專利名稱：自體抗原篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種自體抗原篩選的方法，是指利用正常人抗體去除非專一性的抗原，再利用病患抗體獲得專一性的自體抗原，并結(jié)合質(zhì)譜儀鑒定自體抗原的方法。
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)若功能不健全，便會(huì)產(chǎn)生免疫性疾病，我們身體許多疾病的根本原因?？勺肪坑诿庖呦到y(tǒng)的功能不健全。一般可分為三種情況第一種是抵抗力降低，身體的免疫細(xì)胞活力下降，或生產(chǎn)免疫細(xì)胞的數(shù)量不足以抵抗入侵的細(xì)菌、病毒或霉菌，因此易被感染流行病，傷風(fēng)、感冒、肺炎、腸炎甚至肝炎、愛(ài)滋病等，都屬于這一類；第二種的免疫不全是免疫系統(tǒng)反應(yīng)過(guò)度，這種情況起因于入侵的物質(zhì)并不是細(xì)菌而只是小花粉或是食物中大分子蛋白質(zhì)，免疫系統(tǒng)就釋出大量的抗體加以對(duì)抗，而攻勢(shì)就發(fā)生在我們的細(xì)胞中，如此引起一連串的反應(yīng)，也被稱為過(guò)敏癥，而這時(shí)候若果真有細(xì)菌，病毒，或霉菌這類真的病原來(lái)侵犯時(shí)，免疫系統(tǒng)已無(wú)余力抵抗了；第三種情況是免疫細(xì)胞攻擊自體的正常細(xì)胞，也就是自體免疫疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，紅斑性狼瘡或皰疹等等，這種免疫系統(tǒng)疾病起因于病患本身免疫辨識(shí)系統(tǒng)發(fā)生問(wèn)題，病患的免疫系統(tǒng)對(duì)于本身的某些物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生自體抗體(autoantibody)，進(jìn)而破壞身體組織造成病痛。
目前已知，并非是只有自體免疫疾病才有自體抗體的存在，越來(lái)越多的相關(guān)研究指出人類對(duì)癌癥所發(fā)生的免疫反應(yīng)，部分存在著腫瘤自體抗原(autoantigen)與人類自體抗體的情形，因此對(duì)于發(fā)現(xiàn)這些可以引起人體反應(yīng)的腫瘤自體抗原在癌癥檢測(cè)、診斷或建立預(yù)后上有一定的方向和應(yīng)用性，進(jìn)而應(yīng)用于疾病的免疫治療上。
利用西方點(diǎn)漬法(Western blotting)，以病患血清中的抗體和(癌)細(xì)胞株或病理組織萃取物反應(yīng)來(lái)找出和病患有反應(yīng)的物質(zhì)，是常用于尋找自體抗原的方法，但由于電泳技術(shù)對(duì)極酸或極堿、極大或極小、表現(xiàn)量極少以及細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的靈敏度與再現(xiàn)性均不佳，使其在特定蛋白質(zhì)分離純化與鑒定上有使用上的限制。在美國(guó)專利5723343中，利用后天副甲狀腺機(jī)能不足(AH)病患的血清(含有自體抗體)和新鮮的人類過(guò)多副甲狀腺細(xì)胞萃取物，利用免疫印跡法(immunoblotting)的方式篩選自體抗原，但因?yàn)槿狈εc正常人的對(duì)照，專一性低，且病患的組織檢體相當(dāng)有限，無(wú)法大量篩選而易有遺漏的自體抗原，發(fā)現(xiàn)自體抗原的機(jī)率較低。此外，此法直接由復(fù)雜的細(xì)胞萃取物中取下有反應(yīng)的蛋白，再送入質(zhì)譜儀分析，在自體抗原的鑒定方面因?yàn)闃悠返母邚?fù)雜度而造成困難，所以開(kāi)發(fā)一套有系統(tǒng)、有效率的自體抗原篩選方法，便成為重要的課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種利用病患體內(nèi)的自體抗體來(lái)篩選自體抗原的方法，其利用自體抗體制備層析管柱，透過(guò)自體抗體與自體抗原間的親和性，搭配疾病所對(duì)應(yīng)的(癌)細(xì)胞株或病理組織萃取物，達(dá)到建立篩選自體抗原的平臺(tái)系統(tǒng)。
本發(fā)明的目的在于提供一種自體抗原篩選方法，其利用正常人及病患的抗體去除非專一性的抗原，再利用該抗體獲得專一性的自體抗原。
本發(fā)明提供了一種自體抗原篩選方法，其包含以下步驟分別純化正常人及病患的抗體；將正常人及病患的抗體分別填充固定于不同管柱之中，制得正常人抗體管柱及病患抗體管柱；取一樣品；將樣品通入正常人抗體管柱；將通過(guò)正常人抗體管柱的樣品通入病患抗體管柱；將滯留于病患抗體管柱中的抗原由管柱中置換出來(lái)；鑒定病患抗體管柱純化所得的抗原。
本發(fā)明的上述方法先利用正常人的抗體管柱來(lái)去除非專一性抗原后，再通入病患的抗體管柱來(lái)得到和病患自體抗體具親和性的自體抗原，可使自體抗體辨識(shí)自體抗原的專一性得到提高，對(duì)后續(xù)的質(zhì)譜鑒定也提供了較佳的分析條件。
前述純化正常人及病患的抗體是利用可捕捉抗體的親和力管柱，由正常人及病患人群的血清樣品中分別純化，得到正常人及病患的抗體；所述可捕捉抗體的親和力管柱為蛋白質(zhì)G親和力管柱(Protein G affinity column)或蛋白質(zhì)A親和力管柱(Protein A affinity column)，優(yōu)選為蛋白質(zhì)G親和力管柱(Protein G affinity column)。
所述抗體選自下列群組免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)或免疫球蛋白M(IgM)。
所述病患血清樣品為單一病患的血清樣品或復(fù)數(shù)病患血清的混合樣品。
所述抗體填充固定于管柱之中是將由血清純化出來(lái)的抗體與管柱中的化學(xué)官能基形成化學(xué)鍵結(jié)固定于管柱中；該化學(xué)官能基包含羥琥珀酰亞胺基(N-hydroxysuccinimide-、NHS-)、溴化氰基(CNBr-)或環(huán)氧基(Epoxy-)。
所述樣品為(癌)細(xì)胞株或病理組織的萃取物。
樣品通入管柱前也可進(jìn)一步增加樣品前處理的步驟。
樣品通入正常人抗體管柱的目的，是藉由正常人抗體管柱捕捉移除樣品中非專一性的抗原；所述樣品通入病患抗體管柱的目的，是藉由病患抗體管柱辨識(shí)捕捉樣品中的自體抗原。
所述鑒定純化所得的抗原是指利用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行的抗原的蛋白質(zhì)定性或定量分析。
將來(lái)自(癌)細(xì)胞株或病理組織萃取物的樣品通入正常人抗體管柱時(shí)，可藉由正常人抗體的專一親和力將非專一性的抗原捕捉而滯留于管柱之中，通過(guò)管柱的樣品將不含非專一性抗原，這個(gè)程序其實(shí)可視為利用病患抗體管柱篩選檢體中自體抗原的樣品前處理，經(jīng)移除樣品中非專一性的抗原，樣品組成便剩下特有的抗原，此時(shí)再將樣品通入含病患抗體的管柱中，藉由病患所具有的自體抗體來(lái)進(jìn)一步篩選疾病相關(guān)的自體抗原。由于已先藉由正常人的血清抗體去除非專一性的抗原，所以利用病患的自體抗體篩選所得到的自體抗原會(huì)具有較高的專一性。
由病患抗體管柱中置換而出的自體抗原，利用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行鑒定，所述鑒定是將質(zhì)譜訊號(hào)透過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，以取得自體抗原的信息。
本發(fā)明藉由結(jié)合免疫親和性層析法、疾病對(duì)應(yīng)的細(xì)胞株，再搭配日趨成熟的蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定技術(shù)構(gòu)筑的自體抗原篩選方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有更快速的篩選效率，由于細(xì)胞株可源源不絕地提供，因此不會(huì)有遺漏的自體抗體，發(fā)現(xiàn)自體抗原的機(jī)會(huì)可顯著提高，而本發(fā)明先利用正常人的抗體管柱來(lái)去除非專一性抗原后，再通入病患的抗體管柱來(lái)得到和病患自體抗體具親和性的自體抗原，不僅可使自體抗體辨識(shí)自體抗原的專一性提高，對(duì)后續(xù)的質(zhì)譜鑒定也提供了較佳的分析條件，若使用復(fù)數(shù)病患血清混合的檢體，將具有加強(qiáng)自體抗原數(shù)量的效果(enriching high incidence ofautoantigen)，利用該方法發(fā)現(xiàn)的自體抗原，其與該疾病相關(guān)且共同存在于病患樣本中，這樣的自體抗原將更適合做為檢測(cè)的工具。


圖1本發(fā)明的自體抗原篩選方法的流程圖；圖2由血清純化自體抗體的流程圖；圖3制備含有自體抗體的管柱的流程圖；圖4本發(fā)明的由細(xì)胞萃取物中純化鑒定自體抗原的流程圖；圖5利用本發(fā)明自體抗原篩選方法進(jìn)行肝硬化細(xì)胞萃取物篩選的正常人抗體管柱及病患抗體管柱的層析圖。其中上圖為正常人抗體管柱層析圖，下圖為病患抗體管柱的層析圖。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于進(jìn)一步了解本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，并非用于限制本發(fā)明。
實(shí)施例1利用本發(fā)明的自體抗原篩選方法進(jìn)行肝癌自體抗原的篩選血清純化自體抗體由血清純化自體抗體的步驟如圖2所示，將血清用鍵結(jié)緩沖液(bindingbuffer20mM PBS，pH 7.0)以1∶10的比例稀釋后，以0.45μm孔徑的濾膜過(guò)濾，避免后續(xù)層析步驟造成管柱堵塞；接著以10倍管柱體積的鍵結(jié)緩沖液，在1ml/min的流速下清洗Protein G親和力管柱，之后將前述經(jīng)濾膜過(guò)濾的血清樣本以0.2ml/min的流速通入Protein G親和力管柱中，使抗體得以藉由與管柱的親和力滯留于管柱中；再取5-10倍管柱體積的鍵結(jié)緩沖液以1ml/min的流速清洗Protein G親和力管柱，移除血清樣品中不與管柱發(fā)生親和力鍵結(jié)的物質(zhì)，然后取2-5倍管柱體積的洗脫緩沖液(elutionbuffer0.1M Glycine-HCl，pH 2.7)以1ml/min的流速將抗體自管柱中洗脫出并收集，收集抗體的試管中需預(yù)先加入60-200μl的Tris-HCl溶液(1M，pH 9.0)，最后將樣品置換于耦合緩沖液(coupling buffer0.2M NaHCO3，0.5M NaCl，pH 8.3)中，即完成血清中自體抗體(IgG)的純化。
由于本發(fā)明需要填充有正常人IgG及病患IgG的管柱各一，故需取正常人及病患血清分別進(jìn)行前述純化步驟。
制備含有自體抗體的管柱制備含有自體抗體的管柱其步驟如圖3所示，取NHS-activated管柱一只，移除上端蓋子后滴一滴酸化溶液(acidification solution1mM HCl(需冰浴))以避免氣泡生成，接著將此管柱上端與注射器(syringe)或泵(pump)連接后移除下端扭轉(zhuǎn)處，再以2倍管柱體積的酸化溶液將管柱中的異丙醇清洗出來(lái)，重復(fù)此清洗步驟3次后，將含有自體抗體的樣品注入管柱中。前述的含有自體抗體的樣品由Protein-G親和力管柱純化血清得到的含有自體抗體的耦合緩沖液，經(jīng)配制后成為總體積約為1倍管柱體積，濃度為0.5-10mg/ml。將前述含有自體抗體的樣品通入管柱后則將管柱密封，在25℃中反應(yīng)15-30分鐘，或者在4℃中反應(yīng)4小時(shí)，使抗體得以與管柱產(chǎn)生化學(xué)鍵結(jié)固定于管柱之中。
自體抗體與管柱完成鍵結(jié)反應(yīng)后，先利用2倍管柱體積的封阻緩沖液(blocking buffer0.5M ethanolamine，0.5M NaCl，pH 8.3)洗脫管柱，重復(fù)此步驟3次，再利用2倍管柱體積的清洗緩沖液(washing buffer0.1Macetate，0.5M NaCl，pH 4)清洗管柱，同樣重復(fù)3次，接著再換回封阻緩沖液以2倍管柱體積洗脫管柱3次后，讓管柱反應(yīng)15-30分鐘，使管柱中未鍵結(jié)自體抗體的官能基被封阻而失去活性，待封阻反應(yīng)完成后以2倍管柱體積的清洗緩沖液清洗管柱，重復(fù)3次，接著以2倍管柱體積的封阻緩沖液洗脫管柱，重復(fù)3次，確保所有未鍵結(jié)自體抗體的官能基都能被封阻，再以2倍管柱體積的清洗緩沖液清洗管柱，重復(fù)3次后，最后以2-5倍管柱體積的一般中性pH緩沖液洗脫管柱后，完成含有自體抗體的管柱制備。由肝硬化細(xì)胞萃取物中純化鑒定自體抗原如圖4所示步驟，首先將移除培養(yǎng)基的肝硬化細(xì)胞(HepG2 C3A cells)2.68mg以冰浴的Tris saline溶液(50mM Tris pH 7.5，150mM NaCl，1.5mMPMSF，Phosphatase inhibitors)清洗兩次后，加入Triton Extraction溶液1ml(15Mm Tris pH 7.5，120mM NaCl，25mM KCl，2mM EGTA，0.1mMDTT，0.5％Triton X-100，10μg/ml leupeptin，0.5Mm PMSF，Phosphataseinhibitors)，置于4℃30分鐘，此時(shí)細(xì)胞開(kāi)始分解釋出蛋白質(zhì)，然后利用桌上型離心機(jī)于4℃以14,000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，移除固態(tài)不溶的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，收集上層液進(jìn)行后續(xù)的免疫親和層析。
經(jīng)收集得到的細(xì)胞萃取液與鍵結(jié)緩沖液(binding buffer)以1∶10的比例稀釋后，利用0.45μm孔徑的濾膜過(guò)濾，以避免后續(xù)通入管柱后造成管柱的阻塞，而在將樣品注入具有抗體(IgG)的管柱前，需先以10倍管柱體積的鍵結(jié)緩沖液，在1ml/min的流速下清洗正常人及病患的抗體管柱，之后將前述經(jīng)濾膜過(guò)濾的細(xì)胞萃取液以0.2ml/min的流速通入正常人抗體管柱中，再取5-10倍管柱體積的鍵結(jié)緩沖液以1ml/min的流速洗脫正常人抗體管柱，此時(shí)細(xì)胞萃取液中所含有的正常人抗體具辨識(shí)捕捉的抗原會(huì)滯留其中，此步驟的目的在于捕捉移除肝硬化細(xì)胞中非專一性的抗原(Non-specific antigen)，所以經(jīng)管柱層析后的細(xì)胞萃取液中將不含非專一性的抗原；將此細(xì)胞萃取液收集導(dǎo)入病患抗體管柱，取5-10倍管柱體積的鍵結(jié)緩沖液以1ml/min的流速洗脫病患抗體管柱，此時(shí)肝硬化細(xì)胞萃取液中所具有的自體抗原將被管柱中病患的自體抗體所捕捉而滯留于管柱之中，如圖5所示，細(xì)胞萃取液通過(guò)正常人抗體管柱時(shí)，一般正常人抗體可辨識(shí)捕捉的抗原將被滯留于管柱中，而將不含前述正常人抗體可辨識(shí)捕捉的抗原的細(xì)胞萃取液導(dǎo)入病患抗體管柱時(shí)，只有病患抗體管柱可辨識(shí)捕捉的抗原被滯留于管柱之中，這些滯留于病患抗體管柱中的抗原，藉由2-5倍管柱體積的洗脫緩沖液(elution buffer)以1ml/min的流速將自體抗原由病患抗體管柱中洗脫出并收集，接著使用胰蛋白酵素(Trypsin)進(jìn)行蛋白質(zhì)水解反應(yīng)，將被水解的自體抗原之勝肽以質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行分析，所得的圖譜可藉由數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)獲知蛋白質(zhì)的信息。
綜上所述，本發(fā)明利用病患體內(nèi)的自體抗體來(lái)篩選自體抗原的方法，其以自體抗體制備層析管柱，透過(guò)自體抗體與自體抗原間的親和性，搭配疾病所對(duì)應(yīng)的(癌)細(xì)胞株，達(dá)到建立篩選自體抗原的平臺(tái)系統(tǒng)，可應(yīng)用于各種疾病以篩選出和該疾病相關(guān)的具特異性自體抗原(specific-autoantigen)，所篩選出的具特異性自體抗原對(duì)于疾病的檢測(cè)、診斷及免疫疾病的治療上應(yīng)有很大的應(yīng)用空間。
權(quán)利要求
1.一種自體抗原篩選方法，其中包含以下步驟分別純化正常人及病患的抗體；將正常人及病患的抗體分別填充固定于不同管柱之中，以制得正常人抗體管柱及病患抗體管柱；取一樣品；將樣品通入正常人抗體管柱；將通過(guò)正常人抗體管柱的樣品通入病患抗體管柱；將滯留于病患抗體管柱中的抗原由管柱中置換出來(lái)；及鑒定病患抗體管柱純化所得的抗原。
2.如權(quán)利要求1所述的自體抗原篩選方法，其中所述純化正常人及病患的抗體為利用可捕捉抗體的親和力管柱，由正常人及病患的血清樣品中分別純化得到的正常人及病患的抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的自體抗原篩選方法，其中所述可捕捉抗體的親和力管柱為蛋白質(zhì)G親和力管柱或蛋白質(zhì)A親和力管柱。
4.如權(quán)利要求3所述的自體抗原篩選方法，其中所述可捕捉抗體的親和力管柱為蛋白質(zhì)G親和力管柱。
5.如權(quán)利要求2所述的自體抗原篩選方法，其中所述抗體選自下列群組免疫球蛋白A、免疫球蛋白G或免疫球蛋白M。
6.如權(quán)利要求2所述的自體抗原篩選方法，其中所述病患的血清樣品為單一病患的血清樣品。
7.如權(quán)利要求2所述的自體抗原篩選方法，其中所述病患的血清樣品為復(fù)數(shù)個(gè)病患血清的混合樣品。
8.如權(quán)利要求1所述的自體抗原篩選方法，其中所述抗體填充固定于管柱之中是指血清純化出來(lái)的抗體與管柱中的化學(xué)官能基形成化學(xué)鍵結(jié)固定于管柱中。
9.如權(quán)利要求8所述的自體抗原篩選方法，其中所述化學(xué)官能基包含羥琥珀酰亞胺基、溴化氰基或環(huán)氧基。
10.如權(quán)利要求1所述的自體抗原篩選方法，其中所述樣品為(癌)細(xì)胞株或病理組織的萃取物。
11.如權(quán)利要求10所述的自體抗原篩選方法，其中所述樣品通入管柱前可進(jìn)一步增加樣品前處理步驟。
12.如權(quán)利要求1所述的自體抗原篩選方法，其中所述鑒定純化所得的抗原是利用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)定性或定量分析。
13.如權(quán)利要求1所述的自體抗原篩選方法，其中所述將樣品通入正常人抗體管柱的目的，是藉由正常人抗體管柱捕捉移除非專一性的抗原。
14.如權(quán)利要求1所述的自體抗原篩選方法，其中所述將通過(guò)正常人抗體管柱的樣品通入病患抗體管柱的目的，是藉由病患抗體管柱辨識(shí)捕捉樣品中的自體抗原。
全文摘要
本發(fā)明提供了關(guān)于自體抗原篩選的方法，其先將疾病相關(guān)的(癌)細(xì)胞株或病理組織萃取物樣品注入填充有正常人抗體的管柱中去除樣品中非專一性的抗原，再將已去除非專一性抗原的樣品注入填充有病患抗體的管柱獲得專一性的自體抗原，并結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)鑒定自體抗原，以達(dá)到快速精確篩選疾病生物標(biāo)記分子的目的。
文檔編號(hào)G01N1/34GK1796995SQ20041010152
公開(kāi)日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2004年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月21日
發(fā)明者曾錙翎, 鄭平福 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人工業(yè)技術(shù)研究院