專利名稱：基于片上pcr的多通道表面等離子共振影像傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于表面等離子體共振原理的生物傳感器，特別是涉及利用生物PCR技術(shù)和等離子體共振原理相結(jié)合制作的傳感器，可以并行檢測多個生物學信號的。
背景技術(shù)：
21世紀是生物學發(fā)展的時代，特別是生物科學與計算機科學經(jīng)融合產(chǎn)生的生物信息學將得到蓬勃的發(fā)展。傳感技術(shù)是信息科學的主要技術(shù)之一，是信息獲取的手段。利用傳感技術(shù)獲取生物樣品的信息是生物檢測技術(shù)發(fā)展的重要內(nèi)容。
其中，光學方法由于其具有非破壞性和高靈敏度的特點被視為是最成熟和最好的生物傳感技術(shù)。自1902年，Wood在光學實驗中首次發(fā)現(xiàn)了表面等離子體共振(Surface PlasmonResonance，SPR)現(xiàn)象以來，SPR儀器和SPR生物傳感器的研究一直受到關(guān)注。表面等離子體振子共振(SPR)是存在于金屬邊緣的自由電子的等離子振蕩。這些振蕩受臨近金屬表面的材料的折射率影響。這種現(xiàn)象被用來檢測表面折射率的細微變化，是形成各種傳感器機制的基礎(chǔ)。形成SPR現(xiàn)象的必要條件之一是金屬和電介質(zhì)間的界面存在。當入射光以某一特定的角度入射時，其反射率會顯著減少，此入射角度即為SPR角。附著在金屬表面的物質(zhì)不同，其SPR角不同，而同一種物質(zhì)，附著在金屬表面的量不同，其SPR角也不相同。根據(jù)上述原理，SPR生物傳感器可以將已知的生物分子固定在幾十納米厚的金屬膜表面，當它與互補的目標生物分子結(jié)合時，由于表面結(jié)構(gòu)的改變將導致SPR角改變，并且根據(jù)SPR角的改變值，可以得知結(jié)合的目標生物分子的種類及濃度。
SPR可以用影像的方法來顯示，這最早由Yeatman在1987年提出。Bengt Ivarsson提出了另外的構(gòu)想應用多波長非同步的SPR影像儀。帶有生物傳感器的SPR最先于1983年使用，1987年應用于影像分析。隨著SPR影像分析的出現(xiàn)，新型、無標記、實時、用來提高單位時間內(nèi)檢測量的多點生化分析設(shè)備層出不窮。目前有三種測量SPR影像的方法。第一種是通過測量在SPR傾斜角一側(cè)以特定波長和共振角度的反射光強(即反射系數(shù)法)來實現(xiàn)；第二種固定入射角，檢測復色光的共振波長(波長探詢法)。第三種是偏振狀態(tài)及相位的檢測(相位探詢法)。
在近些年來，SPR傳感器因為可實時、無標記檢測，以及高靈敏及小型化的優(yōu)勢廣泛應用于疫苗研制、疾病診斷、藥物靶標與藥物開發(fā)、案件偵破、環(huán)境監(jiān)測、食品安全檢驗、興奮劑檢測等多個領(lǐng)域。特別是在生物傳感器中，使用SPR檢測抗體及其對抗原的反應是生物醫(yī)學診斷中主要關(guān)心的問題，其中與細菌或病毒有關(guān)的抗體的存在是重要的感染指示。SPR還可用于基因探測器，其中可以使用聯(lián)結(jié)成目標分析物中規(guī)定序列的脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
世界上已有一些基于SPR原理的生物傳感器產(chǎn)品，以瑞典的Biacore AB的Biacore系列生物傳感器為例，它的制備方法是將100nm厚的金膜固定在玻璃基質(zhì)上，將此玻璃片嵌在一個塑料平板夾里，用一種折射率與棱鏡匹配的聚合物將芯片耦合到玻璃棱鏡上。在芯片表面固定一層葡聚糖分子層，使它較容易與其它生物大分子偶聯(lián).它以發(fā)光二極管為光源，用線性陣列發(fā)光二極管作為檢測器，檢測不同入射角處的反射光強度.但這只完成了單點SPR的檢測，一次只能對一種物質(zhì)進行檢測，并且它沒有影像檢測的能力，這就嚴重限制了它在一次試驗中篩別多種DNA序列的能力，在一定程度限制了它的應用。而且這種設(shè)備體積較大，價格昂貴，這就限制了其在國內(nèi)的使用。因而開發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權(quán)、結(jié)構(gòu)緊湊，價格合理的SPR傳感器是國內(nèi)在此領(lǐng)域工程技術(shù)人員共同追求的目標。
經(jīng)文獻檢索，發(fā)現(xiàn)在專利號為US 5,313,264描述了一種由微導管和閥門構(gòu)成一個具有樣液操作處理模塊網(wǎng)絡的SPR傳感器，該網(wǎng)絡被用來在構(gòu)成探測層SPR導體表面移動適量的包含有探測物質(zhì)的液體，然后再移動到位于探測層上面目標液體。該SPR傳感器也是單色光源和光學系統(tǒng)組成。光學系統(tǒng)產(chǎn)生由光源提供光線而形成楔型匯聚光束并且引導光束照射到傳感器表面。楔型光束沿著一個空間固定的，相對窄條的傳感器表面在發(fā)生共振角的范圍內(nèi)照射到探測層。共振角的范圍由楔型光束的匯聚角度決定。反射光線在一個二維光電探測器上成像。光電探測器上提供的信號是探測層表面折射率變化的度量，而附著于探測層的物質(zhì)與通過樣液處理模塊流經(jīng)探測層表面的待測溶液相互作用結(jié)果產(chǎn)生了這種變化。
許多常規(guī)的用于形成探針層SPR方法和儀器都要求樣液從探測層流過并光學掃描傳感器表面，這些方法相對復雜，不夠經(jīng)濟并且耗費時間。該傳感器設(shè)計較為復雜，體積較大，不利于儀器的小型化。這就需要一種具有可選擇性SPR傳感器，能夠具有多層次的分析探針，同時在幾個通道探測層泵送樣液。
US 2003048452專利描述了一種基于傳感器表面光學分析采樣區(qū)域的二維影像SPR儀器。該儀器包含有一個的傳感器表面層，該層由能夠響應SPR傳導材料構(gòu)成，如一些帶有自由電荷的金屬金，銀，鋁等。一束由兩種或者兩種以上波長的電磁波從傳感器的二維表面區(qū)域前端或者后端照射，與此同時，這兩種或兩種以上波長的在傳感器表面的反射強度被檢測到，檢測裝置提供了二維或者多維的表面影像，表面每一點有效折射率以二維影像的方式顯示，二維影像構(gòu)成一幅彩色圖像。但是該SPR傳感器裝置采用固定入射光角度，以波長為變量的工作模式。這些裝置的靈敏度受分光計分辨率，溫度變化以及入射光波長的限制，要同時使用復色光才能夠在比較大的動態(tài)范圍內(nèi)獲得較高的靈敏度和精度。
核酸陣列技術(shù)在生命科學研究中的成功使用比傳統(tǒng)方法用來定量檢測復雜生物系統(tǒng)大大節(jié)省了時間，但是，由于定量檢測生物分子技術(shù)的成本高昂，并且?guī)в幸欢ǖ姆派湫院托枰M行熒光標定和探測，因而使得這種技術(shù)受到了限制。US 20030049639描述的是基于核酸微陣列大規(guī)模鑒別生物分子的共振SPR影像探測的方法。校對過的復色光在SPR角度范圍內(nèi)照射到經(jīng)過化學修飾金膜表面的核酸分子膜上，反射的光線經(jīng)過寬度為10nm的帶通慮波器(830nm)被CCD收集。通過CCD采集的信號能夠探測到金膜表面不同的核酸分子反射率。由于金膜表面不同的探針結(jié)合的靶分子不同因而可以迅速的檢測出DNA/RNA等生物分子。
CN 1421699描述了一種基于表面等離子體共振(SPR)原理、可以并行檢測多個生物學信號的生物傳感器。該生物傳感器依次由基質(zhì)，金屬膜，化學修飾層，交聯(lián)劑層和生物單分子層構(gòu)成，其特征在于在生物單分子層的不同位置結(jié)合了多種生物分子，可并行定量檢測生物樣品中特定目標分子的濃度。這種設(shè)計的缺點在于測量精度不夠。由于影響SPR傳感器測量精度的因素很多，其中樣液的成份、濃度、溫度以及樣液中非待測分子與敏感膜的作用是影響檢測精度的主要因素。除了待測分子與敏感膜上的探針分子相互作用可以改變敏感膜的介電常數(shù)，從而改變共振角或共振波長(特異性響應)外，樣液中其它成份及其濃度的變化、溫度變化會引起樣液介電常數(shù)的變化，而且樣液中非待測分子與敏感膜的相互作用會直接改變敏感膜介電常數(shù)；這些變化最終都將引起共振角或共振波長的變化(非特異性響應)。
如上所述，這些方法有三個主要缺陷響應時間低和角度分辨率有限，SPR傳感器測量精確度不夠高。另外，目前SPR傳感系統(tǒng)所能檢測到的生物分子材料表面最小覆蓋量為1×10-12g/mm2，這對于檢測低濃度、小分子量的樣品是不夠的，因此可以通過PCR擴增的方法提高樣品濃度，從而提高SPR檢測的分辯能力。
由此可見，將PCR技術(shù)與SPR技術(shù)結(jié)合起來可以大大提高SPR技術(shù)的檢測范圍和效果。同時要提高特異性響應的檢測精度，就必須從實際測得的響應中剔除非特異性響應。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用的方法是單色光入射，反應池采用MEMS工藝，集成制造了PCR反應池和SPR反應池，使DNA分子的擴增和檢測得以在一個芯片上完成；利用單色面陣CCD采集SPR影像，通過SPR影像分析，可以同時檢測各通道的共振角，實現(xiàn)了SPR響應曲線的實時、動態(tài)檢測，提高了檢測精度及速度，使用方便，符合SPR傳感器發(fā)展趨勢。該傳感系統(tǒng)的光路設(shè)計使得入射光可以在可能發(fā)生共振的角度范圍內(nèi)以不同角度同時照射各個通道，通過SPR影像可以同時檢測不同角度入射光線的反射光強。
由本發(fā)明的原理可知由于無需對反應物進行標記和純化，SPR技術(shù)特別適用于生物分子之間相互作用的研究。SPR傳感器的優(yōu)點是能夠無干擾地實時監(jiān)測物質(zhì)分子，特別是生物分子的相互作用。使用PCR的優(yōu)點在于靈敏度高(PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克量級的起始待測模板擴增到微克水平，在細菌學中最小檢出率為3個細菌)；簡便、快速；對標本的純度要求低(不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA粗制品及總RNA均可作為擴增模，可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等粗制的DNA擴增檢測)。
本發(fā)明的技術(shù)方案這種基于片上PCR的多通道表面等離子共振影像傳感器，包括共振SPR樣品池和PCR反應池，其特點是它將共振SPR樣品池和PCR反應池)結(jié)合在一起，構(gòu)成傳感器反應池；傳感器主體上部是由硅片構(gòu)成的長方體形傳感器反應池，下部是柱面棱鏡，兩者之間是玻璃基片，玻璃基片上是敏感膜，敏感膜上是硅片的傳感器反應池，在硅片反應池中設(shè)置共振SPR樣品池和PCR反應池，從硅片傳感器反應池上部設(shè)置樣液的樣品進口和樣品出口；在傳感器主體兩側(cè)是入射光路、出射光路和與出射光路末端連接的計算機平臺(19)；入射光路中由發(fā)光二極管發(fā)出的光經(jīng)過球面透鏡，在針孔處會聚，再經(jīng)過一個平凸透鏡轉(zhuǎn)換為平行光，平行光先后通過濾光片和偏振片，調(diào)整偏振片的位置產(chǎn)生P偏振光，最后利用一個柱面透鏡對平行光進行角向會聚，使其在柱面棱鏡的敏感膜處會聚成一條直線，射向柱面棱鏡底面；出射光路由一個會聚透鏡和面陣CCD組成，入射光在柱面棱鏡底面發(fā)生全反射后經(jīng)會聚透鏡成為平行光，由面陣CCD完成光信號的采集，再送入計算機進行處理。
這種基于片上PCR的多通道表面等離子共振影像傳感器的檢測方法，它包括10個步驟。
本發(fā)明率先提出了將PCR技術(shù)與SPR技術(shù)結(jié)合起來的檢測方式，解決了SPR技術(shù)對于低濃度的DNA分子難以測量的問題，同時也簡化了PCR擴增后相對煩雜的檢測過程，提高了檢測效率。
本發(fā)明克服了非特異性響應對于SPR傳感器測量精度的影響，提供一種多通道影像傳感器，以便能夠很好地克服非特異性響應，得到特異性響應，從而實現(xiàn)對待測生物分子及其相互作用的檢測，從總體上提高了傳感器的性能。
本發(fā)明采用角向會聚入射光，使得入射光可以在可能發(fā)生共振的角度范圍內(nèi)以不同角度同時照射各個通道，避免了機械調(diào)節(jié)可能帶來的誤差。
本發(fā)明使用了SPR影像檢測手段，可以同時檢測各通道的共振角，實現(xiàn)了SPR響應曲線的實時、動態(tài)檢測，提高了檢測精度及速度。
本發(fā)明還有另外一個方面是能夠?qū)PR儀器和基于SPR的傳感器小型化，提高了儀器的熱穩(wěn)定性和機械穩(wěn)定性，結(jié)構(gòu)緊湊。
本發(fā)明的相關(guān)原理也適用于復色光入射，檢測共振波長的方法。
本發(fā)明的有益效果有以下四個特點(a)可以一次完成多個樣品的檢測，在真正意義上，實時、動態(tài)檢測生物分子的相互作用所引起的特異性響應，這在藥物篩選中是十分必要的；(b)可以一次完成同一樣品的不同特征的檢測，這一點可以有效降低疾病檢測中存在假陽性的幾率；(c)在多通道中設(shè)置參考通道，可以消除非特異性響應的影響。(d)可以對低濃度的DNA分子進行測量，簡化了PCR擴增后相對煩雜的檢測過程。


圖1傳感器系統(tǒng)結(jié)構(gòu)2反應池俯視3反應池剖面4傳感芯片結(jié)構(gòu)5A、B、C通道的總響應曲線6C通道的特異性響應曲線圖其中1、樣品進口；2、樣品出口；3、硅片反應池；4、共振SPR樣品池；5、敏感膜；6、發(fā)光二極管；7、球面透鏡；8、針孔；9、平凸透鏡；10、濾光片；11、偏振片；12、柱面透鏡；13、柱面棱鏡；14、面陣CCD；15、入射光路；16、出射光路；17、會聚透鏡；18、玻璃基片；19、計算機；20、傳感器主體；21、PCR反應池；22、棱鏡放置槽；23、A通道；24、B通道；25、C通道；26、清洗通道進口；27、清洗通道出口具體實施方式
為了更好的理解本發(fā)明，現(xiàn)在結(jié)合附圖和實例來說明基于片上PCR多通道影像SPR傳感器的基本結(jié)構(gòu)和工作原理以及如何能夠克服非特異性響應，得到特異性響應，從而實現(xiàn)對待測生物分子及其相互作用的檢測。
這種基于片上PCR的多通道表面等離子共振影像傳感器，包括共振SPR樣品池和PCR反應池，其特點是它將共振SPR樣品池4和PCR反應池21結(jié)合在一起，構(gòu)成傳感器硅片反應池3；傳感器主體20上部是由硅片構(gòu)成的長方體形傳感器硅片反應池3，下部是柱面棱鏡13，兩者之間是玻璃基片18，玻璃基片上是敏感膜5，敏感膜上是硅片的傳感器硅片反應池3，在硅片反應池中設(shè)置共振SPR樣品池和PCR反應池，從硅片傳感器反應池上部設(shè)置樣液的樣品進口1和樣品出口2；在傳感器主體兩側(cè)是入射光路15、出射光路16、和與出射光路末端連接的計算機平臺19；入射光路中由發(fā)光二極管6發(fā)出的光經(jīng)過球面透鏡7，在針孔8處會聚，再經(jīng)過一個平凸透鏡9轉(zhuǎn)換為平行光，平行光先后通過濾光片10和偏振片11，調(diào)整偏振片的位置產(chǎn)生P偏振光，最后利用一個柱面透鏡12對平行光進行角向會聚，使其在柱面棱鏡13的敏感膜5處會聚成一條直線，射向柱面棱鏡底面；出射光路16由一個會聚透鏡17和面陣CCD14組成，入射光在柱面棱鏡底面發(fā)生全反射后經(jīng)會聚透鏡成為平行光，由面陣CCD完成光信號的采集，再送入計算機進行處理。
入射光路的光線入射角必須在40°-90°之間。
在針孔(8)處會聚的孔徑Ф＝0.1-0.3mm。
濾光片用來改善入射光的單色性，濾光片的峰值波長為632.8nm。
這種基于片上PCR的多通道表面等離子共振影像傳感器的檢測方法，它包括下述步驟1)先向A、B、C三個通道同時通入摩爾比為1∶9的生物素化硫醇衍生物和OH根硫醇稀釋液的混合物磷酸鹽PBS緩沖液，反應時間足夠長，16-30小時，在各通道表面生成緊密覆蓋的自組裝單分子膜SAM，再用磷酸鹽PBS緩沖液清洗；2)然后在各通道順序通入磷酸鹽PBS緩沖液、濃度足夠高的鏈酶抗生物素Streptavidin，反應5-20分鐘、磷酸鹽PBS緩沖液，同時實時檢測A、B通道的共振角；3)計算反應前后共振角的差值，計算出表面靈敏度；4)用緩沖液磷酸鹽PBS清洗三個通道，再將含有大鼠肝臟f蛋白基因探針的磷酸鹽PBS緩沖液通入C通道，完成探針分子的固定；5)通入磷酸鹽PBS緩沖液清洗C通道，再用純凈水對三個通道進行清洗，然后同時向三個通道中依次通入純凈水和乙二醇，計算各個通道在通入純凈水和乙二醇時的共振角的差值，計算出體靈敏度和KC；6)使用蠕動泵將反應物注入PCR擴增反應池，反應體積約為20μl，PCR擴增樣品為大鼠肝臟f蛋白基因，濃度為1.3μg/μl。反應緩沖液中含有上游、下游引物各20pmol、Taq酶1.25u及dNTP各0.2mmol；7)將反應物的溫度依次穩(wěn)定在95℃、55℃、72℃，并進行30個溫度循環(huán)，達到DNA擴增的目的；8)在向SPR樣品池通入待測樣液進行檢測前，應先通入PBS對SPR樣品池各通道進行清洗；9)使用蠕動泵將PCR反應池中的擴增產(chǎn)物注入SPR樣品池，并控制雜交溫度，實時檢測各通道共振角，結(jié)果如圖5所示；10)求得任意時刻t各通道的響應，以PBS的共振角為基準ΔθA(t)、ΔθB(t)、ΔθC(t)，根據(jù)求出的參數(shù)就可以求出C通道的特異性動態(tài)響應曲線。
濾光片用來改善入射光的單色性，濾光片的峰值波長為632.8。
利用微機電系統(tǒng)MEMS工藝制備硅片反應池，包括下述過程1.清洗選擇所需的單晶硅片(確定晶向、電阻率等)，用清洗液和大量冷、熱去離子水將表面清洗干凈。
2.氧化在單晶硅表面生長一層SiO2薄膜，保護和鈍化硅片表面，作為選擇性腐蝕的掩蔽層，氧化膜的好壞對后續(xù)工藝有很大影響。
3.涂膠在SiO2膜上涂一層光刻膠。
4.光刻光刻是圖形復印和化學腐蝕相結(jié)合的精密表面加工技術(shù)，將設(shè)計好的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)通過掩膜版，利用紫外光復制在光刻膠層。
5.顯影將光刻后的硅片放入顯影液中，使曝光后的光刻膠溶解，從而顯現(xiàn)出系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖形。
6.SiO2腐蝕使用氫氟酸(HF)腐蝕液，將無膠膜覆蓋的SiO2腐蝕掉，得到系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖形。腐蝕液的配比是氫氟酸(48％)∶氟化銨(pH值約為4～5)∶去離子水＝3毫升∶6克∶10毫升。氫氟酸腐蝕SiO2的機理是其與SiO2發(fā)生絡合反應，生成可溶于水的絡合物，
反應式為
總反應式為
7.去膠將腐蝕后硅片表面殘留的光刻膠去除干凈。
8.硅各向異性腐蝕根據(jù)硅的各向異性特性，利用堿性腐蝕液，將沒有SiO2膜保護的單晶硅腐蝕掉，形成V型槽或U型槽。
9.去除SiO2保護膜用氫氟酸腐蝕液去除殘余的SiO2保護層，得到刻蝕好系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的襯底硅片。
10.鍵合根據(jù)需要，將多個制作好微結(jié)構(gòu)的硅片利用鍵合工藝結(jié)合在一起，組成封閉的三維系統(tǒng)，完成所需的功能。
圖4是傳感芯片的結(jié)構(gòu)23、A通道，24、B通道，25、C通道。在玻璃基片上共有A、B、C三個通道。各通道首先同時生成一層厚度為50nm的均勻金膜，然后在B通道的金膜上制備厚度約為15nm的高折射率電介質(zhì)層(Ta2O5或TiO2等)。測試前，在C通道的金膜上生成一層含有探針分子的敏感膜。傳感芯片的基片與柱面棱鏡的材料相同，二者通過光學耦合液結(jié)合為一個完整的半柱面棱鏡。傳感芯片上各種膜的制備采用濺射、光刻工藝。入射光路產(chǎn)生的角向會聚單色P偏振光束正好在傳感芯片金膜表面會聚為一條與三個通道正交的直線。單色面陣CCD與計算機共同完成SPR影像的實時采集。SPR影像中不同象素行對應不同的入射角，其象素值為對應入射角光線的反射光強。進樣系統(tǒng)由PCR-SPR反應池和溫控系統(tǒng)(由半導體制冷片和溫控電路組成)及微量蠕動泵構(gòu)成。
體響應即是指待測樣液成份、濃度、溫度等體內(nèi)變化所引起的共振角的變化。A、B、C三個通道的響應可分別表示為ΔθA(t)＝bA(t)+sA(t)＝BAΔn(t)+SAΔNn(t)(1)ΔθB(t)＝bB(t)+sB(t)＝BBΔn(t)+SBΔNn(t)(2)ΔθC(t)＝bC(t)+sC(t)(3)＝BCΔn(t)+SC(KCΔNn(t)+ΔNSC(t))ΔθA(t)、ΔθB(t)、ΔθC(t)分別表示A、B、C通道的響應(即共振角度的改變)，bA(t)、bB(t)、bC(t)表示A、B、C通道中體內(nèi)折射率變化引起的響應，sA(t)、sB(t)、sC(t)表示A、B、C通道中的表面折射率變化而引起的響應。BA、SA、BB、SB、BC、SC分別表示A、B、C通道的體靈敏度和表面靈敏度。Δn(t)、ΔNn(t)、ΔNSC(t)表示體內(nèi)折射率的變化、非特異性作用所引起的表面折射率變化和特異性作用所引起的表面折射率變化，t表示時間。
對通道C而言，特異性作用引起的響應為ΔθSC＝SCΔNSC(t)(4)＝ΔθC(t)-BCΔn(t)-SCKCΔNn(t)為確定KC的值，可向傳感器表面通入不含目標分子的樣液，此時C通道的響應中不包含特異性吸收引起的響應，即(4)式的值為0，可得KC=θC(t)-BCΔn(t)SCΔNn(t)=θC(t)-BCBAbASCSASA---(5)]]>再通過(1)、(2)式求得Δn(t)、ΔNn(t)并與KC一起代入(4)式就可以得到C通道的非特異性響應。
入射光路可以提供一定角度范圍的入射光，與面陣CCD相配合，可以一次完成一定角度范圍的反射光強的檢測。在柱面透鏡前還加裝有濾光片和偏振片。濾光片用于改善入射光的單色性，偏振片用于產(chǎn)生P偏振光。
光路的具體參數(shù)及說明如下①LED東芝公司的TLRH190P型LED，參數(shù)如前所述。
②球面透鏡直徑Ф＝10mm，焦距f＝10mm；LED距離球面透鏡約為焦距的10倍(100mm左右，近似于平行入射)。
③平凸透鏡直徑Ф＝20mm，焦距f＝35mm。
④柱面透鏡焦距f＝40mm，大小為15mm×15mm。
⑤濾光片干涉濾光片，峰值波長為632.8nm，其透過率為60％。
⑥偏振片直徑Ф＝25.4mm，透過率＞60％，偏振化方向在圖平面內(nèi)；偏振片和柱面透鏡的方向應保持統(tǒng)一。
⑦光路的所有元件均可方便拆裝，易于更換；各元件的間距均按照上述參數(shù)設(shè)計，且可微調(diào)。
⑧所有光學元件封裝于煮黑的金屬筒內(nèi)，可削弱雜散光影響，提高檢測精度。
⑨整個光路的設(shè)計既要充分利用光源的能量，又要獲得寬度很小的會聚線。
因柱面透鏡的通光孔徑為12mm×12mm，焦距f＝40mm，可以估算入射角范圍大約為α＝2×arctg[12/(2×40)]≈17度。CCD距金屬膜約120mm，所以反射光在CCD表面形成的光斑寬度約為36mm，CCD有效長度約為37.4mm。實驗中通過觀察采集到的曲線可以看出，CCD可一次性采集到所有反射光的信號。檢測精度由CCD決定，我們所采用的CCD的象素間距為7μm，反射光程約為120mm，經(jīng)計算理論角度分辨率達0.0033度，比0.1度提高了約2個數(shù)量級。
實施例1采用以下實驗步驟可以確定A、B、C通道的表面靈敏度，同時完成敏感膜的制備。在確定各通道靈敏度時，采用如圖2所示的樣品池(3、硅片基底，22、棱鏡放置槽，23、A通道樣品池，24、B通道樣品池，25、C通道樣品池)，先向A、B、C三個通道同時通入摩爾比為1∶9的生物素化硫醇衍生物和OH根硫醇稀釋液的混合物(PBS緩沖液環(huán)境)，反應足夠長時間(16小時以上)，在各通道表面生成緊密覆蓋的自組裝單分子膜(SAM)，再用PBS緩沖液清洗。然后在各通道順序通入表面等離子體PBS緩沖液、濃度足夠高的鏈酶抗生物素(Streptavidin)(反應約5-20分鐘)、磷酸鹽PBS緩沖液，同時實時檢測A、B通道的共振角，并計算反應前后共振角的差值。由上述的(1)-(3)式計算得出表面靈敏度。
通過下面的實驗完成C通道探針分子的固定，并可以測定體靈敏度的比值。用PBS緩沖液清洗三個通道，再將含有大鼠肝臟f蛋白基因探針的磷酸鹽PBS緩沖液通入C通道，完成探針分子的固定。通入磷酸鹽PBS緩沖液清洗C通道，再用純凈水對三個通道進行清洗，然后同時向三個通道中依次通入純凈水和乙二醇，計算各個通道在通入純凈水和乙二醇時的共振角的差值。并由上述的(1)-(3)、(5)式計算得出體靈敏度和KC。此時傳感芯片制作完成，如圖4所示。
以下實驗可以實現(xiàn)用SPR檢測方法對PCR擴增產(chǎn)物直接進行檢測，簡化了PCR擴增后相對煩雜的檢測過程。
PCR擴增樣品為大鼠肝臟f蛋白基因，濃度為1.3μg/μl。反應緩沖液中含有上游、下游引物各20pmol、Taq酶1.25u及dNTP各0.2mmol，使用蠕動泵將反應物注入PCR擴增反應池，反應體積約為20μl。
PCR擴增的一個熱循環(huán)周期包括以下三個步驟①.加熱樣品，當溫度達到95℃左右時，DNA分子由雙鏈結(jié)構(gòu)分解成兩條單鏈。
②.降溫冷卻至55℃左右，使分解后的單鏈按堿基互補原則與引物結(jié)合。
③.再次加熱升溫至72℃，使寡核苷酸按堿基配對原則沿引物生長，完成DNA的一次復制。
實驗采用半導體制冷片溫控系統(tǒng)對反應池進行溫度控制，將反應物的溫度依次穩(wěn)定在95℃、55℃、72℃，并進行30個溫度循環(huán)，達到DNA擴增的目的，為后繼SPR檢測做準備。
在向SPR樣品池通入待測樣液進行檢測前，應先通入PBS對SPR樣品池各通道進行清洗，之后再通入包含有待測樣品的擴增產(chǎn)物，并控制雜交溫度，實時檢測各通道共振角，結(jié)果如圖8所示。從圖中可以求得任意時刻t各通道的響應(以PBS的共振角為基準)ΔθA(t)、ΔθB(t)、ΔθC(t)，結(jié)合標定結(jié)果，利用(1)-(5)式及已求出的參數(shù)就可以求出C通道的特異性動態(tài)響應曲線，如圖6所示。
權(quán)利要求
1.一種基于片上PCR的多通道表面等離子共振影像傳感器，包括共振SPR樣品池和PCR反應池，其特征在于它將共振SPR樣品池(4)和PCR反應池(21)結(jié)合在一起，構(gòu)成傳感器反應池(3)；傳感器主體(20)上部是由硅片構(gòu)成的長方體形傳感器反應池(3)，下部是柱面棱鏡(13)，兩者之間是玻璃基片(18)，玻璃基片上是敏感膜(5)，敏感膜上是硅片的傳感器反應池(3)，在硅片反應池中設(shè)置共振SPR樣品池和PCR反應池，從硅片傳感器反應池上部設(shè)置樣液的樣品進口(1)和樣品出口(2)；在傳感器主體兩側(cè)是入射光路(15)、出射光路(16)、和與出射光路末端連接的計算機平臺(19)；入射光路中由發(fā)光二極管(6)發(fā)出的光經(jīng)過球面透鏡(7)，在針孔(8)處會聚，再經(jīng)過一個平凸透鏡(9)轉(zhuǎn)換為平行光，平行光先后通過濾光片(10)和偏振片(11)，調(diào)整偏振片的位置產(chǎn)生P偏振光，最后利用一個柱面透鏡(12)對平行光進行角向會聚，使其在柱面棱鏡(13)的敏感膜(5)處會聚成一條直線，射向柱面棱鏡底面；出射光路(16)由一個會聚透鏡(17)和面陣CCD(14)組成，入射光在柱面棱鏡底面發(fā)生全反射后經(jīng)會聚透鏡成為平行光，由面陣CCD完成光信號的采集，再送入計算機進行處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于片上PCR的多通道表面等離子共振影像傳感器，其特征在于入射光路的光線入射角必須在40°-90°之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于片上PCR的多通道表面等離子共振影像傳感器，其特征在于在針孔(8)處會聚的孔徑Ф＝0.1-0.3mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于片上PCR的多通道表面等離子共振影像傳感器，其特征在于濾光片用來改善入射光的單色性，濾光片的峰值波長為632.8nm。
5.一種基于片上PCR的多通道表面等離子共振影像傳感器的檢測方法，其特征在于它包括下述步驟1)先向A、B、C三個通道同時通入摩爾比為1∶9的生物素化硫醇衍生物和OH根硫醇稀釋液的混合物磷酸鹽PBS緩沖液，反應時間足夠長，16-30小時，在各通道表面生成緊密覆蓋的自組裝單分子膜SAM，再用PBS緩沖液清洗；2)然后在各通道順序通入磷酸鹽PBS緩沖液、濃度足夠高的鏈酶抗生物素Streptavidin，反應5-20分鐘、磷酸鹽PBS緩沖液，同時實時檢測A、B通道的共振角；3)計算反應前后共振角的差值，計算出表面靈敏度；4)用磷酸鹽PBS緩沖液清洗三個通道，再將含有大鼠肝臟f蛋白基因探針的磷酸鹽PBS緩沖液通入C通道，完成探針分子的固定；5)通入緩沖液PBS清洗C通道，再用純凈水對三個通道進行清洗，然后同時向三個通道中依次通入純凈水和乙二醇，計算各個通道在通入純凈水和乙二醇時的共振角的差值，計算出體靈敏度和KC；6)使用蠕動泵將反應物注入PCR擴增反應池，反應體積約為20μl，PCR擴增樣品為大鼠肝臟f蛋白基因，濃度為1.3μg/μl。反應緩沖液中含有上游、下游引物各20pmol、Taq酶1.25u及dNTP各0.2mmol；7)將反應物的溫度依次穩(wěn)定在95℃、55℃、72℃，并進行30個溫度循環(huán)，達到DNA擴增的目的；8)在向共振SPR樣品池通入待測樣液進行檢測前，應先通入共振PBS對SPR樣品池各通道進行清洗；9)使用蠕動泵將PCR反應池中的擴增產(chǎn)物注入共振SPR樣品池，并控制雜交溫度，實時檢測各通道共振角，結(jié)果如圖5所示；10)求得任意時刻t各通道的響應，以PBS的共振角為基準ΔθA(t)、ΔθB(t)、ΔθC(t)，根據(jù)求出的參數(shù)就可以求出C通道的特異性動態(tài)響應曲線。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于表面等離子體共振原理的生物傳感器，特別是涉及利用生物PCR技術(shù)和等離子體共振原理相結(jié)合制作的傳感器。該傳感器是將SPR樣品池和PCR反應池結(jié)合在一起，構(gòu)成傳感器反應池；傳感器主體上部是由硅片構(gòu)成的長方體形反應池，下部是柱面棱鏡，在傳感器主體兩側(cè)是入射光路、出射光路、和與出射光路末端連接的計算機平臺；單色光入射，利用單色面陣CCD采集SPR影像，通過影像分析，檢測各通道的共振角、共振角的變化，即為各通道的響應。本發(fā)明的有益效果有以下四個特點(a)可以一次完成多個樣品的檢測，(b)可以一次完成同一樣品的不同特征的檢測，(c)在多通道中設(shè)置參考通道，消除非特異性響應的影響。(d)可以對低濃度的DNA分子進行測量。
文檔編號G01N33/50GK1664560SQ200410094090
公開日2005年9月7日 申請日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者劉國華, 牛文成, 張福海, 俞梅, 賈蕓芳, 張維, 米永巍, 王寧 申請人:南開大學