xiàn)出大量定位。這些結(jié)果因此暗示H460-16-2可能是gp96的變體。
總之，本發(fā)明指導(dǎo)了H460-16-2抗原作為治療試劑靶點的應(yīng)用，該試劑在給藥時能夠降低哺乳動物體內(nèi)表達抗原的癌癥的腫瘤負(fù)荷，且還能夠延長受治療哺乳動物的存活。本發(fā)明還指導(dǎo)了CDMAB(H460-16-2)及其衍生物靶向其抗原以降低哺乳動物體內(nèi)表達抗原的癌癥的腫瘤負(fù)荷的應(yīng)用和延長患有表達該抗原的腫瘤的哺乳動物存活的應(yīng)用。此外，本發(fā)明還指導(dǎo)了在癌細(xì)胞中檢測H460-16-2抗原的應(yīng)用，該應(yīng)用可用于對患有表達該抗原的腫瘤的哺乳動物的診斷、治療預(yù)測和預(yù)后。
如果患者對治療的初始階段不敏感或發(fā)生轉(zhuǎn)移，可以重復(fù)產(chǎn)生腫瘤專一性抗體的過程用于再治療。此外，可以將抗癌抗體與從患者體內(nèi)獲得的紅血細(xì)胞偶聯(lián)并重輸注用于轉(zhuǎn)移的治療。對轉(zhuǎn)移型癌癥很少有有效的治療且轉(zhuǎn)移通常預(yù)示著不理想的結(jié)果導(dǎo)致死亡。但是，轉(zhuǎn)移型癌癥常常是充分血管化的且紅血細(xì)胞對抗癌抗體的運送具有在腫瘤位點聚集抗體的作用。甚至在轉(zhuǎn)移前，大部分癌細(xì)胞的存活依賴于宿主的血液供應(yīng)，且與血紅細(xì)胞偶聯(lián)的抗癌抗體對原位腫瘤也是有效的?？商鎿Q地，抗體可以與其它造血細(xì)胞偶聯(lián)，例如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺手細(xì)胞等。
有5類抗體且各類抗體與一種由其重鏈賦予的功能關(guān)聯(lián)。一般認(rèn)為由裸抗體殺死癌細(xì)胞由抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性(ADCC)或補體依賴細(xì)胞毒性(CDC)介導(dǎo)。例如小鼠IgM以及IgG2a抗體可以通過與補體系統(tǒng)中的C-1成分結(jié)合激活人的補體，由此激活補體活化的經(jīng)典通路，該通路可導(dǎo)致腫瘤降解。對于人抗體，最有效的補體激活抗體一般為IgM和IgG1。小鼠IgG2a和IgG3同型抗體有效募集具有Fc受體的細(xì)胞毒性細(xì)胞，由此造成單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和某些淋巴細(xì)胞的殺細(xì)胞作用。人的IgG1和IgG3同型抗體均介導(dǎo)ADCC。
抗體介導(dǎo)的癌癥殺死的另一個可能的機制可能通過抗體的應(yīng)用，這些抗體能夠催化細(xì)胞膜及其相關(guān)糖蛋白或糖脂中的各種化學(xué)鍵的水解，即所謂的催化抗體。
有另外兩種更廣為接受的抗體介導(dǎo)癌癥細(xì)胞殺死機制。第一種機制是將抗體用作疫苗以誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生對位于癌細(xì)胞上的推定抗原的免疫反應(yīng)。第二種機制是將抗體用于靶向生長受體并干擾它們的功能或下調(diào)受體以有效地使其功能喪失。
因此，本發(fā)明的目的是利用從來自特定個體的細(xì)胞中制備癌癥疾病改善抗體的方法來分離雜交瘤細(xì)胞系和相應(yīng)的由所述雜交瘤細(xì)胞系編碼的分離的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段，該疾病改善抗體對癌細(xì)胞是細(xì)胞毒性的，但同時對非癌細(xì)胞相對無毒。
本發(fā)明的另一目的是指導(dǎo)CDMAB及其抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明的進一步的目的是制備CDMAB，其細(xì)胞毒性通過ADCC介導(dǎo)。
本發(fā)明的進一步的目的是制備CDMAB，其細(xì)胞毒性通過CDC介導(dǎo)。
本發(fā)明的進一步的目的是制備CDMAB，其細(xì)胞毒性是其催化細(xì)胞化學(xué)鍵水解能力的一個功能。
本發(fā)明的進一步的目的是制備CDMAB，該抗體在癌癥診斷、預(yù)后和監(jiān)測的結(jié)合實驗中有用。
通過以下說明，其中通過圖解和實施例的方式闡述了本發(fā)明的某些具體實施方式
，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)勢將變得明顯。
附圖簡要說明本專利或申請文件包含至少一幅彩色附圖。在提出要求并支付了必要費用后，專利局將提供帶有彩色附圖的本專利或?qū)＠暾埞_文本的復(fù)印件。


圖1.顯示在研究期間不同治療組的平均體重的直方圖。數(shù)據(jù)表示為在各時間點各組的平均值+/-SEM。
圖2.在預(yù)防性MB-231乳腺癌模型中H460-16-2對腫瘤生長的作用。虛線表示抗體給藥的期間。數(shù)據(jù)點代表平均值+/-SEM。
圖3.在H460-16-2、緩沖液和同型對照抗體治療后患腫瘤小鼠的存活。在治療后70天內(nèi)監(jiān)測小鼠的存活。
圖4.在成熟MDA-MB-231乳腺癌模型中H460-16-2對腫瘤生長的作用。虛線表示抗體給藥的期間。數(shù)據(jù)點代表平均值+/-SEM。
圖5.ARH460-16-2和順鉑的治療功效或抗腫瘤作用的圖示。生長抑制計算為治療的腫瘤體積中值相對于同型對照治療組的百分率T/C×100，其中T是第X天治療組的腫瘤中值，且C是第X天對照組的腫瘤體積中值。虛線表示治療的期間。
圖6.在治療期前和后的實驗組動物的平均體重。
圖7.在H460-16-2、順鉑或同型對照抗體治療后患腫瘤小鼠的存活。在治療后60天內(nèi)監(jiān)測小鼠的存活。
圖8.從SCID小鼠外植的人MB-231乳腺癌。A.抗波形絲蛋白。B.H460-16-2。C.抗gp96。箭頭指向帶有細(xì)胞質(zhì)和點狀染色的細(xì)胞。放大率為100X。
圖9.小鼠肝臟。A.抗波形絲蛋白。B.H460-16-2。C.抗gp96。數(shù)以肝細(xì)胞的抗gp96陽性染色。放大率為100X。
圖10.小鼠腎臟。A.抗波形絲蛋白。B.H460-16-2。箭頭指向腎小管細(xì)胞的頂端(apical)染色。C.抗gp96。箭頭指向腎小管細(xì)胞的彌散(iffuse)染色。放大率為100X。
圖11.小鼠卵巢。A.抗波形絲蛋白。B.H460-16-2。箭頭指向濾泡中卵子的胞質(zhì)染色。C.抗gp96。箭頭指向粒細(xì)胞。放大率為100X。
圖12.H460-16-2結(jié)合乳腺癌腫瘤(浸潤型導(dǎo)管癌)的代表性顯微圖。在圖中的黃色和橙色箭頭分別指向黏膜細(xì)胞和惡性細(xì)胞層。放大率為100X。
圖13.顯示H460-16-2(A)和抗gp96抗體(B)在乳腺癌組織陣列的浸潤型導(dǎo)管癌樣品的組織切片上的結(jié)合模式的代表性顯微圖。藍色箭頭表示抗原靶的細(xì)胞定位。放大率為200X。
本發(fā)明的詳細(xì)說明實施例1根據(jù)布達佩斯條約，雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2在2002年9月4日保藏于美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection)，弗吉尼亞馬納薩斯大學(xué)大街10801，20110-2209，其保藏號為PTA-4621。根據(jù)37CFR1.808，保藏者保證在專利授權(quán)后將永久取消被保藏材料在公眾使用方面的所有限制。
通過在CL-1000瓶(BD Biosciences，Oakville，ON)里培養(yǎng)雜交瘤制備H460-16-2單克隆抗體，每周兩次進行收集和重新接種，且根據(jù)Protein G Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences，Baie d′Urfe，QC)的標(biāo)準(zhǔn)抗體純化步驟進行純化抗體。
體內(nèi)預(yù)防性腫瘤實驗參考圖1和2中顯示的數(shù)據(jù)，將含有5百萬MB-231人乳腺癌細(xì)胞的100微升鹽溶液皮下注射進小鼠后頸部移植進4至8周大的雌性SCID小鼠。將小鼠隨機分成3個治療組，每組10只。在灌輸20mg/kg的H460-16-2測試抗體之前一天，在用含有2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl和20mM Na2HPO4的稀釋液從儲備濃度稀釋后，將體積為300微升的抗體緩沖液或同型對照抗體(已知不與MB-231細(xì)胞結(jié)合)腹腔內(nèi)給藥?？贵w隨后以相同的方式在7周內(nèi)每周給藥一次。
大約每7天用測徑器測量腫瘤的生長，測量10周或直至各動物達到加拿大動物保護委員會(CCAC)的終點或第120天。在研究期間記錄動物的體重。在研究結(jié)束時，根據(jù)CCAC規(guī)定將所有動物處以安樂死。
在本試驗中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)是縱向數(shù)據(jù)組的典型實例。通常，在這樣的數(shù)據(jù)組中在時間點之間存在高度關(guān)聯(lián)且在更鄰近的時間點之間觀察到更高度的關(guān)聯(lián)。因此，方差的重復(fù)測量分析(重復(fù)ANOVA)被用于確定治療之間的差異，且協(xié)方差分析的方法被用于確定差異發(fā)生的時間點。當(dāng)在各時間點的組間差異不僅僅由于組而是由于之前的時間點造成時，后一方法是合適的方法。
在整個研究中沒有毒性的臨床跡象。每周測量的體重是康復(fù)和生存失敗的指示劑。圖1代表了3組小鼠在研究期間的平均體重。各組內(nèi)的體重隨著時間增加。重復(fù)ANOVA說明組間沒有顯著差異且接受同型對照、抗體緩沖液或H460-16-2治療的組在時間點的平均分布沒有變化。
對整個實驗使用重復(fù)ANOVA，以下結(jié)果是值得注意的。重復(fù)ANOVA法說明不僅組的平均值沒有不同(p＜0.001)且相互之間在平均分布的形態(tài)上沒有不同。從圖2中可以看出，治療組H460-16-2和其它組相比似乎有更顯著的作用。此外，同型對照治療組和抗體緩沖液治療組之間的差異在統(tǒng)計學(xué)上不顯著。在協(xié)方差的分析中，在第18天第一次出現(xiàn)了顯著差異，其中同型和緩沖液治療對照組和H460-16-2治療組有所不同。在第53天，(在治療結(jié)束后的第一次腫瘤體積測量)H460-16-2治療組的腫瘤體積是抗體對照治療組的1.3％(p＜0.0001)由此證實預(yù)防腫瘤負(fù)荷的有效性。H460-16-2治療還有相應(yīng)的存活益處(圖3)。提高的存活是功效的有價值的指示劑。在治療后的70多天中對所有3組進行了跟蹤。Cox比例風(fēng)險分析測試估計在ARH460-16-2組中的死亡風(fēng)險是緩沖對照組的大約71％(p＝0.028)。這些數(shù)據(jù)證明和對照治療組相比測試抗體具有存活益處。對照組在移植后的74-81天之間達到50％的死亡率。相反，治療組在研究結(jié)束時(移植后第120天)還沒有達到50％死亡率。同型對照治療組在移植后第74天達到100％死亡率。相反，H460-16-2治療動物在治療結(jié)束時呈現(xiàn)60％的存活。
總之，H460-16-2抗體治療和對照抗體相比在公認(rèn)的人癌癥疾病模型中防止腫瘤負(fù)荷并增加存活。這些結(jié)果暗示該抗體(H460-16-2)用作包括人的其它哺乳動物治療的有力的藥理學(xué)和制藥學(xué)益處。
實施例2體內(nèi)成熟腫瘤實驗將含有5百萬MB-231乳腺癌細(xì)胞的100微升鹽溶液通過皮下注射進后頸部移植進5-6周大的雌性SCID小鼠。用測徑器每周測量腫瘤生長。當(dāng)群體中大部分在移植后的34天達到100mm3的腫瘤體積(范圍在70-130mm3)時，將12只小鼠隨機分入4個治療組。在用含有2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl和20mM Na2HPO4的稀釋液從儲備濃度稀釋后，H460-16-2或同型對照抗體(已知不和MB-231細(xì)胞結(jié)合)以150微升的體積按15mg/kg/劑的劑量靜脈給藥；順鉑以300微升的體積按9mg/kg/劑(用鹽溶液稀釋)的劑量腹腔內(nèi)給藥。隨后以相同的方式每周3次進行總計10劑的抗體給藥直至移植后的第48天。順鉑每四天給藥，共3劑。在研究期間或直至各動物達到CCAC終點，大約每7天用測徑器測量腫瘤的生長。在研究期間記錄動物的體重。在研究結(jié)束時根據(jù)CCAC規(guī)定對所有動物處以安樂死。
在隨機分組時，各組的平均腫瘤體積和標(biāo)準(zhǔn)偏差是相似的同型對照，(97.60+/-18.33)；H460-16-2(95.25+/-16.82)；順鉑(98.00+/-18.93)。這說明進行了真正的隨機化。如圖4中所示，在3周治療期結(jié)束時，抗體H460-16-2能夠顯著抑制腫瘤生長。3組之間的平均腫瘤體積比較顯示組間的差異是非常顯著的(表1)。
表1在治療結(jié)束時的平均腫瘤體積比較

*在0.05的水平均數(shù)差是顯著的。
通過計算反映生長抑制的T/C率(接受治療的腫瘤體積中值(T)對同型對照的腫瘤體積中值(C)的百分比)進一步評估功效。H460-16-2抗體實現(xiàn)了相當(dāng)于49％的T/C腫瘤體積中值的終點(圖5)。圖4進一步顯示在與同型對照相比時H460-16-2治療導(dǎo)致了顯著的對腫瘤生長的抑制且抑制是以最大耐受劑量(MTD)給藥的順鉑的2/3，但沒有順鉑伴隨的毒性或死亡。
在實驗期間每周記錄的體重被用作安全和毒性評估的指示劑。如表2中列出的和圖6中顯示的，在同型對照或H460-16-2治療組中的體重差異最小化。相反，在治療期間，在順鉑組中觀察到顯著的惡體質(zhì)(p＝0.005)。在該組中，體重減輕達到初始體重的19.2％且產(chǎn)生了臨床痛苦的額外證據(jù)諸如毛皮起褶、由脫水引起的皮膚隆起以及嗜睡。和順鉑治療組中觀察到的2例死亡相比，H460-16-2治療組中沒有死亡。
表2在治療結(jié)束時體重和腫瘤生長抑制的變化(％T/C)

*給藥劑重 靜脈內(nèi)每周3次，共3周。
**給藥劑量 腹腔內(nèi)每4天1次，共3劑。
和同型對照治療相比(圖7)，H460-16-2顯示了存活益處。在第170天(大約在治療后的120天)，與順鉑和同型對照組的0％相比，33％的H460-16-2治療組仍然存活。
總之，在SCID小鼠的乳腺癌成熟腫瘤的異種移植模型中，H460-16-2比同型對照抗體顯著更有效地抑制腫瘤生長。在3周的治療期間，H460-16-2達到的T/C腫瘤體積中值的終點和對照相比小于50％。此外，H460-16-2造成的抑制是以MTD給藥的順鉑造成的抑制的2/3而沒有化療藥物觀察到的毒性或死亡跡象。
因此，H460-16-2治療和對照抗體相比顯著降低了成熟腫瘤的腫瘤負(fù)荷且在公認(rèn)的人癌癥疾病模型中顯示了存活益處，暗示著該抗體用于其它哺乳動物包括人在內(nèi)的治療的藥理學(xué)和制藥學(xué)益處。
實施例3正常小鼠組織染色在小鼠組織中研究了H460-16-2抗原的分布并與gp96抗原比較。為了確定進一步實驗的條件，首先進行IHC優(yōu)化實驗。如上所述進行H460-16-2單克隆抗體的制備和純化。
皮下移植了MB-231腫瘤細(xì)胞的未接受治療小鼠在移植后的74天被處以安樂死。分解出腫瘤組中和主要器官的組織并在10％中性緩沖福爾馬林中固定48小時。在固定后，將組織轉(zhuǎn)移至70％乙醇中，處理、石蠟包埋、切片并在玻璃載玻片上封片以染色。在60℃烘箱中干燥1小時對載玻片脫石蠟并將載玻片在Coplin瓶中浸于二甲苯5次，每次4分鐘脫蠟。在一系列梯度乙醇洗滌(100％-75％)處理后，在水中對切片重新水合。將載玻片浸入pH 6的10mM檸檬酸緩沖液中(Dako，Toronto，ON)并在高、中、低檔各微波加熱5分鐘并最后浸入冷的PBS中。隨后將載玻片浸入3％的過氧化氫溶液6分鐘，用PBS洗滌3次，每次5分鐘，干燥，與Universal封閉液(Dako，Toronto，ON)在室溫共同放置5分鐘并干燥。將H460-16-2、單克隆小鼠抗波形絲蛋白(Dako，Toronto，ON)和亦被稱作抗gp96的抗grp94(Stressgen Biotechnologies，Victoria，BC)在抗體稀釋緩沖液(Dako，Toronto，ON)中稀釋至其工作濃度(各抗體為2.5μg/mL、5μg/mL或10μg/mL)并在4℃潮濕的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。用PBS將載玻片洗滌3次，每次5分鐘。用供應(yīng)的HRP偶聯(lián)二級抗體(Dako Envision System，Toronto，ON)在室溫檢測/觀察初級抗體的免疫反應(yīng)30分鐘。在該步驟后，用PBS將載玻片洗滌3次，每次5分鐘，并通過加入用于免疫過氧化酶染色的DAB(3，3’-二氨基聯(lián)苯胺四氯化氫，Dako，Toronto，ON)色原底物溶液在室溫進行顏色反應(yīng)10分鐘。用自來水洗滌載玻片中止色原反應(yīng)。在用Meyer′s蘇木精(Sigma Diagnostics，Oakville，ON)復(fù)染后，用梯度乙醇(75-100％)將載玻片脫水并用二甲苯使其透明。使用封片劑(Dako Faramount，Toronto，ON)在載玻片上封上蓋玻片。使用Axiovert 200(Zeiss Canada，Toronto，ON)顯微鏡觀察載玻片并用Northern Eclipse圖像軟件(Mississauga，ON)獲取并儲存數(shù)字圖像。由病理學(xué)家對結(jié)果進行讀取、評價和解釋。
合適的濃度是使陽性(抗gp96)和陰性對照抗體(抗波形絲蛋白)均產(chǎn)生預(yù)期結(jié)果的濃度?？共ㄐ谓z蛋白對小鼠組織已呈現(xiàn)陰性但對人組織呈現(xiàn)陽性。此前已顯示抗gp96抗體對小鼠和人組織均為陽性。在這些研究中，對照抗體在高和低濃度均沒有產(chǎn)生預(yù)期結(jié)果，但5μg/mL的濃度產(chǎn)生。

縮寫是-M膜染色；C細(xì)胞質(zhì)染色；M/C膜-質(zhì)染色；N細(xì)胞核染色；D彌散染色；P點狀染色；A頂部染色；DCT遠曲小管；PCT近曲小管。
SCID小鼠組織和移植人乳腺癌MB-231的IHC調(diào)查結(jié)果(表3)顯示陰性對照抗體抗波形絲蛋白對小鼠組織是陰性的但對人組織是陽性的?？共ㄐ谓z蛋白(圖8A)顯示強細(xì)胞質(zhì)染色和一些細(xì)胞膜染色；H460-16-2顯示強細(xì)胞膜染色(圖8B)，且抗gp96顯示偶發(fā)的陽性點狀和胞質(zhì)染色細(xì)胞(圖8C)。抗波形絲蛋白(圖9A)和H460-16-2(圖9B)沒有對小鼠肝臟染色但抗gp96產(chǎn)生了肝細(xì)胞的強細(xì)胞質(zhì)染色(圖9C)?？共ㄐ谓z蛋白(圖10A)沒有對小鼠腎臟染色。H460-16-2(圖10B)顯示了對近曲小管和遠曲小管的頂端染色而抗gp96對相同細(xì)胞產(chǎn)生了胞質(zhì)和點狀的彌散染色(圖10C)?？共ㄐ谓z蛋白(圖11A)沒有對小鼠卵巢發(fā)生染色。H460-16-2(圖11B)僅對卵子發(fā)生了胞質(zhì)和細(xì)胞核染色而抗gp96對卵子產(chǎn)生了彌散的胞質(zhì)和細(xì)胞核染色且對粒細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞質(zhì)和點狀染色(圖11C)。
抗波形絲蛋白陰性對照抗體對人組織發(fā)生預(yù)期染色且對小鼠組織沒有染色(見圖8-11)。由于H460-16-2抗原是gp96癌變體的可能性，抗gp96抗體可被用作陽性對照?？筭p96抗體顯示了對MB-231細(xì)胞的染色(圖9)，與gp96表達與乳腺癌的關(guān)聯(lián)相一致。gp96也在涉及蛋白質(zhì)合成的很多細(xì)胞型的細(xì)胞質(zhì)中表達，例如肝細(xì)胞、胰腺的朗格漢斯氏島細(xì)胞、卵巢粒細(xì)胞和卵子、以及輸卵管的粘膜上皮(表3)。這和gp96作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白伴侶的推定作用是完全一致的。
H460-16-2抗體對MB-231細(xì)胞染色，這和其在相應(yīng)腫瘤模型中的體內(nèi)作用是一致的。此外，該抗體對小鼠腎中的DCT和PCT(表3)和小鼠卵子(圖11)染色。根據(jù)小鼠組織的取樣，似乎H460-16-2抗原不只局限于人細(xì)胞，而且也以抗體能夠識別的抗原的方式在小鼠中表達。如同正常小鼠腎組織染色所證實的，在H460-16-2和gp96抗原的表達上存在顯著的差別；H460-16-2中獲得頂部染色而由抗gp96觀察到彌散染色(圖10)。該差異的另一個實例是用抗gp96對卵子的額外染色(圖11)。關(guān)鍵的差異在于在肝臟中不發(fā)生H460-16-2染色，而gp96染色相當(dāng)廣泛(圖9)。
為了進一步進行上述實驗，使用H460-16-2、抗gp96(為了和H460-16-2比較)以及抗波形絲蛋白(陰性對照)對正常小鼠組織陣列(Imgenex，San Diego，CA)染色。使用的染色程序和上述相同。如表4中所總結(jié)，抗波形絲蛋白沒有對測試的任何組織發(fā)生染色；H460-16-2又一次僅對卵巢和腎臟染色而抗gp96仍然對廣泛得多的小鼠組織染色。這些結(jié)果與上述結(jié)果一致且再一次證明H460-16-2表達不限于人細(xì)胞且其表達限于且特異于正常小鼠組織。同樣肯定H460-16-2和抗gp96一樣對相同組織染色，但抗gp96繼續(xù)對更廣泛的組織染色，支持H460-16-2抗原可能是gp96子集的觀點。
表4對正常小鼠組織陣列的IHC

縮寫NR非代表性照片。
實施例4正常人組織染色進行IHC研究表征H460-16-2抗原在人體中的分布。由于H460-16-2抗原如之前生化方法所確定的可能是gp96的癌癥變體，將H460-16-2抗原與靶向gp96的抗體進行比較。使用人體正常器官組織陣列(Imgenex，San Diego，CA)進行了抗體與60個正常人體組織的結(jié)合。在抗體稀釋緩沖液中將所有初級抗體(H460-16-2；抗grp94(也被稱作抗gp96，Stressgen Biotechnologies，Victoria，BC)；以及小鼠IgG1陰性對照(Dako，Toronto，ON))稀釋至5μg/ml的濃度(在優(yōu)化步驟中發(fā)現(xiàn)的最佳濃度)。該陰性對照抗體已經(jīng)由制造商證實對所有哺乳動物組織是陰性的。遵照實施例3中的IHC步驟。
表5陳列了H460-16-2對正常人體組織陣列的染色結(jié)果的總結(jié)。該表中有3類組織染色。一組組織是完全陰性的。這些組織包括正常心臟、腎臟、腦、胰腺、乳腺、睪丸、卵巢和胎盤。第二組組織包括顯示了陽性染色的組織。這些組織包括皮膚、輸尿管、胃和前列腺。唾液腺對該抗體呈現(xiàn)了最強的染色。第三組組織包括在組織切片中染色陽性的組織，但染色限于浸潤型巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和纖維原細(xì)胞。該組中包括肺、肝臟、胃、小腸和結(jié)腸中的巨噬細(xì)胞，以及脾臟和膽囊中的淋巴細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)注意抗原在要害器官包括肝臟、腎臟、心臟和肺的細(xì)胞上不存在?？贵w與巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞結(jié)合，且在這些切片的一些器官中觀察到它們的存在。作為對比，對抗gp96呈現(xiàn)陰性的組織包括皮下脂肪、骨骼肌、肺、心臟、胃平滑肌、膀胱、子宮肌層、卵巢、胎盤臍帶、腦(白質(zhì)和灰質(zhì))、小腦和脊髓。除了子宮肌層的例外，所有這些組織對H460-16-2染色也是陰性的。這些結(jié)果暗示H460-16-2與抗gp96抗體識別的組織中的一個小子集結(jié)合。這和小鼠組織研究是一致的，其中抗gp96除了與也和H460-16-2結(jié)合的兩個組織，腎臟和卵巢結(jié)合外，與肝臟、胰腺、腦和輸卵管結(jié)合。這些結(jié)果暗示H460-16-2抗原沒有在正常組織上廣泛表達，且該抗體與人體中有限數(shù)量的組織特異性地結(jié)合。
表5H460-16-2對正常人體組織的IHC

為了描述gp96和H460-16-2抗原分布之間的差異，在表6中羅列了表達抗原的細(xì)胞類型。從表中，很清楚的是抗gp96抗體比H460-16-2與更大范圍的細(xì)胞類型結(jié)合。進一步地，H460-16-2的最強結(jié)合是纖維原細(xì)胞、腺泡上皮和淋巴細(xì)胞。其和巨噬細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、平滑肌、黏膜上皮以及甲狀腺濾泡細(xì)胞發(fā)生弱結(jié)合?？筭p96與額外的15種細(xì)胞類型結(jié)合，且與表達H460-16-2抗原的各細(xì)胞類型結(jié)合。結(jié)果暗示H460-16-2抗原是gp96的子集，因為表達H460-16-2的細(xì)胞均表達gp96抗原。
表6正常人體組織的IHC總結(jié)

這些組織調(diào)查證實H460-16-2抗原在包括要害器官在內(nèi)的正常組織中有非常有限的分布。實驗也顯示抗gp96抗體和H460-16-2相比與更廣泛的組織結(jié)合。H460-16-2與結(jié)合抗gp96的組織中一子集結(jié)合且與有限的細(xì)胞類型結(jié)合。在H460-16-2陽性但非gp96陽性的組織中，H460-16-2僅與巨噬細(xì)胞和纖維原細(xì)胞，通常表達gp96的細(xì)胞類型結(jié)合。小鼠和人組織調(diào)查之間的差異也指出H460-16-2抗體識別人體中相關(guān)的抗原且在正常小鼠中由于表達很有限而僅有有限重要性的抗原。由于H460-16-2抗體本身不能識別人抗原形式，其本身是可以使用的。
實施例5人腫瘤組織染色進行了IHC研究以確定H460-16-2抗原與人乳腺癌之間的癌癥關(guān)聯(lián)以及確定H460-16-2抗體是否可能識別人癌癥。將抗gp96染色和靶向黑曲霉葡萄糖氧化酶的抗體染色比較，該酶在哺乳動物組織中不存在也不能被誘導(dǎo)(陰性對照)。使用了從50名乳腺癌患者中獲得的乳腺癌組織陣列和從乳腺癌患者的非癌乳腺組織中獲得的9個樣品(Imgenex Corporation，San Diego，CA)。各患者提供了以下信息年齡、性別、美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)腫瘤階段、淋巴結(jié)、雌激素受體(ER)和黃體素受體(PR)的狀態(tài)。遵照實施例3中IHC的步驟。所有抗體在5μg/ml的工作濃度使用。
表7和8提供了H460-16-2和抗gp96抗體與乳腺癌組織陣列的結(jié)合總結(jié)。各陣列包含來自50名患者的腫瘤樣品?？傊?，測試的50名患者中的64％對H460-16-2抗原呈現(xiàn)陽性而對于gp96，84％呈現(xiàn)陽性。對H460-16-2和gp96抗原，來自乳腺癌患者的9個正常乳腺組織樣品中僅2個是陽性的。明顯的，在雌激素和黃體素受體狀況之間沒有明確的關(guān)聯(lián)。還顯示，在更高的腫瘤階段，存在H460-16-2抗原更強的陽性表達的趨勢。如圖12所示，H460-16-2染色相對于正常細(xì)胞，對癌細(xì)胞是相當(dāng)專一的，圖12中黏膜細(xì)胞是明顯陰性的且惡性細(xì)胞層是高度陽性的。H460-16-2抗原觀察到的細(xì)胞定位模式在大多數(shù)情況下局限在細(xì)胞膜?？筭p96抗體對更多的乳腺癌樣品染色但一致地顯示細(xì)胞膜定位和基本的胞質(zhì)定位(圖13)?？筭p96對來自乳腺癌患者正常組織樣品的染色和H460-16-2相同。這些結(jié)果暗示在接近2/3的乳腺癌患者中可以表達H460-16-2抗原。染色模式顯示在患者樣品中，抗體對惡性細(xì)胞有高特異性且H460-16-2抗原位于細(xì)胞膜上由此使其成為具有吸引力的可入藥靶點。
表7H460-16-2對正常和腫瘤人乳腺的IHC

表8抗gp96對正常和腫瘤人乳腺的IHC

為了確定H460-16-2抗原是否在除了乳腺以外的其它人腫瘤組織上表達，在多種人腫瘤組織陣列(Imgenex，San Diego，CA)上使用H460-16-2。為各患者提供了以下信息年齡、性別、器官和診斷。使用的染色步驟和實施例3中說明的相同。使用波形絲蛋白作為陽性對照且使用與所述人乳腺腫瘤組織陣列中使用的相同的陰性對照抗體。所有抗體在5μg/mL的工作濃度使用。
如表9中羅列的，H460-16-2對除了乳腺以外的數(shù)種不同的人癌癥染色。以下的腫瘤類型對H460-16-2總是陽性的(盡管程度不同)淋巴結(jié)(2/2)、骨(2/2)、肺(4/4)、腎臟(3/3)、子宮(3/3)以及甲狀腺(2/2)。胃(4/5)、肝臟(2/3)和腮腺(2/3)也呈現(xiàn)出現(xiàn)相對一致的陽性染色。一些其它的腫瘤類型也偶爾出現(xiàn)染色陽性。如同乳腺癌中觀察到的，H460-16-2染色主要定位在癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上。
因此，H460-16-2抗原似乎不僅僅在乳腺癌的細(xì)胞膜上存在，而且在大量的腫瘤類型的細(xì)胞膜上出現(xiàn)。這些結(jié)果暗示H460-16-2有在除了乳腺以外的廣泛的腫瘤類型中作為治療藥物的潛力。

表9人多種腫瘤陣列上的IHC縮寫M細(xì)胞膜染色；C胞質(zhì)染色；M/C細(xì)胞膜-細(xì)胞質(zhì)染色；CS完全脫落的切片；PS部分脫落的切片；F切片被折疊。
在本說明書中提及的所有專利和公開物對本發(fā)明涉及的領(lǐng)域的技術(shù)人員而言具有說明性。所有專利和公開物在此以相同程度被參考引用，如同各公開物被專門且獨立地說明被參考引用一樣。
應(yīng)當(dāng)明白盡管說明了本發(fā)明的一些形式，本發(fā)明不應(yīng)收到在此說明的具體形式和各部分的安排的限制。在不背離本發(fā)明范圍的情況下進行各種改變對本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的且本發(fā)明不應(yīng)被認(rèn)為受到本說明書中顯示和說明的內(nèi)容的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地認(rèn)同本發(fā)明很適于實現(xiàn)發(fā)明目的并獲得提及的以及其中固有的結(jié)果和優(yōu)勢。在此所述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物學(xué)相關(guān)化合物、方法、步驟和技術(shù)是目前優(yōu)選具體實施方式
的代表，旨在示范而不作為對范圍的限制。本發(fā)明精神所包含的和所附權(quán)利要求范圍所定義的其中的變化和其它應(yīng)用將由本領(lǐng)域技術(shù)人員進行。盡管結(jié)合特定優(yōu)選具體實施方式
對本發(fā)明進行了說明，應(yīng)當(dāng)明白權(quán)利要求的本發(fā)明不應(yīng)當(dāng)不恰當(dāng)?shù)厥艿竭@些特定具體實施方式
的限制。事實上，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的對進行本發(fā)明的所述模式進行的各種修改被認(rèn)為在隨后權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種在哺乳動物體內(nèi)治療人腫瘤的方法，其中所述腫瘤表達和單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合的抗原，所述抗原結(jié)合片段具有由保藏于ATCC保藏號為PTA-4621的克隆編碼的單克隆抗體的識別特征，所述方法包括對所述哺乳動物以有效降低所述哺乳動物腫瘤負(fù)荷的量進行所述單克隆抗體的給藥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗體與細(xì)胞毒部分偶聯(lián)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述細(xì)胞毒部分是放射性同位素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗體激活補體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗體介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗體是小鼠抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗體是人源化抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗體是嵌合抗體。
9.由保藏于ATCC保藏號為PTA-4621的克隆編碼的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段是人源化的。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其與細(xì)胞毒部分、酶、放射性化合物或造血細(xì)胞偶聯(lián)。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段是嵌合抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段是小鼠抗體。
14.保藏于ATCC保藏號為PTA-4621的分離的抗體。
15.一種確定選自人腫瘤的組織樣品中癌細(xì)胞的存在的結(jié)合實驗，包含提供來自所述人腫瘤的組織樣品；提供由保藏于ATCC保藏號為PTA-4621的克隆編碼的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段；將所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述組織樣品接觸；以及確定所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述組織樣品的結(jié)合；由此說明在所述樣品中所述癌細(xì)胞的存在。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的結(jié)合實驗，其中人腫瘤組織樣品取自源自結(jié)腸、卵巢、肺或胸腺組織的腫瘤。
17.一種在選自人腫瘤的組織樣品中分離或篩選癌細(xì)胞的方法，包括提供來自所述人腫瘤的組織樣品；提供由保藏于ATCC的保藏號為PTA-4621的克隆編碼的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段；將所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述組織樣品接觸；以及確定所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述組織樣品的結(jié)合；由此通過所述結(jié)合將所述癌細(xì)胞分離且確定在所述組織樣品中癌細(xì)胞的存在。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中人腫瘤組織樣品獲自源自結(jié)腸、卵巢、肺或乳腺組織的腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用新穎的篩選模式制備患者癌癥疾病改善抗體的方法。通過使用癌癥細(xì)胞毒性作為終點分離抗癌抗體，本方法使得制備用于治療和診斷目的的抗癌抗體成為可能。所述抗體可被用于協(xié)助對癌癥的定級和診斷，且能被用于治療原發(fā)腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移?？拱┛贵w能夠與毒素、酶、放射性化合物和造血細(xì)胞偶聯(lián)。
文檔編號C07K16/28GK1849136SQ200480023963
公開日2006年10月18日 申請日期2004年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月23日
發(fā)明者戴維·S·F·揚, 海倫·P·芬德利, 蘇珊·E·哈恩, 高橋美代子 申請人:阿里烏斯研究公司