專(zhuān)利名稱(chēng)：以頭發(fā)中的氧化蛋白質(zhì)為指標(biāo)的頭發(fā)損傷評(píng)價(jià)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過(guò)對(duì)頭發(fā)中的氧化蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異熒光標(biāo)記、檢測(cè)其熒光來(lái)評(píng)價(jià)頭發(fā)的損傷度的方法，以及為了實(shí)施該方法而使用的試劑盒。
背景技術(shù)：
頭發(fā)因燙發(fā)處理、脫色、氧化染發(fā)劑處理、梳理、吹風(fēng)機(jī)等的熱處理、暴露于紫外線、在游泳池中暴露于次氯酸等的各種各樣的外在因素而受到損傷。頭發(fā)一旦受到損傷就不會(huì)得到修復(fù)。另外，損傷也有隨著時(shí)間流逝而發(fā)展的情況。因此，為了保持頭發(fā)的健康狀態(tài)，當(dāng)然通過(guò)日常護(hù)理來(lái)使頭發(fā)不易受到損傷是很重要的，但是，事先確認(rèn)其損傷度，抑制損傷的發(fā)展也極為重要。作為評(píng)價(jià)頭發(fā)損傷度的方法，已知有視覺(jué)評(píng)價(jià)、物性評(píng)價(jià)等方法，例如利用掃描型電子顯微鏡的頭發(fā)表面分析法(Swift J.A.等、J.Society of Cosmetic Chemists(1972)Vol.23，p695)、測(cè)定頭發(fā)的機(jī)械強(qiáng)度的抗拉試驗(yàn)法(Donald E.D.等，J.Society of Cosmetic Chemists(1968)Vol.19，p395)、測(cè)定頭發(fā)內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化的方法(Humphres W.T.等，J.Societyof Cosmetic Chemists(1972)Vol.23，p359)、用熒光物質(zhì)標(biāo)記頭發(fā)、用熒光顯微鏡測(cè)定損傷的方法(Tate M.L.等，J.Society of Cosmetic Chemists(1993)Vol.44，p347)等，但任何一種方法都需要特殊的裝置，而且有操作麻煩的缺點(diǎn)。
特開(kāi)平8-178920號(hào)公報(bào)、特開(kāi)平8-271515號(hào)公報(bào)中公開(kāi)了，以SH基團(tuán)為頭發(fā)損傷的指標(biāo)，采用對(duì)該SH基團(tuán)進(jìn)行選擇性標(biāo)記的熒光物質(zhì)對(duì)頭發(fā)進(jìn)行熒光染色，測(cè)定頭發(fā)的損傷度的方法，所述SH基團(tuán)因例如燙發(fā)處理等導(dǎo)致角蛋白中大量含有的S-S鍵斷裂而產(chǎn)生，所述熒光物質(zhì)例如為N-(9-吖啶基)馬來(lái)酰亞胺、N-(7-二甲基-氨基-4-甲基香豆素基)馬來(lái)酰亞胺，。通過(guò)該方法，可以不需要熒光顯微鏡等，用目視進(jìn)行損傷度的檢測(cè)，謀求測(cè)定的簡(jiǎn)便化。通常，燙發(fā)處理由以下步驟構(gòu)成經(jīng)過(guò)還原處理來(lái)暫時(shí)切斷頭發(fā)角蛋白中的S-S鍵而生成SH基團(tuán)，然后通過(guò)氧化處理使該SH基團(tuán)恢復(fù)成S-S鍵。另外，脫色處理僅由氧化處理構(gòu)成。但是，如果在進(jìn)行燙發(fā)處理、脫色處理的同時(shí)、過(guò)度發(fā)生氧化反應(yīng)，則SH基團(tuán)、S-S鍵轉(zhuǎn)化為半胱氨酸(SO3H)，這也被認(rèn)為是頭發(fā)損傷的原因之一。半胱氨酸不與選擇性標(biāo)記SH基團(tuán)的熒光物質(zhì)反應(yīng)，因此以SH基團(tuán)為頭發(fā)損傷指標(biāo)的此類(lèi)方法所得到的結(jié)果，被認(rèn)為有時(shí)無(wú)法準(zhǔn)確反映頭發(fā)的實(shí)際損傷度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于提供一種可以簡(jiǎn)便的、并且能更加準(zhǔn)確地反映頭發(fā)的實(shí)際損傷度的頭發(fā)損傷度評(píng)價(jià)方法。
本發(fā)明提供一種評(píng)價(jià)頭發(fā)損傷的方法。該方法的特征在于，通過(guò)對(duì)頭發(fā)中的氧化蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異熒光標(biāo)記，檢測(cè)其熒光來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。該損傷起因于下述誘因中的任一種或它們多種的組合，所述誘因是頭發(fā)的燙發(fā)處理、脫色、氧化染發(fā)劑處理、梳理、吹風(fēng)機(jī)等熱處理、暴露于紫外線、在游泳池中暴露于次氯酸中。
在優(yōu)選的方案中，氧化蛋白質(zhì)的羰基的特異的熒光標(biāo)記，是通過(guò)使含有肼基的熒光物質(zhì)與氧化蛋白質(zhì)作用·鍵合而進(jìn)行的。優(yōu)選從熒光素-5-氨基硫脲和丹磺酰肼(Dansyl hydrazine)中選擇該含有肼基的熒光物質(zhì)。
在優(yōu)選的方案中，上述評(píng)價(jià)可在熒光顯微鏡下進(jìn)行。但是，當(dāng)含肼基的熒光物質(zhì)為丹磺酰肼時(shí)，上述熒光檢測(cè)可以目測(cè)進(jìn)行。
從另一觀點(diǎn)考慮，本發(fā)明可提供一種用于在評(píng)價(jià)頭發(fā)的損傷的方法中使用的試劑盒。該試劑盒的特征在于，是含有用于對(duì)氧化蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異熒光標(biāo)記的熒光物質(zhì)而構(gòu)成的。
優(yōu)選的情況是，熒光物質(zhì)為含有肼基的熒光物質(zhì)，更優(yōu)選的情況是含肼基的熒光物質(zhì)選自熒光素-5-氨基硫脲和丹磺酰肼組成的組中。
通過(guò)本發(fā)明，可提供一種簡(jiǎn)便的、且能顯示準(zhǔn)確反映頭發(fā)的實(shí)際損傷結(jié)果的頭發(fā)損傷評(píng)價(jià)方法。通過(guò)該評(píng)價(jià)方法，可對(duì)由以下誘因引起的損傷進(jìn)行評(píng)價(jià)燙發(fā)處理、脫色、氧化染發(fā)劑處理、梳理、利用吹風(fēng)機(jī)等的熱處理、暴露于紫外線、在游泳池中暴露于次氯酸試劑等。


圖1示出利用熒光素-5-氨基硫脲進(jìn)行的頭發(fā)氧化蛋白質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果。
圖2示出顯示經(jīng)紫外線處理、次氯酸鈉處理引起的頭發(fā)氧化蛋白質(zhì)的亢進(jìn)的熒光顯微鏡照片。
圖3是將圖2的結(jié)果以平均亮度的形式進(jìn)行數(shù)值化的圖。
圖4用平均亮度表示經(jīng)燙發(fā)處理、脫色處理引起的頭發(fā)氧化蛋白質(zhì)的亢進(jìn)。
圖5用平均亮度表示使用丹磺酰肼作為熒光物質(zhì)時(shí)的經(jīng)燙發(fā)處理、脫色處理引起的頭發(fā)氧化蛋白質(zhì)的亢進(jìn)。
圖6顯示醫(yī)療用紫外線熒光燈引起的頭發(fā)損傷的定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖7示出人工太陽(yáng)照明燈引起的頭發(fā)損傷的照片(a)及其定量試驗(yàn)的結(jié)果(b)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供一種通過(guò)對(duì)頭發(fā)中的氧化蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異熒光標(biāo)記、檢測(cè)其熒光來(lái)評(píng)價(jià)頭發(fā)的損傷度的方法、及用于實(shí)施該方法的試劑盒。
頭發(fā)(或發(fā)干)由覆蓋其表面的毛小皮、位于其內(nèi)部占頭發(fā)大部分的毛皮質(zhì)及中心部位的毛髓質(zhì)構(gòu)成。特別地，毛小皮從頭發(fā)的根部向前端以鱗狀重合覆蓋頭發(fā)的表面保護(hù)內(nèi)部，如果毛小皮未受到損傷，保持健康的狀態(tài)，則頭發(fā)看上去很有光澤。頭發(fā)大致由80～90％的蛋白質(zhì)、1～8％的脂質(zhì)、0.6～1.0％的微量元素、及12～13％的水構(gòu)成。頭發(fā)中存在各種各樣的蛋白質(zhì)，主要的蛋白質(zhì)為角蛋白。含角蛋白的頭發(fā)蛋白質(zhì)伴隨著暴露于燙發(fā)劑、脫色劑、氧化染發(fā)劑等中含有的化學(xué)類(lèi)氧化劑、紫外線、大氣污染物質(zhì)、游泳池中使用的次氯酸類(lèi)試劑、梳理產(chǎn)生的摩擦、吹風(fēng)機(jī)等產(chǎn)生的熱等各種因素，而被氧化，結(jié)果引入了羰基?？梢哉J(rèn)為此類(lèi)氧化包括蛋白質(zhì)中的Lys、Arg、Pro等氨基酸殘基的NH2基被直接氧化成羰基的情況；及脂質(zhì)被氧化成過(guò)氧化脂質(zhì)，進(jìn)而分解成反應(yīng)活性很高的醛類(lèi)，其與蛋白質(zhì)結(jié)合而發(fā)生氧化的情況等。
本發(fā)明中可利用的對(duì)氧化蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異熒光標(biāo)記的熒光物質(zhì)，優(yōu)選具有可與氧化蛋白質(zhì)的羰基鍵合的肼基-NHNH2。作為此類(lèi)熒光物質(zhì)的例子，可列舉出熒光素-5-氨基硫脲、丹磺酰肼、德克薩斯紅酰肼(Texas Red hydrazide)、熒光黃酰肼(Lucifer Yellow hydrazide)等。
在使用此類(lèi)含肼基熒光物質(zhì)時(shí)，氧化蛋白質(zhì)的檢測(cè)可按照例如以下方法實(shí)施(1)對(duì)頭發(fā)采樣；(2)使適當(dāng)?shù)木彌_液(例如100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5)中的含肼基熒光物質(zhì)與頭發(fā)在室溫下反應(yīng)數(shù)小時(shí)(例如1小時(shí))；(3)反應(yīng)結(jié)束后用適當(dāng)?shù)纳砣芤?例如用緩沖液磷酸緩沖生理食鹽液(PBS))充分洗凈后，用例如熒光顯微鏡來(lái)檢測(cè)氧化蛋白質(zhì)；(4)任選地，拍攝顯微鏡照片。
在使用通過(guò)照射紫外線發(fā)出可目視的熒光的熒光物質(zhì)例如丹磺酰肼作為含有肼基的熒光物質(zhì)的情況下，被熒光標(biāo)記的氧化蛋白質(zhì)也可以不使用熒光顯微鏡，僅憑目測(cè)進(jìn)行檢測(cè)。作為通過(guò)照射紫外線發(fā)出可目視的熒光的其他熒光物質(zhì)，可列舉出N-(9-芴基甲氧基羰基)肼(FMOC-肼)等。
在使用通過(guò)照射紫外線發(fā)出可目視的熒光的熒光物質(zhì)例如丹磺酰肼作為含有肼基的熒光物質(zhì)的情況下，氧化蛋白質(zhì)的檢測(cè)可以按照例如下述方法進(jìn)行(1)對(duì)頭發(fā)采樣；
(2)使適當(dāng)?shù)木彌_液(例如100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5)中的含肼基熒光物質(zhì)與頭發(fā)在室溫下反應(yīng)數(shù)小時(shí)(例如1小時(shí))；(3)反應(yīng)結(jié)束后、用適當(dāng)?shù)纳砣芤?例如緩沖液磷酸緩沖生理食鹽液(PBS))充分洗凈后，使用例如黑光等對(duì)其照射紫外線；(4)目視觀察發(fā)出熒光的氧化蛋白質(zhì)；(5)任選地，拍攝照片。
氧化蛋白質(zhì)的特異熒光標(biāo)記，也可利用生物素酰肼和熒光標(biāo)記抗生物素蛋白的組合。由于生物素酰肼也含有肼基，所以可與蛋白質(zhì)的羰基鍵合。此時(shí)，首先在氧化蛋白質(zhì)上鍵合生物素酰肼，然后通過(guò)生物素-抗生物素蛋白鍵使熒光標(biāo)記抗生物素蛋白與生物素酰肼結(jié)合，其結(jié)果是對(duì)氧化蛋白質(zhì)進(jìn)行了熒光標(biāo)記。生物素酰肼可使用在本領(lǐng)域中廣為人知的，例如由ピア一ス社制造銷(xiāo)售的產(chǎn)品。另外，熒光抗生物素蛋白可使用例如熒光素抗生物素蛋白。
在使用這樣的含肼基的熒光物質(zhì)的情況下，氧化蛋白質(zhì)的檢測(cè)例如可按照以下述方法實(shí)施(1)對(duì)頭發(fā)采樣；(2)使適當(dāng)?shù)木彌_液(例如100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5)中的生物素酰肼在室溫下與頭發(fā)反應(yīng)數(shù)小時(shí)(例如1小時(shí))；(3)反應(yīng)結(jié)束后、用適當(dāng)?shù)纳砣芤?例如緩沖液磷酸緩沖生理食鹽液(PBS))充分洗凈后，與熒光標(biāo)記抗生物素蛋白在室溫下反應(yīng)數(shù)小時(shí)(例如1小時(shí))；(4)用例如熒光顯微鏡檢測(cè)氧化蛋白質(zhì)；(5)任選地，拍攝顯微鏡照片。
本發(fā)明所涉及的試劑盒，除了上述熒光物質(zhì)之外，還可同時(shí)含有實(shí)施上述各種評(píng)價(jià)方法所必需的試劑、例如各種緩沖試劑。
本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，如下述實(shí)施例中所示那樣，頭發(fā)內(nèi)的氧化蛋白質(zhì)的量與頭發(fā)的損傷度有一定程度相關(guān)性。例如，燙發(fā)處理中使用的氧化劑一般分為過(guò)氧化氫類(lèi)的物質(zhì)和溴酸鈉類(lèi)物質(zhì)這兩類(lèi)，已知其中過(guò)氧化氫類(lèi)氧化力強(qiáng)，對(duì)頭發(fā)產(chǎn)生的損傷大。另外，以氧化蛋白質(zhì)為指標(biāo)，比較由過(guò)氧化氫類(lèi)及溴酸鈉類(lèi)燙發(fā)處理產(chǎn)生的頭發(fā)的損傷度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化氫類(lèi)燙發(fā)處理的頭發(fā)比溴酸鈉類(lèi)燙發(fā)處理的頭發(fā)受到的損傷更強(qiáng)。另外，頭發(fā)的脫色處理與燙發(fā)處理不同，僅由頭發(fā)的氧化處理步驟構(gòu)成，當(dāng)反應(yīng)過(guò)度進(jìn)行時(shí)，SH基團(tuán)、S-S鍵轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼?SO3H)，因此在目前以SH基團(tuán)為指標(biāo)的方法中，無(wú)法正確評(píng)價(jià)損傷。但是，以氧化蛋白質(zhì)為指標(biāo)，比較脫色處理及燙發(fā)處理產(chǎn)生的頭發(fā)的損傷度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脫色處理的頭發(fā)與燙發(fā)處理的頭發(fā)相比、受到更強(qiáng)的損傷。由上述結(jié)果可知，伴隨頭發(fā)的損傷度的提高，頭發(fā)中的氧化蛋白質(zhì)的量也增大。因此可知，以氧化蛋白質(zhì)為指標(biāo)的頭發(fā)損傷評(píng)價(jià)方法，可以顯示出更加準(zhǔn)確地反映了頭發(fā)實(shí)際損傷的結(jié)果。
通過(guò)使用上述氧化蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法及試劑盒，可實(shí)現(xiàn)以氧化蛋白質(zhì)為指標(biāo)的簡(jiǎn)便的頭發(fā)損傷測(cè)定。本發(fā)明的方法不需要蛋白質(zhì)的提取操作、電泳操作、蛋白質(zhì)印跡操作等，只要有熒光顯微鏡便可實(shí)施。另外，如果使用丹磺酰肼等作為熒光物質(zhì)，則僅照射紫外線就可以目視評(píng)價(jià)被熒光染色的氧化蛋白質(zhì)。因此，上述氧化蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法及試劑盒，可通過(guò)簡(jiǎn)單的操作及設(shè)備來(lái)獲得對(duì)頭發(fā)評(píng)價(jià)的有力的信息，可在例如化妝品銷(xiāo)售鋪面等進(jìn)行簡(jiǎn)單地實(shí)施。
通過(guò)以下的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
實(shí)施例實(shí)施例1利用熒光素-5-氨基硫脲進(jìn)行的頭發(fā)氧化蛋白質(zhì)的檢測(cè)在9名被試驗(yàn)者(頭發(fā)沒(méi)有經(jīng)過(guò)化學(xué)處理的經(jīng)歷)的頭發(fā)根側(cè)和前端側(cè)(離根部大約20厘米的部位)、以5厘米的長(zhǎng)度各采取1根，用具有下述組成的洗滌劑(處方1)、在室溫下浸泡10分鐘進(jìn)行洗滌，然后在水中浸泡漂洗1小時(shí)。將其干燥后，用瞬間強(qiáng)力粘合劑阿隆發(fā)(Aron alpha)固定于載玻片上。使其在20μM的熒光素-5-氨基硫脲的100mM的MES-Na緩沖液(pH＝5.5)中在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后、用PBS充分洗滌后，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，每個(gè)樣品攝取4張圖像。在進(jìn)行數(shù)值化時(shí)，從圖像上分離頭發(fā)和背景，求出頭發(fā)的平均亮度。
處方1(洗滌劑)原料名配合量(質(zhì)量％)アルスコ一プNM((株)東邦化學(xué)) 6.80椰子油脂肪酸酰胺丙基甜菜堿液(30％)1.20檸檬酸0.06苯甲酸鈉 0.09EDTA·3Na 0.01離子交換水91.84合計(jì) 100.00其結(jié)果在圖1中示出。從圖1可知，在根部側(cè)沒(méi)有觀察到有個(gè)人差異。與此相反，在前端側(cè)觀察到有相當(dāng)大的個(gè)人差異?？梢哉J(rèn)為這反映了保養(yǎng)方法的個(gè)人差異等。
實(shí)施例2利用熒光素-5-氨基硫脲的頭發(fā)氧化蛋白質(zhì)的檢測(cè)以5厘米的長(zhǎng)度采取一名被試驗(yàn)者的頭發(fā)前端側(cè)(頭發(fā)沒(méi)有經(jīng)過(guò)化學(xué)處理的經(jīng)歷)，共取3根，在洗滌劑(處方1)中、在室溫下浸泡10分鐘進(jìn)行洗滌，然后在水中浸泡漂洗1小時(shí)。對(duì)第1根照射紫外線(UVA)200J/cm2，將第2根在0.2mM次氯酸鈉中、在37℃下保溫16小時(shí)，對(duì)最后的第3根不做任何處理。最后，將經(jīng)過(guò)紫外線處理、次氯酸鈉處理的頭發(fā)在洗滌劑(處方1)中、在室溫下浸泡10分鐘進(jìn)行洗滌，然后在水中浸泡漂洗1小時(shí)。將其干燥后，用瞬間強(qiáng)力粘合劑阿隆發(fā)固定在載玻片上。將其在20μM的熒光素-5-氨基硫脲的100mM的MES-Na緩沖液(pH＝5.5)中、在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后、用PBS充分洗滌后，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，每個(gè)樣品各攝取12張圖像。在進(jìn)行數(shù)值化時(shí)，從圖像上分離頭發(fā)和背景，求出頭發(fā)的平均亮度。
如上所述，圖2為熒光處理過(guò)的頭發(fā)的熒光顯微鏡照片，圖3示出各頭發(fā)的平均亮度。如圖2和圖3所示，在紫外線處理、次氯酸鈉處理的任一種處理中，都能觀察到頭發(fā)的氧化蛋白質(zhì)亢進(jìn)。
實(shí)施例3利用熒光素-5-氨基硫脲進(jìn)行的頭發(fā)氧化蛋白質(zhì)的檢測(cè)以5厘米的長(zhǎng)度采取一名被試驗(yàn)者的頭發(fā)前端側(cè)(頭發(fā)沒(méi)有經(jīng)過(guò)化學(xué)處理的經(jīng)歷)，共取4根，在洗滌劑(處方1)中、在室溫下浸泡10分鐘進(jìn)行洗滌，然后在水中浸泡漂洗1小時(shí)。對(duì)第1根進(jìn)行脫色處理，對(duì)第2根進(jìn)行燙發(fā)處理(溴酸鈉類(lèi))，對(duì)第3根進(jìn)行燙發(fā)處理(過(guò)氧化氫類(lèi))，對(duì)最后的第4根不做任何處理。脫色處理為，將以下所示的處方2的A劑、B劑、C劑按照4∶6∶1的比例進(jìn)行混合，在室溫下將頭發(fā)在其中浸泡30分鐘。重復(fù)該操作4次。燙發(fā)處理(溴酸鈉類(lèi))為，在以下所述的處方3的1號(hào)液中在30℃浸泡10分鐘，水洗滌30秒，在2號(hào)液(溴酸鈉類(lèi))中在30℃浸泡10分鐘。燙發(fā)處理(過(guò)氧化氫類(lèi))為，在處方3的1號(hào)液中在30℃浸泡10分鐘，水洗滌30秒，在3號(hào)液(過(guò)氧化氫類(lèi))中在30℃浸泡5分鐘。將經(jīng)過(guò)脫色、燙發(fā)處理過(guò)的頭發(fā)最后在洗滌劑(處方1)中在室溫浸泡10分鐘、進(jìn)行洗滌，然后在水中浸泡漂洗1小時(shí)。將其干燥后，用瞬間強(qiáng)力粘合劑阿隆發(fā)固定于載玻片上。將其在20μM的熒光素-5-氨基硫脲的100mM的MES-Na緩沖液(pH＝5.5)中在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后用PBS充分洗滌，然后用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，每個(gè)樣品各攝取8張圖像。在進(jìn)行數(shù)值化時(shí)，從圖像上分離頭發(fā)和背景，求出頭發(fā)的平均亮度。
處方2(脫色損傷用的脫色劑處方)A劑 原料名 配合量(質(zhì)量％)氨水(28％)3.60離子交換水96.40合計(jì) 100.00
B劑 原料名 配合量(質(zhì)量％)過(guò)氧化氫(30％) 20.00磷酸(一級(jí)) 0.20磷酸氫二鈉(無(wú)水) 0.20錫酸鈉 0.02對(duì)羥基苯甲酸甲酯 0.05離子交換水 79.53合計(jì) 100.00C劑 原料名 配合量(質(zhì)量％)過(guò)硫酸鉀 74.22硅酸鈉 17.62硫酸銨 1.91焦磷酸鈉 6.25合計(jì) 100.00處方3(燙發(fā)損傷用的燙發(fā)劑處方)1號(hào)劑 原料名配合量(質(zhì)量％)巰基乙酸銨液(50％) 12.90單乙醇胺 0.90碳酸銨(一級(jí)) 2.80尿素 1.00EDTA·3Na0.10月桂基二甲基氨基乙酸甜菜堿(40％) 0.30離子交換水 82.00合計(jì) 100.00
2號(hào)劑(溴酸鈉類(lèi))原料名配合量(質(zhì)量％)溴酸鈉液(20％)40.00磷酸氫鉀 0.30磷酸氫二鈉(12水) 0.20離子交換水59.30合計(jì) 100.003號(hào)劑(過(guò)氧化氫類(lèi))原料名配合量(質(zhì)量％)過(guò)氧化氫水(31％) 6.45磷酸(1％) 2.00磷酸氫二鈉(12水) 0.03離子交換水91.52合計(jì) 100.00圖4中顯示出各頭發(fā)的平均亮度的結(jié)果。燙發(fā)處理、脫色處理中均觀察到了頭發(fā)氧化蛋白質(zhì)的亢進(jìn)。另外，有趣的是，過(guò)氧化氫類(lèi)的燙發(fā)處理比溴酸鈉類(lèi)燙發(fā)處理觀察到了更多的氧化蛋白質(zhì)?？梢哉J(rèn)為這反映了，如果燙發(fā)處理方法不同，則頭發(fā)受到的氧化程度不同。
實(shí)施例4利用丹磺酰肼進(jìn)行的頭發(fā)氧化蛋白質(zhì)的檢測(cè)以5厘米的長(zhǎng)度采取一名被試驗(yàn)者的頭發(fā)前端側(cè)(頭發(fā)沒(méi)有經(jīng)過(guò)化學(xué)處理的經(jīng)歷)，共取4根，在洗滌劑(處方1)中在室溫浸泡10分鐘進(jìn)行洗滌，然后在水中浸泡漂洗1小時(shí)。對(duì)第1根進(jìn)行脫色處理，對(duì)第2根進(jìn)行燙發(fā)處理(溴酸鈉類(lèi))，對(duì)第3根進(jìn)行燙發(fā)處理(過(guò)氧化氫類(lèi))，對(duì)最后的第4根不做任何處理。脫色處理為，將以下所示的處方2的A劑、B劑、C劑按照4∶6∶1的比例進(jìn)行混合，在室溫下將頭發(fā)在其中浸泡30分鐘。重復(fù)該操作4次。燙發(fā)處理(溴酸鈉類(lèi))為，在以下所述的處方3的1號(hào)液中在30℃浸泡10分鐘，水洗滌30秒，在2號(hào)液(溴酸鈉類(lèi))中在30℃浸泡10分鐘。燙發(fā)處理(過(guò)氧化氫類(lèi))為，在處方3的1號(hào)液中在30℃浸泡10分鐘，水洗滌30秒，在3號(hào)液(過(guò)氧化氫類(lèi))中在30℃浸泡5分鐘。將脫色、燙發(fā)處理過(guò)的頭發(fā)最后在洗滌劑(處方1)中在室溫浸泡10分鐘進(jìn)行洗滌，然后在水中浸泡漂洗1小時(shí)。將其干燥后，用瞬間強(qiáng)力粘合劑阿隆發(fā)固定于載玻片上。將其在50μM的丹磺酰肼的100mM的MES-Na緩沖液(pH＝5.5)中在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后、用PBS充分洗滌后，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，每個(gè)樣品各攝取4張圖像。在進(jìn)行數(shù)值化時(shí)，從圖像上分離頭發(fā)和背景，求出頭發(fā)的平均亮度。
圖5示出各頭發(fā)的平均亮度的結(jié)果。在燙發(fā)處理、脫色處理中、均觀察到了頭發(fā)氧化蛋白的亢進(jìn)。另外，有趣的是，過(guò)氧化氫類(lèi)燙發(fā)處理比溴酸鈉類(lèi)燙發(fā)處理觀察到了更多的氧化蛋白質(zhì)?？梢哉J(rèn)為這反映了，如果燙發(fā)方法不同，則頭發(fā)受到的氧化程度不同。
實(shí)施例5使用本方法，對(duì)健康正常黑發(fā)和脫色頭發(fā)的紫外線導(dǎo)致的頭發(fā)損傷進(jìn)行定量。
(1)試驗(yàn)1紫外線照射條件為，將3根醫(yī)療用紫外線熒光燈(UV-B)[FL20S·E-30/DMR]設(shè)定在離目標(biāo)15cm的高度處。(0.641mW/cm2)。
樣品為4個(gè)等級(jí)①健康正常黑發(fā)②脫色頭發(fā)1(健康正常黑發(fā)進(jìn)行15分鐘脫色處理后的頭發(fā))③脫色頭發(fā)2(健康正常黑發(fā)進(jìn)行30分鐘脫色處理后的頭發(fā))④脫色頭發(fā)3(健康正常黑發(fā)進(jìn)行30分鐘×2次脫色處理后的頭發(fā))在將上述4個(gè)等級(jí)的頭發(fā)洗發(fā)干燥后，分為未照射和照射2類(lèi)，照射樣品經(jīng)紫外線照射70小時(shí)。將照射后的樣品與未照射樣品一并洗凈，按照本方法進(jìn)行頭發(fā)的損傷評(píng)價(jià)。使用得到的平均亮度，利用以下式子，對(duì)頭發(fā)曝曬損傷進(jìn)行數(shù)值化。
頭發(fā)曝曬損傷＝照射頭發(fā)平均熒光亮度-未照射頭發(fā)平均熒光亮度其結(jié)果在圖6中示出。
結(jié)果在黑色素少的脫色頭發(fā)2及3中，確認(rèn)有很大的頭發(fā)損傷。頭發(fā)內(nèi)部的黑色素量的減少依賴(lài)于脫色的處理時(shí)間，由此可以認(rèn)為，在脫色頭發(fā)中、由于黑色素的原因，對(duì)紫外線的防御力降低。
另外，可知本試驗(yàn)法適合于進(jìn)行頭發(fā)的損傷評(píng)價(jià)。
以后的試驗(yàn)是通過(guò)影響力大的脫色頭發(fā)3來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)的。
(2)試驗(yàn)2以脫色處理30分鐘×2次的頭發(fā)為對(duì)象進(jìn)行試驗(yàn)。
紫外線照射條件為，將1個(gè)人工太陽(yáng)照明燈SOLAX 500W的XC-500B型(セリツク株式會(huì)社制)的照明裝置，設(shè)定在離目標(biāo)40cm的高度處。
(UV強(qiáng)度54W/m2，UV照射量210KJ/m2，用UV傳感器[東レテクイ(株)制]進(jìn)行測(cè)定)。
照射水平為6個(gè)等級(jí)(3，6，12，24，48，72小時(shí))對(duì)脫色頭發(fā)進(jìn)行洗發(fā)干燥后，分為未照射和照射2類(lèi)，照射樣品按照上述6個(gè)等級(jí)進(jìn)行人工太陽(yáng)照射。將照射后樣品與未照射樣品一并洗凈，用本方法進(jìn)行頭發(fā)的損傷評(píng)價(jià)。使用得到的平均亮度，利用以下式子對(duì)頭發(fā)曝曬損傷進(jìn)行數(shù)值化。
頭發(fā)曝曬損傷＝照射頭發(fā)的平均熒光亮度-未照射頭發(fā)的平均熒光亮度其結(jié)果在圖7中示出。
結(jié)果確認(rèn)了頭發(fā)損傷依賴(lài)于人工太陽(yáng)照明的照射時(shí)間而增加。因此，可知本試驗(yàn)法適合于評(píng)價(jià)因紫外線引起的頭發(fā)的損傷。
考慮到實(shí)驗(yàn)的效率，下面進(jìn)行人工太陽(yáng)照明12小時(shí)，確認(rèn)抗氧化劑的效果。
(3)試驗(yàn)3以脫色處理30分×2次的頭發(fā)為對(duì)象進(jìn)行試驗(yàn)。
紫外線照射條件為，將1個(gè)人工太陽(yáng)照明燈SOLAX 500W的XC-500B型(セリツク株式會(huì)社制)的照明裝置設(shè)定在離目標(biāo)40cm的高度處，照射12小時(shí)。
(UV強(qiáng)度54W/m2，UV照射量210KJ/m2，用UV傳感器[東レテクイ(株)制]進(jìn)行測(cè)定)試驗(yàn)水平8個(gè)等級(jí)①未涂布(離子交換水)②紅茶提取物(0.1％香榮興行社制)③薰衣草提取液(0.1％香榮興行社制)④葡萄種子提取物(0.1％キツコ一マン社制)⑤生育酚(0.001％)⑥醋酸生育酚(0.001％)⑦硫代?；撬?0.001％)⑧甘油(0.1％)對(duì)脫色頭發(fā)進(jìn)行洗發(fā)干燥后，分為未照射樣品組和照射樣品2類(lèi)。在照射樣品的情況下，將頭發(fā)樣品在上述8個(gè)等級(jí)的試樣中浸泡15分鐘，取出干燥。對(duì)干燥后的樣品按照上述條件進(jìn)行人工太陽(yáng)照明的照射。將照射后樣品與未照射樣品一并洗凈，用本方法進(jìn)行頭發(fā)的損傷評(píng)價(jià)。使用得到的平均亮度，利用下式1和2，算出抑制頭發(fā)曝曬損傷的效果。
式1頭發(fā)曝曬損傷＝照射頭發(fā)的平均熒光亮度-未照射頭發(fā)的平均熒光亮度式2 為了簡(jiǎn)便起見(jiàn)，如下設(shè)定頭發(fā)曝曬損傷的防御效果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。
A80％或其以上
B大于等于50％、且小于80％C大于等于20％、且小于50％D小于20％以下示出被測(cè)的試劑的效果。
紅茶提取物B，薰衣草提取液B，葡萄種子提取物A，生育酚A，醋酸生育酚A，硫代?；撬酇，甘油D結(jié)果可以判斷出本方法也適用于抗氧化劑的篩選體系。
權(quán)利要求
1.一種評(píng)價(jià)頭發(fā)損傷的方法，其特征在于，通過(guò)對(duì)頭發(fā)中的氧化蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異的熒光標(biāo)記，檢測(cè)其熒光來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，所述損傷起因于下述誘因中的任一種或它們多種的組合，所述誘因是，頭發(fā)的燙發(fā)處理、脫色處理、氧化染發(fā)劑處理、梳理、熱處理、暴露于紫外線、在游泳池中暴露在次氯酸中。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，所述對(duì)氧化蛋白質(zhì)的羰基的特異的熒光標(biāo)記，是通過(guò)使含有肼基的熒光物質(zhì)與所述氧化蛋白質(zhì)進(jìn)行作用·鍵合來(lái)實(shí)施的。
4.如權(quán)利要求1～3的任一項(xiàng)所述的方法，所述含有肼基的熒光物質(zhì)選自熒光素-5-氨基硫脲和丹磺酰肼。
5.如權(quán)利要求1～4的任一項(xiàng)所述的方法，所述評(píng)價(jià)在熒光顯微鏡下進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，所述含有肼基的熒光物質(zhì)為丹磺酰肼，所述熒光檢測(cè)通過(guò)目測(cè)進(jìn)行。
7.一種用于在頭發(fā)的損傷評(píng)價(jià)方法中使用的試劑盒，其特征在于，含有用于對(duì)氧化蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異熒光標(biāo)記的熒光物質(zhì)而構(gòu)成。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，所述熒光物質(zhì)為含有肼基的熒光物質(zhì)。
9.如權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，所述含肼基的熒光物質(zhì)選自熒光素-5-氨基硫脲和丹磺酰肼。
全文摘要
本發(fā)明提供一種評(píng)價(jià)頭發(fā)損傷的方法，其特征在于，通過(guò)對(duì)頭發(fā)中的氧化蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異的熒光標(biāo)記，檢測(cè)其熒光來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。所述損傷起因于下述誘因中的任一種或它們多種的組合，所述誘因是，頭發(fā)的燙發(fā)處理、脫色處理、氧化染發(fā)劑處理、梳理、吹風(fēng)機(jī)等的熱處理、暴露于紫外線、在游泳池中暴露在次氯酸中。
文檔編號(hào)G01N21/77GK1902487SQ20048004024
公開(kāi)日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2004年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月9日
發(fā)明者藤田宏志, 久保早苗, 安田正明, 平尾哲二, 川副智行 申請(qǐng)人:株式會(huì)社資生堂