專利名稱：一種總丹酚酸的含量測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及總丹酚酸的含量測定方法，特別是涉及采用分光光度法測定總丹酚酸的含量。
背景技術(shù)：
總丹酚酸(total salvianolic acid，TSA)是唇形科植物丹參(Salvia miltiorrhizaBunge)的水溶性有效成分，其多具有酚酸性結(jié)構(gòu)。最早發(fā)現(xiàn)的丹參素化學(xué)名為β-3，4-二羥苯乳酸(β-3，4-dihydroxybenyl lactic acid)是各種丹酚酸的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)，此后發(fā)現(xiàn)了一系列酚酸類化合物，命名為丹酚酸(salvianolic acid)并按照英文字母排序，主要有丹酚酸A、B、C、D、E、G、H、I、J、四甲基丹酚酸F、異丹酚酸C，還有迷迭香酸、紫草酸等等。丹酚酸多數(shù)是由丹參素與其它有機(jī)酸類化合物縮合而成。如丹酚酸A是由一分子丹參素與兩分子咖啡酸縮和而成，丹酚酸B是由三分子丹參素與一分子咖啡酸縮和而成，丹酚酸C則為兩分子丹參素縮合而成，迷迭香酸是由一分子丹參素與一分子咖啡酸縮和而成，其它丹酚酸亦有類似結(jié)構(gòu)。
有關(guān)總丹酚酸的含量測定方法文獻(xiàn)報道較少。有采用丹參素、丹參素鈉或丹酚酸B為對照品，以紫外分光光度法在286nm左右進(jìn)行測定，此法僅適用于純化程度較高的總丹酚酸，而對于丹參的水溶性提取物中的總丹酚酸測定，或者由總丹酚酸組成的復(fù)方制劑等中總丹酚酸測定，則存在較大的誤差。也有文獻(xiàn)報道采用高效液相色譜法測定一種或數(shù)種丹酚酸類化合物(如丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B等等)來控制總酚酸的含量，但此法僅能反映所測丹酚酸類化合物的含量，而不能表示總丹酚酸的含量。王勝春等[第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1993，14(5)386]報道以鐵氰化鉀-三氯化鐵為顯色劑，在730nm處進(jìn)行比色測定，但此法需加入十二烷基硫酸鈉防止產(chǎn)生沉淀，但十二烷基硫酸鈉的加入量不易控制，顯色后生成物的顏色變化較快，不易進(jìn)行準(zhǔn)確測定，且操作步驟較多，十分繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高的總丹酚酸含量的分光光度測定方法。
本發(fā)明方法的技術(shù)措施如下供試品溶液和對照品溶液中分別加入亞硝酸或亞硝酸鹽，在酸性條件下進(jìn)行氧化，氧化后將溶液調(diào)節(jié)至堿性，然后按分光光度法在497±2nm進(jìn)行測定。
上述供試品溶液是由待測含量的總丹酚酸提取物或由總丹酚酸組成的復(fù)方制劑制備而成的溶液；上述對照品溶液是由丹參素、丹參素鈉或丹酚酸B配制而成的溶液。
上述亞硝酸或亞硝酸鹽是在溶液中可離解為亞硝酸根離子(NO2-)的亞硝酸鹽，如亞硝酸鈉(NaNO2)、亞硝酸鉀(KNO2)、亞硝酸(HNO2)、亞硝酸鋰(LiNO2)或亞硝酸鈷鈉[NaCo(NO2)6]等。上述酸性條件可通過加入強(qiáng)酸弱堿鹽如硝酸鋁[Al(NO3)]、硝酸鎳[Ni(NO3)2]等，或者酸式鹽如磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)等，或者有機(jī)酸如甲酸、乙酸等，或者無機(jī)酸如高氯酸、濃酸、硝酸、鹽酸、磷酸等來實(shí)現(xiàn)。上述將溶液調(diào)節(jié)至堿性，可通過加入在水溶液中呈堿性的化合物來實(shí)現(xiàn)，如氫氧化鈉(NaOH)、氫氧化鉀(KOH)或氨水(NH3·H2O)等。
總丹酚酸是由丹參提取所得的有效部位，其中含有丹參素、丹酚酸A和丹酚酸B等多種丹酚酸類，這些丹酚酸類化合物均具有藥理活性。藥理研究表明，總丹酚酸對心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用；對腦組織細(xì)胞損傷有保護(hù)作用并且具有抗氧化作用。采用本發(fā)明方法對作為有效部位的總丹酚酸整體進(jìn)行了含量測定，先在酸性條件下用亞硝酸根離子(NO2-)進(jìn)行氧化，氧化后將溶液調(diào)節(jié)至堿性，在堿性條件下進(jìn)行分光光度測定，避開了雜質(zhì)干擾嚴(yán)重的波長范圍，操作簡單、準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)。


圖1為經(jīng)本發(fā)明方法處理過的含總丹酚酸復(fù)方制劑的紫外可見波長掃描圖。
圖2為經(jīng)本發(fā)明方法處理過的丹酚酸B的紫外可見波長掃描圖。
圖3為未經(jīng)本發(fā)明方法處理的含總丹酚酸復(fù)方制劑的紫外可見波長掃描圖。
圖4為未經(jīng)本發(fā)明方法處理的丹酚酸B的紫外可見波長掃描圖。
圖5為經(jīng)本發(fā)明方法處理過的總丹酚酸提取物的紫外可見波長掃描圖。
圖6為經(jīng)本發(fā)明方法處理過的丹參素鈉的紫外可見波長掃描圖。
具體實(shí)施例方式
下面列舉實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，該實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而對本發(fā)明并沒有限制。
實(shí)施例一和對比例對照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B對照品適量，加50％(ml/ml)的乙醇溶液制成每1ml含丹酚酸B 0.1mg的溶液，精密量取此溶液5ml，用50％(ml/ml)的乙醇溶液定容至25ml，即得。
供試品溶液的制備 精密稱取一種由總丹酚酸所組成的復(fù)方制劑100mg(總酚酸的含量按投藥量計(jì)算應(yīng)為5.80％)，置50ml量瓶中，加50％(ml/ml)的乙醇溶液適量，超聲使溶散，再用50％(ml/ml)的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，離心，取上清液5ml，用50％(ml/ml)的乙醇溶液定容至25ml，即得。
對比例測定與結(jié)果對照品溶液和供試品溶液分別照分光光度法(中國藥典2005年版一部附錄V A)，于287nm波長處進(jìn)行測定。結(jié)果該復(fù)方制劑中總酚酸含量為6.92％。
實(shí)施例一測定與結(jié)果精密量取對照品溶液與供試品溶液各5ml，分別置50ml量瓶中。分別精密加入5％的NaNO2試液2ml，搖勻，放置6分鐘，再加入10％Al(NO3)3試液2ml，搖勻，放置6分鐘，最后再加入1mol/L氫氧化鈉溶液20ml，水定容至刻度，搖勻，靜置15分鐘。在30分鐘內(nèi)，照分光光度法(中國藥典2005年版一部附錄VA)，于497nm波長處分別進(jìn)行測定。結(jié)果該復(fù)方制劑中總酚酸含量為5.61％。
結(jié)論該種復(fù)方制劑中總酚酸的含量按投藥量計(jì)算應(yīng)為5.80％，用本發(fā)明方法(實(shí)施例一)測定為5.61％，與實(shí)際值接近；而對比例中的方法測定為6.92％，遠(yuǎn)高于實(shí)際值，說明雜質(zhì)干擾較多，導(dǎo)致測定不準(zhǔn)確。
從波長掃描圖也可看出，本發(fā)明方法實(shí)施例一之圖1供試品和圖2對照品在497nm附近波譜峰清晰而無干擾；而對比例之圖3供試品和圖4對照品在497nm附近波譜峰不明顯，在287nm附近有干擾。
實(shí)施例二對照品溶液的制備 精密稱取丹參素鈉對照品適量，加50％(ml/ml)的乙醇溶液制成每1ml含丹參素鈉0.1mg的溶液，即得對照品溶液。
供試品溶液的制備 精密稱取總丹酚酸提取物50mg，置50ml量瓶中，加50％(ml/ml)的乙醇溶液適量，超聲使溶散，再用50％(ml/ml)的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，精密量取5ml用水定容至25ml，搖勻，即得。
測定法 精密量取對照品溶液與供試品溶液各5ml，分別置50ml量瓶中。分別精密加入5％的NaNO2試液2ml，搖勻，放置6分鐘，再加入10％Al(NO3)3試液2ml，搖勻，放置6分鐘，最后再加入1mol/L氫氧化鈉溶液20ml，水定容至刻度，搖勻，靜置15分鐘。在30分鐘內(nèi)，照分光光度法(中國藥典2005年版一部附錄V A)，于497nm波長處分別進(jìn)行測定。
結(jié)果該總丹酚酸提取物中總丹酚酸百分含量(以丹參素鈉計(jì))為71.23％。圖5供試品和圖6對照品在497nm附近波譜峰清晰而無干擾。
實(shí)施例三對照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B對照品適量，加50％(ml/ml)的乙醇溶液制成每1ml含丹酚酸B 0.1mg的溶液，即得對照品溶液。
供試品溶液的制備 精密稱取總丹酚酸提取物50mg，置50ml量瓶中，加50％(ml/ml)的乙醇溶液適量，超聲使溶散，再用50％(ml/ml)的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，精密量取5ml用水定容至25ml，搖勻，即得。
測定法 精密量取對照品溶液與供試品溶液各5ml，分別置50ml量瓶中。分別精密加入5％的NaNO2試液2ml，搖勻，放置6分鐘，再加入10％Al(NO3)3試液2ml，搖勻，放置6分鐘，最后再加入1mol/L氫氧化鈉溶液20ml，水定容至刻度，搖勻，靜置15分鐘。在30分鐘內(nèi)，照分光光度法(中國藥典2005年版一部附錄V A)，于497nm波長處分別進(jìn)行測定。
結(jié)果該總丹酚酸提取物中總丹酚酸百分含量(以丹酚酸B計(jì))為73.55％。
實(shí)施例四對照品溶液的制備 精密稱取丹參素鈉對照品適量，加50％(ml/ml)的乙醇溶液制成每1ml含丹參素鈉0.1mg的溶液，即得對照品溶液。
供試品溶液的制備 精密稱取總丹酚酸提取物50mg，置50ml量瓶中，加50％(ml/ml)的乙醇溶液適量，超聲使溶散，再用50％(ml/ml)的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，精密量取5ml用水定容至25ml，搖勻，即得。
測定法 精密量取對照品溶液與供試品溶液各5ml，分別置50ml量瓶中。分別精密加入5％的NaNO2試液2ml，搖勻，放置6分鐘，再加入0.7mol/l的HNO3試液2ml，搖勻，放置6分鐘，最后再加入1mol/L氫氧化鉀溶液20ml，水定容至刻度，搖勻，靜置15分鐘。在30分鐘內(nèi)，照分光光度法(中國藥典2005年版一部附錄V A)，于498nm波長處分別進(jìn)行測定。
結(jié)果該總丹酚酸提取物中總丹酚酸百分含量(以丹參素鈉計(jì))為71.82％。
實(shí)施例五對照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B對照品適量，加50％(ml/ml)的乙醇溶液制成每1ml含丹酚酸B 0.1mg的溶液，即得對照品溶液。
供試品溶液的制備 精密稱取總丹酚酸提取物50mg，置50ml量瓶中，加50％(ml/ml)的乙醇溶液適量，超聲使溶散，再用50％(ml/ml)的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，精密量取5ml用水定容至25ml，搖勻，即得。
測定法 精密量取對照品溶液與供試品溶液各5ml，分別置50ml量瓶中。分別精密加入5％的NaNO2試液2ml，搖勻，放置6分鐘，再加入冰乙酸2ml，搖勻，放置6分鐘，最后再加入氨試液20ml，水定容至刻度，搖勻，靜置15分鐘。在30分鐘內(nèi)，照分光光度法(中國藥典2005年版一部附錄V A)，于497nm波長處分別進(jìn)行測定。
結(jié)果該總丹酚酸提取物中總丹酚酸百分含量(以丹酚酸B計(jì))為72.95％。
實(shí)施例六對照品溶液的制備 精密稱取丹參素鈉對照品適量，加50％(ml/ml)的乙醇溶液制成每1ml含丹參素鈉0.1mg的溶液，即得對照品溶液。
供試品溶液的制備 精密稱取總丹酚酸膠囊內(nèi)容物100mg，置50ml量瓶中，加50％(ml/ml)的乙醇溶液適量，超聲使溶散，再用50％(ml/ml)的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，離心，精密量取上清液5ml用水定容至25ml，搖勻，即得。
測定法 精密量取對照品溶液與供試品溶液各5ml，分別置50ml量瓶中。分別精密加入5％的NaNO2試液2ml，搖勻，放置6分鐘，再加入甲酸0.5ml，搖勻，放置6分鐘，最后再加入1mol/L氫氧化鈉溶液20ml，水定容至刻度，搖勻，靜置15分鐘。在30分鐘內(nèi)，照分光光度法(中國藥典2005年版一部附錄V A)，于496nm波長處分別進(jìn)行測定。
結(jié)果該總丹酚酸膠囊的總丹酚酸百分含量(以丹參素鈉計(jì))為8.42％。
實(shí)施例七對照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B對照品適量，加50％(ml/ml)的乙醇溶液制成每1ml含丹酚酸B 0.1mg的溶液，即得對照品溶液。
供試品溶液的制備 精密稱取丹酚酸粉針50mg，置50ml量瓶中，加50％(ml/ml)的乙醇溶液適量，超聲使溶散，再用50％(ml/ml)的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，精密量取5ml用水定容至25ml，搖勻，即得。
測定法 精密量取對照品溶液與供試品溶液各5ml，分別置50ml量瓶中。分別精密加入5％的NaNO2試液2ml，搖勻，放置6分鐘，再加入10％Al(NO3)3試液2ml，搖勻，放置6分鐘，最后再加入1mol/L氫氧化鈉溶液20ml，水定容至刻度，搖勻，靜置15分鐘。在30分鐘內(nèi)，照分光光度法(中國藥典2005年版一部附錄V A)，于497nm波長處分別進(jìn)行測定。
結(jié)果該總丹酚酸粉針的總丹酚酸百分含量(以丹酚酸B計(jì))為62.85％。
權(quán)利要求
1.一種總丹酚酸的含量測定方法，包括供試品溶液和對照品溶液測定前的處理，處理后用分光光度法進(jìn)行測定，其特征在于，測定前在所述供試品溶液和對照品溶液中分別加入亞硝酸或亞硝酸鹽，在酸性條件下進(jìn)行氧化，氧化后將溶液調(diào)節(jié)至堿性，然后按分光光度法在497±2nm進(jìn)行測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含量測定方法，其特征在于，所述供試品溶液是由待測含量的總丹酚酸提取物或由總丹酚酸組成的復(fù)方制劑制備而成的溶液；所述對照品溶液是由丹參素、丹參素鈉或丹酚酸B配制而成的溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含量測定方法，其特征在于，所述亞硝酸鹽為亞硝酸鈉、亞硝酸鉀、亞硝酸鋰或亞硝酸鈷鈉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含量測定方法，其特征在于，所述酸性條件是通過加入強(qiáng)酸弱堿鹽、酸式鹽、有機(jī)酸或者無機(jī)酸而形成酸性條件。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的含量測定方法，其特征在于，所述強(qiáng)酸弱堿鹽為硝酸鋁或硝酸鎳；所述酸式鹽為磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀；所述有機(jī)酸為甲酸或乙酸；所述無機(jī)酸為高氯酸、濃酸、硝酸、鹽酸或磷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含量測定方法，其特征在于，所述將溶液調(diào)節(jié)至堿性，是通過加入氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨水而將溶液調(diào)節(jié)至堿性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種總丹酚酸的含量測定方法，它在測定前在供試品溶液和對照品溶液中分別加入亞硝酸或亞硝酸鹽，在酸性條件下進(jìn)行氧化，氧化后將溶液調(diào)節(jié)至堿性，然后按分光光度法在497±2nm進(jìn)行測定。本發(fā)明的總丹酚酸含量測定方法操作簡單、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高。
文檔編號G01N21/25GK1923226SQ20051001496
公開日2007年3月7日 申請日期2005年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月1日
發(fā)明者李偉, 張文生, 葉正良 申請人:天津天士力制藥股份有限公司