專利名稱：含有微粒子表面電荷控制劑的組合物、利用該組合物的微粒子分離方法及微粒子分離裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于控制微粒子表面電荷的組合物、利用該組合物來分離微粒子的方法以及微粒子分離裝置。
背景技術(shù)：
人們知道，作為分離細(xì)胞、細(xì)菌、病毒、有機(jī)或無機(jī)聚合物等微粒子的方法，可以利用離子交換液相色譜法及電泳法。這些方法是利用作為測定對(duì)象物的上述各種微粒子的表面電荷的差，通過與固相的介電相互作用或介電移動(dòng)性來進(jìn)行分離。例如，有利用毛細(xì)作用的電泳裝置分離T淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞的報(bào)告(日本エム·イ-學(xué)會(huì)雜志、Vo1.15、No.10(2001)、p12-16)，但是，各細(xì)胞并沒有完全被分離，因此，人們正在研究簡便且正確的微粒子分離技術(shù)。
另一方面，人們還知道一種修飾微粒子表面、人為地改變其表面電荷的方法。
例如，用電泳法分析蛋白質(zhì)時(shí)，采用疏水鍵使十二烷基硫酸鈉(簡稱SDS)結(jié)合在蛋白表面來進(jìn)行分離的方法(SDS電泳法)是公知。
此外，為測定細(xì)胞的活度，已知的還有在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞碎液中注入標(biāo)記化(如通過熒光或放射性物質(zhì)的標(biāo)記)的底物的方法。若往細(xì)胞內(nèi)注入標(biāo)記化了的底物，則底物由于細(xì)胞內(nèi)存在的酶而發(fā)生變化，因此底物表面的電荷就會(huì)發(fā)生變化。為此，在往細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞碎液中注入底物的前后，由于其底物的介電移動(dòng)性發(fā)生變化，采用毛細(xì)作用的電泳法，通過測定其變化的底物量，就能檢測細(xì)胞的活度(如，參照美國專利申請(qǐng)公開第2002/0142323A1號(hào)說明書及美國專利申請(qǐng)公開第2002/0037542A1號(hào)說明書)。
發(fā)明的揭示在利用上述日本エム·イ-學(xué)會(huì)雜志、Vol.15、No.10(2001)、p2-7中所記載的現(xiàn)有技術(shù)時(shí)，由于作為測定對(duì)象的微粒子只依靠其自身的表面電荷進(jìn)行分離，因此往往與雜質(zhì)的分離不徹底。這是因?yàn)闃?gòu)成不同的微粒子的各表面的物質(zhì)間無顯著的差別，并且由于這些物質(zhì)所具有的電荷比較弱，即使要用介電分離微粒子，也不會(huì)在其介電移動(dòng)性上產(chǎn)生有意義的差別的緣故。
另一方面，上述的SDS電泳法，由于SDS非特異性結(jié)合在蛋白質(zhì)表面，因此原則上依靠蛋白質(zhì)的大小結(jié)合的SDS的量發(fā)生變化。由此產(chǎn)生了不能人為地控制結(jié)合量的問題。另外，SDS是離子性的表面活性劑，由于使包括蛋白質(zhì)在內(nèi)的生體物質(zhì)發(fā)生了變性，因此目前的SDS電泳法是僅僅針對(duì)變性了的蛋白質(zhì)而被利用的方法。
在上述細(xì)胞活度測定法中，存在著利用細(xì)胞中的酶使底物的表面電荷發(fā)生變化、由細(xì)胞內(nèi)酶的量及種類來控制表面電荷量而不能人為地進(jìn)行電荷控制的缺陷。此方法由于只利用細(xì)胞中的酶以及與該酶反應(yīng)的底物，所以不能修飾細(xì)胞表面以及使細(xì)胞表面電荷產(chǎn)生變化。
本發(fā)明將提供解決上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題的方法。
本發(fā)明的目的之一是改變?cè)嚇又械哪繕?biāo)微粒子的表面電荷量，提供根據(jù)該改變的表面電荷量來分離或定量試樣中的目標(biāo)微粒子的組合物。該組合物含有溶液中具有正或負(fù)的電荷、并能特異性地結(jié)合于該目標(biāo)微粒子的電荷控制劑。
本發(fā)明的組合物的較好實(shí)施方式是，上述電荷控制劑與存在于目標(biāo)微粒子表面上的選自有機(jī)聚合物、蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)及核酸的生體機(jī)能性物質(zhì)特異性結(jié)合。
本發(fā)明的組合物的較好實(shí)施方式是，上述電荷控制劑含有選自羧酸基、磷酸基、磺酸基、酚基、醇基、叔胺基及季銨基的基團(tuán)。
本發(fā)明的組合物的較好實(shí)施方式是，上述電荷控制劑含有能特異性結(jié)合于目標(biāo)微粒子的蛋白質(zhì)、肽或核酸。較好的是上述核酸為適體或其機(jī)能等價(jià)物。更好的是上述電荷控制劑還含有在溶液中具有正或負(fù)電荷的標(biāo)記物質(zhì)。
本發(fā)明的組合物的更理想的實(shí)施方式是，上述電荷控制劑為能特異性結(jié)合于上述生體機(jī)能性物質(zhì)的抗體或其機(jī)能等價(jià)物與上述標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而得的復(fù)合體。
其它更理想的實(shí)施方式是，上述電荷控制劑為對(duì)應(yīng)于存在于上述目標(biāo)微粒子表面的受體的配體或其機(jī)能等價(jià)物與上述標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而得的復(fù)合體。上述配體最好是肽激素、生長因子、細(xì)胞因子或兒茶酚胺。
其它更理想的實(shí)施方式是，上述電荷控制劑為適體或其機(jī)能等價(jià)物與上述標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而得的復(fù)合體。
上述標(biāo)記物質(zhì)較好是色素標(biāo)記(dyeing marker)、膠體金(gold colloid)或膠乳。
上述色素標(biāo)記較好是氨基乙基4-疊氮基苯甲酰胺三鈉鹽或N-(3-三乙基銨丙基)-4-(4-(二-十八烷胺基)苯乙烯基)吡啶鎓二-4-氯苯磺酸鹽。
本發(fā)明的組合物的較好的實(shí)施方式是，上述電荷控制劑可逆地與上述目標(biāo)微粒子結(jié)合。
本發(fā)明的組合物的較好的實(shí)施方式是，上述電荷控制劑通過離子鍵或氫鍵與上述目標(biāo)微粒子特異性結(jié)合。
本發(fā)明組合物的理想實(shí)施方式是，目標(biāo)微粒子為選自白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板及紅細(xì)胞的細(xì)胞。較好的是上述淋巴細(xì)胞為T細(xì)胞、B細(xì)胞或NK細(xì)胞中的任一種。
本發(fā)明的組合物最好被用于檢查被檢體的免疫機(jī)能。
本發(fā)明的組合物最好被用于檢查被檢體的疲勞或被檢體所承受的緊張程度。
本發(fā)明的組合物最好是被用于檢查被檢體是否有病毒感染。
本發(fā)明的組合物的理想實(shí)施方式是，目標(biāo)微粒子為細(xì)菌、病毒或真菌中的任一種。上述細(xì)菌最好選自病原性大腸桿菌(Escherichia coliform bacillus)、沙門氏桿菌(salmonella)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)、腸炎弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、蠟樣芽胞桿菌(bacillus cereus)、彎曲桿菌(Campylobacter)、產(chǎn)氣莢膜桿菌(Clostridium perfringens)及金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
本發(fā)明的組合物最好被用于預(yù)防或檢查食物中毒。
本發(fā)明的另一目的是提供改變?cè)嚇又械哪繕?biāo)微粒子的表面電荷量，根據(jù)該改變的表面電荷量分離或定量該試樣中的該目標(biāo)微粒子的電荷控制劑的制造方法。
本發(fā)明的電荷控制劑的制造方法的特征是，包括使在溶液中能具有正或負(fù)電荷的標(biāo)記物質(zhì)與能特異性結(jié)合于目標(biāo)微粒子的蛋白質(zhì)或核酸或它們的機(jī)能等價(jià)物結(jié)合的工序。
本發(fā)明的電荷控制劑的制造方法的理想實(shí)施方式是，上述蛋白質(zhì)或核酸或它們的機(jī)能等價(jià)物與存在于目標(biāo)微粒子表面上的選自有機(jī)聚合物、蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)及核酸的生體機(jī)能性物質(zhì)特異性結(jié)合。
本發(fā)明的電荷控制劑的制造方法的更理想實(shí)施方式是，上述蛋白質(zhì)為抗體。
本發(fā)明的電荷控制劑的制造方法的更理想實(shí)施方式是，上述核酸為適體。
本發(fā)明的電荷控制劑的制造方法的更理想實(shí)施方式是，上述蛋白質(zhì)為對(duì)應(yīng)于存在于目標(biāo)微粒子表面的受體的配體。
本發(fā)明的電荷控制劑的制造方法的理想實(shí)施方式是，上述標(biāo)記物質(zhì)含有選白羧酸基、磷酸基、磺酸基、酚基、醇基、叔胺基及季銨基的基團(tuán)。
本發(fā)明的電荷控制劑的制造方法的理想實(shí)施方式是，上述標(biāo)記物質(zhì)為色素標(biāo)記、膠體金或膠乳。上述色素標(biāo)記最好是氨基乙基4-疊氮基苯甲酰胺三鈉鹽或N-(3-三乙基銨丙基)-4-(4-(二-十八烷胺基)苯乙烯基)吡啶鎓二-4-氯苯磺酸鹽。
本發(fā)明的電荷控制劑的制造方法的理想實(shí)施方式是，目標(biāo)微粒子為選自白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板及紅細(xì)胞的細(xì)胞。
本發(fā)明的電荷控制劑的制造方法的其它理想實(shí)施方式是，目標(biāo)微粒子為細(xì)菌、病毒或真菌中的任一種。
本發(fā)明的電荷控制劑的制造方法的理想實(shí)施方式是，能夠?qū)?yīng)于蛋白質(zhì)或核酸或它們的機(jī)能等價(jià)物調(diào)節(jié)所結(jié)合的上述標(biāo)記物質(zhì)的比例或量。
本發(fā)明的另一目的是提供分離或定量試樣中的目標(biāo)微粒子的方法。該方法的特征是，包括將含有目標(biāo)微粒子的試樣及與該目標(biāo)微粒子特異性結(jié)合、且在該試樣中具有正或負(fù)電荷的電荷控制劑進(jìn)行混合，由此使該電荷控制劑與該目標(biāo)微粒子結(jié)合的混合工序；以及對(duì)以上混合得到的試樣施加電壓或電流，并根據(jù)因該電荷控制劑的結(jié)合而發(fā)生了變化的表面電荷來分離或定量上述結(jié)合了電荷控制劑的目標(biāo)微粒子的工序。
上述混合工序較好是多種微粒子各自分別獨(dú)立地進(jìn)行。
上述混合工序較好是多種微粒子各自采用互不相同的電荷控制劑進(jìn)行。
本發(fā)明的分離或定量方法的理想實(shí)施方式是，上述目標(biāo)微粒子為選自白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板及紅細(xì)胞的細(xì)胞；或者是選自細(xì)菌、病毒及真菌的微生物。
本發(fā)明的分離或定量方法的更理想實(shí)施方式是，上述電荷控制劑與存在于目標(biāo)微粒子表面上的選自有機(jī)聚合物、蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)及核酸的生體機(jī)能性物質(zhì)結(jié)合。
本發(fā)明的分離或定量方法的更理想實(shí)施方式是，上述電荷控制劑含有能特異性結(jié)合于目標(biāo)微粒子的蛋白質(zhì)、肽或核酸。
本發(fā)明的分離或定量方法的更理想實(shí)施方式是，上述核酸為適體或其機(jī)能等價(jià)物。
本發(fā)明的分離或定量方法的更理想實(shí)施方式是，上述電荷控制劑還含有在溶液中具有正或負(fù)的電荷的標(biāo)記物質(zhì)。
本發(fā)明的分離或定量方法的更理想實(shí)施方式是，上述電荷控制劑為能特異性結(jié)合于上述生體機(jī)能性物質(zhì)的抗體或其機(jī)能等價(jià)物與上述標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而得的復(fù)合體。
本發(fā)明的分離或定量方法的另一更理想實(shí)施方式是，上述電荷控制劑為對(duì)應(yīng)于存在于上述目標(biāo)微粒子表面的受體的配體或其機(jī)能等價(jià)物與上述標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而得的復(fù)合體。上述配體最好是肽激素、生長因子、細(xì)胞因子或兒茶酚胺。
本發(fā)明的分離或定量方法的另一更理想實(shí)施方式是，上述電荷控制劑為適體或其機(jī)能等價(jià)物與上述標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而得的復(fù)合體。
本發(fā)明的分離或定量方法的另一更理想實(shí)施方式是，上述標(biāo)記物質(zhì)為色素標(biāo)記、膠體金或膠乳。上述色素標(biāo)記最好為氨基乙基4-疊氮基苯甲酰胺三鈉鹽或N-(3-三乙基銨丙基)-4-(4-(二-十八烷胺基)苯乙烯基)吡啶鎓二-4-氯苯磺酸鹽。
本發(fā)明的另一目的是提供分離或定量試樣中的目標(biāo)微粒子的裝置。該裝置的特征是，具備將含有目標(biāo)微粒子的試樣及與該目標(biāo)微粒子特異性結(jié)合、且在該試樣中具有正或負(fù)電荷的電荷控制劑進(jìn)行混合，由此使該電荷控制劑結(jié)合于該目標(biāo)微粒子的混合手段；以及對(duì)以上混合得到的試樣施加電壓或電流，并根據(jù)因該電荷控制劑的結(jié)合而發(fā)生了改變的該目標(biāo)微粒子的表面電荷來分離或定量上述結(jié)合了電荷控制劑的目標(biāo)微粒子的分離·定量手段。
本發(fā)明的裝置的理想實(shí)施方式是，在上述混合手段中還具備將含有目標(biāo)微粒子的試樣和電荷控制劑分別注入的多個(gè)注入手段。
本發(fā)明的裝置的理想實(shí)施方式是，目標(biāo)微粒子為選自白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板及紅細(xì)胞的細(xì)胞，或者為選自細(xì)菌、病毒及真菌的微生物。
本發(fā)明的裝置的理想實(shí)施方式是，電荷控制劑與存在于目標(biāo)微粒子表面上的選自有機(jī)聚合物、蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)及核酸的生體機(jī)能性物質(zhì)結(jié)合。
本發(fā)明的裝置的理想實(shí)施方式是，電荷控制劑含有能特異性結(jié)合于上述目標(biāo)微粒子的蛋白質(zhì)、肽或核酸。上述核酸最好為適體或其機(jī)能等價(jià)物。
本發(fā)明的裝置的理想實(shí)施方式是，上述電荷控制劑還含有在溶液中具有正或負(fù)的電荷的標(biāo)記物質(zhì)。
本發(fā)明的裝置的理想實(shí)施方式是，上述電荷控制劑為能特異性結(jié)合于上述生體機(jī)能性物質(zhì)的抗體或其機(jī)能等價(jià)物和上述標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而得的復(fù)合體。
本發(fā)明的裝置的理想實(shí)施方式是，上述電荷控制劑為對(duì)應(yīng)于存在于上述目標(biāo)微粒子表面的受體的配體或其機(jī)能等價(jià)物與上述標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而得的復(fù)合體。上述配體最好是肽激素、生長因子、細(xì)胞因子或兒茶酚胺。
本發(fā)明的裝置的理想實(shí)施方式是，上述電荷控制劑為適體或其機(jī)能等價(jià)物與上述標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而得的復(fù)合體。
本發(fā)明的裝置的理想實(shí)施方式是，上述標(biāo)記物質(zhì)為色素標(biāo)記、膠體金或膠乳。上述色素標(biāo)記最好為氨基乙基4-疊氮基苯甲酰胺三鈉鹽或N-(3-三乙基銨丙基)-4-(4-(二-十八烷胺基)苯乙烯基)吡啶鎓二-4-氯苯磺酸鹽。
在本說明書中，有關(guān)抗體等蛋白質(zhì)或肽激素等肽的“機(jī)能等價(jià)物”是指與原先的蛋白質(zhì)或肽的氨基酸序列相比因1個(gè)以上的氨基酸的置換、加成或缺失而有所不同，但是，相對(duì)于與原先的蛋白質(zhì)或肽相同的目標(biāo)分子(如抗原體或細(xì)胞表面的受體)能具有同樣的特異性及親和性結(jié)合的多肽或肽。并且，即使原先的蛋白質(zhì)或肽或上述的機(jī)能等價(jià)物經(jīng)磷酸化(Ser、Thr、Tyr)、乙?；?N末端、Lys)或C末端酰胺化等肽修飾基進(jìn)行修飾，只要相對(duì)于與原先的蛋白質(zhì)或肽相同的目標(biāo)分子能具有同樣的特異性及親和性結(jié)合，即可包括在上述“機(jī)能等價(jià)物”的范圍內(nèi)。
在本說明書中，有關(guān)適體“機(jī)能等價(jià)物”是指與原先的適體的堿基排列相比因1個(gè)以上的堿基的置換、加成或缺失而有所不同，但是，相對(duì)于與原先的適體相同的目標(biāo)分子能具有同樣的特異性及親和性結(jié)合的核酸(RNA或DNA)。并且，即使原先的適體或上述機(jī)能等價(jià)的核酸經(jīng)修飾(如經(jīng)熒光色素修飾5’末端)，只要相對(duì)于與原先的適體相同的目標(biāo)分子能具有同樣的特異性及親和性結(jié)合，即可包括在上述“機(jī)能等價(jià)物”的范圍內(nèi)。
在本說明書中，“與目標(biāo)微粒子特異性結(jié)合”是指相對(duì)于其它的微粒子而言，對(duì)目標(biāo)微粒子可以更高的結(jié)合親和性進(jìn)行結(jié)合的結(jié)合。該特異性結(jié)合的親和性用Ka(結(jié)合常數(shù))＝[A-B]/([A]·[B])(但是，A及B為2種分子、A-B為A與B的復(fù)合體)來表示時(shí)，較好是至少約為105、106、107、108、109或1010M-1。
通過本發(fā)明，能提供簡便且正確的微粒子分離技術(shù)。本發(fā)明由于使用了表面電荷控制劑，所以能高效率地控制微粒子表面電荷，并可實(shí)現(xiàn)微粒子的正確且簡便的分離及測定。
通過本發(fā)明，能賦予目標(biāo)微粒子以特異性電荷。因此，即使試樣中的目標(biāo)微粒子與其它的分子大小大致相同，也能通過電泳進(jìn)行分離。
本發(fā)明的電荷控制劑與目標(biāo)微粒子的結(jié)合為可逆結(jié)合，同時(shí)又因?yàn)樵诒景l(fā)明中不使用SDS等表面活性劑，所以能無損傷地回收分離·檢測后的細(xì)胞、細(xì)菌。
對(duì)附圖的簡單說明

圖1為表示本發(fā)明的原理的簡單示意圖。
圖2為表示本發(fā)明的助(helper)T細(xì)胞與殺傷性(killer)T細(xì)胞的分離的色譜法。
圖3為表示本發(fā)明的細(xì)菌細(xì)胞的分離的色譜法。
圖4為本發(fā)明的微粒子分離裝置的簡單示意圖。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明涉及改變?cè)嚇又械哪繕?biāo)微粒子的表面電荷量、并根據(jù)該改變的表面電荷量來分離或定量試樣中的目標(biāo)微粒子的組合物，該組合物含有在溶液中具有正或負(fù)的電荷、能特異性結(jié)合于該目標(biāo)微粒子的電荷控制劑。
本發(fā)明的電荷控制劑最好具有磺酸基、磷酸基、氨基、醇基、酚基或羧酸基等在水溶液中能電離的基團(tuán)，并且具有能結(jié)合于其它物質(zhì)的官能基。作為本發(fā)明的理想電荷控制劑，可舉例與細(xì)胞表面存在的抗原特異性結(jié)合的抗體和在溶液中具有正或負(fù)電荷的標(biāo)記物質(zhì)的復(fù)合體；或其自身與其它物質(zhì)特異性結(jié)合、并且在溶液中具有電荷的適體等。
作為本發(fā)明的測定對(duì)象的目標(biāo)微粒子，一般包括成為被檢對(duì)象的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等血液細(xì)胞；細(xì)菌、病毒、真菌等微生物細(xì)胞，但并不局限于這些。本發(fā)明能適用于試樣中以微粒子形態(tài)存在的任何物質(zhì)。
下面，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說明。
圖1表示本發(fā)明的原理概況。一般地，固體(微粒子)與液體進(jìn)行相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，緊貼固體移動(dòng)的層(固定層)的最外面(滑動(dòng)面)的電位與液體內(nèi)部的電位之差被稱為ζ電位或界面動(dòng)電電位(electrokinetic potential)。換言之，ζ電位控制著固體與液體間產(chǎn)生相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)的界面動(dòng)電現(xiàn)象。
圖1中的(a)模擬地表示作為電荷控制劑使用標(biāo)記抗體時(shí)的例子，圖1中的(b)模擬地表示作為電荷控制劑使用適體時(shí)的例子。
如圖1中的(a)所示，作為被檢測對(duì)象的血細(xì)胞等微粒子(用圖1中的(a)及(b)左邊的圓形表示，血細(xì)胞、微生物菌體等一般具有負(fù)電荷)在溶液中移動(dòng)時(shí)，該微粒子便產(chǎn)生固有的ζ電位即ζ1。如果經(jīng)免疫反應(yīng)使特異性結(jié)合的抗體分子1結(jié)合在該微粒子上(圖1中的(a)正中所示)，則該抗體·微粒子復(fù)合體也會(huì)在溶液中移動(dòng)，此時(shí)產(chǎn)生ζ電位即ζ2。通常抗體分子1不具有有意義的有效電荷，因此ζ2變得與ζ1幾乎相等。這里，抗體分子1具有帶有電荷的標(biāo)記物質(zhì)2時(shí)(在圖1(a)所示的例子中帶有負(fù)電荷)，標(biāo)記抗體·微粒子復(fù)合體在溶液中移動(dòng)產(chǎn)生的ζ電位即ζ3，由于標(biāo)記物質(zhì)2的負(fù)電荷而變得比ζ1小。(如ζ1＝-10mV時(shí)，ζ2＝-11mV，ζ3＝-20mV等)。因此，能增加在電泳或電滲之類的動(dòng)電現(xiàn)象中的微粒子的性能。即使被檢對(duì)象為帶有正電荷的微粒子時(shí)，也能使用帶有正電荷的標(biāo)記物質(zhì)來改變微粒子的性能。
與作為被檢對(duì)象的微粒子特異性結(jié)合的抗體，可采用本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行配制，也可利用市場銷售的抗體。該類抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體、抗體片段、單鏈抗體、嵌合抗體。該類抗體能對(duì)微粒子上的選自有機(jī)聚合物、蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)及核酸的生體機(jī)能性物質(zhì)的表位進(jìn)行特異性識(shí)別，并且能與之結(jié)合。本發(fā)明使用的抗體用Ka(結(jié)合常數(shù))＝[Ag-Ab]/([Ag]·[Ab])(Ag為抗原，Ab為抗體，且Ag-Ab表示抗原抗體復(fù)合體)表示時(shí)，例如，對(duì)于作為被檢對(duì)象的微粒子最好表示至少約105、106、107、108、109或1010M-1的特異性結(jié)合親和性。
該類抗體可采用本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行配制。即，可采用微粒子或其中的一部分，注入山羊、綿羊、牛、豚鼠、兔、黑鼠、小鼠等寄主的肉趾、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、淋巴節(jié)四周或腹腔內(nèi)，再用包括親和精制在內(nèi)的常用方法，將寄主中產(chǎn)生的免疫球蛋白進(jìn)行沉淀、分離及精制而得。
或者，該類抗體采用包括以下技術(shù)的公知技術(shù)，例如，由Koehler及Milstein(Nature 256495、1975)最早記載的雜交瘤技術(shù)，人類B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等、1983、Immunol.Today 472；Cote等、1983、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、802026)，以及EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等、MONOCLONAL ANTIBODIES ANDCANCER THERAPY、Alan R Liss Inc.、New York、NY、77-96頁、1985)等，能得到作為單克隆抗體的抗體。得到單克隆抗體的具體順序，如在Goding等、MONOCLONAL ANTIBODIESPRINCIPLES AND PRACTICE(第2版)Acad.Press、N.Y.等上面有記載。
在上述抗體的“機(jī)能等價(jià)物”中包含只在與測定對(duì)象粒子特異性結(jié)合的抗體的結(jié)合部位切出的片段等。抗體由H鏈和L鏈組成，各有3個(gè)抗原(與本發(fā)明的目標(biāo)微粒子相當(dāng))結(jié)合部位(CDRcomplementary determinant region)存在?？芍辉诟髯缘慕Y(jié)合部位與抗原特異性結(jié)合。該結(jié)合形態(tài)與蛋白質(zhì)(含肽)-蛋白質(zhì)間的結(jié)合形態(tài)(如，抗原抗體結(jié)合或肽激素-受體結(jié)合等)相同，為氫鍵、離子鍵及疏水鍵組成的復(fù)合的結(jié)合形態(tài)。一般地，要切出這樣的結(jié)合部位，應(yīng)從作為編碼抗體的DNA或RNA制作與各自的CDR相當(dāng)?shù)亩嗪塑账徭湥⒂霉姆肿由飳W(xué)方法使其表達(dá)，這樣就能得到目標(biāo)肽片段。
抗體或其機(jī)能等價(jià)物用在溶液中具有電荷的適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物質(zhì)(最好是熒光物質(zhì))進(jìn)行標(biāo)記，可作為本發(fā)明的電荷控制劑使用。結(jié)合了這些標(biāo)記物質(zhì)的抗體，通過離子鍵、疏水鍵、氫鍵或它們的組合，結(jié)合于具有代表性的如存在于細(xì)胞表面等的有機(jī)聚合物、蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)、核酸等生體機(jī)能性物質(zhì)。
能特異性結(jié)合于測定對(duì)象的微粒子的抗體以外的其它物質(zhì)也可作為本發(fā)明的電荷控制劑使用。作為其例子，當(dāng)目標(biāo)微粒子是細(xì)胞時(shí)，例如有特異性結(jié)合于存在于細(xì)胞表面的受體的配體。該配體可例舉肽激素、生長因子、細(xì)胞因子或兒茶酚胺等。該類分子是特異性結(jié)合于存在于形質(zhì)膜上的受體(細(xì)胞表面的受體)而顯示其作用的。該類分子本身在溶液中具有電荷時(shí)，可單獨(dú)地作為本發(fā)明的電荷控制劑使用。此外，即使是與具有能結(jié)合于其它物質(zhì)的官能基、在溶液中帶電荷的標(biāo)記物質(zhì)組成的復(fù)合體，也可作為本發(fā)明的電荷控制劑使用。
圖1中的(b)模擬地表示作為電荷控制物質(zhì)使用具有負(fù)電荷的適體時(shí)的情況。由于磷酸基在水溶液中的電離，所以適體在生理pH濃度下帶著負(fù)電荷。如圖所示，適體分子直接結(jié)合于微粒子，因此微粒子·適體復(fù)合體所具有的ζ電位即ζ3變得比單獨(dú)使用微粒子時(shí)的ζ電位即ζ1小。因此，與上述圖1的(a)所示的相同，能夠加強(qiáng)電泳或電滲之類的動(dòng)電現(xiàn)象中的微粒子的特性。即使被檢對(duì)象為帶有正電荷的微粒子，利用帶有正電荷的適體同樣能改變微粒子的特性。
如上所述，由于適體自身在水溶液中帶有電荷，所以即使不用帶有電荷的標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，適體也能單獨(dú)地作為本發(fā)明的電荷控制劑使用。并且，即使帶有電荷的標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合于適體形成標(biāo)記適體，它也理所當(dāng)然地能作為本發(fā)明的電荷控制劑使用。
本說明書中使用的術(shù)語“適體”是本領(lǐng)域通常所用的含義，即眾所周知的在細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合、控制作為目標(biāo)的蛋白質(zhì)的活動(dòng)的物質(zhì)，它存在于雙鏈DNA或單鏈RNA。
適體一般地可按以下順序得到。
首先，隨機(jī)地合成寡DNA(60堿基)。其次，從理論上有10兆種類以上的寡DNA的庫中，用親和柱分離與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合的寡DNA。用多聚酶的連鎖反應(yīng)(PCR)對(duì)分離的寡DNA進(jìn)行增幅，再重復(fù)用親和柱進(jìn)行分離。通過重復(fù)這一操作5次以上，便能選出對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)親和性強(qiáng)的適體?；蛘咭部筛鶕?jù)需要利用市場上銷售的適體。例如，市場上銷售的由Molecular Probe公司等生產(chǎn)的適體。一般地，這些適體以溶液或粉末的形態(tài)在市場上銷售。
利用RNA適體或DNA適體時(shí)，通過試樣中或緩沖劑中的核糖核酸酶來分解適體，往往會(huì)使適體所帶的電荷發(fā)生變化。因此，通常最好是預(yù)先添加抑制核糖核酸酶的物質(zhì)(核糖核酸酶抑制劑，如RNasin(Promega公司制))。
另一方面，在使用抗體或肽等蛋白質(zhì)時(shí)，最好也適當(dāng)添加蛋白質(zhì)分解酶抑制物質(zhì)。
作為對(duì)與目標(biāo)微粒子特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)(如抗體或?qū)?yīng)于細(xì)胞表面受體的配體)或核酸(如適體)賦予電荷(正或負(fù))的標(biāo)記物質(zhì)的例子，可例舉具有磺酸基、磷酸基、氨基、醇基、酚基或羧酸基等在水溶液中能電離的基團(tuán)、并且具有能與其它物質(zhì)結(jié)合的官能基的化合物。
作為具有磺酸基及能結(jié)合于其它物質(zhì)的官能基的化合物，可例舉CascadeBlue(注冊(cè)商標(biāo))、?；撬帷?-羥基-5-磺基苯胺亞水楊基、1-(2-羥基-4-磺基萘基偶氮)2-萘酚-3，6-二磺酸、螢蝦屬黃、Mordant Blue-31或5-磺基-8-羥基喹啉等，或者這些化合物的衍生物。其中，Cascade Blue、1-(2-羥基-4-磺基萘基偶氮)2-萘酚-3，6-二磺酸、螢蝦屬黃、Mordant Blue-31或5-磺基-羥基喹啉等或這些物的衍生物為熒光物質(zhì)，可以利用它們自身作為檢測手段(色素標(biāo)記)，因此較好。
作為具有磷酸基及能結(jié)合于其它物質(zhì)的官能基的化合物的例子，可例舉腺苷單磷酸、尿嘧啶單磷酸、脫氧胸核苷單磷酸、胍基單磷酸或Oregon Green 488或者這些化合物的衍生物等。其中，Oregon Green 488或其衍生物為熒光物質(zhì)，可以利用自身作為檢測手段(色素標(biāo)記)，因此較好。
作為具有氨基及能結(jié)合于其它物質(zhì)的官能基的化合物的例子，較好的是具有叔胺基或季銨基、并且具有能結(jié)合于其它物質(zhì)的官能基的化合物。
作為具有叔胺基及能結(jié)合于其它物質(zhì)的官能基的化合物的例子，可例舉二甲基乙二胺、二甲基甘氨酸、二甲基苯二胺、鈣黃綠素、丹磺酰氯或二乙基氨基香豆素羧酰肼或者這些化合物的衍生物等。其中，鈣黃綠素、丹磺酰氯或二乙基氨基香豆素羧酰肼或者這些化合物的衍生物為熒光物質(zhì)，可以利用它們自身作為檢測手段(色素標(biāo)記)，因此較好。
作為具有季銨基及能結(jié)合于其它物質(zhì)的官能基的化合物的例子，可例舉FM3-25(注冊(cè)商標(biāo))、甜菜堿、cartinine、四甲基若丹明尸胺或若丹明X或者這些化合物的衍生物等。其中，F(xiàn)M3-25、四甲基若丹明尸胺或若丹明X或者這些化合物的衍生物為熒光物質(zhì)，可以利用自身作為檢測手段(色素標(biāo)記)，因此較好。
作為具有醇基及能結(jié)合于其它物質(zhì)的官能基的化合物的例子，可例舉氨基乙醇、氨基丁醇、氨基丙醇或氨基苯甲醇等。
作為具有酚基及能結(jié)合于其它物質(zhì)的官能基的化合物的例子，可例舉氨基羥基苯甲酸、氨基甲基苯酚、8-羥基喹啉或亞水楊基氨基苯酚等。其中，8-羥基喹啉或亞水楊基氨基苯酚等或這些化合物的衍生物為熒光物質(zhì)，可以利用自身作為檢測手段(色素標(biāo)記)，因此較好。
作為具有羧酸基及能結(jié)合于其它物質(zhì)的官能基的化合物的例子，可例舉氨基丁酸、氨基苯甲酸或鈣黃綠素等。其中，鈣黃綠素為具有多價(jià)羧酸的物質(zhì)，且是熒光物質(zhì)，可以利用其自身作為檢測手段(色素標(biāo)記)，因此較好。
多數(shù)的色素標(biāo)記在市場有售。在以下所示的實(shí)施例中，使用Cascade Blue(注冊(cè)商標(biāo))衍生物、FM(注冊(cè)商標(biāo))3-25。
作為與可特異性結(jié)合于目標(biāo)微粒子的分子(如抗體或?qū)?yīng)于細(xì)胞表面受體的配體或適體)結(jié)合、具有負(fù)電荷或正電荷的標(biāo)記物質(zhì)的其它例子，可例舉膠體金、膠乳等。
用這樣的標(biāo)記物質(zhì)對(duì)上述的蛋白質(zhì)、肽或核酸等進(jìn)行標(biāo)記的技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的。用市售的色素標(biāo)記時(shí)，通常按照制造者的指導(dǎo)書，將色素標(biāo)記結(jié)合于這些分子。
使用本發(fā)明的電荷控制劑時(shí)，應(yīng)注意選擇最合適的試樣溶液的pH值。例如，羧酸基的pKa約為2～5，如果試樣溶液的pH值在2～5以上的范圍內(nèi)，則質(zhì)子被除去，因而帶有負(fù)電荷。因此，在帶有負(fù)電荷的狀態(tài)下，要使帶有羧酸基的電荷控制劑與目標(biāo)微粒子進(jìn)行反應(yīng)，最好把試樣溶液的pH值預(yù)先設(shè)定在4以上。
同樣，使用含有酚基或醇基的電荷控制劑時(shí)，由于酚基及醇基的pKa約為9～11，因此，要在帶有負(fù)電荷的狀態(tài)時(shí)使用，最好把pH值設(shè)定在9～11以上的范圍。
在使用含有叔胺基的電荷控制劑時(shí)，由于叔胺基的pKa約為10～12，因此，要在帶有正電荷的狀態(tài)時(shí)使用，最好使pH值為10～12以下。
另一方面，在含有磺酸基、磷酸基及季銨基的情況下，由于在pH值為2～13的溶液中都帶有電荷，因此可使用大范圍的pH值。在希望得到負(fù)電荷時(shí)，最好使用具有磺酸基或磷酸基的化合物；在希望得到正電荷時(shí)，最好使用具有季銨基的化合物。
分離及/或定量通過本發(fā)明的電荷控制劑改變了表面電荷的測定對(duì)象的微粒子的方法只要根據(jù)微粒子的表面電荷來進(jìn)行分離或定量即可。采用具有代表性的毛細(xì)管電泳法最為合適。為達(dá)到本發(fā)明的目的，盡管可使用市售的毛細(xì)管電泳裝置，但是，如本申請(qǐng)的圖4所示，具備混合電荷控制劑與試樣的手段的裝置更為合適。
另外，作為可用于通過本發(fā)明的電荷控制劑來分離及/或定量試樣中的目標(biāo)微粒子的方法及裝置，可例舉使用利用了毛細(xì)管電泳的基片(chip)的方法及裝置等。
在測定對(duì)象物為血液細(xì)胞時(shí)，本發(fā)明適用于以下的用途。
(疲勞及緊張的診斷)眾所周知，由于慢性疲勞及過度勞動(dòng)、高度的精神緊張會(huì)影響身體的免疫機(jī)能，從而易患上各種疾病。本發(fā)明通過檢查免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，能測得因工作勞累對(duì)目前健康狀況造成的影響，特別是能測得正在累積的疲勞及緊張程度。
人們知道，通過簡便的對(duì)淋巴細(xì)胞表面抗原的解析，可作為免疫機(jī)能的檢查。眾所周知，若施加急性精神壓力的話，則淋巴細(xì)胞中諸如NK細(xì)胞(天然殺傷性細(xì)胞)在作廢血液中的數(shù)目增加，其活性也上升；在承受了慢性精神緊張時(shí)，則其數(shù)目減少，活性也降低。例如，有憂郁癥患者的NK細(xì)胞機(jī)能降低的報(bào)告(河野友信編、《緊張?jiān)\斷手冊(cè)》、國際醫(yī)療科學(xué)、1990年1月、p11、表2-2)。此外，還有隨著試驗(yàn)中的精神緊張，NK細(xì)胞活性下降和干擾素產(chǎn)生下降的報(bào)告(河野友信編、《緊張?jiān)\斷手冊(cè)》、國際醫(yī)療科學(xué)、1990年1月、p11、表2-2)。
NK細(xì)胞在人體中承擔(dān)著抗腫瘤作用、抗病毒作用等生體防御機(jī)構(gòu)中心的任務(wù)。天然殺傷活性即使不預(yù)先在感染源中暴露也是存在的，這就顯示了其在先天性的防御機(jī)構(gòu)方面特有的一切性質(zhì)。因此，NK細(xì)胞的作用是免疫機(jī)構(gòu)中的一道防線，通過檢測出這樣的天然殺傷活性或NK細(xì)胞數(shù)目的變化，就能檢測出被檢者的免疫機(jī)能的變化(例如，D.M.Weir著、《免疫學(xué)概論》、共立出版株式會(huì)社、1999年4月、p36-37；河野友信編、《緊張?jiān)\斷手冊(cè)》、國際醫(yī)療科學(xué)、1990年1月、p11、表2-2)。
表達(dá)于NK細(xì)胞表面的CD抗原有CD16、CD56、CD57等，但是其中的CD56的90％以上在NK細(xì)胞可見，因此可以單獨(dú)地作為NK細(xì)胞的標(biāo)記使用。在利用本發(fā)明的電荷控制劑測定被檢者的NK細(xì)胞數(shù)時(shí)，例如，用具有電荷的標(biāo)記物質(zhì)對(duì)特異性結(jié)合于該CD56的抗體等物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記(即，制作本發(fā)明的電荷控制劑)，然后將該改變抗體與從被檢者采集的血液混合，使該改變抗體結(jié)合在血液中的NK細(xì)胞上。然后，用毛細(xì)管電泳來分離及定量結(jié)合了該改變抗體的NK細(xì)胞，由此可測得NK細(xì)胞數(shù)。
(病毒感染的疹斷)人們知道，一旦感染上病毒，則淋巴細(xì)胞的組成就會(huì)發(fā)生變化。例如，Rosenberg等人發(fā)現(xiàn)，若感染上愛滋病毒，則會(huì)引起血液中的CD4表達(dá)T細(xì)胞數(shù)的減少及CD4/CD8比率的減小(Immunology Today Vol 19，Issuel，1998，p10-17)。感染上AIDS時(shí)，CD4陽性細(xì)胞減少；感染上其它的病毒時(shí)，CD8陽性細(xì)胞增加。因此，通過檢測出這些淋巴細(xì)胞數(shù)目的增減，便能知道被檢者是否感染上AIDS病毒或其它的病毒。
要利用本發(fā)明的電荷控制劑來進(jìn)行檢測，則首先改變特異性結(jié)合于CD4及CD8的物質(zhì)(如，對(duì)應(yīng)于此的抗體)，并賦予電荷(即，制作本發(fā)明的電荷控制劑)，該改變抗體與從測定對(duì)象采集的血液混合，使該改變抗體結(jié)合在血液中的CD4及CD8的陽性細(xì)胞上。然后，用毛細(xì)管電泳來分離及定量結(jié)合了該改變抗體的NK細(xì)胞，由此可測得CD4及CD8的陽性細(xì)胞數(shù)目。
另外，使用特異性結(jié)合于測定對(duì)象病毒的物質(zhì)時(shí)，可直接檢測出病毒的數(shù)目。例如，使本發(fā)明的電荷控制劑與目標(biāo)病毒結(jié)合，該電荷控制劑中，特異性結(jié)合于測定對(duì)象病毒的抗體上結(jié)合了具有電荷的標(biāo)記物質(zhì)，用毛細(xì)管電泳等方法對(duì)其進(jìn)行分離及定量，可直接測得病毒的數(shù)目。
此外，測定對(duì)象為微生物細(xì)菌時(shí)，本發(fā)明適用于以下的用途。
(食物中毒的預(yù)防及診斷)測定對(duì)象為微生物細(xì)菌時(shí)，本發(fā)明能用于檢測出與食物中毒相關(guān)的細(xì)菌。食物中毒細(xì)菌是指以下的細(xì)菌，分別存在于易污染的食品。
病原性大腸菌對(duì)家畜，主要是牛受感染的較多，牛肉由于該細(xì)菌而成為中毒食品，這是食物中毒的普遍原因。除此之外，生菜、貝割菜等可能成為所有食品及水中毒的原因。
由于沙門氏桿菌本來就是導(dǎo)致人畜共患疾病的原因的病菌，因此高比率地存在于家畜及家禽的腸道內(nèi)。這還并不局限于雞、豬及牛，有時(shí)蜥蜴及龜?shù)葘櫸锷砩弦矓y帶著這些細(xì)菌。當(dāng)帶有沙門氏桿菌的肉及蛋作為原材料使用時(shí)，有時(shí)因加熱處理不充分而殘留著沙門氏桿菌，或污染了已烹飪的食品也會(huì)引起食物中毒。另外，由于攜帶有沙門氏桿菌的老鼠糞便及尿使廚房及食品受到污染，有時(shí)也會(huì)引起食物中毒。作為引起食物中毒原因的食品，多數(shù)是鰻魚、牛肝刺身、煎蛋、自制色拉醬、烤雞等肉食類及蛋之類的禽產(chǎn)品。
由于在包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的鳥類、蟲類、淡水魚等多種動(dòng)物及水中檢測出小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，因而通過與這些動(dòng)物的接觸，或吃了被這種細(xì)菌污染的肉特別是豬肉，細(xì)菌就會(huì)感染給人。
腸炎弧菌存在于海水及海泥中，若海水溫度在20度以上、最低氣溫在15度以上，則在海水中大量繁殖，并附著在魚貝類上被帶上岸。類似的食品不僅以魚貝類的刺身及壽司為代表，也有泡菜成為中毒食品的例子。有時(shí)通過調(diào)理過生的魚貝類的炊具及手指也可傳染該類細(xì)菌。
蠟樣芽胞桿菌是一種在土壤、灰塵、水中等自然界廣泛分布的菌，從與土有關(guān)的面類、豆類、香辛料等中被高比率地檢測出來。問題食品有炒飯、意大利通心粉、炒面及日式蛋包飯等，還有一天前炒過或煮過的食物第二天再食用時(shí)也易成為問題食品。
彎曲桿菌存在于家畜、家禽及鴿等寵物的腸道內(nèi)，特別是雞的帶菌率較高，因此從雞肉中檢測出此菌的情況較多。此外也從豬肉及牛肉中檢測出來。有時(shí)也從野鳥、寵物類等帶菌動(dòng)物的糞便或河水及井水中檢測出來。雞的里肌肉、燒烤、烤肉等生食或加熱不足的肉以及沙拉菜及生水等也會(huì)成為問題食品。
產(chǎn)氣莢膜桿菌是土壤細(xì)菌的一種，但在海水等自然界也有廣泛分布，高比率地存在于人及動(dòng)物的腸道。根據(jù)“快餐病”這一別名可想而知，大量加工加熱過的咖喱飯、歐式蓋交飯、面調(diào)味汁等也會(huì)成問題食品。
金黃色葡萄球菌并不局限于化膿的傷口，常存在于膿胞、腳癬、粉刺、喉及鼻中、皮膚及毛發(fā)等，即使健康的人也攜帶有這種菌。由于手指等污染食品的機(jī)會(huì)較多，因此，幾乎所有的食品都有可能成為問題食品，特別是飯團(tuán)。此外，盒飯、日式糕點(diǎn)、鮮奶油等也會(huì)成為問題食品。
從感染了這類細(xì)菌的食品中檢測細(xì)菌時(shí)，例如，在各食品被檢物25g中加入225ml新生霉素加EC培養(yǎng)基，從消化了的溶液中適量取出一些(該工序?yàn)楸绢I(lǐng)域所慣用)。向其中混合入用特異性結(jié)合于測定對(duì)象細(xì)菌的抗體制得的本發(fā)明的電荷控制劑，形成細(xì)菌與電荷控制劑的復(fù)合體，然后通過實(shí)施毛細(xì)管電泳，就能檢測出上述細(xì)菌-電荷控制劑復(fù)合體。在發(fā)生食物中毒時(shí)，也能用上述方法檢測出引起中毒的細(xì)菌。并且，通過事先檢測出這樣的細(xì)菌，可以防止含有上述引起中毒的細(xì)菌的食品上市。
下面，用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明加以說明。這些實(shí)施例是本發(fā)明的示例，并不限定本發(fā)明。
(實(shí)施例1)(血液細(xì)胞的分離)將對(duì)應(yīng)于助T細(xì)胞特別表達(dá)的CD4(cluster ofdifferentiation 4)的抗體與對(duì)應(yīng)于殺傷性T細(xì)胞特別表達(dá)的CD8的抗體，按照以下的順序，和式1表示的Cascade Blue(注冊(cè)商標(biāo))衍生物(Molecular Probe公司制氨基乙基4-疊氮基苯甲酰胺三鈉鹽C27H18N5Na3O12S3，以下，簡稱為Cascade Blue衍生物)進(jìn)行結(jié)合。
如式1所示，Cascade Blue衍生物具有磺酸基。
添加從Sigma公司購入的抗CD4抗體(1mg/ml、pH7.0的磷酸緩沖液(PBS)中)與相對(duì)于抗體量10倍摩爾量的Cascade Blue衍生物(5.1ug/ml、pH7.0的PBS中)，在室溫放置3小時(shí)，使Cascade Blue衍生物結(jié)合在CD4抗體上。然后，將得到的反應(yīng)液經(jīng)凝膠過濾(Sephadex G-25)，除去未結(jié)合的Cascade Blue衍生物。結(jié)果得到每抗CD4抗體分子結(jié)合了2個(gè)Cascade Blue衍生物的抗CD4抗體。
同樣，對(duì)從Sigma公司購入的抗CD8抗體進(jìn)行處理，得到每抗CD8抗體分子結(jié)合了8個(gè)Cascade Blue衍生物的抗CD8抗體。
Cascade Blue衍生物與抗體結(jié)合的數(shù)目用下式計(jì)算。
Cascade Blue衍生物與抗體結(jié)合的數(shù)目＝[Cb410nm]/([Ab-Cb280nm]-α×[410nm])。
式中，[Ab280nm]抗體的280nm的吸光度、[Cb280nm]Cascade Blue衍生物的280nm的吸光度、[Cb410nm]Cascade Blue衍生物的410nm的吸光度、[Ab-Cb280nm]Cascade Blue衍生物標(biāo)記化抗體的280nm的吸光度、α＝[Cb280nm]/[Cb410nm]。
這些用Cascade Blue衍生物標(biāo)記化了的抗體，按下面所示的詳細(xì)順序與含有從血液中得到的T細(xì)胞的試樣進(jìn)行恒溫培養(yǎng)(25℃、1小時(shí))后，將混合液導(dǎo)入毛細(xì)管電泳裝置(Beckman公司制、P/ACE系統(tǒng)MDQ)。結(jié)果如圖2所示，可以分離出助T細(xì)胞與殺傷性T細(xì)胞。另外，圖2示出了用波長410nm的光對(duì)電泳后的毛細(xì)管進(jìn)行激發(fā)，對(duì)來源于Cascade Blue衍生物的波長430nm的熒光強(qiáng)度的掃描結(jié)果。
(電荷控制劑與血液細(xì)胞的接觸及血液細(xì)胞的分離)在1.5ml容量的試管中加入500ul含有表達(dá)CD4細(xì)胞的溶液及500μl含表達(dá)CD8細(xì)胞的溶液，再加入Cascade Blue標(biāo)記抗CD4抗體溶液(1mg/ml)及Cascade Blue標(biāo)記抗CD8抗體溶液(1mg/ml)5μl，在室溫陰暗處放置3小時(shí)后，用以下條件進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳。
<毛細(xì)管電泳及檢測條件>
裝置P/ACE系統(tǒng)MDQ(Beckman Coulter)，毛細(xì)管熔融二氧化硅毛細(xì)管(Beckman公司制)內(nèi)徑100μm、總長32.0cm、有效長21cm，泳動(dòng)條件10kV、20分鐘，泳動(dòng)緩沖液將三羥基甲基氨基甲烷(Tris base)10.8g、硼酸5.5g、0.5M的EDTA(pH8)4ml、褐藻酸鈉0.1g與氯化鈉2g溶于水中配制成1000ml的溶液，
檢測條件激發(fā)波長410nm、熒光波長430nm，檢測器MDQ激光誘導(dǎo)熒光(LIF)檢測器。
其結(jié)果是，在與加入BacLight SYTO9(Molecular Probe公司制)時(shí)相同的移動(dòng)度下，檢測到各峰。將這些峰的餾分收集后，用熒光顯微鏡觀察，便能確認(rèn)發(fā)出熒光的各種細(xì)胞。由此，可判斷檢測出了Cascade Blue標(biāo)記抗CD4抗體及Cascade Blue標(biāo)記抗CD8抗體和CD4細(xì)胞及CD8細(xì)胞各自特異性的結(jié)合。但是，在100mM Tris-硼酸緩沖溶液中只加入Cascade Blue標(biāo)記抗CD4抗體溶液及Cascade Blue標(biāo)記抗CD8抗體溶液的對(duì)照標(biāo)樣，在與電滲流幾乎相同的保持時(shí)間中只檢測出該峰，而未觀察到其它的峰。
(實(shí)施例2)(細(xì)菌的分離)與實(shí)施例1相同，使Cascade Blue衍生物與對(duì)應(yīng)于鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium、以下記作S.T.)的抗體(按照常法配制)和對(duì)應(yīng)于腸炎沙門氏菌(S.enteritidis、以下記作S.E.)(按照常法配制)的抗體結(jié)合。其結(jié)果是，得到每1分子結(jié)合了1.5個(gè)Cascade Blue衍生物的抗ST抗體以及每1分子結(jié)合了9個(gè)Cascade Blue衍生物的抗SE抗體。
將這些用Cascade Blue衍生物標(biāo)記了的抗體按以下詳細(xì)的順序，與含有沙門氏桿菌的試樣進(jìn)行恒溫培養(yǎng)(37℃、30分鐘)后，把得到的混合液送入毛細(xì)管電泳裝置(Bechman公司制、P/ACE系統(tǒng)MDQ)。結(jié)果如圖3所示，能分離出各種沙門氏桿菌。圖3還顯示了用波長410nm的光對(duì)電泳后的毛細(xì)管進(jìn)行激發(fā)，對(duì)來源于Cascade Blue衍生物的波長430nm的熒光強(qiáng)度的掃描結(jié)果。
(電荷控制劑與沙門氏桿菌的接觸及沙門氏桿菌的分離)從S.T.的斜面固體培養(yǎng)物中取1白金耳勺的菌體，將其分別接種于含有5 0ml按常法配制的EEM肉湯培養(yǎng)基(Enterbacteriaceae Enrichment Mannitol(EEM)肉湯培養(yǎng)基4.35g/100ml)的200ml容量的三角燒瓶中，在37℃下震蕩培養(yǎng)16小時(shí)。同樣，配制對(duì)S.E.的培養(yǎng)液。將得到的培養(yǎng)液各500μl置入容量為1.5ml的試管中，加Cascade Blue標(biāo)記抗ST抗體溶液(1mg/ml)及CascadeBlue標(biāo)記抗SE抗體溶液(1mg/ml)各5μl，在陰暗處37℃下放置30分鐘，使沙門氏桿菌和對(duì)應(yīng)于各沙門氏桿菌的標(biāo)記化抗體接觸，在以下的條件下進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳。
<毛細(xì)管電泳及檢測條件>
裝置P/ACE系統(tǒng)MDQ(Beckman Coulter)，毛細(xì)管熔融二氧化硅毛細(xì)管(Beckman公司制)內(nèi)徑75μm、總長31.2cm、有效長21cm，泳動(dòng)條件10kV、20分鐘，泳動(dòng)緩沖液Tris base 10.8g、硼酸5.5g、0.5M的EDTA(pH8)4ml、褐藻酸鈉0.1g與氯化鈉2g溶于水中調(diào)制成1000ml的溶液，檢測條件激發(fā)波長410nm、熒光波長430nm，檢測器MDQ激光誘導(dǎo)熒光(LIF)檢測器。
另外，在100mM的Tis-硼酸緩沖液500μl中添加含有上述2種CascadeBlue標(biāo)記抗沙門氏桿菌抗體中的任一種的溶液5μl，將此溶液(對(duì)照試樣)及布魯氏菌屬的菌株(Brucella sp.strain)KYM-1、寡養(yǎng)單胞菌屬的菌株(Stenotrophomonas sp.strain)KYM2、不動(dòng)桿菌屬的菌株(Acinetobacter sp.strain)KYM3、叢毛單胞菌屬的菌株(Commanonas sp.strain)KYM4、金桿菌屬的菌株(Aureobacterium sp.strain)KYM6、纖維單胞菌屬的菌株(Cellulomonas sp.strain)KYM7、Acinetobacterium sp.strain KYM8、3種大腸埃希氏菌(Escherichia coli)合計(jì)10種細(xì)菌溶于100mM Tris-硼酸緩沖液500μl中，使各菌的濃度分別達(dá)到105個(gè)/ml，再加入含有上述2種Cascade Blue標(biāo)記抗沙門氏桿菌抗體中的任一種的溶液5μl，在室溫陰暗處放置15分鐘后，將此作為比較試樣，對(duì)它們也同樣進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳。其結(jié)果是，對(duì)于Tris-硼酸緩沖液中只含有CascadeBlue標(biāo)記抗沙門氏桿菌抗體的對(duì)照試樣，在與電滲流幾乎相同的保持時(shí)間中，只檢測出游離的Cascade Blue標(biāo)記抗沙門氏桿菌抗體的峰，而未觀察到其它的峰。同樣地，對(duì)含有10種細(xì)菌的溶液(比較試樣)進(jìn)行檢測，也只檢測出與對(duì)照試樣同樣的游離的Cascade Blue標(biāo)記抗沙門氏桿菌抗體的峰。
與此相對(duì)應(yīng)的是，在含有沙門氏桿菌的試樣中，除了與游離的Cascade Blue標(biāo)記抗沙門氏桿菌抗體相當(dāng)?shù)姆逯?，還能檢測出與加入BacLightSYTO9時(shí)相同的移動(dòng)度下的峰。將這些峰的餾分收集后，用熒光顯微鏡觀察，便能確認(rèn)發(fā)出熒光的各沙門氏桿菌。由此，可判斷檢測出了各種Cascade Blue標(biāo)記抗沙門氏桿菌抗體分別與各沙門氏桿菌特異性結(jié)合。
(實(shí)施例3)除了用具有正電荷的下式2表示的FM(注冊(cè)商標(biāo))3-25N-(3-三乙基銨丙基)-4-(4-(二-十八烷胺基)苯乙烯基)吡啶鎓二-4-氯苯磺酸鹽(C68H113Cl2N3O6S2)代替Cascade Blue衍生物之外，其它操作與實(shí)施例1相同，分離助T細(xì)胞與殺傷性T細(xì)胞。用波長510nm的光對(duì)電泳后的毛細(xì)管進(jìn)行激發(fā)，通過對(duì)來源于上述的波長624nm的熒光強(qiáng)度進(jìn)行掃描，能分離并檢測出助T細(xì)胞與殺傷性T細(xì)胞。
(實(shí)施例4)采用圖4簡略表示了結(jié)構(gòu)的微粒子分離裝置，與實(shí)施例1同樣分離血細(xì)胞。在圖4中用電荷控制劑1表示的槽內(nèi)，放入結(jié)合了2個(gè)Cascade Blue衍生物的CD4抗體，在圖4中用電荷控制劑2表示的槽內(nèi)，放入結(jié)合了10個(gè)Cascade Blue衍生物的CD8抗體，在圖4中用電荷控制劑3表示的槽內(nèi)，放入結(jié)合了20個(gè)Cascade Blue衍生物的CD45抗體，在圖4中用樣品表示的槽內(nèi)，放入血細(xì)胞樣品。開動(dòng)圖中所示的所有的泵，用與這些泵相連的混合器混合各種標(biāo)記化抗體，然后送入毛細(xì)管電泳裝置。用波長410nm的光對(duì)電泳后的毛細(xì)管進(jìn)行激發(fā)，通過對(duì)來源于上述化合物的波長430nm的熒光強(qiáng)度進(jìn)行掃描，能分離并檢測出助T細(xì)胞與殺傷性T細(xì)胞。
(實(shí)施例5)(革蘭氏陽性菌的分離)使Cascade Blue衍生物與對(duì)應(yīng)于唾液鏈球菌(S.Thermophilus、以下記作ST)的抗體(按照常法配制)及對(duì)應(yīng)于變異鏈球菌(S.Mutans、以下記作SM)(按照常法配制)的抗體結(jié)合。其結(jié)果是，得到每1分子結(jié)合了2個(gè)Cascade Blue衍生物的抗ST抗體以及每1分子結(jié)合了5個(gè)Cascade Blue衍生物的抗SM抗體。
將這些用Cascade Blue衍生物標(biāo)記過的抗體按以下詳細(xì)的順序分別與含有鏈球菌的試樣進(jìn)行恒溫培養(yǎng)(37℃、30分鐘)后，把得到的混合液送入毛細(xì)管電泳裝置(Beckman公司制、P/ACE系統(tǒng)MDQ)。結(jié)果能分離出各種鏈球菌(未圖示)。用波長410nm的光對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行激發(fā)，對(duì)來源于Cascade Blue衍生物的波長430nm的熒光的強(qiáng)度進(jìn)行測定。
(電荷控制劑與鏈球菌的接觸及菌的分離)從ST的斜面固體培養(yǎng)物中取1白金耳勺的菌體，將它們分別接種于內(nèi)有按常法配制的tryptic soybean培養(yǎng)基的200ml容量的三角燒瓶中，在95％的二氧化碳?xì)夥罩?，?7℃靜置培養(yǎng)16小時(shí)。同樣，也配制對(duì)SM的培養(yǎng)液。將得到的培養(yǎng)液各500μl置入容量為1.5mi的試管中，加Cascade Blue標(biāo)記抗ST抗體溶液(1mg/ml)及Cascade Blue標(biāo)記抗SM抗體溶液(1mg/ml)各5μl，在陰暗處37℃下放置30分鐘，使鏈球菌與對(duì)應(yīng)于各鏈球菌的標(biāo)記化抗體接觸。在以下條件進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳。
<毛細(xì)管電泳及檢測條件>
裝置P/ACE系統(tǒng)MDQ(Beckman Coulter)，毛細(xì)管熔融二氧化硅毛細(xì)管(Beckman公司制)內(nèi)徑75μm、總長31.2cm、有效長21cm，泳動(dòng)條件10kV、20分鐘，泳動(dòng)緩沖液Tris base10.8g、硼酸5.5g、0.5M的EDTA(pH8)4ml、褐藻酸鈉0.1g與氯化鈉2g溶于水中調(diào)制成1000ml的溶液，檢測條件激發(fā)波長410nm、熒光波長430nm，檢測器MDQ激光誘導(dǎo)熒光(LIF)檢測器。
另外，在100mM的Tis-硼酸緩沖液500μl中添加含有上述2種CascadeBlue標(biāo)記抗鏈球菌抗體中的任一種的溶液5μl，將此溶液(對(duì)照試樣)及布魯氏菌屬的菌株(Brucella sp.strain)KYM-1、寡養(yǎng)單胞菌屬的菌株(Stenotrophomonassp.strain)KYM2、不動(dòng)桿菌屬的菌株(Acinetobacter sp.strain)KYM3、叢毛單胞菌屬的菌株(Commanonas sp.strain)KYM4、金桿菌屬的菌株(Aureobacteriumsp.strain)KYM6、纖維單胞菌屬的菌株(Cellulomonas sp.strain)KYM7、Acinetobacterium sp.strain KYM8、3種大腸埃希氏菌(Escherichia coli)合計(jì)10種細(xì)菌溶于100mM Tris-硼酸緩沖液500μl中，使各菌的濃度分別達(dá)到107個(gè)/ml，再加入含有上述2種Cascade Blue標(biāo)記抗鏈球菌抗體中的任一種的溶液5μl，在室溫陰暗處放置15分鐘后，將此作為比較試樣，對(duì)它們也同樣進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳。其結(jié)果是，對(duì)于Tris-硼酸緩沖液中只含有Cascade Blue標(biāo)記抗沙門氏桿菌抗體的對(duì)照試樣，在與電滲流幾乎相同的保持時(shí)間中，只檢測出游離的Cascade Blue標(biāo)記抗沙門氏桿菌抗體的峰，而未觀察到其它的峰。同樣地，對(duì)含有10種細(xì)菌的溶液(比較試樣)進(jìn)行檢測，也只檢測出與對(duì)照試樣同樣的游離的Cascade Blue標(biāo)記抗沙門氏桿菌抗體的峰。
與此相對(duì)應(yīng)的是，在含有鏈球菌的試樣中，除了與游離的Cascade Blue標(biāo)記抗鏈球菌抗體相當(dāng)?shù)姆逯猓€能檢測出與加入BacLightSYTO9時(shí)相同的移動(dòng)度下的峰。將這些峰的餾分收集后，用熒光顯微鏡觀察，便能確認(rèn)發(fā)出熒光的各鏈球菌。由此，可判斷檢測出了各種Cascade Blue標(biāo)記抗鏈球菌抗體分別與各鏈球菌特異性結(jié)合。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的電荷控制劑可用于改變?cè)嚇又械哪繕?biāo)微粒子的表面電荷。本發(fā)明可用于根據(jù)上述改變了的表面電荷量來分離或定量試樣中的目標(biāo)微粒子。本發(fā)明可作為簡便且正確的微粒子分離技術(shù)使用。
本發(fā)明還可用于疲勞或緊張程度的檢查、病毒感染的檢查、食物中毒的預(yù)防或檢查等。
權(quán)利要求
1.組合物，它是改變?cè)嚇又械哪繕?biāo)微粒子的表面電荷量，根據(jù)該改變的表面電荷量來分離或定量該試樣中的該目標(biāo)微粒子的組合物，其特征在于，含有溶液中具有正或負(fù)的電荷、并能特異性地結(jié)合于該目標(biāo)微粒子的電荷控制劑。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征還在于，上述電荷控制劑與存在于上述目標(biāo)微粒子表面上的選自有機(jī)聚合物、蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)及核酸的生體機(jī)能性物質(zhì)特異性結(jié)合。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征還在于，上述電荷控制劑含有選自羧酸基、磷酸基、磺酸基、酚基、醇基、叔胺基及季銨基的基團(tuán)。
4.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征還在于，上述電荷控制劑含有能特異性結(jié)合于上述目標(biāo)微粒子的蛋白質(zhì)、肽或核酸。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征還在于，上述核酸為適體或其機(jī)能等價(jià)物。
6.如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征還在于，上述電荷控制劑還含有在溶液中具有正或負(fù)電荷的標(biāo)記物質(zhì)。
7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征還在于，上述電荷控制劑為能特異性結(jié)合于上述生體機(jī)能性物質(zhì)的抗體或其機(jī)能等價(jià)物與上述標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而得的復(fù)合體。
8.如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征還在于，上述電荷控制劑為對(duì)應(yīng)于存在于上述目標(biāo)微粒子表面的受體的配體或其機(jī)能等價(jià)物與上述標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而得的復(fù)合體。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其特征還在于，上述配體為肽激素、生長因子、細(xì)胞因子或兒茶酚胺。
10.如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征還在于，上述電荷控制劑為適體或其機(jī)能等價(jià)物與上述標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而得的復(fù)合體。
11.如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征還在于，上述標(biāo)記物質(zhì)為色素標(biāo)記、膠體金或膠乳。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征還在于，上述色素標(biāo)記為氨基乙基4-疊氮基苯甲酰胺三鈉鹽或N-(3-三乙基銨丙基)-4-(4-(二-十八烷胺基)苯乙烯基)吡啶鎓二-4-氯苯磺酸鹽。
13.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征還在于，上述電荷控制劑可逆地與上述目標(biāo)微粒子結(jié)合。
14.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征還在于，上述電荷控制劑通過離子鍵或氫鍵與上述目標(biāo)微粒子特異性結(jié)合。
15.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征還在于，上述目標(biāo)微粒子為選自白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板及紅細(xì)胞的細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其特征還在于，上述淋巴細(xì)胞為T細(xì)胞、B細(xì)胞或NK細(xì)胞中的任一種。
17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征還在于，被用于檢查被檢體的免疫機(jī)能。
18.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征還在于，被用于檢查被檢體的疲勞或被檢體所承受的緊張程度。
19.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征還在于，被用于檢查被檢體是否有病毒感染。
20.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征還在于，上述目標(biāo)微粒子為細(xì)菌、病毒或真菌中的任一種。
21.如權(quán)利要求20所述的組合物，其特征還在于，上述細(xì)菌選自病原性大腸桿菌、沙門氏桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、腸炎弧菌、蠟樣芽胞桿菌、彎曲桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌及金黃色葡萄球菌。
22.如權(quán)利要求21所述的組合物，其特征還在于，被用于預(yù)防或檢查食物中毒。
23.電荷控制劑的制造方法，它是改變?cè)嚇又械哪繕?biāo)微粒子的表面電荷量，根據(jù)該改變的表面電荷量分離或定量該試樣中的該目標(biāo)微粒子的電荷控制劑的制造方法，其特征在于，包括使在溶液中可具有正或負(fù)電荷的標(biāo)記物質(zhì)與能特異性結(jié)合于上述目標(biāo)微粒子的蛋白質(zhì)、肽或核酸或它們的機(jī)能等價(jià)物結(jié)合的工序。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征還在于，上述蛋白質(zhì)、肽或核酸或它們的機(jī)能等價(jià)物與存在于上述目標(biāo)微粒子表面上的選自有機(jī)聚合物、蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)及核酸的生體機(jī)能性物質(zhì)特異性結(jié)合。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征還在于，上述蛋白質(zhì)為抗體。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征還在于，上述核酸為適體。
27.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征還在于，上述蛋白質(zhì)或上述肽為對(duì)應(yīng)于存在于上述目標(biāo)微粒子表面的受體的配體。
28.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征還在于，上述標(biāo)記物質(zhì)含有選自羧酸基、磷酸基、磺酸基、酚基、醇基、叔胺基及季銨基的基團(tuán)。
29.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征還在于，上述標(biāo)記物質(zhì)為色素標(biāo)記、膠體金或膠乳。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征還在于，上述色素標(biāo)記為氨基乙基4-疊氮基苯甲酰胺三鈉鹽或N-(3-三乙基銨丙基)-4-(4-(二-十八烷胺基)苯乙烯基)吡啶鎓二-4-氯苯磺酸鹽。
31.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征還在于，上述目標(biāo)微粒子為選自白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板及紅細(xì)胞的細(xì)胞。
32.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征還在于，上述目標(biāo)微粒子為細(xì)菌、病毒或真菌中的任一種。
33.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征還在于，能夠?qū)?yīng)于上述蛋白質(zhì)、肽或核酸或它們的機(jī)能等價(jià)物調(diào)節(jié)所結(jié)合的上述標(biāo)記物質(zhì)的比例或量。
34.分離或定量試樣中的目標(biāo)微粒子的方法，其特征在于，包括將含有目標(biāo)微粒子的試樣及與該目標(biāo)微粒子特異性結(jié)合、且在該試樣中具有正或負(fù)電荷的電荷控制劑進(jìn)行混合，由此使該電荷控制劑與該目標(biāo)微粒子結(jié)合的混合工序；以及對(duì)以上混合得到的試樣施加電壓或電流，并根據(jù)因該電荷控制劑的結(jié)合而發(fā)生了變化的表面電荷來分離或定量結(jié)合了上述電荷控制劑的上述目標(biāo)微粒子的工序。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征還在于，上述混合工序根據(jù)多種微粒子的種類分別獨(dú)立地進(jìn)行。
36.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征還在于，上述混合工序根據(jù)多種微粒子的種類采用互不相同的電荷控制劑進(jìn)行。
37.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征還在于，上述目標(biāo)微粒子為選自白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板及紅細(xì)胞的細(xì)胞；或者是選自細(xì)菌、病毒及真菌的微生物。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征還在于，上述電荷控制劑與存在于上述目標(biāo)微粒子表面上的選自有機(jī)聚合物、蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)及核酸的生體機(jī)能性物質(zhì)結(jié)合。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征還在于，上述電荷控制劑含有能特異性結(jié)合于上述目標(biāo)微粒子的蛋白質(zhì)、肽或核酸。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征還在于，上述核酸為適體或其機(jī)能等價(jià)物。
41.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征還在于，上述電荷控制劑還含有在溶液中具有正或負(fù)的電荷的標(biāo)記物質(zhì)。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征還在于，上述電荷控制劑為能特異性結(jié)合于上述生體機(jī)能性物質(zhì)的抗體或其機(jī)能等價(jià)物與上述標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而得的復(fù)合體。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征還在于，上述電荷控制劑為對(duì)應(yīng)于存在于上述目標(biāo)微粒子表面的受體的配體或其機(jī)能等價(jià)物與上述標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而得的復(fù)合體。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征還在于，上述配體為肽激素、生長因子、細(xì)胞因子或兒茶酚胺。
45.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征還在于，上述電荷控制劑為適體或其機(jī)能等價(jià)物與上述標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而得的復(fù)合體。
46.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征還在于，上述標(biāo)記物質(zhì)為色素標(biāo)記、膠體金或膠乳。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征還在于，上述色素標(biāo)記為氨基乙基4-疊氮基苯甲酰胺三鈉鹽或N-(3-三乙基銨丙基)-4-(4-(二-十八烷胺基)苯乙烯基)吡啶鎓二-4-氯苯磺酸鹽。
48.分離或定量試樣中的目標(biāo)微粒子的裝置，其特征在于，具備將含有目標(biāo)微粒子的試樣及與該目標(biāo)微粒子特異性結(jié)合、且在該試樣中具有正或負(fù)電荷的電荷控制劑進(jìn)行混合，由此使該電荷控制劑結(jié)合于該目標(biāo)微粒子的混合手段；以及對(duì)以上混合得到的試樣施加電壓或電流，并根據(jù)因該電荷控制劑的結(jié)合而發(fā)生了改變的該目標(biāo)微粒子的表面電荷來分離或定量結(jié)合了上述電荷控制劑的上述目標(biāo)微粒子的分離·定量手段。
49.如權(quán)利要求48所述的裝置，其特征還在于，在上述混合手段中還具備將含有上述目標(biāo)微粒子的試樣和上述電荷控制劑分別注入的多個(gè)注入手段。
50.如權(quán)利要求48所述的裝置，其特征還在于，上述目標(biāo)微粒子為選自白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板及紅細(xì)胞的細(xì)胞，或者為選自細(xì)菌、病毒及真菌的微生物。
51.如權(quán)利要求50所述的裝置，其特征還在于，上述電荷控制劑與存在于上述目標(biāo)微粒子表面上的選自有機(jī)聚合物、蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)及核酸的生體機(jī)能性物質(zhì)結(jié)合。
52.如權(quán)利要求51所述的裝置，其特征還在于，上述電荷控制劑含有能特異性結(jié)合于上述目標(biāo)微粒子的蛋白質(zhì)、肽或核酸。
53.如權(quán)利要求52所述的裝置，其特征還在于，上述核酸為適體或其機(jī)能等價(jià)物。
54.如權(quán)利要求52所述的裝置，其特征還在于，上述電荷控制劑還含有在溶液中具有正或負(fù)的電荷的標(biāo)記物質(zhì)。
55.如權(quán)利要求54所述的裝置，其特征還在于，上述電荷控制劑為能特異性結(jié)合于上述生體機(jī)能性物質(zhì)的抗體或其機(jī)能等價(jià)物和上述標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而得的復(fù)合體。
56.如權(quán)利要求54所述的裝置，其特征還在于，上述電荷控制劑為對(duì)應(yīng)于存在于上述目標(biāo)微粒子表面的受體的配體或其機(jī)能等價(jià)物與上述標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而得的復(fù)合體。
57.如權(quán)利要求56所述的裝置，其特征還在于，上述配體為肽激素、生長因子、細(xì)胞因子或兒茶酚胺。
58.如權(quán)利要求54所述的裝置，其特征還在于，上述電荷控制劑為適體或其機(jī)能等價(jià)物與上述標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合而得的復(fù)合體。
59.如權(quán)利要求54所述的裝置，其特征還在于，上述標(biāo)記物質(zhì)為色素標(biāo)記、膠體金或膠乳。
60.如權(quán)利要求59所述的裝置，其特征還在于，上述色素標(biāo)記為氨基乙基4-疊氮基苯甲酰胺三鈉鹽或N-(3-三乙基銨丙基)-4-(4-(二-十八烷胺基)苯乙烯基)吡啶鎓二-4-氯苯磺酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及改變?cè)嚇又械哪繕?biāo)微粒子的表面電荷量、根據(jù)該改變的表面電荷量來分離或定量該試樣中的該目標(biāo)微粒子的組合物，該組合物含有溶液中具有正或負(fù)的電荷、并能特異性地結(jié)合于該目標(biāo)微粒子的電荷控制劑。本發(fā)明還涉及分離或定量試樣中的目標(biāo)微粒子的方法。該方法包括將含有目標(biāo)微粒子的試樣及與該目標(biāo)微粒子特異性結(jié)合、且在該試樣中具有正或負(fù)電荷的電荷控制劑進(jìn)行混合，由此使該電荷控制劑與該目標(biāo)微粒子結(jié)合的混合工序；以及對(duì)以上混合得到的試樣施加電壓或電流，并根據(jù)因該電荷控制劑的結(jié)合而發(fā)生了變化的表面電荷來分離或定量結(jié)合了上述電荷控制劑的上述目標(biāo)微粒子的工序。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1701234SQ20048000088
公開日2005年11月23日 申請(qǐng)日期2004年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月10日
發(fā)明者中山浩 申請(qǐng)人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社