專利名稱：制備內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)的改進(jìn)方法
本申請(qǐng)是1992年5月19日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)No07/885，501的繼續(xù)部分。
大體上說(shuō)本發(fā)明涉及由重組方法制備內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)的改進(jìn)技術(shù)，更具體地說(shuō)本發(fā)明涉及通過(guò)將遺傳工程技術(shù)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在培養(yǎng)液，包括在發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，從而大規(guī)模地生產(chǎn)重組體內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)，如殺菌滲透性增加(BPI)的蛋白質(zhì)、脂多糖結(jié)合蛋白質(zhì)(LBP)、高密度脂蛋白、鱟抗-LPS因子、tachyplesin以及結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)的方法。
內(nèi)毒素，或脂多糖，是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的一種成分，并且牽涉到急性細(xì)菌感染的臨床表現(xiàn)。已有人報(bào)道了許多可與內(nèi)毒素，脂多糖(“LPS”)的骨架結(jié)構(gòu)相結(jié)合的蛋白質(zhì)。這樣的LPS結(jié)合蛋白質(zhì)的實(shí)例是殺菌性通透性增加的蛋白質(zhì)(“BPI蛋白質(zhì)”)、脂多糖結(jié)合蛋白質(zhì)(“LBP”)[引入本文作為參考]、高密度脂蛋白以及tachyplesin[Nakamura，et al.，J.Biol.Chem.，26316709-16713(1988)]，引入本文作為參考。
特定的這類蛋白質(zhì)具有明顯的結(jié)構(gòu)同源性。例如，BPI和LBP都具有大約25kDa的帶正電荷的氨基末端區(qū)域，該區(qū)域是各個(gè)與LPS的類脂A部分相結(jié)合的例子的一部分，參見(jiàn)Schumannet al.，Science 2491429-1431(1990)。
BPI蛋白質(zhì)與膜結(jié)合的LPS結(jié)合可以提高敏感的革蘭氏陰性細(xì)菌的包膜的通透性，Ooi，et al.，J.Biol.Chem.，26214891(1987)。BPI蛋白質(zhì)也結(jié)合到可溶性LPS，并且通過(guò)利用酸提取以及與離子交換層析或大腸桿菌親和層析相結(jié)合的方法已從多形核白細(xì)胞嗜中性粒細(xì)胞(“PMNs”)中分離出人BPI蛋白質(zhì)，Elsbach et al.，J.Biol.Chem.，25411000(1979);Weiss et al.，Blood，69652(1987)。從人PMNs中分離的完整BPI蛋白質(zhì)具有潛在的針對(duì)廣譜革蘭氏陰性細(xì)菌的殺菌活性，Elsbach，et al.，J.Biol.Chem.，25411000(1979)。該抗菌活性表現(xiàn)為與分離到的人完整BPI蛋白質(zhì)的氨基末端區(qū)域相關(guān)聯(lián)。相反，分離到的人BPI蛋白質(zhì)的羧基末端區(qū)域僅顯示微弱的可檢測(cè)的抗菌活性，Ooi，et al.，J.Exp.Med.，174649(1991)。
已將編碼BPI的人DNA進(jìn)行克隆并且所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列已經(jīng)得到闡明[參見(jiàn)，Gray et al.，J.Biol.Chem.，2649505(1989)，下文中稱之為“Gray”;美國(guó)專利證書(shū)No.5，198，541，這兩篇文獻(xiàn)引入本文作參考]，因而可以大規(guī)模地生產(chǎn)重組BPI及其生物活性[例如，氨基和羧基末端]片段。開(kāi)始的試驗(yàn)是利用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)純化方法從被轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)基中純化重組BPI和BPI相關(guān)的蛋白質(zhì)，但僅得到低產(chǎn)量，利用35S標(biāo)記的蛋氨酸以及在能表達(dá)含有成熟BPI蛋白質(zhì)的氨基末端199個(gè)氨基酸重組產(chǎn)物(下文中稱為rBPI(1-199))的轉(zhuǎn)染的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)的細(xì)胞培養(yǎng)物上進(jìn)行的脈沖跟蹤試驗(yàn)表明，在3.5小時(shí)至7小時(shí)跟蹤時(shí)期內(nèi)培養(yǎng)基中重組BPI片段消失了。目的在于測(cè)定該低產(chǎn)量產(chǎn)品的主要成分的初試方法表明，該蛋白質(zhì)產(chǎn)品顯示有顯著的“粘性”，并且，事實(shí)上該蛋白質(zhì)本身相互吸附，吸附至培養(yǎng)基中其他成分(包括宿主細(xì)胞)，以及吸附至塑料和玻璃培養(yǎng)容器上。但是，還不能解釋該蛋白質(zhì)丟失的確切的原因。
類似于BPI蛋白質(zhì)，LBP結(jié)合至LPS的類脂A部分。由肝臟分泌的完整LBP蛋白質(zhì)是60KD蛋白質(zhì)并且已有報(bào)道該蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)將LPS傳遞至巨噬細(xì)胞，Ooi，et al.，J.Exp.Med.，174649-65(1991)。與BPI蛋白質(zhì)不同的是，通常LBP加強(qiáng)由LPS產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。例如，LBP刺激LPS誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子(“TNF”)產(chǎn)生。
本發(fā)明的興趣在于利用離子交換材料分離和純化蛋白質(zhì)和相關(guān)物質(zhì)。例如，由Prior等人的PCT公開(kāi)申請(qǐng)No.WO89/05157報(bào)道了借助于將細(xì)胞培養(yǎng)基通過(guò)色譜柱而將重組免疫球蛋白分離和純化，其中免疫球蛋白吸附至交換物質(zhì)上。然后通過(guò)提高柱子中的鹽濃度而洗脫該免疫球蛋白，作為另一個(gè)實(shí)例，Robins等人的PCT公開(kāi)申請(qǐng)No.WO90/08159報(bào)道了通過(guò)在陰離子交換材料存在時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)而從蛋白質(zhì)制備物中除去DNA。Wang.Ann.N.Y.Acad.Sci.，413313-321(1983)提供了利用非離子樹(shù)脂從發(fā)酵培養(yǎng)物中生產(chǎn)和分離典型的抗菌素環(huán)己酰亞胺的“雜合”發(fā)酵和提取方法的結(jié)果，并且指出對(duì)于一種樹(shù)脂(XAD-4，Rohm and Haas，Philadelphia，PA)，產(chǎn)品吸附至該樹(shù)脂表面，以方便地從該樹(shù)脂上收集該產(chǎn)品。
由于利用內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)如BPI蛋白質(zhì)和LBP作為細(xì)菌感染以及其后遺癥的調(diào)節(jié)因子，因而該領(lǐng)域中需要一種從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離該蛋白質(zhì)的改進(jìn)方法。
本發(fā)明提供了有助于高產(chǎn)量地分離內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)，尤其是類脂A結(jié)合蛋白質(zhì)的改進(jìn)方法。
大體上說(shuō)該改進(jìn)方法包括將顆粒狀陽(yáng)離子交換材料摻入到含有宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，該宿主細(xì)胞已用編碼內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA遺傳轉(zhuǎn)染。由所說(shuō)宿主細(xì)胞分泌至細(xì)胞培養(yǎng)基中的這些蛋白質(zhì)可逆地結(jié)合至所說(shuō)陽(yáng)離子交換材料上。然后從細(xì)胞培養(yǎng)基上分離帶有結(jié)合蛋白質(zhì)的陽(yáng)離子交換材料。最后，再?gòu)年?yáng)離子交換材料上分離出所需的內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)。
該改進(jìn)方法包括將顆粒狀陽(yáng)離子交換材料(優(yōu)選的是S-瓊脂糖顆粒)摻入到含有宿主細(xì)胞(優(yōu)選的是CHO-KI或CHO-DG44細(xì)胞)的細(xì)胞培養(yǎng)基中，該宿主細(xì)胞已用表達(dá)內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)或其片段的DNA進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。由所說(shuō)宿主細(xì)胞分泌至細(xì)胞培養(yǎng)基中的該蛋白質(zhì)可逆地結(jié)合至所說(shuō)陽(yáng)離子交換材料上。然后從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離帶有結(jié)合蛋白的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。最后，從陽(yáng)離子交換材料上分離該蛋白質(zhì)。
目前優(yōu)選用于實(shí)施本發(fā)明的陽(yáng)離子交換材料是S-瓊脂糖并且現(xiàn)在優(yōu)選的分離方法包括將陽(yáng)離子交換材料依次與梯度或等級(jí)增加的離子強(qiáng)度接觸。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，將該改進(jìn)方法用于生產(chǎn)重組BPI產(chǎn)物，包括但不限于殺菌性/通透性增加的蛋白質(zhì)及其生物活性片段，也可以生產(chǎn)與BPI相關(guān)的產(chǎn)品，如融合蛋白包括在他們的氨基末端是BPI蛋白或其一種生物學(xué)活性片段，在它們的羧基末端，至少有免疫球蛋白重鏈區(qū)域的一個(gè)不變區(qū)或其等位變異體。由遺傳工程轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞分泌所需的蛋白質(zhì)，該宿主細(xì)胞在適合于其生長(zhǎng)以及該蛋白質(zhì)產(chǎn)物分泌的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并維持。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，還將本發(fā)明的改進(jìn)方法應(yīng)用于分離脂多糖結(jié)合蛋白質(zhì)和其氨基末端片段。
前文的概述舉例說(shuō)明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。通過(guò)閱讀下面的詳細(xì)描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能顯而易見(jiàn)地知道本發(fā)明的許多方面和優(yōu)點(diǎn)。


圖1.描繪了利用本發(fā)明的方法以及傳統(tǒng)的層析方法分離rBPI(1-199)蛋白質(zhì)的比較實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖2.描繪了從S-瓊脂糖中逐步洗脫rBPI(1-99)的結(jié)果。
圖3.描繪了利用Western印跡技術(shù)分析根據(jù)本發(fā)明制備的產(chǎn)品的結(jié)果。
圖4.描繪了根據(jù)本發(fā)明方法制備的rBPI-Ig融合產(chǎn)品的Western印跡。
圖5.描述了表明分離根據(jù)本發(fā)明方法制備的LBP的凝膠的考馬斯亮藍(lán)染色的結(jié)果。
下面的詳細(xì)描述舉例說(shuō)明本發(fā)明方法的實(shí)施過(guò)程，具體涉及從動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中重組制備三種特定的內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)重組BPI蛋白質(zhì)融合蛋白質(zhì)的氨基末端部分(“rBPI蛋白質(zhì)”)、重組LBP的氨基末端部分(“rLBP”)、以及rBPI免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)(“rBPI-Ig融合”)。本文采用特定的具體內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)舉例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施，由于其一般結(jié)構(gòu)和功能的相似性，所以利用本發(fā)明方法可以分離任何內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。這樣的蛋白質(zhì)包括但不限于多粘菌素B、高密度脂蛋白、鱟抗-LPS因子以及tachyplesin。
更具體地講，實(shí)施例1說(shuō)明向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入陽(yáng)離子交換材料、S-瓊脂糖導(dǎo)致rBPI蛋白質(zhì)產(chǎn)量提高。實(shí)施例2進(jìn)一步提供了表明將陽(yáng)離子交換材料導(dǎo)入細(xì)胞培養(yǎng)物中導(dǎo)致rBPI蛋白質(zhì)產(chǎn)量增加的結(jié)果。實(shí)施例3舉例說(shuō)明用改進(jìn)方法分離rBPI-免疫球蛋白融合蛋白的實(shí)施過(guò)程，實(shí)施例4舉例說(shuō)明陽(yáng)離子交換材料在LBP分離過(guò)程中應(yīng)用。
實(shí)施例1重組BPI產(chǎn)品的分離利用本發(fā)明的方法分離重組BPI蛋白，該蛋白質(zhì)是編碼31個(gè)殘基信號(hào)序列以及成熟人BPI的N-末端的頭199個(gè)氨基酸的DNA的表達(dá)產(chǎn)物，其序列列于SEQ ID NoS1和2，并且在本文中稱作為“rBPI(1-199)”。該DNA序列與Gray，et al.，(見(jiàn)前)報(bào)道的編碼BPI的DNA序列的不同之處在于，其中rBPI(1-199)表達(dá)產(chǎn)物的第151位的纈氨酸(具體為GTG)，而不是Gray等人序列中的GTC，而且在rBPI(1-199)中185位編碼的是谷氨酸(具體為GAG)而不是在Gray等人報(bào)道的序列的相應(yīng)位點(diǎn)上的賴氨酸(具體為AAG)。在Gazzano-Santoro，et al.，Infection and Immunity，604754-4761(1992)中報(bào)道了rBPI(1-199)蛋白質(zhì)的重組產(chǎn)物，其中的蛋白質(zhì)稱作為“rBPI-23”。
在該實(shí)施例中使用的宿主細(xì)胞是用DNA載體轉(zhuǎn)化的CHO-KI細(xì)胞，該載體包括編碼人BPI的初始199個(gè)氨基末端氨基酸及其前面的內(nèi)源性31個(gè)殘基分泌信號(hào)序列的DNA，所需的表達(dá)產(chǎn)物rBPI(1-199)是人BPI蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性片段，該片段含有起始的199個(gè)氨基末端殘基，在由宿主細(xì)胞進(jìn)行的轉(zhuǎn)譯后分泌加工過(guò)程中已將信號(hào)序列殘基從該片段上除去。
制備在添加了5%胎牛血清的Ham′s F12培養(yǎng)基中含有轉(zhuǎn)染的CHO宿主細(xì)胞的兩個(gè)旋轉(zhuǎn)搖瓶，并將細(xì)胞生長(zhǎng)至融合(大約3天)。一旦達(dá)到融合，移走Hams F12培養(yǎng)基并用500ml HB-CHO無(wú)血清培養(yǎng)基(Irvine Scientific，Irvine Ca.)替代。向作為第一旋轉(zhuǎn)搖瓶的兩個(gè)搖瓶之一中加入約8gm(濕重)的無(wú)菌S-瓊脂糖(Pharmacia，fast flow，＃17-0511-01，Uppsula，Sweden)3天。然后分離S-瓊脂糖以便制備第一個(gè)柱。從搖瓶中移走生長(zhǎng)培養(yǎng)基以及S-瓊脂糖樹(shù)脂，收集后放置至少15分鐘以便使S-瓊脂糖沉至容器的底部。通過(guò)傾析移走大部分不含樹(shù)脂的培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)基通過(guò)一個(gè)裝置如熱處理的玻璃盤(pán)過(guò)濾，以便移走細(xì)胞并滯留S-瓊脂糖。在傾析培養(yǎng)基后，將S-瓊脂糖懸浮于乙酸鹽緩沖液，該緩沖液(PH4.0)包括含有0.1M NaCl的20mM乙酸鈉鹽/乙酸，緩慢攪拌，并使之沉淀10分鐘。然后傾去緩沖液并將小體積的S-瓊脂糖轉(zhuǎn)移至合適大小的液相色譜柱(1×10cm，Econocolumn，BioRad，Richmond，CA)。
第二個(gè)搖瓶含有的細(xì)胞在上面所述條件但沒(méi)有S-瓊脂糖存在的情況下生長(zhǎng)。從該搖瓶中移出培養(yǎng)基。通過(guò)離心移走CHO細(xì)胞并調(diào)整澄清的培養(yǎng)基使之含有20mM醋酸鈉/醋酸，PH4.0。稀釋該培養(yǎng)基至導(dǎo)電率為10-15ms/cm，然后上樣于第二個(gè)即傳統(tǒng)的S-瓊脂糖柱子上，該柱子已用含0.1M NaCl的20mM乙酸鈉/乙酸(乙酸緩沖液PH4.0)平衡，以便最大程度地結(jié)合rBPI(1-199)蛋白質(zhì)。
用0.1M NaCl-乙酸緩沖液洗滌第一和第二個(gè)S-瓊脂糖柱，直至洗脫液的A280吸收度相同于僅含0.1M NaCl-乙酸緩沖液的A280吸收度。然后用1.0M NaCl-乙酸緩沖液以單一步驟洗脫結(jié)合至每個(gè)柱子上的蛋白質(zhì)。
將來(lái)自兩個(gè)柱子上的洗脫液進(jìn)行ELISA分析，在4℃，PBS存在下將來(lái)自洗脫液的樣品結(jié)合至Immulon-平底多孔平板(Dynetech Labs)上過(guò)夜。然后將這些平板用溶于PBS中的0.05%吐溫-20洗滌，再與溶于含0.05%吐溫-20的PBS中的1∶1000稀釋的兔抗-rBPI(1-199)抗血清，在室溫下共同孵育1小時(shí)。孵育后，再一次用含0.05%吐溫-20的PBS洗滌平板，并按照制造商的說(shuō)明用TMB試劑(Pierce Rockford II)顯色ELISA，并在450nm處在EL309微滴板讀數(shù)器中讀數(shù)(Biotek Instruments，Winooski Vt.)。
ELISA結(jié)果顯示，源自于細(xì)胞培養(yǎng)基的S-瓊脂糖柱的洗脫液比已加入培養(yǎng)基的S-瓊脂糖柱的洗脫液所產(chǎn)生的反應(yīng)性強(qiáng)3-8倍。
實(shí)施例2提供的結(jié)果進(jìn)一步證明與轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞一起培養(yǎng)S-瓊脂糖提高了由轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的rBPI(1-199)蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。
實(shí)施例2定量分析分離的rBPI(1-199)為了進(jìn)一步定量地證明向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入陽(yáng)離子交換材料時(shí)，從實(shí)施例1中的CHO細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得的rBPI(1-199)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的產(chǎn)量更高，在上面描述的洗脫液樣品上進(jìn)行凝膠染色和Western分析。
通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離從實(shí)施例1描述的1.0M NaCl-乙酸緩沖液洗脫液中獲得的蛋白質(zhì)樣品。首先將rBPI(1-199)樣品調(diào)節(jié)至含有少于0.5M的NaCl，然后通過(guò)加入冰冷丙酮至終濃度為75%而沉淀樣本。通過(guò)以大于10，000rpm轉(zhuǎn)速離心5-10分鐘而使得到的蛋白質(zhì)沉淀形成團(tuán)丸。移去上清液，將該沉淀懸浮于含8M脲，2%SDS，6-mM Tris HCl，PH6.8的凝膠緩沖液中。將懸浮的樣品和合適的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物(BioRad Richmond，CA和BRL，Bethesda，MD)加熱至95℃，保持3-5分鐘，然后上樣于特定百分?jǐn)?shù)或梯度百分?jǐn)?shù)的聚丙烯酰胺凝膠(BioRad)上并用微型Protean II凝膠電泳設(shè)備(BioRad)進(jìn)行分離。電泳后，直接將凝膠進(jìn)行考馬斯染色(0.5%考馬斯亮藍(lán)-R，25%異丙醇，10%甲醇，10%乙酸)或進(jìn)行電轉(zhuǎn)移。將通過(guò)SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)與合適的預(yù)染色的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(BioRad)一起轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(BA85，Schleicher and Schuell Keene，NH)或PVDF(Immobilon-P，Millipore，Bedford，MA)膜上。轉(zhuǎn)移是在0.5大氣壓，10%CAPS(環(huán)己胺-1-丙烷-磺酸)，10%甲醇，PH11.5中進(jìn)行20分鐘。根據(jù)制造商的說(shuō)明用1∶1000稀釋的兔抗-人BPI(全蛋白)抗血清和Western Lite Chemiluminescent Detection System(Tropix System，Bedford，MA)加工處理所得到的印跡。用0.25%的明膠取代Tropix I-Block并且在電轉(zhuǎn)移后不干燥膜。經(jīng)加工的膜曝光于Cronex 4膠片(Dupont，Wilmington，DE)。
染色的凝膠和Western分析的結(jié)果顯示于圖1中，其中正方形A和B分別表示由與培養(yǎng)物培養(yǎng)基一起孵育的S-瓊脂糖珠形成的柱子的流出物(FT)0.1M Nacl和1.0M NaCl洗脫物的考馬斯染色和Western印跡分析。正方形C和D相應(yīng)地表示從“傳統(tǒng)的”S-瓊脂糖柱上得到的洗脫物的考馬斯染色和Western吸印分析。方塊A和C的箭頭表明相應(yīng)于rBPI(1-199)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分子量的區(qū)域。當(dāng)在細(xì)胞生長(zhǎng)期間向培養(yǎng)基中加入陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，S-瓊脂糖，估測(cè)rBPI(1-199)蛋白質(zhì)產(chǎn)量至少提高10倍。
隨后的實(shí)驗(yàn)包括從3-5個(gè)旋轉(zhuǎn)援瓶中獲得的20-40克S-瓊脂糖中分離rBPI(1-199)。用NaCl濃度逐漸提高的乙酸鹽緩沖液洗脫結(jié)合的樣品。如圖2所示，發(fā)現(xiàn)在用0.8，0.9，1.0和1.5MNaCl-乙酸鹽緩沖液洗脫S-瓊脂糖柱的洗脫液中由考馬斯藍(lán)染色后觀察到的rBPI(1-199)產(chǎn)物為23Kd蛋白質(zhì)。在0.2M至0.7MNaCl-乙酸鹽緩沖液洗脫物中觀察到少量或沒(méi)有rBPI(1-199)蛋白質(zhì)。Western印跡結(jié)果(圖3)表明在S-瓊脂糖柱的0.8M至1.0MNaCl-乙酸鹽緩沖液的洗脫液中獲得最強(qiáng)的可檢測(cè)的rBPI(1-199)蛋白質(zhì)信號(hào)。
來(lái)自S-瓊脂糖柱的1.5MNaCl洗脫液也含有識(shí)別為rBPI(1-199)的蛋白質(zhì)(見(jiàn)圖2，右邊泳道)。S-瓊脂糖柱的1.5MNaCl-乙酸鹽緩沖液洗脫液含有具有分子量為約40KDa和大于66KDa蛋白質(zhì)(圖2)，在用二硫蘇糖醇處理后，能將它們還原為一條約23KDa單譜帶。還原的蛋白質(zhì)與抗-BPI抗血清有交叉反應(yīng)，并有正確加工的rBPI(1-199)的N-未端序列。40KDa和大于66KDa的蛋白質(zhì)顯示出是rBPI(1-199)的二硫鍵相連的多體。
前面提到的結(jié)果表明向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入陽(yáng)離子交換材料提高了rBPI(1-199)蛋白質(zhì)的回收率。為了測(cè)定S-瓊脂糖的最適濃度，向含有500ml培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的旋轉(zhuǎn)搖瓶中加入1.25克至10克量的S-瓊脂糖柱，并按如上所述進(jìn)行孵育。然后按如上所述將含有陽(yáng)離子交換材料的培養(yǎng)基傾倒至柱上。先用0.1MNaCl乙酸鹽緩沖液，然后用0.7MNaCl-乙酸鹽緩沖液洗滌柱子。并用1.0MNaCl-乙酸鹽緩沖液洗脫rBPI(1-199)樣品。在C4反相HPLC上進(jìn)行層析而測(cè)定rBPI(1-199)的產(chǎn)量，對(duì)于加入2.5克，5.0克和10克量的S-瓊脂糖柱，該產(chǎn)量基本上是不變的。在每瓶?jī)H含有1.25克S-瓊脂糖柱的旋轉(zhuǎn)瓶中產(chǎn)量約降低50%。
實(shí)施例3提供的結(jié)果證明利用本發(fā)明方法獲得的rBPI融合蛋白產(chǎn)量提高。
實(shí)施例3rBPI-Ig融合蛋白的分離。
在本實(shí)施例中使用的宿主細(xì)胞是用DNA載體轉(zhuǎn)染的CHO-DG44細(xì)胞，該載體含有編碼與至少一種免疫球蛋白重鏈的一個(gè)不變區(qū)融合的BPI蛋白起始的199個(gè)氨基酸的DNA。在互補(bǔ)的共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)No.07/885，911，以及共同擁有的目前申請(qǐng)的繼續(xù)部分申請(qǐng)系列號(hào)-(Attorney Docket No.27129/31429，兩文獻(xiàn)引入本文做參考)中提供了這樣的“rBPI融合體”的構(gòu)建過(guò)程。在旋轉(zhuǎn)搖瓶中生長(zhǎng)轉(zhuǎn)染的CHO-DG44細(xì)胞。對(duì)于每個(gè)旋轉(zhuǎn)搖瓶，用轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種每個(gè)T150燒瓶(含50ml無(wú)核苷α-MEM以及10%經(jīng)滲析的胎牛血清)，使細(xì)胞生長(zhǎng)至融合(約3-4天)。然后將細(xì)胞用胰蛋白酶處理，并轉(zhuǎn)移至含500mlHam′s F12培養(yǎng)基和10%胎牛血清的900cm2旋轉(zhuǎn)瓶中，約生長(zhǎng)3天至融合。一旦達(dá)到融合后，除去Ham′s F12培養(yǎng)基并用500mlHB-CHO無(wú)血清培養(yǎng)基(Irvine Scientific，Irvine，CA)替代。
首先用Dulbecco′s磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌S-瓊脂糖并在120℃高壓蒸汽滅菌20分鐘，然后經(jīng)無(wú)菌操作將它加入到旋轉(zhuǎn)瓶中。將細(xì)胞在37℃培養(yǎng)3天，此時(shí)移走珠子和生長(zhǎng)培養(yǎng)基并不受干擾地放置至少15分鐘。通過(guò)傾析移去大部分不含樹(shù)脂的培養(yǎng)基，并通過(guò)一個(gè)裝置，如加熱處理的玻璃盤(pán)進(jìn)行過(guò)濾，以便除去細(xì)胞并滯留S-瓊脂糖。在潷去培養(yǎng)基后，將S-瓊脂糖懸浮于含有20mM乙酸鈉/乙酸，0.1M NaCl，PH4.0的乙酸緩沖液中，緩慢攪拌并將它放置10分鐘。然后潷去緩沖液并將小體積的S-瓊脂糖轉(zhuǎn)移至合適大小的液相色譜柱。用Econocolumn(2.5×10cm，BioRad，Richmond，CA)分析從3至5個(gè)旋轉(zhuǎn)瓶收集的20至40克貯存的S-瓊脂糖樣品。用0.1M NaCl-乙酸鈉緩沖液洗滌經(jīng)填充的S-瓊脂糖柱，直至洗脫液的A280吸收值等同于僅含0.1M NaCl-乙酸鹽緩沖液的吸收值，然后用0.5M NaCl-乙酸鹽緩沖液，用1.0M NaCl-乙酸鹽緩沖液，并再用1.5MNaCl-乙酸鹽緩沖液洗滌。
按上面所述制備其它的CHO-DG44細(xì)胞，不同的是培養(yǎng)基中不加入S-瓊脂糖珠。與前面不同，制定一個(gè)方案，利用兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)A柱純化rBPI融合表達(dá)產(chǎn)物。將HB-CHO培養(yǎng)基的第一個(gè)樣品(見(jiàn)上文)通過(guò)一個(gè)0.45μm濾器過(guò)濾，以便從剩余的培養(yǎng)基中分離CHO-DG44細(xì)胞。將該樣品PH調(diào)至8.0并置于Pro SepA(Bioprocessing)柱上。將第二種制備物置于AvidGel(Bioprocessing)柱上。用25mM檸檬酸鹽緩沖液(PH5.5)洗脫兩個(gè)柱子。從這兩種蛋白質(zhì)A柱上都沒(méi)有回收到rBPI融合產(chǎn)物。并且在還原后也未從ProSepA柱上觀察到產(chǎn)物(圖4，泳道1)。但是，用100mM檸檬酸鹽緩沖液(PH 3.0)洗滌ProSepA和Avidgel柱時(shí)，檢測(cè)到rBPI融合蛋白，分別顯示于圖4的泳道2和3。圖4的泳道4-6表示來(lái)自S-瓊脂糖柱的0.5M，1.0M和1.5M洗脫液。在S-瓊脂糖柱的洗脫液中，1.5M洗脫液含有相應(yīng)于約100KD的融合二聚體。
實(shí)施例4提供的結(jié)果證明，如果將用編碼LBP的DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞與陽(yáng)離子交換樹(shù)脂一起孵育時(shí)也可以獲得產(chǎn)量增加的LBP產(chǎn)品。
實(shí)施例4脂多糖結(jié)合蛋白質(zhì)的分離已得到的相對(duì)于LBP的25KD氨基未端的DNA序列顯示于SEQ ID No.3中。該序列與Schumann et al.，Science，2491429-1431(1990)報(bào)道的序列中的兩個(gè)區(qū)域(SEQ ID No.4)不同。這些不同之處導(dǎo)致129-132位以及149位的氨基酸不同(在Schumann，supra中148位的天冬酰胺殘基是由GAT編碼的，而在SEQ ID No.3中由GAC編碼)。也可參見(jiàn)PCT公開(kāi)申請(qǐng)93/06228。
在該實(shí)施例中使用的宿主細(xì)胞是用DNA載體轉(zhuǎn)染的CHO-DG44細(xì)胞，該載體含有編碼LBP的起始197個(gè)氨基酸即表達(dá)產(chǎn)物的DNA。
將轉(zhuǎn)染的DG44細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)搖瓶中生長(zhǎng)。對(duì)于每一種旋轉(zhuǎn)瓶，用轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種T150燒瓶(含有50ml無(wú)核苷的α-MEM以及10%經(jīng)滲析的胎牛血清)，并將細(xì)胞生長(zhǎng)至融合(大約3-4天)。然后用胰蛋白酶處理細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至含有500ml Ham′s F12培養(yǎng)基和10%胎牛血清的900cm2旋轉(zhuǎn)瓶中，大約生長(zhǎng)3天至融合。一旦達(dá)到融合，除去Ham′s F12培養(yǎng)基，并用500ml HB-CHO無(wú)血清培養(yǎng)基(Irvine Scientific，Irvine，CA)代替。
將S-瓊脂糖珠首先用PBS洗滌，并在120℃高壓滅菌20分鐘，然后經(jīng)無(wú)菌操作加至旋轉(zhuǎn)瓶中。將細(xì)胞在37℃培養(yǎng)3天，此時(shí)除去珠和生長(zhǎng)培養(yǎng)基并不受干擾至少保留15分鐘。通過(guò)傾析除去大部分不含樹(shù)脂的培養(yǎng)基，并使培養(yǎng)基通過(guò)一個(gè)裝置過(guò)濾，如熱處理的玻璃碟，以便移走細(xì)胞而滯留S-瓊脂糖。在傾去培養(yǎng)基后，將S-瓊脂糖懸浮于含20mM乙酸鈉/乙酸，0.1MNaCl(PH4.0)的乙酸鹽緩沖液中，緩慢攪拌，并使之沉淀10分鐘。然后潷去緩沖液，并轉(zhuǎn)移小體積的S-瓊脂糖至大小合適的液相色譜柱上。將一個(gè)Econocolumn(2.5×10cm，BioRad，Richmond，CA)應(yīng)用于從3至5個(gè)旋轉(zhuǎn)瓶收集的20至40克S-瓊脂糖貯存樣品。用0.1MNaCl-乙酸鹽緩沖液洗滌已填充的S-瓊脂糖柱直至洗脫液的吸收值相等于僅含0.1MNaCl-乙酸鹽緩沖液的吸收值，再用0.7NNaCl-乙酸鹽緩沖液以及再用1.0M NaCl-乙酸鹽緩沖液洗滌。
從已加入S-瓊脂糖珠的細(xì)胞培養(yǎng)物收獲的rLBP的產(chǎn)量顯示于圖5中，該圖為上文描述的0.7M(泳道1和3)和1.0M(泳道2和4)洗脫液的考馬斯染色凝膠。如圖所示，在1.0M時(shí)洗脫出顯著量的LBP?；谄溆?jì)算到的PI(6.6)，S-瓊脂糖能夠促進(jìn)LBP從細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生是未曾預(yù)料到的。在上面使用的培養(yǎng)基中，其PH約為7.0，基于LBP的PI值，所期望的是LBP應(yīng)不帶電荷或微帶負(fù)電荷，并因此而不能與陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，如S-瓊脂糖起反應(yīng)。
在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)熟練技術(shù)人員而言顯然能夠在前面描述的目前優(yōu)選的實(shí)施例基礎(chǔ)上進(jìn)行許多修飾和改變。例如，在本發(fā)明中使用的陽(yáng)離子交換材料的濃度可以依據(jù)所使用的細(xì)胞的數(shù)目和類型(即，生產(chǎn)重組產(chǎn)品的效率)而變化。作為另一個(gè)例子，在本發(fā)明方法中可以使用除S-瓊脂糖以外的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂[例如，Biorex 70，以及SP(硫丙基)型材料如SP-葡聚糖凝膠，以及CM(羧甲基)型材料如CM環(huán)脂糖和CM葡聚糖凝膠]，由于其最容易操作，易于無(wú)菌處理等等原因，S-瓊脂糖是優(yōu)選的。還有另一個(gè)例子，雖然上面描述的實(shí)施例指出內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)的重組制備是在旋轉(zhuǎn)瓶中進(jìn)行，但本發(fā)明的方法也可以簡(jiǎn)便地?cái)U(kuò)大規(guī)模至發(fā)酵罐中生產(chǎn)。用于生產(chǎn)rBPI(1-199)的方法的典型的發(fā)酵條件包括在750L Chemap(Woodbury，N.Y.)發(fā)酵罐中使用600L操作體積，其中用pING4502質(zhì)粒[參見(jiàn)，Gazzano et al.，supra)轉(zhuǎn)染的CHO-K1細(xì)胞在ExCell301培養(yǎng)基(JRH Scirntific)中生長(zhǎng)，該培養(yǎng)基中已補(bǔ)充了0.05%FBS和0.01%消珠劑(U Carferm Adjuvant 27.Union Carbide)并加入了1%SP瓊脂糖“大珠”[100-300微米直徑，Pharmacia)。最后，期望根據(jù)本發(fā)明方法分離到的重組內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)的精確洗脫曲線依據(jù)所涉及的被確切識(shí)別的蛋白質(zhì)的不同而變化。作為一個(gè)實(shí)例，在用0.7M NaCl-乙酸鹽緩沖液洗滌后可簡(jiǎn)便地從樹(shù)脂珠上分離到rBPI(1-199)。但是，在用0.6MNaCl-乙酸鹽緩沖液洗滌后進(jìn)行的分離可以增加如由Theofan等人在共有的互補(bǔ)美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)No.08/013，801中描述的BPI蛋白質(zhì)的胱氨酸取代類似物的產(chǎn)量。最后，本發(fā)明的范圍應(yīng)該僅限制于所附的權(quán)利要求的范圍。
序列目錄(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人Grinna，Lynn
(ⅱ)發(fā)明名稱制備內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)的改進(jìn)方法(ⅲ)序列數(shù)4(ⅳ)通訊地址(A)地址Marshall，O′Toole，Gerstern，Murray & Borum(B)街道6300 Sears Tower，233 South Wacker Drive(C)城市芝加哥(D)州伊利諾斯(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編60606-6402(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀格式(A)介質(zhì)類型Floppy盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release ＃1.0，Version ＃1.25(ⅵ)目前的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(ⅶ)以前申請(qǐng)的資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S07/885，501(B)申請(qǐng)日1992年5月19日
(ⅷ)代理人/代理商資料(A)姓名Meyers，Thomas C.
(B)登記號(hào)36，989(C)委托/案件目錄編號(hào)31405(ⅸ)電訊資料(A)電話312/474-6300(B)傳真312/474-0448(C)電傳25-3856(2)SEQ ID No.1的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1813個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單股(D)結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/鍵CDS(B)定位31..1491(ⅸ)特征(A)名稱/鍵mal-肽(B)定位124.1491(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No.1
(2)SEQ ID No.2的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度487氨基酸(B)類型氨基酸(C)結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No.2
(2)SEQ ID No.3的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度591堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單股(D)結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/鍵CDS(B)定位1..591(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No.3
(2)SEQ ID No.4的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度197個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No.權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)的方法，其中包括在適合細(xì)胞生長(zhǎng)和維持的培養(yǎng)基中培養(yǎng)遺傳轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，并且所述蛋白質(zhì)分泌到所說(shuō)培養(yǎng)基中，其改進(jìn)之處包括下列順序的步驟在允許內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)可逆地結(jié)合至所說(shuō)陽(yáng)離子交換材料的條件下，將顆粒狀陽(yáng)離子交換材料摻入所說(shuō)培養(yǎng)基中；從所說(shuō)培養(yǎng)基中分離所說(shuō)的結(jié)合了內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)的陽(yáng)離子交換材料；以及從所說(shuō)的陽(yáng)離子交換材料中分離所說(shuō)的內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的改進(jìn)方法，其中所說(shuō)的陽(yáng)離子交換材料是S-瓊脂糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的改進(jìn)方法，其中所說(shuō)的內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合至細(xì)菌脂多糖的類脂A區(qū)域。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的改進(jìn)方法，其中所說(shuō)的內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)是殺菌性/滲透性提高的蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的改進(jìn)方法，其中所說(shuō)的內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)是殺菌性/通透性提高的蛋白質(zhì)的氨基未端片段，所說(shuō)蛋白質(zhì)能夠結(jié)合脂多糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的改進(jìn)方法，其中所說(shuō)的內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)是一種融合蛋白，其包含殺菌性/通透性增加的蛋白質(zhì)以及免疫球蛋白重鏈的一個(gè)不變區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的改進(jìn)方法，其中所說(shuō)的內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)是脂多糖結(jié)合蛋白質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的改進(jìn)方法，其中所說(shuō)的內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)是能夠結(jié)合脂多糖的脂多糖結(jié)合蛋白質(zhì)的氨基未端片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的改進(jìn)方法，其中所說(shuō)的分離步驟包括將所說(shuō)的陽(yáng)離子交換基質(zhì)依次與等級(jí)或梯度增加的離子強(qiáng)度接觸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種改進(jìn)的分離內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)的方法，該蛋白質(zhì)由在合適細(xì)胞培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞分泌。在優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明包括向培養(yǎng)基中加入陽(yáng)離子交換材料，作為提高重組內(nèi)毒素結(jié)合的蛋白質(zhì)，如殺菌性/通透性提高的蛋白質(zhì)以及脂多糖結(jié)合蛋白質(zhì)的產(chǎn)量的手段。
文檔編號(hào)C12N15/00GK1096822SQ9310945
公開(kāi)日1994年12月28日 申請(qǐng)日期1993年6月21日 優(yōu)先權(quán)日1992年5月19日
發(fā)明者L·S·格林納 申請(qǐng)人:索馬公司