專利名稱：角質(zhì)層的氧化蛋白質(zhì)的評(píng)價(jià)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種二維評(píng)價(jià)角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)在角質(zhì)層上的性狀的方法，其特征在于，對(duì)氧化蛋白質(zhì)進(jìn)行特異的熒光標(biāo)識(shí)；并提供一種為了實(shí)施該方法而采用的試劑盒。本發(fā)明還提供一種藥物的篩選方法，所述藥物會(huì)抑制氧化劑例如次氯酸鈉等導(dǎo)致的氧化蛋白質(zhì)的增加。本發(fā)明進(jìn)一步還涉及一種檢測(cè)來自皮膚的角質(zhì)層樣品中的水不溶性物質(zhì)即角質(zhì)化包膜的氧化形態(tài)的方法。
背景技術(shù)：
從進(jìn)行用于維持更健康皮膚的正確的皮膚護(hù)理的觀點(diǎn)出發(fā)，正確把握膚質(zhì)(或皮膚狀態(tài))是很重要的。因此，在用化妝品進(jìn)行皮膚護(hù)理時(shí)，人們通過例如向美容技術(shù)者問診等來評(píng)價(jià)化妝品使用者的膚質(zhì)。另外，為了客觀地評(píng)價(jià)膚質(zhì)，也使用各種測(cè)量儀器，根據(jù)觀察或測(cè)定出的參數(shù)來評(píng)價(jià)皮膚狀態(tài)或機(jī)能。
近年來，鑒于皮膚與隨著年齡增長的老化、光老化的關(guān)系，角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的研究日益盛行。所說的氧化蛋白質(zhì)是指，受到氧化而導(dǎo)入了羰基的蛋白質(zhì)，一般包括，蛋白質(zhì)中的稱作Lys、Arg、Pro的氨基酸殘基的NH2基直接氧化形成羰基而生成的物質(zhì)；和脂質(zhì)氧化成過氧化脂質(zhì)，進(jìn)一步分解成活性高的醛，其與蛋白質(zhì)結(jié)合而生成的物質(zhì)。對(duì)氧化蛋白質(zhì)與老化相關(guān)的研究逐漸豐富，人們認(rèn)識(shí)到在老化(腦、肝、成纖維細(xì)胞)、阿爾茨海默氏病、早老癥(Werner綜合征)等中，氧化蛋白質(zhì)增加。
可以認(rèn)為，在皮膚中，皮膚表面的皮脂被自由基氧化而生成過氧化脂質(zhì)，由此使得蛋白質(zhì)開始氧化。過氧化脂質(zhì)一旦生成，氧化便連鎖地進(jìn)行，不僅僅對(duì)肌膚表面造成刺激，而且直至角質(zhì)層深處對(duì)細(xì)胞造成損害。這樣，可以認(rèn)為皮脂、皮膚蛋白質(zhì)的氧化使肌膚本來具有的保持潤澤、彈性、亮澤等的機(jī)能全部降低。因此，可以認(rèn)為，對(duì)表皮的氧化蛋白質(zhì)的性狀例如存在量、分布狀態(tài)等進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)于正確把握膚質(zhì)或皮膚狀態(tài)，然后確定皮膚護(hù)理法的策略、選擇化妝品是很重要的。
如上所述，人們對(duì)角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)進(jìn)行了大量研究。J.J.Thiele et al.FEBS Letter 1998 Feb 6，422(3)，403-406中記載了角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法。其中公開了，通過將膠帶粘附在皮膚表層上，并進(jìn)行剝離即所謂的膠帶剝離操作，來獲得粘附有角質(zhì)層的膠帶(“膠帶角質(zhì)層”)，用ELISA檢測(cè)氧化蛋白質(zhì)的方法。根據(jù)Thiele等的研究，將紫外線照射到膠帶角質(zhì)層上，結(jié)果看到氧化蛋白質(zhì)增加，而且氧化蛋白質(zhì)的存在量在臉部等暴露部分的角質(zhì)層中比上臂等非暴露部分角質(zhì)層中多。
在J.J.Thiele et al.J.Invest.Dermatol.1999Sep.113(3)，335-359中，通過從膠帶角質(zhì)層中提取蛋白質(zhì)，對(duì)可溶性成分進(jìn)行DNPH標(biāo)識(shí)，實(shí)施SDS-PAGE，使用抗DNP抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，來進(jìn)行氧化蛋白質(zhì)的檢測(cè)。其中報(bào)道了，氧化蛋白質(zhì)在角質(zhì)層的上層中比中層、下層中多。
在C.S.Sander et al.J.Invest.Dermatol.2002，Apr，118(4)，618-625中，通過用DNPH標(biāo)識(shí)人皮膚組織切片，用抗DNP進(jìn)行染色，來檢測(cè)氧化蛋白質(zhì)。其中，發(fā)現(xiàn)光老化皮膚中主要是真皮中的氧化蛋白質(zhì)的量增多，另外報(bào)道了，由于連日照射紫外線，使得角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的量增多，另外，其增加比例隨著紫外線照射量而增大。
這樣，人們進(jìn)行了大量關(guān)于角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的研究，也得到了其與皮膚的因年齡增長而導(dǎo)致的老化、因紫外線照射等導(dǎo)致的光老化之間關(guān)聯(lián)性的啟示。因此，可以預(yù)測(cè)，皮膚的氧化蛋白質(zhì)的性狀的評(píng)價(jià)，可以向以預(yù)防或改善皮膚老化為目的的合適的皮膚護(hù)理法、治療法、化妝品、醫(yī)藥品的選擇等提供有效的信息。
現(xiàn)有技術(shù)中的氧化蛋白質(zhì)的檢測(cè)都包括下述繁瑣的工序，即，采取角質(zhì)層樣品，進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，使DNPH與該蛋白質(zhì)提取物作用，用DNP來標(biāo)識(shí)氧化蛋白質(zhì)，用SDS-PAGE進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，使其與抗DNP抗體作用，然后與過氧化物酶標(biāo)識(shí)的二級(jí)抗體結(jié)合，然后用化學(xué)發(fā)光試劑(ECL基質(zhì))進(jìn)行顯色。而且，得到的信息限于關(guān)于氧化蛋白質(zhì)的量，完全沒有提供其在肌膚上如何分布、如何明顯存在的二維詳細(xì)信息。因此，雖然暗示了氧化蛋白質(zhì)的檢測(cè)對(duì)于膚質(zhì)的評(píng)價(jià)是有用的，但其操作麻煩，而且得到的信息也有限，由于這些理由等，所以不太被人們應(yīng)用。但是可以認(rèn)為，如果能夠謀求其簡易化、并且其信息內(nèi)容也更詳細(xì)化，則其可以成為，用于提供咨詢服務(wù)的有效的方，例如近年來化妝品業(yè)界等進(jìn)行的以建議適當(dāng)?shù)钠つw護(hù)理法等為目的的咨詢服務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明者以能夠容易獲得皮膚角質(zhì)層的氧化蛋白質(zhì)在皮膚上的性狀的二維信息，特別是能夠?qū)崿F(xiàn)該氧化蛋白質(zhì)的信息在化妝品等銷售時(shí)的咨詢服務(wù)中的應(yīng)用為課題。一直以來，還完全沒有獲得皮膚角質(zhì)層的氧化蛋白質(zhì)在皮膚上的性狀的二維信息的嘗試。
因此，本發(fā)明提供一種二維地評(píng)價(jià)角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)在角質(zhì)層上性狀的方法，其特征在于，通過對(duì)從皮膚采取的角質(zhì)層樣品中的該氧化蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異的熒光標(biāo)識(shí)，并檢測(cè)該熒光，來進(jìn)行評(píng)價(jià)。優(yōu)選在熒光顯微鏡下進(jìn)行上述檢測(cè)。更優(yōu)選將上述熒光顯微鏡所得到的檢測(cè)結(jié)果圖像化。
在優(yōu)選方式中，上述氧化蛋白質(zhì)的羰基的特異的熒光標(biāo)識(shí)是通過使含有肼基的熒光物質(zhì)作用·結(jié)合在上述氧化蛋白質(zhì)而實(shí)施的。優(yōu)選從熒光素-5-氨基硫脲和德克薩斯紅酰肼(texas red hydrazide)中選擇上述含有肼基的熒光物質(zhì)。
在另一個(gè)優(yōu)選形態(tài)中，通過使生物素酰肼作用·結(jié)合在上述氧化蛋白質(zhì)上，然后在其上作用·結(jié)合熒光標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白，形成生物素酰肼與熒光標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白的復(fù)合體，來實(shí)施上述氧化蛋白質(zhì)的羰基的特異的熒光標(biāo)識(shí)。上述熒光標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白優(yōu)選為熒光素標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白。
在另一個(gè)優(yōu)選形態(tài)中，通過使二硝基苯肼作用·結(jié)合在上述氧化蛋白質(zhì)上，然后在其上作用·結(jié)合抗二硝基苯基抗體，然后將特異的熒光標(biāo)識(shí)抗體作用·結(jié)合在該抗二硝基苯基抗體上，來實(shí)施上述氧化蛋白質(zhì)的羰基的特異的熒光標(biāo)識(shí)。
優(yōu)選上述角質(zhì)層樣品為通過對(duì)皮膚進(jìn)行膠帶剝離而采取的膠帶角質(zhì)層。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種在對(duì)角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)在角質(zhì)層上的存在方式進(jìn)行二維評(píng)價(jià)的方法中使用的試劑盒，該試劑盒的特征在于，是含有下述部分而形成的，即，用于通過膠帶剝離來采取角質(zhì)層樣品的膠帶；和用于對(duì)氧化蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異的熒光標(biāo)識(shí)的熒光物質(zhì)。優(yōu)選在熒光顯微鏡下進(jìn)行上述評(píng)價(jià)。更優(yōu)選將上述熒光顯微鏡所得到的檢測(cè)結(jié)果圖像化。
在優(yōu)選的方式中，上述熒光物質(zhì)為含有肼基的熒光物質(zhì)，通過使含有肼基的熒光物質(zhì)作用·結(jié)合于上述氧化蛋白質(zhì)上來實(shí)施上述氧化蛋白質(zhì)的羰基的特異的熒光標(biāo)識(shí)。上述含有肼基的熒光物質(zhì)優(yōu)選選自熒光素-5-氨基硫脲和德克薩斯紅酰肼。
在另一個(gè)優(yōu)選形態(tài)中，上述熒光物質(zhì)為熒光標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白，通過使生物素酰肼作用·結(jié)合在上述氧化蛋白質(zhì)上，然后在其上作用·結(jié)合熒光標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白，形成生物素酰肼與熒光標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白的復(fù)合體，來實(shí)施上述氧化蛋白質(zhì)的羰基的特異的熒光標(biāo)識(shí)。優(yōu)選上述熒光標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白為熒光素標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白。
在另一個(gè)優(yōu)選形態(tài)中，上述熒光物質(zhì)為熒光標(biāo)識(shí)抗體，通過使二硝基苯肼作用·結(jié)合在上述氧化蛋白質(zhì)上，然后在其上作用·結(jié)合抗二硝基苯基抗體，然后使特異的熒光標(biāo)識(shí)抗體作用·結(jié)合在該抗二硝基苯基抗體上，來實(shí)施利用上述氧化蛋白質(zhì)的熒光物質(zhì)的特異的熒光標(biāo)識(shí)。
從另一觀點(diǎn)出發(fā)，本發(fā)明提供一種抑制氧化蛋白質(zhì)增加的藥物的篩選方法。該方法的特征在于，通過用適當(dāng)?shù)难趸瘎┖秃蜻x藥物來處理從角質(zhì)層例如皮膚采取的角質(zhì)層樣品或皮膚本身，然后對(duì)角質(zhì)層上被氧化了的蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異的熒光標(biāo)識(shí)，檢測(cè)該熒光，來評(píng)價(jià)該藥物抑制氧化蛋白質(zhì)增加的活性。
在優(yōu)選的方式中，通過使含有肼基的熒光物質(zhì)作用·結(jié)合在上述氧化蛋白質(zhì)上，來實(shí)施上述氧化蛋白質(zhì)的羰基的特異的熒光標(biāo)識(shí)。優(yōu)選上述含有肼基的熒光物質(zhì)選自熒光素-5-氨基硫脲和德克薩斯紅酰肼。
在另一個(gè)優(yōu)選方式中，通過使生物素酰肼作用·結(jié)合在上述氧化蛋白質(zhì)上，然后在其上作用·結(jié)合熒光標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白，形成生物素酰肼與熒光標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白的復(fù)合體，來實(shí)施上述氧化蛋白質(zhì)的羰基的特異的熒光標(biāo)識(shí)。優(yōu)選上述熒光標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白為熒光素標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白。
在另一個(gè)優(yōu)選方式中，通過使二硝基苯肼作用·結(jié)合在上述氧化蛋白質(zhì)上，然后在其上作用·結(jié)合抗二硝基苯基抗體，然后使特異的熒光標(biāo)識(shí)抗體作用·結(jié)合在該抗二硝基苯基抗體上，來實(shí)施上述氧化蛋白質(zhì)的羰基的特異的熒光標(biāo)識(shí)。
優(yōu)選上述角質(zhì)層樣品為通過對(duì)皮膚進(jìn)行膠帶剝離而采取的膠帶角質(zhì)層。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種檢測(cè)來自皮膚的角質(zhì)層樣品中的水不溶性物質(zhì)即角質(zhì)化包膜(角質(zhì)肥厚膜)的氧化形態(tài)的方法，其特征在于，通過對(duì)該氧化形態(tài)的角質(zhì)化包膜中的羰基進(jìn)行特異的熒光標(biāo)識(shí)，檢測(cè)該熒光，來進(jìn)行評(píng)價(jià)。
在優(yōu)選的方式中，上述氧化形態(tài)的角質(zhì)化包膜中的羰基的特異的熒光標(biāo)識(shí)是通過使含有肼基的熒光物質(zhì)作用·結(jié)合在上述氧化形態(tài)的角質(zhì)化包膜上而實(shí)施的。優(yōu)選上述含有肼基的熒光物質(zhì)選自熒光素-5-氨基硫脲和德克薩斯紅酰肼。
在另一個(gè)優(yōu)選方式中，通過使生物素酰肼作用·結(jié)合在上述氧化形態(tài)的角質(zhì)化包膜上，然后在其上作用·結(jié)合熒光標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白，形成生物素酰肼與熒光標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白的復(fù)合體，來實(shí)施上述氧化形態(tài)的角質(zhì)化包膜中的羰基的特異的熒光標(biāo)識(shí)。優(yōu)選上述熒光標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白為熒光素標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白。
在另一個(gè)優(yōu)選方式中，通過使二硝基苯肼作用·結(jié)合在上述氧化形態(tài)的角質(zhì)化包膜上，然后在其上作用·結(jié)合抗二硝基苯基抗體，然后將特異的熒光標(biāo)識(shí)抗體作用·結(jié)合在該抗二硝基苯基抗體上，來實(shí)施上述氧化形態(tài)的角質(zhì)化包膜中的羰基的特異的熒光標(biāo)識(shí)。
更優(yōu)選上述方法包含下述操作用能夠有選擇地染色的色素對(duì)上述角質(zhì)化包膜的疏水性區(qū)域染色，進(jìn)行檢測(cè)，和/或檢測(cè)該角質(zhì)化包膜的抗原性。優(yōu)選上述色素為尼羅紅，上述抗原性優(yōu)選使用抗人內(nèi)披蛋白(involucrin)抗體進(jìn)行檢測(cè)。
更優(yōu)選用熒光顯微鏡進(jìn)行上述檢測(cè)。


圖1表示利用生物素酰肼檢測(cè)角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的結(jié)果。
圖2表示利用德克薩斯紅酰肼檢測(cè)角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的結(jié)果。
圖3表示利用二硝基苯肼(DNPH)檢測(cè)角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的結(jié)果。
圖4表示丙酮處理過的角質(zhì)層的氧化蛋白質(zhì)的評(píng)價(jià)結(jié)果。
圖5表示利用熒光素-5-氨基硫脲檢測(cè)角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的部位差異的結(jié)果。
圖6表示角質(zhì)層最外層與內(nèi)層的氧化蛋白質(zhì)的比較結(jié)果。
圖7表示紫外線照射引起的角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的增加結(jié)果。
圖8表示紫外線照射引起的角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的增加結(jié)果。
圖9表示次氯酸鈉和不飽和脂肪酸引起的角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的增加結(jié)果。
圖10表示次氯酸鈉引起的角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的增加結(jié)果。
圖11表示不飽和脂肪酸引起的角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的增加結(jié)果。
圖12表示乙醛引起的角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的增加結(jié)果。
圖13表示生物素酰肼引起的氧化角質(zhì)化包膜的檢測(cè)結(jié)果。
圖14表示角質(zhì)化包膜的氧化度與利用抗內(nèi)披蛋白抗體檢測(cè)出的成熟度的同時(shí)比較結(jié)果。
圖15表示角質(zhì)化包膜氧化度和利用尼羅紅檢測(cè)出的成熟度的同時(shí)比較結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供一種二維評(píng)價(jià)角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)在角質(zhì)層上的性狀的方法，其特征在于，通過對(duì)從皮膚采取的角質(zhì)層樣品中的該氧化蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異的熒光標(biāo)識(shí)，檢測(cè)該熒光，來進(jìn)行評(píng)價(jià)；并提供用于實(shí)施該方法的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的方法，也如下述實(shí)施例所示，可對(duì)氧化蛋白質(zhì)進(jìn)行特異的熒光標(biāo)識(shí)。
角質(zhì)層由表皮角質(zhì)化細(xì)胞末梢分化而形成的角質(zhì)細(xì)胞和將其包圍的細(xì)胞間脂質(zhì)構(gòu)成。角質(zhì)細(xì)胞以身為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的角蛋白為主要成分，由將其包圍的角質(zhì)化包膜(角質(zhì)肥厚膜)構(gòu)成。在紫外線、化學(xué)類氧化劑、大氣污染物等各種因素中的暴露以及隨著年齡的增長，使角質(zhì)層蛋白質(zhì)被氧化，結(jié)果導(dǎo)入羰基?？梢哉J(rèn)為在這樣的氧化中有下述情況蛋白質(zhì)中的被稱為Lys、Arg、Pro的氨基酸殘基的NH2基直接氧化而形成羰基的情況；脂質(zhì)氧化成過氧化脂質(zhì)，進(jìn)一步分解成反應(yīng)活性高的醛，其與蛋白質(zhì)結(jié)合的情況。
在本發(fā)明中，來自皮膚的角質(zhì)層樣品可以是來自于身體的任何部位的樣品，另外，也可以是這樣的樣品(組織或者細(xì)胞)的培養(yǎng)物。作為該樣品來源的身體部位或區(qū)域的典型的例子，可以列舉出例如，臉部的臉頰、額頭、指甲和軀干等。
這樣的樣品可以通過所謂的外科手段等的侵入方法而得到，但是，在特別是以評(píng)價(jià)膚質(zhì)為目的的情況下，為了簡便，優(yōu)選通過非侵入式方法從皮膚中取得。作為非侵入式方法，可以列舉出例如，該技術(shù)領(lǐng)域中常用的膠帶剝離、擦拭法等。
由于膠帶剝離通過在皮膚表面粘附膠帶片，并實(shí)施剝離，可以將皮膚的二維狀態(tài)直接轉(zhuǎn)印到該膠帶上，所以在本發(fā)明中是特別優(yōu)選的。如果通過膠帶剝離來采取膠帶角質(zhì)層、不進(jìn)行裁斷、以保持原樣的狀態(tài)對(duì)氧化蛋白質(zhì)進(jìn)行特異的熒光染色，則可以得到對(duì)應(yīng)于實(shí)際的皮膚的二維性狀的氧化蛋白質(zhì)的二維信息。
膠帶剝離的優(yōu)選方法是，首先，將皮膚表層用例如酒精等進(jìn)行凈化來消除皮脂、污漬等，將切成合適尺寸(例如5×5cm)的膠帶片輕輕地放在皮膚表面上，對(duì)整個(gè)膠帶施加均勻的力，壓平，然后用均勻的力將膠帶剝離。膠帶可以是市售的玻璃紙膠帶等，例如可以使用ScotchSuperstrength Mailing Tape(3M公司制)等。
本發(fā)明中可利用的對(duì)氧化蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異的熒光標(biāo)識(shí)的熒光物質(zhì)優(yōu)選為可與氧化蛋白質(zhì)的羰基結(jié)合的含肼基-NHNH2的物質(zhì)。這樣的熒光物質(zhì)的例子，可以列舉出，熒光素-5-氨基硫脲、德克薩斯紅酰肼、熒光黃酰肼等。
在使用這樣的含肼基的熒光物質(zhì)的情況下，氧化蛋白質(zhì)的檢測(cè)例如可以如下那樣實(shí)施(1)通過例如膠帶剝離來采取角質(zhì)層樣品；(2)使適當(dāng)緩沖液(例如100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5))中的含肼基的熒光物質(zhì)與樣品在室溫下反應(yīng)數(shù)小時(shí)(例如1小時(shí))；(3)在反應(yīng)結(jié)束后，用適當(dāng)?shù)纳砣芤?例如緩沖液磷酸緩沖生理食鹽液(PBS))充分洗滌后，用熒光顯微鏡檢測(cè)氧化蛋白質(zhì)；(4)任選地，進(jìn)行熒光顯微鏡拍照。
氧化蛋白質(zhì)的特異的熒光標(biāo)識(shí)也可使用生物素酰肼與熒光標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白的組合。由于生物素酰肼也具有肼基，所以其可結(jié)合在蛋白質(zhì)的羰基上。在這種情況下，首先使生物素酰肼結(jié)合在氧化蛋白質(zhì)上，然后通過生物素-抗生物素蛋白結(jié)合來使熒光標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白與生物素酰肼結(jié)合，結(jié)果使氧化蛋白質(zhì)被熒光標(biāo)識(shí)。生物素酰肼可以采用該領(lǐng)域公知的例如ピア一ス社制造銷售的產(chǎn)品。另外，熒光抗生物素蛋白可使用例如熒光素抗生物素蛋白等。
在使用這樣的含肼基熒光物質(zhì)的情況下，氧化蛋白質(zhì)的檢測(cè)例如可以如下那樣實(shí)施(1)通過例如膠帶剝離來采取角質(zhì)層樣品；
(2)使適當(dāng)緩沖液(例如100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5))中的生物素酰肼與樣品在室溫下反應(yīng)數(shù)小時(shí)(例如1小時(shí))；(3)在反應(yīng)結(jié)束后，用適當(dāng)?shù)纳砣芤?例如緩沖液磷酸緩沖生理食鹽液(PBS)充分洗滌后，使熒光標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白在室溫中反應(yīng)數(shù)小時(shí)(例如1小時(shí))；(4)用熒光顯微鏡檢測(cè)氧化蛋白質(zhì)；(5)任選地，進(jìn)行熒光顯微鏡拍照。
也可以通過使二硝基苯肼作用·結(jié)合在氧化蛋白質(zhì)的羰基上，用熒光色素標(biāo)識(shí)該二硝基苯基部分，來進(jìn)行氧化蛋白質(zhì)的特異的熒光標(biāo)識(shí)。因此，在本發(fā)明更優(yōu)選的方式中，可以用熒光免疫測(cè)定法等來檢測(cè)與氧化蛋白質(zhì)的羰基結(jié)合了的二硝基苯肼的二硝基苯基部分。
在利用這樣的二硝基苯肼進(jìn)行熒光標(biāo)識(shí)的情況下，氧化蛋白質(zhì)的檢測(cè)例如可以如下那樣實(shí)施(1)通過例如膠帶剝離來采取角質(zhì)層樣品；(2)使適當(dāng)?shù)木彌_液(例如100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5))中的二硝基苯肼(DNPH)與樣品在室溫下反應(yīng)數(shù)小時(shí)(例如1小時(shí))；(3)在反應(yīng)結(jié)束后，用適當(dāng)?shù)纳砣芤?例如緩沖液磷酸緩沖生理食鹽液(PBS))充分洗凈后，在抗DNP抗體例如兔DNP抗體(ZYMED公司制)的同樣的生理溶液中，在室溫反應(yīng)數(shù)小時(shí)(例如1小時(shí))；(4)在反應(yīng)結(jié)束后，用同樣的生理溶液充分洗凈，使特異的熒光標(biāo)識(shí)的二級(jí)抗體例如熒光素標(biāo)識(shí)抗兔Ig(アマシヤムフアルマシアバイオテク社制)等與上述抗DNP抗體在室溫反應(yīng)數(shù)小時(shí)(例如1小時(shí))；(5)用熒光顯微鏡檢測(cè)氧化蛋白質(zhì)；(6)任選地，進(jìn)行熒光顯微鏡拍照。
本發(fā)明涉及的試劑盒，除了上述膠帶和熒光物質(zhì)之外，還可以同時(shí)含有上述各種評(píng)價(jià)方法實(shí)施所必要的試劑，例如各種緩沖劑。
通過使用上述氧化蛋白質(zhì)檢測(cè)方法和試劑盒，可得到氧化蛋白質(zhì)在皮膚上的二維性狀，具體來說是存在量、存在部位、分布狀態(tài)例如是分散存在、還是局部存在等各種信息，而且無需現(xiàn)有技術(shù)中所必需的蛋白質(zhì)的提取操作、電泳操作、蛋白質(zhì)印跡操作等，作為昂貴的設(shè)備，只要有熒光顯微鏡即可。因此，上述氧化蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法和試劑盒可以用簡單操作和設(shè)備來提供對(duì)膚質(zhì)評(píng)價(jià)有效的信息，可在例如化妝品商店的柜臺(tái)簡單實(shí)施。
本發(fā)明還提供抑制氧化蛋白質(zhì)增加的藥物的篩選方法。該方法的特征在于通過用適當(dāng)?shù)难趸瘎┖秃蜻x藥物對(duì)從角質(zhì)層例如皮膚采取的角質(zhì)層樣品或皮膚本身進(jìn)行處理，然后對(duì)角質(zhì)層上被氧化了的蛋白質(zhì)中的羰基進(jìn)行特異的熒光標(biāo)識(shí)，檢測(cè)該熒光，來對(duì)該藥物的抑制氧化蛋白質(zhì)的增加的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。作為氧化劑，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種氧化劑、例如次氯酸鈉；不飽和脂肪酸例如亞油酸、油酸、棕櫚油酸；醛類例如丙烯醛等。角質(zhì)層樣品的利用氧化劑的處理，可以與利用候選藥物的處理同時(shí)進(jìn)行，或在利用候選藥物處理后進(jìn)行。在優(yōu)選方式中，用氧化劑和候選藥物同時(shí)處理角質(zhì)層樣品。
具體而言，抑制氧化蛋白質(zhì)增加的藥物的篩選方法例如可以如下那樣實(shí)施。
將膠帶貼附于健康成人的皮膚，例如非暴露部分的腹部，并立即剝離，非侵入性地采取角質(zhì)層最外層。將粘附了角質(zhì)層的膠帶在混合有氧化劑和一定濃度的候選藥物的水溶液中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后充分洗凈，然后對(duì)被氧化的蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行如上所述的特異的熒光標(biāo)識(shí)，充分洗凈后，用熒光顯微鏡等進(jìn)行觀察，由此來評(píng)價(jià)候選藥物抑制氧化劑引起的氧化蛋白質(zhì)的增加的程度。對(duì)于評(píng)價(jià)而言，可以選擇下述濃度作為標(biāo)準(zhǔn)，即，將氧化蛋白質(zhì)的增加抑制到例如僅用氧化劑培養(yǎng)時(shí)的值與僅用水培養(yǎng)時(shí)的值的中間值的藥物濃度，例如在該濃度小于等于1mM，優(yōu)選小于等于500μM，更優(yōu)選小于等于250μM的情況下，可以認(rèn)為是抑制氧化蛋白質(zhì)增加的藥物。另外，抑制氧化蛋白質(zhì)增加的藥物的效果，還可以基于在同時(shí)向人皮膚涂布氧化劑后采取的角質(zhì)層樣品的氧化蛋白質(zhì)的值來進(jìn)行評(píng)價(jià)。
進(jìn)而，本發(fā)明提供一種檢測(cè)來自皮膚的角質(zhì)層樣品中的水不溶性物質(zhì)即角質(zhì)化包膜(角質(zhì)肥厚膜)的氧化形態(tài)的方法，其特征在于，通過對(duì)該氧化形態(tài)的角質(zhì)化包膜，具體地說是對(duì)氧化形態(tài)的角質(zhì)化包膜中的氧化蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異的熒光標(biāo)識(shí)，檢測(cè)該熒光，來進(jìn)行評(píng)價(jià)。
如上所述，角質(zhì)細(xì)胞以角蛋白纖維為主要成分，由將其包圍的角質(zhì)化包膜構(gòu)成。角質(zhì)化包膜是隨著表皮角化細(xì)胞分化而生成的多個(gè)角質(zhì)化包膜前體蛋白通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)，不溶化而形成的。進(jìn)而，其一部分共價(jià)鍵合神經(jīng)酰胺等，形成疏水性結(jié)構(gòu)，這暗示了，可以提供上述細(xì)胞間脂質(zhì)的層狀結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，形成角質(zhì)層阻擋功能的基礎(chǔ)?？赏ㄟ^將皮膚組織或皮膚培養(yǎng)細(xì)胞等，在含有十二烷基硫酸鈉等表面活性劑和巰基乙醇等還原劑的溶液中煮沸，利用離心分離等方法得到除去了可溶性成分的不溶性組分，來調(diào)制角質(zhì)化包膜?？赏ㄟ^用顯微鏡對(duì)其進(jìn)行形態(tài)觀察，來評(píng)價(jià)其性狀。Michel等報(bào)導(dǎo)了，在相對(duì)于角質(zhì)層最外層的角質(zhì)層深處，有很多脆弱結(jié)構(gòu)的角質(zhì)化包膜(J.Invest.Dermatol 9111-15，1988)。另一方面，在干癬和葉狀魚鱗癬等中，在最外層也可看到脆弱的角質(zhì)化包膜(Br.J.Dermatol12215-21，1990)。
被認(rèn)為成為角質(zhì)層阻擋功能特別是防止從體內(nèi)蒸發(fā)水分、從外界混入異物的功能的主體的脂質(zhì)與角質(zhì)化包膜的關(guān)聯(lián)性或角質(zhì)化包膜的性狀受到關(guān)注，其評(píng)價(jià)方法也被公開(特開2001-91514號(hào)公報(bào))。但是，在現(xiàn)有技術(shù)中，還沒有關(guān)于角質(zhì)化包膜的氧化形態(tài)的評(píng)價(jià)的報(bào)道。如上所述，角質(zhì)化包膜也由蛋白質(zhì)構(gòu)成，因此通過運(yùn)用本發(fā)明涉及的角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法，可同樣操作來檢測(cè)其氧化形態(tài)。
角質(zhì)化包膜的氧化形態(tài)的具體評(píng)價(jià)方法例如可以如下那樣實(shí)施(1)通過例如膠帶剝離來采取角質(zhì)層樣品；(2)使適當(dāng)?shù)木彌_液(例如100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5))中的生物素酰肼與樣品在室溫反應(yīng)數(shù)小時(shí)(例如1小時(shí))；(3)在反應(yīng)結(jié)束后，加入水性提取液(例如含有2％的十二烷基硫酸鈉、20mM的二硫蘇糖醇、5mM的EDTA的0.1M的Tris-鹽酸緩沖液(pH8.5))，對(duì)水不溶性組分角質(zhì)化包膜進(jìn)行加熱處理(例如在100℃加熱10分鐘)，將不溶物離心分離(例如4000g，10分鐘)，以角質(zhì)化包膜的形式收集；(4)任意重復(fù)進(jìn)行(3)的操作，將可溶性成分徹底除去；(5)將角質(zhì)化包膜懸浮液滴加到載玻片上，風(fēng)干，丙酮固定后，用適當(dāng)?shù)纳砣芤?例如緩沖液磷酸緩沖生理食鹽液(PBS))充分洗凈，然后使熒光標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白在室溫反應(yīng)數(shù)小時(shí)(例如1小時(shí))；(6)在反應(yīng)結(jié)束后，用同樣的生理溶液充分洗凈，然后用熒光顯微鏡檢測(cè)氧化角質(zhì)化包膜；(7)任選地，進(jìn)行熒光顯微鏡拍照。
在上述氧化角質(zhì)化包膜的檢測(cè)方法中，任選地，為了對(duì)角質(zhì)化包膜的成熟形態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)，可利用對(duì)疏水性區(qū)域選擇性染色的色素進(jìn)行染色，或?yàn)榱嗽u(píng)價(jià)角質(zhì)化包膜的未成熟形態(tài)，也可同時(shí)實(shí)施對(duì)內(nèi)披蛋白抗體的抗原性檢測(cè)。
作為可以對(duì)疏水性區(qū)域(特別是生物組織中)選擇性地染色的色素，可使用被用于各種疏水性區(qū)域的染色的色素。作為具體的這樣的色素，可以列舉出例如，尼羅紅(Nile Red)、油紅O(Oil Red O)、蘇丹III(SudanIII)。特別地，優(yōu)選使用尼羅紅。尼羅紅可以是與其還原型即尼羅藍(lán)的混合物。這樣的混合物還包括，在尼羅藍(lán)的水溶液中尼羅藍(lán)的一部分自然氧化而轉(zhuǎn)化成尼羅紅的狀態(tài)的物質(zhì)。
作為成為用于檢測(cè)角質(zhì)化包膜的構(gòu)成蛋白質(zhì)的抗原性的對(duì)象蛋白質(zhì)，可以列舉出內(nèi)披蛋白、兜甲蛋白等可共價(jià)結(jié)合脂質(zhì)的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)間交聯(lián)鍵合的異肽、假異肽。它們的抗原性可使用針對(duì)這些蛋白質(zhì)或肽的抗體來檢測(cè)出。檢測(cè)方法只要是能夠檢測(cè)抗體與上述蛋白質(zhì)或肽的結(jié)合的方法，則可以是任何方法，但是優(yōu)選使用在對(duì)組織標(biāo)本中的酶、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)等的抗原物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)識(shí)或染色時(shí)使用的熒光抗體法。作為抗體的熒光標(biāo)識(shí)，可以使用例如，熒光素異硫氰酸酯(FITC)、四甲基羅達(dá)明異硫氰酸酯(TRITC)等。
根據(jù)角質(zhì)化包膜的性狀的評(píng)價(jià)方法，例如利用抗原性的檢測(cè)方法能有顯著差異地檢測(cè)角質(zhì)層樣品中的角質(zhì)化包膜的內(nèi)披蛋白的情況，意味著脂質(zhì)沒有與內(nèi)披蛋白共價(jià)鍵結(jié)合至有顯著差異的量(或可識(shí)別的程度)，或者交聯(lián)反應(yīng)不充分而保持了抗原性，可以評(píng)價(jià)為，角質(zhì)層樣品中的角質(zhì)化包膜處于未熟狀態(tài)。相反，在例如不能有顯著差異地檢測(cè)內(nèi)披蛋白的情況下，脂質(zhì)與內(nèi)披蛋白生成了大量的共價(jià)鍵，或者交聯(lián)反應(yīng)充分進(jìn)行、使抗原性消失，可以評(píng)價(jià)為，角質(zhì)化包膜處于成熟的狀態(tài)。另外，例如在角質(zhì)層樣品中檢測(cè)出(或觀察到)被尼羅紅進(jìn)行了強(qiáng)陽性染色的角質(zhì)化包膜的情況下，可評(píng)價(jià)為，角質(zhì)化包膜處于非常柔韌的狀態(tài)。相反，在可看到尼羅紅產(chǎn)生的染色性具有多樣性的情況下，可評(píng)價(jià)為，在角質(zhì)化包膜形成過程中存在差異。以上的評(píng)價(jià)同樣可以適用于所培養(yǎng)的表皮角化細(xì)胞中的角質(zhì)化包膜形成過程。
實(shí)施例下面通過實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
實(shí)施例1利用生物素酰肼檢測(cè)角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)在健康成人的臉部和上臂內(nèi)側(cè)粘附透明膠帶、并立即剝離，對(duì)角質(zhì)層最外層進(jìn)行非侵入地采樣。使其在5mM的生物素酰肼(PIERCE公司制)的100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5)中在室溫反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，用磷酸緩沖生理食鹽液(PBS)進(jìn)行充分洗凈，然后使熒光素標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白(アマシヤムフアルマシアバイオテク社制；用PBS稀釋成1∶100體積)在室溫反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，用PBS充分洗凈后，用熒光顯微鏡(オリンパス社BX52)觀察。圖1中顯示了其觀察圖像。
如圖1所示，在上臂內(nèi)側(cè)和臉部都觀察到熒光，利用生物素酰肼-熒光素標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白對(duì)氧化蛋白質(zhì)進(jìn)行了充分標(biāo)識(shí)，暗示可進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)施例2利用德克薩斯紅酰肼檢測(cè)角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)在健康成人的臉部(臉頰)和上臂內(nèi)側(cè)粘附透明膠帶、并立即剝離，對(duì)角質(zhì)層最外層進(jìn)行非侵入地采樣。使其在20μM的德克薩斯紅酰肼(モレキコラ一プロ一ブス社制)的100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5)中在室溫反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，用磷酸緩沖生理食鹽液(PBS)充分洗凈，然后用熒光顯微鏡觀察。圖2中顯示了該觀察圖像。
如圖2所示可知，在上臂內(nèi)側(cè)和臉部都觀察到熒光，與熒光素-5-氨基硫脲一樣，氧化蛋白質(zhì)也被德克薩斯紅酰肼標(biāo)識(shí)。
實(shí)施例3利用二硝基苯肼(DNPH)檢測(cè)角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)在健康成人的臉部和上臂內(nèi)側(cè)粘附透明膠帶、并立即剝離，對(duì)角質(zhì)層最外層進(jìn)行非侵入地采樣。使其在200μM的二硝基苯肼(和光純藥工業(yè)(株)社制)的100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5)中、在室溫反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，用磷酸緩沖生理食鹽液(PBS)充分洗凈，然后在兔DNP抗體(ZYMED公司制)的PBS溶液(1μg/ml)中、在室溫反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，用PBS充分洗凈，在熒光素標(biāo)識(shí)抗兔Ig(アマシヤムフアルマシアバイオテク社制；用PBS稀釋成1∶100)中、在室溫反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，用PBS充分洗凈，然后用熒光顯微鏡觀察。圖3中顯示了該觀察圖像。
如圖3所示，在上臂內(nèi)側(cè)和臉部都觀察到熒光，可知使用二硝基苯肼，與生物素酰肼、熒光素-5-氨基硫脲、德克薩斯紅酰肼一樣，也可以對(duì)氧化蛋白質(zhì)進(jìn)行特異的標(biāo)識(shí)。
實(shí)施例4丙酮處理過的角質(zhì)層的氧化蛋白質(zhì)的評(píng)價(jià)在4個(gè)健康成人的臉部粘附透明膠帶、并立即剝離，對(duì)角質(zhì)層最外層進(jìn)行非侵入地采樣，每個(gè)人準(zhǔn)備三個(gè)樣品。對(duì)一個(gè)樣品進(jìn)行30分鐘的丙酮處理，不對(duì)另外兩個(gè)樣品實(shí)施處理(這里，將經(jīng)丙酮處理過的樣品記為“丙酮→標(biāo)識(shí)”樣品，將另外兩個(gè)記為“僅標(biāo)識(shí)”或“標(biāo)識(shí)→丙酮”樣品)。分別使其在20μM的熒光素-5-氨基硫脲(モレキコラ一プロ一ブス社制)的100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5)中、在室溫反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，用磷酸緩沖生理食鹽液(PBS)充分洗凈，僅將“標(biāo)識(shí)→丙酮”樣品在丙酮中處理30分鐘。然后，用熒光顯微鏡對(duì)各樣品進(jìn)行觀察。通過圖像來分離細(xì)胞和背景，求出各自的平均輝度，由此使氧化蛋白質(zhì)的量數(shù)值化。圖4表示該數(shù)值化的圖表。
由圖4可知，即使對(duì)膠帶角質(zhì)層進(jìn)行丙酮處理，也不能看到信號(hào)強(qiáng)度顯著變化。因此，暗示了熒光酰肼標(biāo)識(shí)的羰基大部分來源于氧化蛋白質(zhì)，角質(zhì)層中存在的過氧化脂質(zhì)的比例很小。
因此，暗示了本申請(qǐng)發(fā)明在檢測(cè)角質(zhì)層中的氧化蛋白質(zhì)方面是極為有利的。
實(shí)施例5利用熒光素-5-氨基硫脲檢測(cè)角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的部位差異在健康成人的臉部(臉頰)和上臂內(nèi)側(cè)粘附透明膠帶、并立即剝離，對(duì)角質(zhì)層最外層進(jìn)行非侵入地采樣。使其在20μM的熒光素-5-氨基硫脲(モレキコラ一プロ一ブス社制)的100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5)中、在室溫反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，用磷酸緩沖生理食鹽液(PBS)充分洗凈后，用熒光顯微鏡觀察。在數(shù)值化時(shí)，通過圖像來分離細(xì)胞和背景，求出各自的平均輝度。圖5顯示了該觀察圖像和數(shù)值化的圖表。
如圖5所示，在上臂內(nèi)側(cè)和臉部都觀察到熒光，從觀察圖像和數(shù)值化的圖表都可看出，臉頰即暴露部分的氧化蛋白質(zhì)的量比上臂內(nèi)側(cè)即非暴露部分更多，這與J.J.Thiele et al.FEBS Letter 1998 Feb 6，422(3)，403-406的看法一致。因此，可知利用生物素酰肼-熒光素標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白，可以充分標(biāo)識(shí)氧化蛋白質(zhì)，可進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)施例6利用熒光素-5-氨基硫脲的角質(zhì)層檢測(cè)最外層和內(nèi)層的氧化蛋白質(zhì)在健康成人的上臂內(nèi)側(cè)粘附透明膠帶、并立即剝離，重復(fù)進(jìn)行20次，采取角質(zhì)層最外層和第20次剝離的角質(zhì)層。使其在20μM的熒光素-5-氨基硫脲(モレキコラ一プロ一ブス社制)的100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5)中、在室溫反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，用磷酸緩沖生理食鹽液(PBS)充分洗凈后，用熒光顯微鏡觀察。在數(shù)值化時(shí)，通過圖像分離細(xì)胞和背景，求出各自的平均輝度。圖6顯示了該觀察圖像和數(shù)值化的圖表。
如圖6所示，從觀察到的圖像和數(shù)值化的圖表都可看出，氧化蛋白質(zhì)在最外層比在第20次剝離的角質(zhì)層中更多，因此氧化蛋白質(zhì)在角質(zhì)層上層更多，這與J.J.Thiele et al.J.Invest.Dermatol.1999，Sep，113(3)，335-359的觀點(diǎn)一致。
實(shí)施例7紫外線照射引起的角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的增加在健康成人的上臂內(nèi)側(cè)粘附透明膠帶、并立即剝離，對(duì)角質(zhì)層最外層進(jìn)行非侵入地采樣。在對(duì)粘附了角質(zhì)層的膠帶照射UVA(240J/cm2)和UVB(77J/cm2)后，使其在20μM的熒光素-5-氨基硫脲(モレキコラ一プロ一プス社制)的100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5)中、在室溫反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，用磷酸緩沖生理食鹽液(PBS)充分洗凈后，用熒光顯微鏡觀察。圖7中顯示了該觀察圖像?？煽吹阶贤饩€照射引起的氧化蛋白質(zhì)的增加，其結(jié)果與C.S.Sander et al.J.Invest.Dermatol.2002，Apr，118(4)，618-625的內(nèi)容一致。
實(shí)施例8紫外線照射引起的角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的增加對(duì)健康成人的背中照射2MED的UVB，10天后，在照射部位粘附透明膠帶、并立即剝離，對(duì)角質(zhì)層最外層進(jìn)行非侵入地采樣。使粘附了角質(zhì)層的膠帶在20μM的熒光素-5-氨基硫脲(モレキコラ一プロ一ブズ社制)的100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5)中在室溫反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，用磷酸緩沖生理食鹽液(PBS)充分洗凈后，用熒光顯微鏡觀察。圖8中顯示了該觀察圖像和數(shù)值化的圖表?？梢钥闯?，與照射前比較，紫外線照射引起氧化蛋白質(zhì)增加。
實(shí)施例9次氯酸鈉和不飽和脂肪酸引起的角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的增加在健康成人的腹部粘附透明膠帶、并立即剝離，對(duì)角質(zhì)層最外層進(jìn)行非侵入地采樣。對(duì)粘附了角質(zhì)層的膠帶涂布200μg/cm2的量的不飽和脂肪酸(亞油酸、油酸、棕櫚油酸)后，在0.2mM的次氯酸鈉水溶液中在37℃培養(yǎng)18小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束后，用磷酸緩沖生理食鹽液(PBS)充分洗凈后，在20μM的熒光素-5-氨基硫脲(モレキコラ一プロ一ブズ社制)的100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5)中、在室溫反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，用磷酸緩沖生理食鹽液(PBS)充分洗凈后，用熒光顯微鏡觀察。圖9中顯示了該觀察圖像和數(shù)值化的圖表?？梢钥吹?，與在水中培養(yǎng)的情況比較，在利用次氯酸鈉的培養(yǎng)中，氧化蛋白質(zhì)增加。另外也看到，通過將不飽和脂肪酸涂布在粘附了角質(zhì)層的膠帶上、并在次氯酸鈉中培養(yǎng)，使得氧化蛋白質(zhì)進(jìn)一步增加。
實(shí)施例10次氯酸鈉引起的角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的增加在健康成人的前臂以2μL/cm2的量連續(xù)5天涂布20mM次氯酸鈉水溶液，粘附透明膠帶、并立即剝離，對(duì)角質(zhì)層最外層進(jìn)行非侵入地采樣。使粘附了角質(zhì)層的膠帶在20μM的熒光素-5-氨基硫脲(モレキコラ一プロ一ブズ社制)的100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5)中在室溫反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，用磷酸緩沖生理食鹽液(PBS)充分洗凈后，用熒光顯微鏡觀察。圖10中顯示了該觀察圖像和數(shù)值化的圖表?？梢钥吹?，連日涂布次氯酸鈉引起氧化蛋白質(zhì)的增加。
實(shí)施例11不飽和脂肪酸引起的角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的增加在健康成人的前臂連續(xù)3天涂布40μL/cm2的量的30％亞油酸乙醇溶液，粘附透明膠帶、并立即剝離，對(duì)角質(zhì)層最外層進(jìn)行非侵入地采樣。使粘附了角質(zhì)層的膠帶在20μM的熒光素-5-氨基硫脲(モレキコラ一プロ一ブズ社制)的100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5)中在室溫反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，用磷酸緩沖生理食鹽液(PBS)充分洗凈后，用熒光顯微鏡觀察。圖11中顯示了該觀察圖像和數(shù)值化的圖表?？煽吹竭B日涂布亞油酸引起氧化蛋白質(zhì)的增加。
實(shí)施例12
醛引起的角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的增加在健康成人的腹部粘附透明膠帶、并立即剝離，對(duì)角質(zhì)層最外層進(jìn)行非侵入地采樣。使粘附了角質(zhì)層的膠帶在1mM的丙烯醛水溶液中在室溫培養(yǎng)18小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束后，用磷酸緩沖生理食鹽液(PBS)充分洗凈后，在20μM的熒光素-5-氨基硫脲(モレキコラ一プロ一ブズ社制)的100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5)中、在室溫反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，用磷酸緩沖生理食鹽液(PBS)充分洗凈后，用熒光顯微鏡觀察。圖12中顯示了該觀察圖像和數(shù)值化的圖表。可看到，丙烯醛引起氧化蛋白質(zhì)的增加。
實(shí)施例13利用藥物抑制角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的增加在健康成人的腹部粘附透明膠帶、并立即剝離，對(duì)角質(zhì)層最外層進(jìn)行非侵入地采樣。將粘附了角質(zhì)層的膠帶在混合有0.2mM的次氯酸鈉和一定濃度的藥物的水溶液中在37℃培養(yǎng)18小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束后，用磷酸緩沖生理食鹽液(PBS)充分洗凈，然后在20μM的熒光素-5-氨基硫脲(モレキコラ一プロ一ブズ社制)的100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5)中、在室溫反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，用磷酸緩沖生理食鹽液(PBS)充分洗凈，然后用熒光顯微鏡觀察?？梢钥吹剑盟幬?，可以抑制次氯酸鈉引起的氧化蛋白質(zhì)的增加。表1顯示了將氧化蛋白質(zhì)的增加抑制到僅由次氯酸鈉培養(yǎng)時(shí)的值與僅由水培養(yǎng)時(shí)的值的中間值的各種藥物濃度。
表1

實(shí)施例14利用生物素酰肼檢測(cè)氧化角質(zhì)化包膜在健康成人的臉部和上臂內(nèi)側(cè)粘附透明膠帶、并立即剝離，對(duì)角質(zhì)層最外層進(jìn)行非侵入地采樣。使其在5mM的生物素酰肼(PIERCE公司角質(zhì)化包膜公司制)的100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5)中、在室溫反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，加入含有2％的十二烷基硫酸鈉、20mM的二硫蘇糖醇、5mM的EDTA的0.1M的Tris-鹽酸緩沖液(pH8.5)，在100℃加熱10分鐘。通過離心分離10分鐘，收集4000g不溶物。進(jìn)而，反復(fù)添加溶出液體和加熱，將可溶性成分徹底除去。將這樣得到的不溶物作為角質(zhì)化包膜。將角質(zhì)化包膜懸浮液滴加到載玻片上，風(fēng)干，丙酮固定后，用磷酸緩沖生理食鹽液(PBS)充分洗凈，然后在熒光素標(biāo)識(shí)抗生物素蛋白(アマシヤムフアルマシアバイオテク社制；用PBS稀釋成1∶100)中在室溫反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，用PBS充分洗凈后，用熒光顯微鏡觀察。圖13顯示該觀察圖像。
從圖13可以看出，檢測(cè)出了氧化形態(tài)的角質(zhì)化包膜(氧化角質(zhì)化包膜)，并可看出，氧化形態(tài)的角質(zhì)化包膜在暴露部分的臉部的角質(zhì)層比非暴露部分的上臂內(nèi)側(cè)多。
實(shí)施例15角質(zhì)化包膜的氧化度和成熟度的同時(shí)比較在健康成人的臉部和上臂內(nèi)側(cè)粘附透明膠帶、并立即剝離，對(duì)角質(zhì)層最外層進(jìn)行非侵入地采樣。使其在200μM的二硝基苯肼(和光純藥工業(yè)(株)社制)的100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5)在室溫反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，加入含有2％的十二烷基硫酸鈉、20mM的二硫蘇糖醇、5mM的EDTA的0.1M的Tris-鹽酸緩沖液(pH8.5)，在100℃加熱10分鐘，通過離心分離10分鐘來收集4000g不溶物。進(jìn)而，反復(fù)添加溶出液體和加熱，將可溶性成分徹底除去。將這樣得到的不溶物作為角質(zhì)化包膜。將角質(zhì)化包膜懸浮液滴加到載玻片上，風(fēng)干、丙酮固定后，用磷酸緩沖生理食鹽液(PBS)充分洗凈，然后將下述物質(zhì)作為一次抗體進(jìn)行反應(yīng)，所述物質(zhì)為用于檢測(cè)被DNP標(biāo)識(shí)的氧化角質(zhì)化包膜的兔抗DNP抗體(ZYMED公司制、1μg/ml)和同時(shí)用于檢測(cè)未成熟的角質(zhì)化包膜的小鼠抗人內(nèi)披蛋白抗體(NOVOCASTRA公司制)。在通過洗滌來除去剩余的抗體后，將德克薩斯紅標(biāo)識(shí)抗兔免疫球蛋白和FITC標(biāo)識(shí)抗小鼠免疫球蛋白(都為アマシヤムフアルマシアバイオテク社制；用PBS稀釋成1∶100)作為二級(jí)抗體在室溫反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)結(jié)束后，用PBS充分洗凈后，用熒光顯微鏡觀察。圖14中顯示了該觀察圖像。
另外，同樣操作，利用兔抗DNP抗體、FITC標(biāo)識(shí)抗小鼠免疫球蛋白抗體來檢測(cè)被DNP標(biāo)識(shí)的氧化角質(zhì)化包膜，同時(shí)通過尼羅紅染色對(duì)成熟的角質(zhì)化包膜染色，用熒光顯微鏡觀察。圖15顯示了該觀察圖像。在該圖中，被尼羅紅染成紅色的成熟角質(zhì)化包膜用白三角表示，被FITC染色成黃綠色的氧化形態(tài)的角質(zhì)化包膜(氧化角質(zhì)化包膜)用黑三角表示。
從圖15可以看出，氧化角質(zhì)化包膜在暴露部位的臉部的角質(zhì)層中比非暴露部位的上臂內(nèi)側(cè)中更多。
工業(yè)可利用性根據(jù)本發(fā)明，可簡單地獲得皮膚角質(zhì)層的氧化蛋白質(zhì)在皮膚上的性狀的二維信息，特別是可謀求在化妝品等銷售時(shí)的咨詢服務(wù)中應(yīng)用該氧化蛋白質(zhì)信息。
權(quán)利要求
1.一種二維評(píng)價(jià)角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)在角質(zhì)層上的性狀的方法，其特征在于，通過對(duì)從皮膚采取的角質(zhì)層樣品中的該氧化蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異的熒光標(biāo)識(shí)，檢測(cè)該熒光，來進(jìn)行評(píng)價(jià)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，在熒光顯微鏡下進(jìn)行上述檢測(cè)，對(duì)由此得到的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行圖像化。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，通過使含有肼基的熒光物質(zhì)作用·結(jié)合到上述氧化蛋白質(zhì)上，來實(shí)施上述氧化蛋白質(zhì)的羰基的特異的熒光標(biāo)識(shí)。
4.如權(quán)利要求1～3的任一項(xiàng)所述的方法，上述角質(zhì)層樣品是通過對(duì)皮膚進(jìn)行膠帶剝離而采取的膠帶角質(zhì)層。
5.一種為了二維評(píng)價(jià)角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)在角質(zhì)層上的存在方式的方法中使用的試劑盒，該試劑盒的特征在于，是含有下述部分而形成的，即用于通過膠帶剝離來采取角質(zhì)層樣品的膠帶；和用于對(duì)氧化蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異的熒光標(biāo)識(shí)的熒光物質(zhì)。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，在熒光顯微鏡下進(jìn)行上述評(píng)價(jià)，并使由此得到的檢測(cè)結(jié)果圖像化。
7.如權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，上述熒光物質(zhì)是含有肼基的熒光物質(zhì)，通過使含有肼基的熒光物質(zhì)作用·結(jié)合到上述氧化蛋白質(zhì)上，來實(shí)施上述氧化蛋白質(zhì)的羰基的特異的熒光標(biāo)識(shí)。
8.一種抑制氧化蛋白質(zhì)的增加的藥物的篩選方法，其特征在于，通過利用合適的氧化劑和候選藥物對(duì)角質(zhì)層進(jìn)行處理，然后對(duì)角質(zhì)層上被氧化了的蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異的熒光標(biāo)識(shí)，檢測(cè)該熒光，來對(duì)該藥物抑制氧化蛋白質(zhì)的增加的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，通過使含有肼基的熒光物質(zhì)作用·結(jié)合到上述氧化蛋白質(zhì)上，來實(shí)施上述氧化蛋白質(zhì)的羰基的特異的熒光標(biāo)識(shí)。
10.一種檢測(cè)來自皮膚的角質(zhì)層樣品中的不溶性物質(zhì)即角質(zhì)化包膜(角質(zhì)化包膜)的氧化形態(tài)的方法，其特征在于，通過對(duì)該氧化形態(tài)的角質(zhì)化包膜中的羰基進(jìn)行特異的熒光標(biāo)識(shí)，檢測(cè)該熒光，來進(jìn)行評(píng)價(jià)。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，通過使含有肼基的熒光物質(zhì)作用·結(jié)合到上述氧化形態(tài)的角質(zhì)化包膜上，來實(shí)施上述氧化形態(tài)的角質(zhì)化包膜中的羰基的特異的熒光標(biāo)識(shí)。
12.如權(quán)利要求10或11所述的方法，進(jìn)一步包括用能夠選擇性地染色的色素對(duì)上述角質(zhì)化包膜的疏水性區(qū)域染色來進(jìn)行檢測(cè)，和/或檢測(cè)該角質(zhì)化包膜的抗原性。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，使用抗人內(nèi)披蛋白抗體來檢測(cè)上述抗原性。
14.如權(quán)利要求9～13的任一項(xiàng)所述的方法，用熒光顯微鏡進(jìn)行上述檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對(duì)角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)在角質(zhì)層上的性狀進(jìn)行二維評(píng)價(jià)方法，其特征在于，通過對(duì)從皮膚采取的角質(zhì)層樣品中的該氧化蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異的熒光標(biāo)識(shí)，檢測(cè)該熒光，來進(jìn)行評(píng)價(jià)，本發(fā)明還提供用于實(shí)施該方法的試劑盒，以及抑制氧化蛋白質(zhì)增加的藥物的篩選方法。進(jìn)而，本發(fā)明還提供一種檢測(cè)來自皮膚的角質(zhì)層樣品中的水不溶性物質(zhì)即角質(zhì)化包膜(角質(zhì)肥厚膜)的氧化形態(tài)的方法，其通過對(duì)該氧化形態(tài)的角質(zhì)化包膜中的羰基進(jìn)行特異的熒光標(biāo)識(shí)，檢測(cè)該熒光，來進(jìn)行評(píng)價(jià)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK1795383SQ20048001066
公開日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2004年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月21日
發(fā)明者藤田宏志, 平尾哲二 申請(qǐng)人:株式會(huì)社資生堂