專利名稱：Fc結(jié)合性蛋白質(zhì)及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對免疫球蛋白具有親和性的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)。更具體地，本發(fā)明涉及能夠作為例如親和色譜用免疫球蛋白親和性配體使用的、與野生型相比顯示高熱穩(wěn)定性等特性的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)、該蛋白質(zhì)的制造方法、和使用該蛋白質(zhì)作為構(gòu)成要素的、吸附例如免疫球蛋白的吸附材料。
背景技術(shù)：
來自免疫球蛋白G(以下也稱為IgG)的免疫信號通過抗原捕捉后的IgG與存在于免疫細(xì)胞表面的Fe受體結(jié)合而被傳導(dǎo)。Fe受體是與IgG的Fe區(qū)域結(jié)合的一組蛋白質(zhì)分子，各個(gè)分子種類具有屬于免疫球蛋白超家族的Fe識別結(jié)構(gòu)域，識別單一種類、或?qū)儆谕粊喰偷拿庖咔虻鞍?。由此確定各個(gè)免疫應(yīng)答中哪種輔助細(xì)胞被動員(非專利文獻(xiàn)I)。Fe受體還可以再分成亞型，作為針對IgG的受體，已經(jīng)報(bào)告存在Fe yR1、Fc YRIIa、Fc YRIIb、Fe Y RIII (非專利文獻(xiàn)I)。這其中，F(xiàn)cyRI與IgG的結(jié)合親和性高，其平衡解離常數(shù)(Kd)為10_8M以下(非專利文獻(xiàn)2)。FcyRI大體分為信號肽區(qū)域、細(xì)胞外區(qū)域、跨細(xì)胞膜區(qū)域、和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域，與IgG的結(jié)合發(fā)生在IgG的Fe區(qū)域和Fe Y RI的細(xì)胞外區(qū)域，然后兩者結(jié)合的信號傳導(dǎo)至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。FcyRI由與IgG的結(jié)合直接相關(guān)的α鏈、以及Υ鏈這2種亞基構(gòu)成，Y鏈通過位于跨細(xì)胞膜區(qū)域與細(xì)胞外區(qū)域的交界處的半胱氨酸介導(dǎo)的共價(jià)鍵形成同型二聚體(非專利文獻(xiàn)I)。FcyRI的α鏈的氨基酸序列和基因堿基序列已由非專利文獻(xiàn)3闡明，其后報(bào)告了通過基因重組技術(shù)以大腸桿菌(專利文獻(xiàn)I)或動物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)的例子(非專利文獻(xiàn)4)。如前述，構(gòu)成Fe Y RI的細(xì)胞外區(qū)域的蛋白質(zhì)(以下也稱為Fe結(jié)合性蛋白質(zhì))基于高度的親和性具有針對人抗體`的良好的識別功能。在該高度的親和性的基礎(chǔ)上，對于Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)，已經(jīng)報(bào)告了作為診斷試劑、抗體醫(yī)藥品的研究用工具或IgG等抗體醫(yī)藥品的制造步驟中利用的親和色譜的配體加以應(yīng)用的方法(專利文獻(xiàn)I)。Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)是以在人體內(nèi)發(fā)揮功能的蛋白質(zhì)作為起源的蛋白質(zhì)，與細(xì)菌的細(xì)胞表層等生物體外存在的蛋白質(zhì)相比，因熱、極端PH變化等而引起蛋白質(zhì)變性的傾向強(qiáng)。另一方面，在將Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)作為用于IgG制備的親和色譜用配體使用的情況下，在使用固定化有該配體的凝膠對通過色譜操作吸附的IgG進(jìn)行洗脫時(shí)，該配體有時(shí)會暴露于檸檬酸緩沖液等低PH的溶液，因而該Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)需要對酸的穩(wěn)定性。此外，在對該凝膠進(jìn)行洗滌或再生的情況下，該配體還有時(shí)會暴露于氫氧化鈉溶液等高PH溶液，因而該Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)又需要對堿的穩(wěn)定性。而且，考慮到該凝膠的長期保存，該Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)還需要對熱的穩(wěn)定性。為了對蛋白質(zhì)這樣的生物體物質(zhì)進(jìn)行工業(yè)利用，有些情況下也需要通過對該生物體物質(zhì)具有的天然結(jié)構(gòu)進(jìn)行改良，來重新制作在一定條件下穩(wěn)定的物質(zhì)。對于酶蛋白質(zhì)等，已經(jīng)報(bào)告了許多向其編碼多核苷酸中人工導(dǎo)入突變，進(jìn)行篩選后，取得獲得了需要的性狀的突變體的例子。然而，對于作為受體蛋白質(zhì)的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)，沒有對熱、酸或堿的穩(wěn)定性提高的改良體的報(bào)告，迄今為止沒有工業(yè)利用的例子?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:特表2002-531086號公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1:J. V. Ravetch 等，Annu. Rev.1mmunol. , 9,457,1991非專利文獻(xiàn)2 :Toshiyuki Takai, Jpn. J. Clin. Tmmunol. , 28, 318, 2005非專利文獻(xiàn)3 J.M. Alien 等，Science，243，378，1989非專利文獻(xiàn)4 :A. Paetz 等，Biochem. Biophys. Res. Commun.，338,1811, 2005非專利文獻(xiàn)5:夕 > 八夕質(zhì)乃構(gòu)造i機(jī)能，J 力卟 寸4工> 7 4 >夕一于'>彐于卟社，9，2005非專利文獻(xiàn)6 :Molecular Cloning, Cold Spring Horbor Laboratory, 256,199
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明提供與野生型的人Fe受體Fe YRI相比，對熱、酸和/或堿的穩(wěn)定性提高了的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)及其 制造方法。此外，本發(fā)明還提供使用該蛋白質(zhì)作為親和色譜用配體，特異性地分離含F(xiàn)e結(jié)合性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)的方法。解決問題的方法本發(fā)明人對上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)確定Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)中涉及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的氨基酸殘基，將該氨基酸殘基取代成其他氨基酸殘基而得到的突變體具有對熱、酸和/或堿的良好穩(wěn)定性，且作為親和色譜用配體是有用的，從而完成了本發(fā)明。SP，本申請包含以下的(A)IK)記載的方案⑷一種Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)，其包含SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列中的第16位至第289位的氨基酸，且該第16位至第289位的氨基酸序列中發(fā)生了以下( Γ(168)中的至少I個(gè)氨基酸取代(I)SEQ ID NO 1的第20位的蘇氨酸被取代成脯氨酸(2) SEQ ID NO 1的第25位的蘇氨酸被取代成賴氨酸(3) SEQ ID NO 1的第38位的蘇氨酸被取代成丙氨酸或絲氨酸(4) SEQ ID NO 1的第46位的亮氨酸被取代成精氨酸或脯氨酸(5) SEQ ID NO 1的第62位的丙氨酸被取代成纈氨酸(6) SEQ ID NO 1的第63位的蘇氨酸被取代成異亮氨酸(7) SEQ ID NO 1的第69位的絲氨酸被取代成苯丙氨酸或蘇氨酸(8) SEQ ID NO 1的第71位的精氨酸被取代成組氨酸(9) SEQ ID NO 1的第77位的纈氨酸被取代成丙氨酸或谷氨酸(IO)SEQ ID NO 1的第78位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸(11) SEQ ID NO 1的第94位的天冬氨酸被取代成谷氨酸(12) SEQ ID NO 1的第100位的異亮氨酸被取代成纈氨酸
(13) SEQ ID NO 1的第110位的絲氨酸被取代成天冬酰胺(14) SEQ ID NO 1的第114位的苯丙氨酸被取代成亮氨酸(15) SEQ ID NO 1的第125位的組氨酸被取代成精氨酸(16) SEQ ID NO 1的第131位的亮氨酸被取代成精氨酸或脯氨酸(17) SEQ ID NO 1的第149位的色氨酸被取代成亮氨酸(18) SEQ ID NO 1的第156位的亮氨酸被取代成脯氨酸(19) SEQ ID NO 1的第160位的異亮氨酸被取代成甲硫氨酸(20) SEQ ID NO 1的第163位的天冬酰胺被取代成絲氨酸(21) SEQ ID NO 1的第195位的天冬酰胺被取代成蘇氨酸(22) SEQ ID NO 1的第199位的蘇氨酸被取代成絲氨酸(23) SEQ ID NO 1的第206位的天冬酰胺被取代成賴氨酸、絲氨酸或蘇氨酸(24) SEQ ID NO 1的第207位的亮氨酸被取代成脯氨酸(25) SEQ ID NO 1的第218位的亮氨酸被取代成纈氨酸(26) SEQ ID NO 1的第240位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸

(27) SEQ ID NO 1的第248位的亮氨酸被取代成絲氨酸(28) SEQ ID NO 1的第283位的亮氨酸被取代成組氨酸(29) SEQ ID NO 1的第285位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺(30) SEQ ID NO 1的第17位的纈氨酸被取代成甘氨酸或谷氨酸(31) SEQ ID NO 1的第19位的蘇氨酸被取代成異亮氨酸(32) SEQ ID NO 1的第20位的蘇氨酸被取代成異亮氨酸(33) SEQ ID NO 1的第25位的蘇氨酸被取代成甲硫氨酸或精氨酸(34) SEQ ID NO 1的第27位的谷氨酰胺被取代成脯氨酸或賴氨酸(35) SEQ ID NO 1的第35位的谷氨酰胺被取代成亮氨酸、甲硫氨酸或精氨酸(36) SEQ ID NO 1的第36位的谷氨酸被取代成甘氨酸(37) SEQ ID NO 1的第41位的亮氨酸被取代成甲硫氨酸(38) SEQ ID NO 1的第42位的組氨酸被取代成亮氨酸(39) SEQ ID NO 1的第44位的谷氨酸被取代成天冬氨酸(40) SEQ ID NO 1的第45位的纈氨酸被取代成丙氨酸(41) SEQ ID NO 1的第46位的亮氨酸被取代成丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、絲氨酸或色氨酸(42) SEQ ID NO 1的第47位的組氨酸被取代成谷氨酰胺、亮氨酸或天冬酰胺(43) SEQ ID NO 1的第49位的脯氨酸被取代成絲氨酸或丙氨酸(44) SEQ ID NO 1的第50位的甘氨酸被取代成精氨酸或谷氨酸(45) SEQ ID NO 1的第51位的絲氨酸被取代成丙氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、脯氨酸或
纈氨酸(46) SEQ ID NO 1的第52位的絲氨酸被取代成甘氨酸(47) SEQ ID NO 1的第53位的絲氨酸被取代成亮氨酸、蘇氨酸或脯氨酸(48) SEQ ID NO 1的第55位的谷氨酰胺被取代成精氨酸(49) SEQ ID NO 1的第57位的苯丙氨酸被取代成酪氨酸
(50) SEQID NO :1的第58位的亮氨酸被取代成精氨酸(51) SEQID NO 1的第60位的甘氨酸被取代成天冬氨酸(52) SEQID NO 1的第61位的蘇氨酸被取代成丙氨酸或絲氨酸(53) SEQID NO 1的第62位的丙氨酸被取代成谷氨酸(54) SEQID NO 1的第63位的蘇氨酸被取代成亮氨酸、苯丙氨酸(55) SEQID NO 1的第64位的谷氨酰胺被取代成脯氨酸、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸(56) SEQID NO 1的第65位的蘇氨酸被取代成丙氨酸或纈氨酸(57) SEQID NO 1的第66位的絲氨酸被取代成蘇氨酸(58) SEQID NO 1的第67位的蘇氨酸被取代成丙氨酸或絲氨酸(59) SEQID NO 1的第69位的絲氨酸被取代成丙氨酸(60) SEQID NO 1的第70位的酪氨酸被取代成組氨酸或苯丙氨酸(61) SEQID NO 1的第71位的精氨酸被取代成酪氨酸 (62) SEQID NO 1的第73位的蘇氨酸被取代成丙氨酸或絲氨酸(63) SEQID NO 1的第74位的絲氨酸被取代成苯丙氨酸(64) SEQID NO 1的第76位的絲氨酸被取代成天冬酰胺(65) SEQID NO 1的第77位的纈氨酸被取代成天冬氨酸或賴氨酸(66) SEQID NO 1的第78位的天冬酰胺被取代成絲氨酸或甘氨酸(67) SEQID NO 1的第80位的絲氨酸被取代成丙氨酸(68) SEQID NO 1的第84位的精氨酸被取代成絲氨酸(69) SEQID NO 1的第88位的甘氨酸被取代成絲氨酸(70) SEQID NO 1的第89位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺或脯氨酸(71) SEQID NO 1的第90位的絲氨酸被取代成甘氨酸(72) SEQID NO 1的第92位的精氨酸被取代成半胱氨酸或亮氨酸(73) SEQID NO 1的第96位的異亮氨酸被取代成纈氨酸或賴氨酸(74) SEQID NO 1的第97位的谷氨酰胺被取代成亮氨酸或賴氨酸(75) SEQID NO 1的第101位的組氨酸被取代成亮氨酸(76) SEQID NO 1的第102位的精氨酸被取代成絲氨酸或亮氨酸(77) SEQID NO 1的第103位的甘氨酸被取代成天冬氨酸或絲氨酸(78) SEQID NO 1的第111位的絲氨酸被取代成丙氨酸(79) SEQID NO :1的第114位的苯丙氨酸被取代成丙氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、蘇氨酸或纈氨酸(80) SEQID NO 1的第115位的蘇氨酸被取代成異亮氨酸或苯丙氨酸(81) SEQID NO 1的第118位的谷氨酸被取代成天冬氨酸(82) SEQID NO 1的第121位的丙氨酸被取代成蘇氨酸或纈氨酸(83) SEQID NO 1的第128位的賴氨酸被取代成精氨酸或甘氨酸(84) SEQID NO 1的第129位的天冬氨酸被取代成甘氨酸(85) SEQID NO 1的第131位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺(86) SEQID NO 1的第133位的酪氨酸被取代成組氨酸或精氨酸(87) SEQID NO 1的第134位的天冬酰胺被取代成絲氨酸
(88) SEQ ID NO 1的第137位的酪氨酸被取代成苯丙氨酸(89) SEQ ID NO 1的第138位的酪氨酸被取代成組氨酸(90) SEQ ID NO 1的第139位的精氨酸被取代成組氨酸(91) SEQ ID NO 1的第140位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸(92) SEQ ID NO 1的第141位的甘氨酸被取代成天冬氨酸或纈氨酸(93) SEQ ID NO 1的第142位的賴氨酸被取代成谷氨酸或精氨酸(94) SEQ ID NO 1的第144位的苯丙氨酸被取代成異亮氨酸(95) SEQ ID NO 1的第147位的苯丙氨酸被取代成絲氨酸(96) SEQ ID NO 1的第148位的組氨酸被取代成精氨酸或谷氨酰胺(97) SEQ ID NO 1的第149位的色氨酸被取代成精氨酸(98) SEQ ID NO 1的第151位的絲氨酸被取代成蘇氨酸(99) SEQ ID NO 1的第152位的天冬酰胺被取代成蘇氨酸、異亮氨酸或脯氨酸(IOO)SEQ ID NO 1的第154位的蘇氨酸被取代成絲氨酸(IOl)SEQ ID NO 1的第156位的亮氨酸被取代成組氨酸(102) SEQ ID NO 1的第157位的賴氨酸被取代成精氨酸

(103) SEQ ID NO 1的第159位的天冬酰胺被取代成蘇氨酸或天冬氨酸(104) SEQ ID NO 1的第160位的異亮氨酸被取代成蘇氨酸、纈氨酸或亮氨酸(105) SEQ ID NO 1的第161位的絲氨酸被取代成蘇氨酸(106) SEQ ID NO 1的第165位的蘇氨酸被取代成甲硫氨酸(107) SEQ ID NO 1的第171位的甲硫氨酸被取代成蘇氨酸(108) SEQ ID NO 1的第173位的賴氨酸被取代成精氨酸(109) SEQ ID NO 1的第174位的組氨酸被取代成谷氨酰胺(IlO)SEQ ID NO 1的第177位的蘇氨酸被取代成絲氨酸(Ill)SEQ ID NO 1的第181位的異亮氨酸被取代成蘇氨酸(112) SEQ ID NO :1的第182位的絲氨酸被取代成蘇氨酸、亮氨酸、纈氨酸或谷氨酸(113) SEQ ID NO 1的第184位的蘇氨酸被取代成絲氨酸(114) SEQ ID NO 1的第190位的脯氨酸被取代成絲氨酸(115) SEQ ID NO 1的第193位的纈氨酸被取代成亮氨酸(116) SEQ ID NO 1的第195位的天冬酰胺被取代成丙氨酸(117) SEQ ID NO 1的第196位的丙氨酸被取代成絲氨酸(118) SEQ ID NO 1的第198位的纈氨酸被取代成甘氨酸或甲硫氨酸(119) SEQ ID NO 1的第199位的蘇氨酸被取代成丙氨酸(120) SEQ ID NO 1的第200位的絲氨酸被取代成甘氨酸或精氨酸(121) SEQ ID NO 1的第202位的亮氨酸被取代成甲硫氨酸(122) SEQ ID NO 1的第203位的亮氨酸被取代成組氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、精氨酸、脯氨酸(123) SEQ ID NO 1的第204位的谷氨酸被取代成纈氨酸(124) SEQ ID NO 1的第207位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺、組氨酸或精氨酸
(125) SEQ ID NO :1的第209位的蘇氨酸被取代成丙氨酸(126) SEQ ID NO 1的第211位的絲氨酸被取代成精氨酸或甘氨酸(127) SEQ ID NO :1的第213位的谷氨酸被取代成纈氨酸或異亮氨酸(128) SEQ ID NO :1的第215位的賴氨酸被取代成精氨酸或谷氨酸(129) SEQ ID NO :1的第217位的亮氨酸被取代成精氨酸或谷氨酰胺(130) SEQ ID NO 1的第218位的亮氨酸被取代成異亮氨酸、甲硫氨酸或賴氨酸(131) SEQ ID NO 1的第219位的谷氨酰胺被取代成脯氨酸或精氨酸(132) SEQ ID NO 1的第223位的亮氨酸被取代成精氨酸、谷氨酰胺或甲硫氨酸(133) SEQ ID NO 1的第224位的谷氨酰胺被取代成精氨酸(134) SEQ ID NO 1的第225位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺(135) SEQ ID NO 1的第227位的苯丙氨酸被取代成異亮氨酸(136) SEQ ID NO 1的第230位的酪氨酸被取代成組氨酸或苯丙氨酸(137) SEQ ID NO 1的第231位的甲硫氨酸被取代成賴氨酸或精氨酸(138) SEQ ID NO 1的第233位的絲氨酸被取代成甘氨酸或天冬酰胺(139) SEQ ID NO 1的第234位的賴氨酸被取代成谷氨酸(140)SEQ ID NO 1的第240位的天冬酰胺被取代成甘氨酸(141) SEQ ID NO 1的第244位的谷氨酸被取代成纈氨酸(142) SEQ ID NO 1的第245位的酪氨酸被取代成組氨酸或谷氨酸(143) SEQ ID NO 1的第246位的谷氨酰胺被取代成精氨酸或賴氨酸(144) SEQ ID NO 1的第248位的亮氨酸被取代成異亮氨酸(145) SEQ ID NO 1的第249位的蘇氨酸被取代成丙氨酸或絲氨酸(146) SEQ ID NO 1的第250位的丙氨酸被取代成纈氨酸(147) SEQ ID NO 1的第251位的精氨酸被取代成絲氨酸(148) SEQ ID NO 1的第252位的精氨酸被取代成組氨酸(149) SEQ ID NO 1的第253位的谷氨酸被取代成甘氨酸(150) SEQ ID NO 1的第257位的亮氨酸被取代成精氨酸或谷氨酰胺(151) SEQ ID NO 1的第261位的谷氨酸被取代成纈氨酸或丙氨酸(152) SEQ ID NO 1的第262位的丙氨酸被取代成纈氨酸(153) SEQ ID NO 1的第263位的丙氨酸被取代成絲氨酸(154) SEQ ID NO 1的 第264位的蘇氨酸被取代成絲氨酸(155) SEQ ID NO 1的第265位的谷氨酸被取代成丙氨酸或甘氨酸(156) SEQ ID NO 1的第268位的天冬酰胺被取代成絲氨酸、異亮氨酸或蘇氨酸(157) SEQ ID NO 1的第270位的亮氨酸被取代成組氨酸、精氨酸或纈氨酸(158) SEQ ID NO 1的第271位的賴氨酸被取代成精氨酸(159) SEQ ID NO 1的第272位的精氨酸被取代成谷氨酰胺(160) SEQ ID NO 1的第277位的谷氨酸被取代成纈氨酸(161) SEQ ID NO 1的第279位的谷氨酰胺被取代成精氨酸或組氨酸(162) SEQ ID NO 1的第282位的甘氨酸被取代成天冬氨酸(163) SEQ ID NO 1的第283位的亮氨酸被取代成脯氨酸
(164) SEQ ID NO 1的第285位的亮氨酸被取代成精氨酸或組氨酸(165) SEQ ID NO 1的第286位的脯氨酸被取代成谷氨酰胺、精氨酸或谷氨酸(166) SEQ ID NO :1的第287位的蘇氨酸被取代成異亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸或纈
氨酸(167) SEQ ID NO 1的第288位的脯氨酸被取代成丙氨酸、絲氨酸或蘇氨酸(168) SEQ ID NO 1的第289位的纈氨酸被取代成丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、亮氨
酸或異亮氨酸。(B)⑷所述的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)，其中，所述第16位至第289位的氨基酸序列中至少發(fā)生了所述(4)、(14)、(41)和(79)中的任一個(gè)所述的氨基酸取代。(C) (B)所述的 Fe 結(jié)合性蛋白質(zhì)，其包含 SEQ ID NO :2、3、4、5、114、118、130、134、148、154、164、170、174和176中的任一個(gè)所示的氨基酸序列中的第34位至第307位的氨基酸。(D) (B)所述的 Fe 結(jié)合性蛋白質(zhì)，其包含 SEQ ID NO :2、3、4、5、114、118、130、134、148、154、164、170、174和176中的任一個(gè)所不的氨基酸序列。(E)編碼(A) (D)中的任一個(gè)所述的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)的多核苷酸。(F)包含(E)所述的多核苷酸的表達(dá)載體。

(G)用(F)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主而得到的轉(zhuǎn)化體。(H) (G)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主是大腸桿菌。(I)Fc結(jié)合性蛋白質(zhì)的制造方法，其中，培養(yǎng)(G)或⑶所述的轉(zhuǎn)化體來生產(chǎn)Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)，并從其培養(yǎng)物回收所產(chǎn)生的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)。(J)將(A) (D)中的任一個(gè)所述的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)固定化于固相而得到的、包含F(xiàn)e結(jié)合性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)吸附材料。(K)抗體純化方法，其包括(I)在將包含 SEQ ID NO : 114、118、130、134、148、154、164、170、174和176中的任一個(gè)所示的氨基酸序列的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)固定化于固相而得到的、包含F(xiàn)e結(jié)合性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)吸附材料中添加包含抗體的溶液，使該抗體吸附于該吸附材料的步驟；以及(2)使用ρΗ3. (Γ4. 5的緩沖液對吸附于所述吸附材料的所述抗體進(jìn)行洗脫的步驟。發(fā)明的效果本發(fā)明的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)是在野生型的人Fe受體Fe Y RI中將位于細(xì)胞外區(qū)域的I個(gè)以上特定氨基酸殘基取代成其他氨基酸而成的蛋白質(zhì)。與野生型的人Fe Y RI相比較，該蛋白質(zhì)對熱、酸和/或堿的穩(wěn)定性提高。因而，通過將本發(fā)明的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)用作親和色譜用配體，能夠穩(wěn)定地對人IgG這樣的抗體進(jìn)行純化。此外，在通過對用包含編碼Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主而得到的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)，生產(chǎn)Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)，并從其培養(yǎng)物回收所產(chǎn)生的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)的制造方法中，將本發(fā)明的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)作為Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)使用，蛋白質(zhì)生產(chǎn)性提高。因而，本發(fā)明在Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)在工業(yè)制造中也是有用的。而且，與野生型的人Fe YRI相比較，本發(fā)明的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)對熱、酸和/或堿的穩(wěn)定性提高。因而，將本發(fā)明的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)固定化于固相而得到的包含F(xiàn)e結(jié)合性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)的吸附材料即使例如進(jìn)行基于堿處理(例如IOOmM氫氧化鈉水溶液)的再生處理，吸附性能也幾乎不會劣化。因此，可以說本發(fā)明的吸附材料特別優(yōu)選用于人IgG這樣的抗體的大量純化用途。


[圖1]顯示人Fe受體FeY RI的結(jié)構(gòu)的概略的圖。[圖2]插入了編碼人FeY RI的多核苷酸的質(zhì)粒pUCFcR的結(jié)構(gòu)概略圖。[圖3]插入了編碼Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)的多核苷酸的質(zhì)粒pETFcR的制作概略圖。[圖4]質(zhì)粒pETMalE的結(jié)構(gòu)概略圖。[圖5]質(zhì)粒pETFcR的結(jié)構(gòu)概略圖。[圖6]對用質(zhì)粒pETFcR轉(zhuǎn)化體表達(dá)的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)的抗體結(jié)合活性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖7]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm4、FcRm6、FcRm8、FcRml9)的生產(chǎn)性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖8]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm32)的生產(chǎn)性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖9]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm32)的堿穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖10]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm36b)的生產(chǎn)性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖11]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm36b)的堿穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)的圖。
`
[圖12]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm44)的生產(chǎn)性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖13]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm44)的堿穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖14]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm48)的生產(chǎn)性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖15]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm48)的堿穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖16]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm54b)的生產(chǎn)性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖17]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm54b)的堿穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖18]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm56b)的生產(chǎn)性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖19]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm56b)的堿穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖20]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm57b)的生產(chǎn)性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖21]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm57b)的堿穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖22]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm60c、FcRm61、FcRm62)的生產(chǎn)性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖23]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm60c、FcRm61、FcRm62)的堿穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖24]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)的酸穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖25]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRml9)固定化凝膠的抗體洗脫性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖26]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm32)固定化凝膠的抗體洗脫性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖27]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm36b)固定化凝膠的抗體洗脫性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖28]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm48)固定化凝膠的抗體洗脫性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖29]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm56b)固定化凝膠的抗體洗脫性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖30]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm57b)固定化凝膠的抗體洗脫性進(jìn)行評價(jià)的圖。[圖31]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm32、FcRm36b、FcRm56b)固定化凝膠的堿穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)的圖。
[圖32]對Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)(FcRm56b)固定化凝膠的重復(fù)穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)的圖。發(fā)明的
具體實(shí)施例方式以下，對本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)進(jìn)行具體說明。人Fe受體Fe Y RI的α鏈的結(jié)構(gòu)示于圖1。人Fe受體Fe Y RI的α鏈由下述區(qū)域構(gòu)成由N末端側(cè)起15個(gè)氨基酸組成的信號肽區(qū)域(SS、SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列中第I位至第15位的區(qū)域)、由277個(gè)氨基酸組成的細(xì)胞外區(qū)域(EC、SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列中第16位至第292位的區(qū)域)、由21個(gè)氨基酸組成的跨細(xì)胞膜區(qū)域(TM、SEQID NO 1所示的氨基酸序列中第293位至第313位的區(qū)域)、以及由61個(gè)氨基酸組成的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域(C、SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中第314位至第374位的區(qū)域)。 本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)包含SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中自第16位的谷氨酰胺至第292位的組氨酸的細(xì)胞外區(qū)域(圖1的EC區(qū)域)中的至少自第16位的谷氨酰胺至第289位的纈氨酸的區(qū)域。此外，本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)可以包含處于EC區(qū)域的N末端側(cè)的信號肽區(qū)域(圖1的SS區(qū)域)的全部或一部分，也可以包含處于EC區(qū)域的C末端側(cè)的跨膜區(qū)域(圖1的TM區(qū)域)或細(xì)胞內(nèi)區(qū)域(圖1的C區(qū)域)。而且，本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)的N末端側(cè)或C末端側(cè)可以添加多組氨酸標(biāo)簽等用于進(jìn)行純化等的標(biāo)簽妝。本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)是SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列中的處于作為細(xì)胞外區(qū)域(圖1的EC區(qū)域)的一部分的第16位的谷氨酰胺 第289位的纈氨酸的區(qū)域中的氨基酸殘基中的至少I個(gè)被取代成其他氨基酸殘基而得到的多肽。通過該取代，與由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列組成的野生型的人Fe y RI相比，本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、酸穩(wěn)定性和/或堿穩(wěn)定性顯著提高，且作為親和色譜用配體是有用的。例如，實(shí)施例中示例的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)在43°C進(jìn)行10分鐘加熱處理，或在70°C進(jìn)行20分鐘加熱處理，或在PH3. O的酸條件下進(jìn)行24小時(shí)處理，或在pHIO的堿條件下53°C進(jìn)行20分鐘處理，仍保持著不低于未發(fā)生氨基酸取代的野生型的人Fe Y RI的抗體結(jié)合活性。具體地，本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)包含SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中、至少第16位的谷氨酰胺至第289位的纈氨酸的區(qū)域的氨基酸序列。而且，該氨基酸序列是發(fā)生了 Thr20Pro(該表示方式表示SEQ ID NO :1的第20位的蘇氨酸被取代成月甫氨酸，以下相同)、Thr25Lys> Thr38Ala> Thr38Ser> Leu46Arg> Leu46Pro> Ala62Val、Thr63Ile、Ser69Phe、Ser69Thr、Arg71His、Val77Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Asp94Glu、IlelOOVaK SerlIOAsnΛPhell4Leu、Hisl25Arg、Leul31Arg、Leul31Pro、Trpl49Leu、Leul56Pro、Ilel60Met、Asnl63Ser、Asnl95Thr、Thrl99Ser、Asn206Lys、Asn206Ser、Asn206Thr、Leu207Pro、Leu218Val、Asn240Asp、Leu248Ser、Leu283His、Leu285Gln、Vall7Gly、Vall7Glu、Thrl9Ile、Thr20Ile、Thr25Met、Thr25Arg、Gln27Pro、Gln27Lys、Gln35Leu、Gln35Met、Gln35Arg、Glu36Gly、Leu41Met、His42Leu、Glu44Asp、Val45Ala、Leu46Ala、Leu46Asn、Leu46Asp、Leu46Gln、Leu46Gly、Leu46His、Leu46Lys、Leu46Ser、Leu46Trp、His47Gln、His47Leu、His47Asn、Pro49Ser、Pro49Ala、Gly50Arg、Gly50Glu、Ser51Ala、 Ser51Thr、 Ser51Leu、 Ser51Pro、 Ser51VaU Ser52Gly、 Ser53Leu、 Ser53Thr、Ser53Pro、Gln55Arg、Phe57Tyr、Leu58Arg、Gly60Asp、Thr61Ala、Thr61Ser、Ala62Glu、Thr63Leu、Thr63Phe、Gln64Pro、Gln64His、Gln64Leu、Gln64Lys、Thr65Ala、Thr65VaUSer66Thr、Thr67Ala、Thr67Ser、Ser69Ala、Tyr70His> Tyr70Phe> Arg71Tyr> Thr73Ala、Thr73Ser、Ser74Phe、Ser76Asn、Val77Asp、Val77Lys、Asn78Ser、Asn78Gly、Ser80Ala、Arg84Ser> Gly88Ser> Leu89Gln、Leu89Pro> Ser90Gly> Arg92Cys> Arg92Leu> Ile96Val、Ile96Lys、Gln97Leu、Gln97Lys、Hisl01Leu、Argl02Ser、Argl02Leu、Glyl03Asp、Glyl03Ser、SerlllAla、Phell4Ala、Phell4Ile、Phell4Met、Phell4Pro、Phell4Thr、Phell4Val、Thrll5Ile、Thrll5Phe、Glull8Asp、Alal21Thr、Alal21Val、Lysl28Arg、Lysl28Gly、Aspl29Gly、Leul31Gln、Tyrl33His、Tyrl33Arg, Asnl34Ser、Tyrl37Phe、Tyrl38His、Argl39His> Asnl40Asp、Glyl41Asp> Gly 141Val> Lysl42Glu> Lysl42Arg> Phel44Ile、Phel47Ser、Hisl48Arg、Hisl48Gln、Trpl49Arg、Serl51Thr、Asnl52Thr、Asnl52Ile、Asnl52Pro、Thrl54Ser、Leul56His、Lysl57Arg> Asnl59Thr、Asnl59Asp、Ilel60Thr>Ilel60VaU Ilel60Leu, Serl61Thr、Thrl65Met、Metl71Thr、Lysl73Arg、Hisl74Gln、Thrl77Ser、 Ilel81Thr、 Serl82Thr、 Serl82Leu、 Serl82Val, Serl82Glu、 Thrl84Ser、Prol90Ser、Vall93Leu、Asnl95Ala、Alal96Ser、Vall98Gly、Vall98Met、Thrl99Ala、Ser200Gly> Ser200Arg> Leu202Met、Leu203His、Leu203Gln、Leu203Tyr> Leu203Arg>Leu203Pro、Glu204Val、Leu207Gln、Leu207His、Leu207Arg、Thr209Ala、Ser211Arg、Ser211Gly、Glu213Val、Glu213Ile、Lys215Arg、Lys215Glu、Leu217Arg、Leu217Gln、Leu218Ile、Leu218Met、Leu218Lys> Gln219Pro> Gln219Arg> Leu223Arg、Leu223Gln、Leu223Met、Gln224Arg> Leu225Gln、Phe227Ile、Tyr230His> Tyr230Phe> Met231Lys>Met231Arg、Ser233Gly、Ser233Asn、Lys234Glu、Asn240Gly、Glu244Val、Tyr245His、Tyr245Glu、Gln246Arg、Gln246Lys、Leu248Ile、Thr249Ala、Thr249Ser、Ala250Val、Arg251Ser、Arg252His、Gl u253Gly、Leu257Arg、Leu257Gln、Glu261Val、Glu261Ala、Ala262Val、Ala263Ser、Thr264Ser、Glu265Ala、Glu265Gly、Asn268Ser、Asn268Ile、Asn268Thr、Leu270His、Leu270Arg、Leu270Val、Lys271Arg、Arg272Gln、Glu277Val、Gln279Arg、Gln279His、Gly282Asp、Leu283Pro、Leu285Arg、Leu285His、Pro286Gln、Pro286Arg> Pro286Glu> Thr287Ile> Thr287Pro> Thr287Ala> Thr287Val> Pro288Ala>Pro288Ser、Pro288Thr、Val289Ala、Val289Asp、Val289Gly、Val289Leu 和 Val289Ile 中的 I個(gè)以上的任意取代的多肽。此外，在上述取代中，若發(fā)生Thr20Pro、Thr25Lys、Thr38Ser、Leu46Pro、Thr6311 e、Ser69Thr、Arg71His、Val77Glu、Asn78Asp、IlelOOVal,Phell4Leu,Ilel60Met,Asnl63Ser,Asnl95Thr、Asn206Thr、Leu207Pro、Asn240Asp、Leu283His 和 Leu285Gln 中的 I 個(gè)以上的任意取代，則熱穩(wěn)定性進(jìn)一步提聞，由此是優(yōu)選的。此外，在上述取代中，若發(fā)生Leu46Arg、Leu46Pro、Leu46Ala、Leu46Asn、Leu46Asp、Leu46Gln、Leu46Gly> Leu46His、Leu46Lys> Leu46S er、Leu46Trp、Phell4Leu、Phell4Ala、Phell4Ile、Phell4Met、Phell4Pro、Phell4Thr 和 Phell4Val 中的 I 個(gè)以上的任意取代，貝丨JFe結(jié)合性蛋白質(zhì)對熱、酸和堿的穩(wěn)定性進(jìn)一步提高，因此是優(yōu)選的。而且，在通過發(fā)生氨基酸取代來制作本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)時(shí)，對于特定的氨基酸位置，也可以取代成前述取代之外的氨基酸，只要具有抗體結(jié)合活性即可。作為其中的一例，可以列舉出在兩個(gè)氨基酸的物理性質(zhì)和/或化學(xué)性質(zhì)相似的氨基酸之間進(jìn)行取代的保守取代。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，就保守取代而言，不僅僅限于Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的功能在發(fā)生了取代者與未發(fā)生取代者之間普遍地能夠得以維持。作為保守取代的一例，可以列舉出甘氨酸和丙氨酸之間、天冬氨酸和谷氨酸之間、絲氨酸和脯氨酸之間、或谷氨酸和丙氨酸之間發(fā)生的取代(非專利文獻(xiàn)5)。本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)中，對于取代的氨基酸的數(shù)目沒有特殊限制。作為一例，可以列舉出以下所示的(a廣(η)的取代體。這些取代體中，(cr(η)所示的取代體對熱、酸和喊的穩(wěn)定性進(jìn)一步提聞，因此是特別優(yōu)選的。(a)發(fā)生了 Leu46Pro、Thr63Ile、Phe 114Leu 和 Asn240Asp 的取代的 4 重取代體(包含SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸序列的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì))、(b)發(fā)生了 Thr38Ser、Leu46Pro> Thr63Ile> IlelOOVal、Phell4Leu 和 Asn240Asp的取代的6重取代體(包含SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸序列的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì))、(c)發(fā)生了 Thr38Ser、Leu46Pro、Thr63Ile、IlelOOVal、Phell4Leu、Ilel60Met、Asnl63Ser和Asn240Asp的取代的8重取代體(包含SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸序列的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì))、(d)發(fā)生了 Thr20Pro、Thr25Lys> Thr38Ser> Leu46Pro> Thr63Ile> Ser69Thr>Arg71His、Val77Glu、Asn78Asp、Ilel00Val、Phell4Leu、Ilel60Met、Asnl63Ser、Asnl95Thr、Asn206Thr、Leu207Pro、Asn240Asp、Leu283His 和 Leu285Gln 的取代的 19 重取代體(包含SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸序列的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì))、(e)發(fā)生了 Thr20Pro、Thr25Lys> Glu36Gly> Thr38Ser> Val45Ala、Leu46Pro>Pro49Ser> Gly60Asp> Thr63Ile> Thr65Ala> Ser69Thr> Arg71His> Val77Glu、Asn78Asp、IlelOOVal、Phel 14Leu> Tyrl33His> Argl39His> Trpl49Arg> Leul56Pro> Ilel60Thr>Asnl63Ser> Lysl73Arg> Ilel81Thr> Asnl95Thr> Leu203His、Asn206Thr> Leu207Gln、Met231Lys、Asn240Asp、Leu283His 和 Leu285Gln 的取代的 32 重取代體(包含 SEQ ID NO 114所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì))、(f)發(fā)生了 Thr20Pro、Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、Val45Ala、Leu46Pro> Pro49Ser> Ser52Gly> Gly60Asp> Thr63Ile> Thr65Ala> Ser69Thr>Arg71His、Val77Glu、Asn78Asp、Ilel00Val、Phell4Leu、Tyrl33His、Argl39His、Trpl49Arg、Asnl52Thr、 Leul56Pro、 Ilel60Thr、 Asnl63Ser、 Lysl73Arg> Ilel81Thr、 Asnl95Thr、Leu203His、Asn206Thr、Leu207Gln、Met231Lys、Asn240Asp、Leu283His 和 Leu285Gln 的取代的36重取代體(包含SEQ ID NO : 118所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì))、(g)發(fā)生了 Thr20Pro、Thr25Lys> Gln35Leu、Glu36Gly> Thr38Ser> Leu41Met、Val45Ala、Leu46Pro> Pro49Ser> Ser52Gly> Gly60Asp> Thr63Ile> Thr65Ala> Ser69Thr>Arg71His、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、He IOOVaU Phe 114Leu、Lysl28Arg、Tyrl33His> Argl39His、Trpl49Arg、Asnl52Thr、Leul56Pro、Lysl57Arg> Ilel60Thr、Asnl63Ser> Lysl73Arg> Ilel81Thr> Serl82Leu> Asnl95Thr> Leu203His、Asn206Thr >Leu207Gln、Glu213Val、Leu218Ile、Met231Lys、Asn240Asp、Thr249Ala、Glu261Val、Leu283His和Leu285Gln的取代的44重取代體( 包含SEQ ID NO : 130所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì))、(h)發(fā)生了 Thr20Pro、Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、Val45Ala、Leu46Pro> Pro49Ser> Ser51Thr> Ser52Gly> Gly60Asp> Thr63Ile> Thr65Ala>Ser69Thr、Arg71His、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、IlelOOVal, Phell4Leu, Lysl28Arg、Leul31Gln、Tyrl33His> Tyr 137Phe> Argl39His、Trpl49Arg、Asnl52Thr、Leul56Pro、Lysl57Arg> Ilel60Thr、Asnl63Ser、Lysl73Arg> Ilel81Thr、Ser182Leu> Thr 184Ser>Asnl95Thr> Leu203His、Asn206Thr> Leu207Gln、Glu213Val、Leu218Ile、Met231Lys>Asn240Asp、Thr249Ala、Glu261Val、Leu283His 和 Leu285Gln 的取代的 48 重取代體(包含SEQ ID NO 134所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì))、(i)發(fā)生了 Thr20Pro、Thr25Lys> Gln35Leu、Glu36Gly> Thr38Ser> Leu41Met、His42Leu、Leu46Pro> Pro49Ser> Ser51Ala> Ser52Gly> Gly60Asp> Thr63Ile> Thr65Ala>Ser69Thr、Arg71His、Thr73Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、IlelOOVal, Phell4Leu、Alal21Val、Lysl28Arg、Leul31Gln、Tyrl33His、Tyrl37Phe、Argl39His、Trpl49Arg、Serl51Thr、Asnl52Thr、Leul56Pro、Lysl57Arg> Ilel60Thr、Asnl63Ser、Lysl73Arg>Ilel81Thr、Serl82Leu、Thrl84Ser、Asnl95Thr、Thrl99Ala、Leu203His、Asn206Thr、Leu207Gln、Glu213Val、Leu218Ile, Met231Lys、Lys234Glu、Asn240Asp、Thr249Ala、Glu261Val、Leu270Val、Leu283His 和 Leu285Gln 的取代的 54 重取代體(包含 SEQ ID NO 148所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì))、(j)發(fā)生了 Thr20Pro、 Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、His42Leu、Leu46Pro> Pro49Ser> Ser51Ala> Ser52Gly> Leu58Arg> Gly60Asp> Thr63Ile>Thr65Ala、Ser69Thr、Arg71His、Thr73Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、IlelOOVal,SerlllAla、Phell4Leu、Thrll5Ile、Alal21Val、Lysl28Arg、Leul31Gln、Tyrl33His、Tyrl37Phe> Argl39His、Trpl49Arg、Serl51Thr、Asnl52Thr、Leul56Pro、Lysl57Arg>Ilel60Thr>Asnl63Ser> Lysl73Arg> Ilel81Thr> Ser182Leu> Thrl84Ser>Asnl95Thr>Thrl99Ala、Leu203His、Asn206Thr、Leu207Gln、Glu213Val、Leu218Ile、Met231Lys、Lys234Glu、Asn240A sp、Thr249Ala、Leu270Val、Leu283His 和 Leu285Gln 的取代的 56 重取代體(包含SEQ ID NO 154所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì))、(k)發(fā)生了 Thr20Pro、Thr25Lys> Gln35Leu、Glu36Gly> Thr38Ser> Leu41Met、His42Leu、Leu46Pro> Pro49Ser> Ser51Ala> Ser52Gly> Leu58Arg> Gly60Asp> Thr63Ile>Thr65Ala、Ser69Thr、Tyr70Phe、Arg71His、Thr73Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、IlelOOVaU SerlllAla、Phell4Leu、Thrll5Ile、Alal21Val、Lysl28Arg、Tyrl33His、Tyrl37Phe> Argl39His、Trpl49Arg、Ser 151Thr> Asnl52Thr、Leul56Pro、Lysl57Arg>Ilel60Thr> Asnl63Ser> Lysl73Arg> Ilel81Thr> Ser 182Leu> Thr 184Ser> Asnl95Thr>Thrl99Ala> Asn206Thr> Leu207Pro> Glu213Val、Leu218Ile、Tyr230Phe> Met231Lys>Ser233Gly、Lys234Glu、Asn240Asp、Thr249Ala、Leu270Val、Leu283His 和 Leu285Gln 的取代的57重取代體(包含SEQ ID NO :164所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì))、(I)發(fā)生了 Thr20Pro、Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、His42Leu、Leu46Pro、Pro49Ser、Ser51Ala、Ser52Gly、Leu58Arg、Gly60Asp、Thr63Ile、Thr65Ala、Ser69Thr、Tyr70Phe、Arg71His、Thr73Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、IlelOOVal、SerlllAla^ Phell4Leu、Thrll5Ile、Alal21Val、Lysl28Arg、Tyrl33His、Tyrl37Phe、Argl39His、Trpl49Arg、Serl51Thr、Asnl52Thr、Leul56Pro、Lysl57Arg、Ilel60Thr、Asnl63Ser、Thrl65Met、Lysl73Arg、Ilel81Thr、Serl82Leu、Thrl84Ser、Asnl95Thr、Thrl99Ala、Asn206Thr、Leu207Pro、Glu213Val、Leu217Gln、Leu218Ile、Tyr230Phe、Met231Lys、Ser233Gly、Lys234Glu、Asn240Asp、Thr249Ala、Leu270Val、Leu283His、Leu285Gln和Val289Asp的取代的60重取代體(包含SEQ IDNO 174所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì))、(m)發(fā)生了 Thr20Pro、Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、His42Leu、Leu46Pro、Pro49Ser、Ser51Ala、Ser52Gly、Leu58Arg、Gly60Asp、Thr63Ile、Thr65Ala、Ser69Thr、Tyr70Phe、Arg71His、Thr73Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、IlelOOVal、SerlllAla^ Phell4Leu、Thrll5Ile、Glull8Asp、Alal21Val、Lysl28Arg、Tyrl33His、Tyrl37Phe、Argl39His、Trpl49Arg、Serl51Thr、Asnl52Thr、Leul56Pro、Lysl57Arg、Ilel60Thr、Asnl63Ser、Thrl65Met、Lysl73Arg、Ilel81Thr、Serl82Leu、Thrl84Ser、Asnl95Thr、Thrl99Ala、Asn206Thr、Leu207Pro、Glu213Val、Leu218Ile、Tyr230Phe、Met231Lys、Ser233Gly、Lys234Glu、Asn240A sp、Gln246Lys、Thr249Ala、Leu270Val、Leu283His、Leu285Gln 和 Val289Asp 的取代的 61 重取代體(包含 SEQ ID NO:170所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì))、(η)發(fā)生了 Thr20Pro、Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、His42Leu、Leu46Pro> Pro49Ser> Ser51Ala> Ser52Gly> Leu58Arg> Gly60Asp> Thr63Ile>Thr65Ala、Ser69Thr、Tyr70Phe、Arg71His、Thr73Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、IlelOOVal, SerlllAla、Phell4Leu、Thrll5Ile、Glull8Asp、Alal21Val、Lysl28Arg、Tyrl33His> Tyrl37Phe> Argl39His、Trpl49Arg、Serl51Thr、Asnl52Thr、Leul56Pro、Lysl57Arg> Ilel60Thr> Asnl63Ser、Thrl65Met、Lysl73Arg> Ilel81Thr、Ser 182Leu>Thrl84Ser、Asnl95Thr、Thrl99Ala、Asn206Thr、Leu207Pro、Glu213Val、Leu217Gln、Leu218Ile、Tyr230Phe> Met231Lys> Ser233Gly> Lys234Glu> Asn240Asp、Gln246Lys>Thr249Ala、Leu270Val、Leu283His、Leu285Gln 和 Val289Asp 的取代的 62 重取代體(包含SEQ ID NO 176所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì))。作為具有編碼本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)的核苷酸序列的多核苷酸(以下也簡稱為本實(shí)施方式的多核苷酸)的制作方法，可以列舉出例如以下所示的(I)或(II)的方法。(I)從本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成核苷酸序列，人工合成包含該核苷酸序列的多核苷酸的方法。(II)直接人工制備、或者從人Fe Y RI的cDNA等出發(fā)通過PCR法等DNA擴(kuò)增方法制備包含人Fe y RI的全體或部分序列的多核苷酸，并采用適當(dāng)方法將制備的該多核苷酸連接的方法。而且，從氨基酸序列到核苷酸序列的轉(zhuǎn)換優(yōu)選在考慮轉(zhuǎn)化的宿主中的密碼子的使用頻率的基礎(chǔ)上進(jìn)行。作為一例，在宿主為大腸桿菌(Escherichiacoli)的情況下,精氨酸(Arg)的 AGA/AGG/CGG/CGA、異亮氨酸(Ile)的 ΑΤΑ、亮氨酸(Leu)的 CTA、甘氨酸(Gly)的GGA、脯氨酸(Pro)的CCC各自的使用頻率低(所謂的稀有密碼子)，因此轉(zhuǎn)換時(shí)避免這些密碼子即可。密碼子的使用頻率的解析也可以利用公共數(shù)據(jù)庫(例如，KAZUSA DNA研究所的主頁上的密碼子用法數(shù)據(jù)庫等)。在采用所述(II)的方法在本實(shí)施方式的多核苷酸中導(dǎo)入突變的情況下，作為DNA擴(kuò)增方法，也可以采用所謂的易錯(cuò)PCR法。對易錯(cuò)PCR法中的反應(yīng)條件沒有特殊限制，只要是能夠在編碼人Fe Y RI的多核苷酸中導(dǎo)入希望的突變的條件即可。例如，通過使作為底物的4種脫氧核苷酸(dATP/dTTP/dCTP/dGTP)的濃度不均一，并在PCR反應(yīng)液中添加O. 01至IOmM濃度(優(yōu)選O.1至ImM)的MnC12來進(jìn)行PCR，能夠在多核苷酸中導(dǎo)入突變。而且，作為在本實(shí)施方式的多核苷酸中導(dǎo)入突變的方法，還可以列舉出以下所示的(III)的方法。(III)使包含人Fe Y RI的全體或部分序列的多核苷酸與作為突變原的藥物接觸、作用，或者對其照射紫外線，在多核苷酸中導(dǎo)入突變來進(jìn)行制作的方法。作為突變原的該藥物，可以使用羥胺、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍、亞硝酸、亞硫酸、肼等本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的突變原藥物。而且，在采用所述(I)、(II)或(III)的方法制作的本實(shí)施方式的多核苷酸的5’末端側(cè)，可以添加編碼信號肽的多核苷酸。在宿主為大腸桿菌的情況下，作為所述信號肽，可以列舉出pelB、DsbA、MalE(SEQ ID NO :182)、TorT等使得蛋白質(zhì)向周質(zhì)中分泌的信號肽(日本特愿2009-256180號)。在使用本實(shí)施方式的多核苷酸轉(zhuǎn)化宿主的情況下，可以使用本實(shí)施方式的多核苷酸本身，而使用在合適位置插入了本實(shí)施方式的多核苷酸的表達(dá)載體(例如原核細(xì)胞、真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化中通常使用的噬菌體、粘粒、質(zhì)粒等)則更為優(yōu)選。而且，對該表達(dá)載體沒有特殊限制，能夠在轉(zhuǎn)化 的宿主內(nèi)穩(wěn)定存在并復(fù)制即可。在以大腸桿菌作為宿主的情況下，可以示例出pET質(zhì)粒載體、pUC質(zhì)粒載體、pTrc質(zhì)粒載體、pCDF質(zhì)粒載體、pBBR質(zhì)粒載體等。此外，所述合適的位置，是指不破壞涉及表達(dá)載體的復(fù)制功能、希望的抗生物質(zhì)標(biāo)記和傳導(dǎo)性的區(qū)域的位置。在所述表達(dá)載體中插入本實(shí)施方式的多核苷酸時(shí)，優(yōu)選以與表達(dá)所必要的啟動子等功能性多核苷酸連接的狀態(tài)插入表達(dá)載體。作為該啟動子的例子，在宿主為大腸桿菌的情況下，可以示例出trp啟動子、tac啟動子、trc啟動子、Iac啟動子、T7啟動子、recA啟動子、Ipp啟動子、以及λ噬菌體的λ PL啟動子、λ PR啟動子等。為了用插入了采用所述方法制作的本實(shí)施方式的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的方法進(jìn)行。例如，在作為宿主選擇屬于埃希氏菌屬的微生物(大腸桿菌JM109株、BL21(DE3)株等)的情況下，可以采用非專利文獻(xiàn)6所述的方法等進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通過采用合適的方法從采用這樣的方法轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化體中進(jìn)行篩選，可以獲得表達(dá)對熱、酸、堿的穩(wěn)定性提高的本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體。為了從該轉(zhuǎn)化體制備插入了本實(shí)施方式的多核苷酸的表達(dá)載體，可以使用堿抽提法、QIAprep SpinMiniprep kit (QIAGEN公司制造)等市售的抽提試劑盒來制備。為了篩選表達(dá)本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體，可以通過例如測定抗體對表達(dá)的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)的結(jié)合活性來進(jìn)行?？贵w的結(jié)合活性可以采用ELISA法、表面等離子體共振法等測定例如對IgG的結(jié)合活性。結(jié)合活性的測定中使用的IgG優(yōu)選人IgG，特別優(yōu)選人IgGl。
作為本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)，可以通過對用含本實(shí)施方式的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到的宿主(轉(zhuǎn)化體)進(jìn)行培養(yǎng)來制造。該Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)的制造方法具體包括培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體、從其培養(yǎng)物回收本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)。而且，本說明書中，培養(yǎng)物所指的概念除了經(jīng)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞自身，還包括培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基等?；厥湛梢酝ㄟ^例如從培養(yǎng)物抽提Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)來進(jìn)行。本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)的制造方法中使用的轉(zhuǎn)化體可以使用適合于對象宿主的培養(yǎng)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在宿主是大腸桿菌的情況下，作為優(yōu)選的培養(yǎng)基的一例，可以列舉出補(bǔ)加了必要營養(yǎng)源的LB (Luria-Bertani)培養(yǎng)基。而且,為了能夠根據(jù)有無導(dǎo)入含本實(shí)施方式的多核苷酸的表達(dá)載體來選擇性地進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的增殖，優(yōu)選在培養(yǎng)基中添加與該表達(dá)載體所含的藥物抗性基因?qū)?yīng)的藥物來進(jìn)行培養(yǎng)。例如，在該表達(dá)載體包含卡那霉素抗性基因的情況下，可以在培養(yǎng)基中添加卡那霉素。此外，培養(yǎng)基中除了碳、氮和無機(jī)鹽供給源之外，還可以添加適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)源，視需要還可以包含選自由谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、硫代乙醇酸鹽和二硫蘇糖醇組成的組中的一種以上的還原劑。而且，還可以添加甘氨酸等促進(jìn)從所述轉(zhuǎn)化體向培養(yǎng)液的蛋白質(zhì)分泌的試劑，具體地，在宿主是大腸桿菌的情況下，優(yōu)選相對于培養(yǎng)基添加2%(w/v)以下的甘氨酸。培養(yǎng)溫度可以根據(jù)表達(dá)的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)的特性來選擇，在宿主是大腸桿菌的情況下，一般為10°C至40°C、優(yōu)選25°C至35°C、更優(yōu)選30°C左右。培養(yǎng)基的pH在宿主是大腸桿菌的情況下，為pH6. 8至pH7. 4,優(yōu)選pH7. O左右。在含本實(shí)施方式的多核苷酸的表達(dá)載體包含誘導(dǎo)性啟動子的情況下，可以在能夠良好表達(dá)含本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)的多肽的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)。作為誘導(dǎo)劑，可以示例出IPTG (異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)。在宿主是大腸桿菌的情況下，通過測定培養(yǎng)液的濁度(600nm 的吸光度)，當(dāng)其變成約O. 5至1. O時(shí)添加適當(dāng)量的IPTG，然后繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)的表達(dá)。IPTG的添加濃度可以在O. 005至1. OmM的范圍適宜選擇，優(yōu)選O. 01至O. 5mM的范圍。IPTG誘導(dǎo)相關(guān)的各種條件可以采用該技術(shù)領(lǐng)域中公知的條件進(jìn)行。為了從本實(shí)施方式的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)液抽提Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)，可以根據(jù)表達(dá)的形式適宜選擇抽提方法。在表達(dá)于培養(yǎng)上清的情況下，可以通過離心分離操作分離菌體，并從所得培養(yǎng)上清抽提Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)。另一方面，在表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)(對于原核生物還包括周質(zhì))的情況下，可以通過在離心分離操作收集菌體后，添加酶處理劑、表面活性劑等破碎菌體，來抽提Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)。為了從抽提出的蛋白質(zhì)中分離純化Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)，可以使用該技術(shù)領(lǐng)域中公知的方法。作為一例，可以列舉出使用液相色譜的分離純化。作為液相色譜，可以列舉出離子交換色譜、疏水性相互作用色譜、凝膠過濾色譜、親和色譜等。通過組合這些色譜進(jìn)行純化操作，能夠高純度地制備本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)。本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)可以用作例如用于分離純化包含F(xiàn)e結(jié)合性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)的親和色譜用配體。為了將本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)適用于所述色譜，可以以例如將本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)固定化于固相而成的、吸附包含F(xiàn)e結(jié)合性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)的吸附材料(以下也簡稱為本實(shí)施方式的吸附材料)的方式使用。作為用于固定化本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)的固相，可以示例出包含親水性乙烯基聚合物、二氧化硅、玻璃、Sepharose (注冊商標(biāo))、瓊脂糖、纖維素、羥基磷灰石、聚苯乙烯的物質(zhì)等。而且，使固相的形態(tài)為空孔得到控制的形態(tài)、或膜的形態(tài)，則從分離能力變好的角度是優(yōu)選的。為了將本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)固定化于固相，可以例如在固相表面導(dǎo)入環(huán)氧基、甲?；?、氨基、羧基等活性基團(tuán)后，使本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)表面存在的氨基酸殘基與導(dǎo)入該固相表面的活性基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。作為使用本實(shí)施方式的吸附材料分離純化的、包含F(xiàn)e結(jié)合性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)(以下也稱為目的蛋白質(zhì))的一例，可以列舉出包含IgG的恒定區(qū)域的蛋白質(zhì)。作為其具體例，可以列舉出IgG、IgG的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)與其他蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。而且，這里所說的IgG的恒定區(qū)域可以包含用例如木瓜蛋白酶等蛋白酶處理而從IgG產(chǎn)生的鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。作為使用本實(shí)施方式的吸附材料分離純化的目的蛋白質(zhì)的例子，可以列舉出 人IgG、人源化IgG、小鼠IgG、大鼠IgG、兔IgG、駱駝IgG等，特別優(yōu)選人IgG或人源化IgG。使用本實(shí)施方式的吸附材料分離純化的人IgG可以列舉出人IgGl、人IgG2、人IgG3和人IgG4。作為使用本實(shí)施方式的吸附材料分離純化的目的蛋白質(zhì)的其他例子，可以列舉出單克隆IgG抗體、多克隆IgG抗體、IgG片段等。使用本實(shí)施方式的吸附材料的、抗體等目的蛋白質(zhì)的分離純化方法具備例如以下所示的⑴和⑵的步驟。(I)在將本實(shí)施方式的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)固定化于固相而得到的包含F(xiàn)e結(jié)合性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)吸附材料中添加含目的蛋白質(zhì)的溶液，使該目的蛋白質(zhì)吸附于該吸附材料的步驟。(2)使用合適的洗脫液洗脫吸附于吸附材料的目的蛋白質(zhì)的步驟。使用本實(shí)施方式的吸附材料分離純化的抗體等目的蛋白質(zhì)可以例如通過采用基因重組技術(shù)，在CHO細(xì)胞(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)等動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、大腸桿菌、芽孢桿菌屬細(xì)菌等細(xì)菌、面包酵母、粟酒裂殖酵母等酵母、或米曲霉等絲狀真菌等中表達(dá)來進(jìn)行生產(chǎn)。而且，在希望將目的蛋白質(zhì)以其表面必要存在糖鏈的形態(tài)進(jìn)行生產(chǎn)的情況下，可以選擇作為真核細(xì)胞的動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母或絲狀真菌，更優(yōu)選使用CHO細(xì)胞。作為包含使用本實(shí)施方式的吸附材料分離純化的目的蛋白質(zhì)的溶液的一例，可以列舉出可表達(dá)目的蛋白質(zhì)的宿主(動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、絲狀真菌等)的培養(yǎng)液、可表達(dá)目的蛋白質(zhì)的植物的破碎液、牛等動物的乳。而且，上述例子中，對于培養(yǎng)液，可以包含可表達(dá)目的蛋白質(zhì)的宿主，也可以通過合適的前處理除去該宿主。這里所說的合適的前處理，可以示例出離心分離操作、精密過濾膜、超濾膜，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法。作為在本實(shí)施方式的吸附材料上吸附目的蛋白質(zhì)的步驟的一例，可以列舉出在使用了本實(shí)施方式的吸附材料的分離純化用柱上，使用合適的送液系統(tǒng)，直接或以PH調(diào)整后的狀態(tài)添加含目的蛋白質(zhì)的溶液，吸附目的蛋白質(zhì)的步驟。該分離純化用柱可以通過例如在合適容量的空柱中充填本實(shí)施方式的吸附劑來制作。此外，送液系統(tǒng)可以使用例如液相色譜中使用的高壓泵、蠕動泵。在對含目的蛋白質(zhì)的溶液進(jìn)行PH調(diào)整的情況下，對調(diào)整的PH沒有特殊限制，只要是目的蛋白質(zhì)不變性的條件即可，可以是中性、酸性、堿性。但是，在通常的目的蛋白質(zhì)的情況下，優(yōu)選將PH調(diào)整至3至10的范圍，特別優(yōu)選調(diào)整至pH4至pH8的范圍。在對本實(shí)施方式的吸附材料上吸附的目的蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫時(shí)，可以在所述吸附步驟后立即進(jìn)行目的蛋白質(zhì)的洗脫，優(yōu)選經(jīng)過在洗脫步驟前用合適的洗滌液除去雜蛋白質(zhì)的洗滌步驟后再進(jìn)行洗脫。作為該洗滌液，可以是調(diào)整至目的蛋白質(zhì)不發(fā)生洗脫的條件的PH的緩沖液。作為用作洗滌液的緩沖液的構(gòu)成要素的一例，可以列舉出乙酸、檸檬酸、組氨酸、磷酸、硼酸、銨鹽(例如乙酸銨、琥珀酸銨)、MES(2-嗎啉乙磺酸一水合物)、MOPS(3-嗎啉丙磺酸)、HEPES(2-[4-(2-羥乙基)-1_哌啶基]乙磺酸)、Tris(三(羥甲基)氨基甲烷)和它們的組合。用作洗滌液的緩沖液的PH因目的蛋白質(zhì)而異，一般優(yōu)選pH為3至10的范圍，特別優(yōu)選PH4至pH8的范圍。而且，用作洗滌液的緩沖液中視需要可以存在添加劑，可以列舉出例如用于調(diào)整緩沖液離子強(qiáng)度的氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀等鹽、甘氨酸、組氨酸、精氨酸等氨基酸、尿素等離液劑、乙醇、甘露醇、甘油、芐醇等醇、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、果糖等糖等。在洗脫本實(shí)施方式的吸附材料上吸附的目的蛋白質(zhì)的步驟中，使用合適的洗脫液使目的蛋白質(zhì)從該吸附材料解離，回收到合適的容器中。作為該洗脫液，只要是是調(diào)整至目的蛋白質(zhì)洗脫并且目的蛋白質(zhì)不變性的條件的PH的緩沖液即可。用作洗脫液的緩沖液的pH因目的蛋白質(zhì)而異，一般優(yōu)選pH為2至11的范圍，特別優(yōu)選pH為2. 5至pH6的范圍。而且，在本實(shí)施方式的吸附材料為將由SEQ ID NO :114、118、130、134、148、154、164、170、174和176中的任一個(gè)所示的氨基酸序列組成的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)固定化于固相而得到的吸附材料的情況下，用作洗脫液的緩沖液的pH為3. (Γ4. 5的范圍。此外，用作洗脫液的緩沖液中視需要可以存在添加劑，可以列舉出例如用于穩(wěn)定化目的蛋白質(zhì)的表面活性劑、鹽、糖等。通過將使用本實(shí)施方式的吸附材料分離純化出的目的蛋白質(zhì)提供給柱色譜，還可以純化至更高純度。作為可使用的色譜，可以示例出離子交換色譜、疏水性相互作用色譜、凝膠過濾色譜、羥基磷灰石色譜等。 實(shí)施例以下列舉出實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限定。實(shí)施例1編碼人Fe受體Fe Y RI的多核苷酸的克隆(I)以SEQ ID NO 1所述的人Fe受體Fe Y RI的氨基酸序列為基礎(chǔ)，對于細(xì)胞外區(qū)域、跨細(xì)胞膜區(qū)域和細(xì)胞內(nèi)區(qū)域(第16位至第374位的區(qū)域)，使用大腸桿菌型的密碼子進(jìn)行了向核苷酸序列的轉(zhuǎn)換。(2)以所述核苷酸序列為基礎(chǔ)，合成了用于制作編碼人Fe Y RI的多核苷酸的52種寡核苷酸。合成的寡核苷酸如SEQ ID NO 10至61所示。(3)為了從⑵合成的寡核苷酸制作編碼人Fe Y RI的多核苷酸的全長，進(jìn)行了下述所示的2階段PCR。(3-1)第I階段的PCR反應(yīng)如下進(jìn)行使用表I所示的反應(yīng)液，94°C、5分鐘熱處理后，以第I步94°C 30秒、第2步62°C 30秒、第3步72°C I分鐘作為I個(gè)循環(huán)，將反應(yīng)進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后72°C進(jìn)行7分鐘熱處理。[表 I]
權(quán)利要求
1. 一種Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)，其包含SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中的第16位至第289 位的氨基酸序列，且該第16位至第289位的氨基酸序列中發(fā)生了以下(1Γ(168)中的至少 I個(gè)氨基酸取代1)SEQID NO 1的第20位的蘇氨酸被取代成脯氨酸2)SEQ ID NO 1的第25位的蘇氨酸被取代成賴氨酸3)SEQ ID NO 1的第38位的蘇氨酸被取代成丙氨酸或絲氨酸4)SEQ ID NO 1的第46位的亮氨酸被取代成精氨酸或脯氨酸5)SEQ ID NO 1的第62位的丙氨酸被取代成纈氨酸6)SEQ ID NO 1的第63位的蘇氨酸被取代成異亮氨酸7)SEQ ID NO 1的第69位的絲氨酸被取代成苯丙氨酸或蘇氨酸8)SEQ ID NO 1的第71位的精氨酸被取代成組氨酸9)SEQ ID NO 1的第77位的纈氨酸被取代成丙氨酸或谷氨酸(10SEQIDNO 的第78位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸(11SEQIDNO 的第94位的天冬氨酸被取代成谷氨酸(12SEQIDNO 的第100位的異亮氨酸被取代成纈氨酸(13SEQIDNO 的第110位的絲氨酸被取代成天冬酰胺(14SEQIDNO 的第114位的苯丙氨酸被取代成亮氨酸(15SEQIDNO 的第125位的組氨酸被取代成精氨酸(16SEQIDNO 的第131位的亮氨酸被取代成精氨酸或脯氨酸(17SEQIDNO 的第149位的色氨酸被取代成亮氨酸(18SEQIDNO 的第156位的亮氨酸被取代成脯氨酸(19SEQIDNO 的第160位的異亮氨酸被取代成甲硫氨酸(20SEQIDNO 的第163位的天冬酰胺被取代成絲氨酸(21SEQIDNO 的第195位的天冬酰胺被取代成蘇氨酸(22SEQIDNO 的第199位的蘇氨酸被取代成絲氨酸(23SEQIDNO 的第206位的天冬酰胺被取代成賴氨酸、絲氨酸或蘇氨酸(24SEQIDNO 的第207位的亮氨酸被取代成脯氨酸(25SEQIDNO 的第218位的亮氨酸被取代成纈氨酸(26SEQIDNO 的第240位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸(27SEQIDNO 的第248位的亮氨酸被取代成絲氨酸(28SEQIDNO 的第283位的亮氨酸被取代成組氨酸(29SEQIDNO 的第285位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺(30SEQIDNO 的第17位的纈氨酸被取代成甘氨酸或谷氨酸(31SEQIDNO 的第19位的蘇氨酸為異亮氨酸(32SEQIDNO 的第20位的蘇氨酸為異亮氨酸(33SEQIDNO 的第25位的蘇氨酸為甲硫氨酸或精氨酸(34SEQIDNO 的第27位的谷氨酰胺被取代成脯氨酸或賴氨酸(35SEQIDNO 的第35位的谷氨酰胺被取代成亮氨酸、甲硫氨酸或精氨酸(36SEQIDNO 的第36位的谷氨酸被取代成甘氨酸(37SEQIDNO1的第41位的亮氨酸被取代成甲硫氨酸(38SEQID NO :1的第42位的組氨酸被取代成亮氨酸(39SEQIDNO1的第44位的谷氨酸被取代成天冬氨酸(40SEQID NO 1的第45位的纈氨酸被取代成丙氨酸(41SEQIDNO1的第46位的亮氨酸被取代成丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、絲氨酸或色氨酸(42SEQIDNO1的第47位的組氨酸被取代成谷氨酰胺、亮氨酸或天冬酰胺(43SEQIDNO1的第49位的脯氨酸被取代成絲氨酸或丙氨酸(44SEQIDNO1的第50位的甘氨酸被取代成精氨酸或谷氨酸(45SEQIDNO1的第51位的絲氨酸被取代成丙氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、脯氨酸或纈氨me (46SEQIDNO1的第52位的絲氨酸被取代成甘氨酸(47SEQIDNO1的第53位的絲氨酸被取代成亮氨酸、蘇氨酸或脯氨酸(48SEQIDNO1的第55位的谷氨酰胺被取代成精氨酸(49SEQIDNO1的第57位的苯丙氨酸被取代成酪氨酸(50SEQIDNO1的第58位的亮氨酸被取代成精氨酸(51SEQIDNO1的第60位的甘氨酸被取代成天冬氨酸(52SEQIDNO1的第61位的蘇氨酸被取代成丙氨酸或絲氨酸(53SEQIDNO1的第62位的丙氨酸被取代成谷氨酸(54SEQIDNO1的第63位的蘇氨酸被取代成亮氨酸、苯丙氨酸(55SEQIDNO1的第64位的谷氨酰胺被取代成脯氨酸、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸(56SEQIDNO1的第65位的蘇氨酸被取代成丙氨酸或纈氨酸(57SEQIDNO1的第66位的絲氨酸被取代成蘇氨酸(58SEQIDNO1的第67位的蘇氨酸被取代成丙氨酸或絲氨酸(59SEQIDNO1的第69位的絲氨酸被取代成丙氨酸(60SEQIDNO1的第70位的酪氨酸被取代成組氨酸或苯丙氨酸(61SEQIDNO:1的第71位的精氨酸被取代成酪氨酸(62SEQIDNO1的第73位的蘇氨酸被取代成丙氨酸或絲氨酸(63SEQIDNO1的第74位的絲氨酸被取代成苯丙氨酸(64SEQIDNO1的第76位的絲氨酸被取代成天冬酰胺(65SEQIDNO1的第77位的纈氨酸被取代成天冬氨酸或賴氨酸(66SEQIDNO1的第78位的天冬酰胺被取代成絲氨酸或甘氨酸 (67SEQIDNO1的第80位的絲氨酸被取代成丙氨酸(68SEQIDNO1的第84位的精氨酸被取代成絲氨酸(69SEQIDNO1的第88位的甘氨酸被取代成絲氨酸(70SEQIDNO1的第89位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺或脯氨酸(71SEQIDNO1的第90位的絲氨酸被取代成甘氨酸(72SEQIDNO1的第92位的精氨酸被取代成半胱氨酸或亮氨酸(73SEQIDNO1的第96位的異亮氨酸被取代成纈氨酸或賴氨酸(74) SEQIDNOI的第(75) SEQIDNOI的第(76)SEQIDNOI的第(77) SEQIDNOI的第(78)SEQIDNOI的第(79)SEQIDNO1的第酸、蘇氨酸或纈氨酸(80) SEQIDNOI的第(81) SEQIDNOI的第(82) SEQIDNOI的第(83) SEQIDNOI的第(84) SEQIDNOI的第(85) SEQIDNOI的第(86) SEQIDNOI的第(87) SEQIDNOI的第(88) SEQIDNOI的第(89) SEQIDNOI的第(90) SEQIDNOI的第(91) SEQIDNOI的第(92) SEQIDNOI的第(93) SEQIDNOI的第(94) SEQIDNOI的第(95) SEQIDNOI的第(96) SEQIDNOI的第(97) SEQIDNOI的第(98) SEQIDNOI的第(99) SEQIDNOI的第100)SEQIDNOI的第154101)SEQIDNOI的第156102)SEQIDNOI的第157103)SEQIDNOI的第159104)SEQIDNOI的第160105)SEQIDNOI的第161106)SEQIDNOI的第165107)SEQIDNOI的第171108)SEQIDNOI的第173109)SEQIDNOI的第174110)SEQIDNOI的第177IlDSEQIDNOI的第181137位的酪氨酸被取代成苯丙氨酸138位的酪氨酸被取代成組氨酸139位的精氨酸被取代成組氨酸140位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸141位的甘氨酸被取代成天冬氨酸或纈氨酸142位的賴氨酸被取代成谷氨酸或精氨酸144位的苯丙氨酸被取代成異亮氨酸147位的苯丙氨酸被取代成絲氨酸148位的組氨酸被取代成精氨酸或谷氨酰胺149位的色氨酸被取代成精氨酸151位的絲氨酸被取代成蘇氨酸152位的天冬酰胺被取代成蘇氨酸、異亮氨酸或脯氨酸`154位的蘇氨酸被取代成絲氨酸位的亮氨酸被取代成組氨酸位的賴氨酸被取代成精氨酸位的天冬酰胺被取代成蘇氨酸或天冬氨酸位的異亮氨酸被取代成蘇氨酸、纈氨酸或亮氨酸位的絲氨酸被取代成蘇氨酸位的蘇氨酸被取代成甲硫氨酸位的甲硫氨酸被取代成蘇氨酸位的賴氨酸被取代成精氨酸位的組氨酸被取代成谷氨酰胺位的蘇氨酸被取代成絲氨酸位的異亮氨酸被取代成蘇氨酸(112SEQIDNOI的第182位的絲氨酸被取代成蘇氨酸、亮氨酸、纈氨酸或谷氨酸(113SEQIDNOI的第184位的蘇氨酸被取代成絲氨酸(114SEQIDNOI的第190位的脯氨酸被取代成絲氨酸(115SEQIDNOI的第193位的纈氨酸被取代成亮氨酸(116SEQIDNOI的第195位的天冬酰胺被取代成丙氨酸(117SEQIDNOI的第196位的丙氨酸被取代成絲氨酸(118SEQIDNOI的第198位的纈氨酸被取代成甘氨酸或甲硫氨酸(119SEQIDNOI的第199位的蘇氨酸被取代成丙氨酸(120SEQIDNOI的第200位的絲氨酸被取代成甘氨酸或精氨酸(121SEQIDNOI的第202位的亮氨酸被取代成甲硫氨酸(122 脯氨酸SEQIDNO1的第203位的亮氨酸被取代成組氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、精氨酸、(123SEQIDNOI的第204位的谷氨酸被取代成纈氨酸(124SEQIDNOI的第207位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺、組氨酸或精氨酸(125SEQIDNOI的第209位的蘇氨酸被取代成丙氨酸(126SEQIDNOI的第211位的絲氨酸被取代成精氨酸或甘氨酸(127SEQIDNOI的第213位的谷氨酸被取代成纈氨酸或異亮氨酸(128SEQIDNOI的第215位的賴氨酸被取代成精氨酸或谷氨酸(129SEQIDNOI的第217位的亮氨酸被取代成精氨酸或谷氨酰胺(130SEQIDNOI的第218位的亮氨酸被取代成異亮氨酸、甲硫氨酸或賴氨酸(131SEQIDNOI的第219位的谷氨酰胺被取代成脯氨酸或精氨酸(132SEQIDNOI的第223位的亮氨酸被取代成精氨酸、谷氨酰胺或甲硫氨酸(133SEQIDNOI的第224位的谷氨酰胺被取代成精氨酸(134SEQIDNOI的第225位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺(135SEQIDNOI的第227位的苯丙氨酸被取代成異亮氨酸(136SEQIDNOI的第230位的酪氨酸被取代成組氨酸或苯丙氨酸(137SEQIDNOI的第231位的甲硫氨酸被取代成賴氨酸或精氨酸(138SEQIDNOI的第233位的絲氨酸被取代成甘氨酸或天冬酰胺(139SEQIDNOI的第234位的賴氨酸被取代成谷氨酸(140SEQIDNOI的第240位的天冬酰胺被取代成甘氨酸(141SEQIDNOI的第244位的谷氨酸被取代成纈氨酸(142SEQIDNOI的第245位的酪氨酸被取代成組氨酸或谷氨酸(143SEQIDNOI的第246位的谷氨酰胺被取代成精氨酸或賴氨 酸(144SEQIDNOI的第248位的亮氨酸被取代成異亮氨酸(145SEQIDNOI的第249位的蘇氨酸被取代成丙氨酸或絲氨酸(146SEQIDNOI的第250位的丙氨酸被取代成纈氨酸(147SEQIDNOI的第251位的精氨酸被取代成絲氨酸(148SEQIDNOI的第252位的精氨酸被取代成組氨酸(149SEQIDNOI的第253位的谷氨酸被取代成甘氨酸(150)SEQ ID NO 1的第257位的亮氨酸被取代成精氨酸或谷氨酰胺(151)SEQ ID NO 1的第261位的谷氨酸被取代成纈氨酸或丙氨酸(152)SEQ ID NO 1的第262位的丙氨酸被取代成纈氨酸(153)SEQ ID NO 1的第263位的丙氨酸被取代成絲氨酸(154)SEQ ID NO 1的第264位的蘇氨酸被取代成絲氨酸(155)SEQ ID NO 1的第265位的谷氨酸被取代成丙氨酸或甘氨酸(156)SEQ ID NO 1的第268位的天冬酰胺被取代成絲氨酸、異亮氨酸或蘇氨酸(157)SEQ ID NO 1的第270位的亮氨酸被取代成組氨酸、精氨酸或纈氨酸(158)SEQ ID NO 1的第271位的賴氨酸被取代成精氨酸(159)SEQ ID NO 1的第272位的精氨酸被取代成谷氨酰胺(160)SEQ ID NO 1的第277位的谷氨酸被取代成纈氨酸(161)SEQ ID NO 1的第279位的谷氨酰胺被取代成精氨酸或組氨酸(162)SEQ ID NO 1的第282位的甘氨酸被取代成天冬氨酸(163)SEQ ID NO 1的第283位的亮氨酸被取代成脯氨酸(164)SEQ ID NO 1的第285位的亮氨酸被取代成精氨酸或組氨酸(165)SEQ ID NO 1的第286位的脯氨酸被取代成谷氨酰胺、精氨酸或谷氨酸(166)SEQ ID NO 1的第287位的蘇氨酸被取代成異亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸或纈氨酸(167)SEQ ID NO 1的第288位的脯氨酸被取代成丙氨酸、絲氨酸或蘇氨酸(168)SEQ ID NO :1的第289位的纈氨酸被取代成丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸或 異亮氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Fc結(jié)合性蛋白質(zhì)，其中，所述第16位至第289位的氨基酸序 列中至少發(fā)生了所述(4)、(14)、(41)和(79)中的任一個(gè)氨基酸取代。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Fc結(jié)合性蛋白質(zhì)，其包含SEQID NO :2、3、4、5、114、118、130、 134、148、154、164、170、174和176中的任一個(gè)所示的氨基酸序列中的第34位至第307位的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Fc結(jié)合性蛋白質(zhì)，其包含SEQID NO :2、3、4、5、114、118、130、 134、148、154、164、170、174和176中的任一個(gè)所示的氨基酸序列。
5.編碼權(quán)利要求r4中的任一項(xiàng)所述的Fc結(jié)合性蛋白質(zhì)的多核苷酸。
6.包含權(quán)利要求5所述的多核苷酸的表達(dá)載體。
7.用權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主而得到的轉(zhuǎn)化體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述宿主為大腸桿菌。
9.一種Fc結(jié)合性蛋白質(zhì)的制造方法，其包括通過培養(yǎng)權(quán)利要求7或8所述的轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)Fc結(jié)合性蛋白質(zhì)，并從其培養(yǎng)物回收生產(chǎn) 的Fc結(jié)合性蛋白質(zhì)。
10.包含F(xiàn)c結(jié)合性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)吸附材料，其通過將權(quán)利要求廣4中任一 項(xiàng)所述的Fc結(jié)合性蛋白質(zhì)固定化于固相而得到。
11.一種抗體純化方法,其包括(1)在包含F(xiàn)c結(jié)合性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)吸附材料中添加包含抗體的溶液，使 該抗體吸附在該吸附材料上的步驟，其中，所述蛋白質(zhì)吸附材料是將包含SEQ ID N0:114、`118、130、134、148、154、164、170、174和176中的任一個(gè)所示的氨基酸序列的Fe結(jié)合性蛋白質(zhì)固定化于固相而得到的；以及(2)使用ρΗ3. (Γ4. 5的緩沖液洗脫吸附于所述吸附材料的所述抗體的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供與野生型相比對熱、酸和/或堿的穩(wěn)定性提高的Fc結(jié)合性蛋白質(zhì)及其制造方法，此外，還提供將該蛋白質(zhì)用作親和色譜用配體，特異性地分離包含F(xiàn)c結(jié)合性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)的方法。解決方法通過將野生型人Fc受體的處于細(xì)胞外區(qū)域的1個(gè)以上的特定氨基酸殘基取代成其他氨基酸殘基，能夠得到與野生型人Fc受體相比、對熱、酸和/或堿的穩(wěn)定性提高的Fc結(jié)合性蛋白質(zhì)。本發(fā)明的Fc結(jié)合性蛋白質(zhì)通過例如固定化于固相，作為親和色譜用配體是有用的。此外，使用用包含編碼本發(fā)明的Fc結(jié)合性蛋白質(zhì)的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主，表達(dá)該蛋白質(zhì)，則與使用野生型人Fc受體的情況相比，蛋白質(zhì)的生產(chǎn)量提高。
文檔編號C12N15/09GK103038344SQ201180023599
公開日2013年4月10日 申請日期2011年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月10日
發(fā)明者畑山耕太, 朝岡義晴, 田中亨, 井出輝彥 申請人:公益財(cái)團(tuán)法人相模中央化學(xué)研究所, 東曹株式會社