一種基于表面等離子體共振技術(shù)的核酸檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于表面等離子體共振技術(shù)的核酸檢測(cè)方法，首先在裸SPR芯片表面電沉積氧化石墨烯，再通過(guò)共軛作用吸附胺基三乙酸接枝的苝衍生物活性化分子層，組裝5′端生物素化的捕獲cDNA探針作為傳感界面對(duì)目標(biāo)tDNA進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)tDNA的結(jié)合捕捉后，加入3′端生物素化的響應(yīng)rDNA形成長(zhǎng)鏈dsDNA并暴露其生物素分子，結(jié)合親和素化辣根過(guò)氧化物酶以完成組裝，最后加入苯胺和雙氧水混合溶液，利用辣根過(guò)氧化物酶催化苯胺聚合沉積反應(yīng)形成聚苯胺，根據(jù)SPR信號(hào)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸的檢測(cè)。本發(fā)明利用二維納米材料進(jìn)行“自下而上”的建構(gòu)、與置頂“自上而下”的重量反應(yīng)器形成具有雙重增敏信號(hào)的SPR傳感平臺(tái)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的特異性和靈敏性檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)飛摩爾水平。
【專利說(shuō)明】
一種基于表面等離子體共振技術(shù)的核酸檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于核酸分析領(lǐng)域，涉及一種基于表面等離子體共振技術(shù)的核酸檢測(cè)方 法，具體涉及一種利用高密度探針組裝方法和酶催聚合反應(yīng)提高質(zhì)量響應(yīng)表面等離子體共 振信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)核酸檢測(cè)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 低生理水平特定DNA/RNA序列的分析方法，對(duì)癌癥早期檢測(cè)以及傳染性病毒的篩 選尤為重要。表面等離子體共振(SPR)技術(shù)是表面等離子體在金屬和電介質(zhì)的交界面上形 成的一電荷層，在電磁波的激勵(lì)下，表面等離子體發(fā)生共振產(chǎn)生基于質(zhì)量變化的SPR信號(hào)， 可方便靈活地應(yīng)用于核酸檢測(cè)。
[0003] 基于質(zhì)量變化的核酸傳感器通常通過(guò)在傳感器介質(zhì)表面組裝捕獲探針DNA/RNA實(shí) 現(xiàn)對(duì)目標(biāo)核酸的檢測(cè)，但由于探針密度較低，難以滿足檢測(cè)需求。一般SPR芯片上，金-硫成 鍵的真實(shí)固定密度遠(yuǎn)低于預(yù)期，而且制備設(shè)備復(fù)雜，重復(fù)性差，靈敏度和檢測(cè)下限較低?，F(xiàn) 有技術(shù)大多通過(guò)設(shè)計(jì)捕獲探針直接和核酸雜交或利用納米材料作為標(biāo)記物來(lái)增強(qiáng)信號(hào)響 應(yīng)，彌補(bǔ)探針密度的不足。Homola課題組利用核酸分子直接增大SPR響應(yīng)，直接、適時(shí)地進(jìn)行 核酸檢測(cè)，但是該方法形成的結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定且重復(fù)性差，檢測(cè)靈敏度低，很難達(dá)到臨床樣品 檢測(cè)的要求(Chemical Reviews. 2008.108,462-493.) Xorn等人設(shè)計(jì)了納米金正方形的合 結(jié)構(gòu)用于增強(qiáng)S P R信號(hào)，其響應(yīng)信號(hào)有很大的提高且檢測(cè)限低于飛摩爾級(jí)別 (J. Am. Chem. Soc. 2011，133,4271-4273.)。利用納米材料對(duì)介質(zhì)表面進(jìn)行功能化也可提高 核酸的檢測(cè)下限，如ConsieH果題組利用LB拉膜儀延伸了氧化石墨烯分子組裝介質(zhì)表面，組 裝生物素探針檢測(cè)，但是納米材料價(jià)格昂貴，合成需要特殊的設(shè)備，生物功能化困難且納米 金生產(chǎn)和納米形貌控制復(fù)雜，制約其批量生產(chǎn)和應(yīng)用(Biosensors&Bioelectronics ,2014， 58(16) :68-74.)。因此，簡(jiǎn)化探針的制備工藝，提高探針結(jié)合的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，增加探 針的密度，能夠進(jìn)一步地促進(jìn)SPR技術(shù)在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有的核酸的SPR檢測(cè)方法中存在的探針密度不高、結(jié)合穩(wěn)定性差、檢測(cè)靈敏 度不足的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)易的具有雙重增敏信號(hào)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、重復(fù)性好的靈敏度 高的基于表面等離子體共振技術(shù)的核酸檢測(cè)方法。本發(fā)明通過(guò)在裸SPR芯片表面電沉積還 原石墨烯(rGO)納米片層，還原石墨烯與芯片基底形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，再通過(guò)共輒作用吸附活 性基團(tuán)，組裝形成高密度探針傳感界面，對(duì)SPR信號(hào)進(jìn)行初次放大，捕獲cDNA探針結(jié)合捕捉 目標(biāo)tDNA，目標(biāo)tDNA又與經(jīng)親和素化辣根過(guò)氧化物酶修飾的響應(yīng)rDNA形成長(zhǎng)鏈dsDNA，酶催 化苯胺聚合沉積為聚苯胺，對(duì)SPR信號(hào)進(jìn)行二次放大，實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA的靈敏檢測(cè)。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] -種基于表面等離子體共振技術(shù)的核酸檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[0007] 步驟1，裸SPR芯片預(yù)處理:將裸SPR芯片依次浸泡在水虎魚(yú)酸溶液、煮沸的H20 2和氨 水的混合溶液中，清洗干凈；
[0008] 步驟2,將氧化石墨烯超聲分散于Na2S〇4溶液中，得到濃度為0.3~0.6mg · mL-1的 氧化石墨烯分散液，之后利用循環(huán)伏安法在預(yù)處理后的SPR芯片上電沉積氧化石墨烯，循環(huán) 電壓為-1.5~+0.5V，循環(huán)速度為50mV s-1，循環(huán)次數(shù)為400~600圈；
[0009] 步驟3，將胺基三乙酸(NTA)接枝的茈衍生物(NTPy)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液散 布在步驟2得到的芯片上，孵育后用二甲基甲酰胺除去未連接的反應(yīng)物；
[0010] 步驟4,將含有Ni(C104)2的乙酸緩沖液滴涂到步驟3得到的芯片上，靜置后沖洗干 凈；
[0011] 步驟5，將含有濃度為0.1~δμΜΑ'端標(biāo)記生物素的CDNA的磷酸緩沖液和乙醇胺封 閉劑滴涂到步驟4得到的芯片上，孵育后沖洗干凈得到cDNA/NTPy/rGO傳感界面；
[0012] 步驟6,將待檢測(cè)的tDNA加入到步驟5得到的芯片上，孵育后沖洗干凈；
[0013]步驟7,將含有濃度為0.1~δμΜ"端標(biāo)記生物素的、與tDNA的單鏈殘基互補(bǔ)配對(duì) 的rDNA的磷酸緩沖液加入到步驟6得到的芯片上，孵育后沖洗干凈，加入親和素化辣根過(guò)氧 化物酶(冊(cè)?-34)，3?財(cái)言號(hào)穩(wěn)定后得到冊(cè)?-34/扣嫩/(18〇嫩/犯1^/40 ;
[0014]步驟8,將含有摩爾比為5~15:1的苯胺與H2〇2的乙酸緩沖液加入到步驟7得到的芯 片上，進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，記錄SPR信號(hào)，待信號(hào)穩(wěn)定后，根據(jù)tDNA的濃度與SPR信號(hào)的線性 關(guān)系，最終計(jì)算得到待檢測(cè)的tDNA的濃度。
[0015] 步驟1中，所述的水虎魚(yú)酸溶液為體積比為1:3的30%wt.H2〇2和98%H 2S〇4的混合 溶液，浸泡時(shí)間為5~20min;所述的雙氧水和氨水的混合溶液中H2〇2和氨水的質(zhì)量濃度均為 5%，浸泡時(shí)間為5~20min。
[0016] 步驟2中，Na2S〇4溶液的濃度為0.1M，超聲時(shí)間為0.5~4h。
[0017] 步驟3中，胺基三乙酸(NTA)接枝的茈衍生物(NTPy)的二甲基甲酰胺溶液中胺基三 乙酸（NTA)接枝的茈衍生物（NTPy)的濃度為2~5mM，胺基三乙酸（NTA)接枝的茈衍生物 (NTPy)的二甲基甲酰胺溶液的用量為0 · 1~2mL，孵化時(shí)間為1~3h。
[0018] 步驟4中，所述的含有Ni(Cl〇4)2的乙酸緩沖液中Ni(Cl〇4)2的濃度為10~20mM，含 有Ni (Cl〇4)2的乙酸緩沖液的用量為0.1~2mL，靜置時(shí)間為2~6h。
[0019]步驟5中，所述的乙醇胺濃度為1~12μΜ。
[0020]本發(fā)明中所述的乙酸緩沖液的濃度為0.05~0.5Μ，pH為4.0~4.3;所述的磷酸緩 沖液的濃度為0.5~1Μ，ρΗ為7.2~7.4，內(nèi)含0.2~0.25M氯化鈉。
[0021]步驟7中，所述的親和素化辣根過(guò)氧化物酶的濃度為500U/L。
[0022]步驟8中，所述的苯胺與H2〇2的乙酸緩沖液中，苯胺的濃度為80~110mM，H2〇 2的濃 度為5~20mM。
[0023]本發(fā)明利用電化學(xué)方法在裸SPR芯片表面沉積還原石墨烯(rGO)納米片層，再通過(guò) 共輒作用吸附胺基三乙酸(NTA)接枝的茈衍生物(NTPy)活性化分子層，然后用鎳離子螯合 NTA羧基集團(tuán)，定向組裝5'端生物素化的捕獲cDNA探針，乙醇胺封閉界面消除非特異性吸附 后作為傳感界面對(duì)目標(biāo)tDNA進(jìn)行檢測(cè)，目標(biāo)tDNA與傳感界面進(jìn)行雜交反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)tDNA的 結(jié)合捕捉后，加入3'端生物素化的響應(yīng)rDNA形成長(zhǎng)鏈dsDNA并暴露其生物素分子，結(jié)合親和 素化辣根過(guò)氧化物酶以完成組裝，最后加入苯胺和雙氧水混合溶液，利用辣根過(guò)氧化物酶 催化苯胺聚合沉積反應(yīng)形成聚苯胺，明顯提高SPR信號(hào)響應(yīng)。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明利用二維納米材料進(jìn)行"自下 而上"的建構(gòu)、與置頂"自上而下"的重量反應(yīng)器形成具有雙重增敏信號(hào)的SPR傳感平臺(tái)，利 用簡(jiǎn)單的化學(xué)催化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，成本低廉，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)過(guò)程中不會(huì)造成環(huán)境污 染，構(gòu)建的組裝結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的特異性和靈敏性檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)飛摩爾 水平。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為本發(fā)明的基于表面等離子體共振技術(shù)的核酸檢測(cè)方法的流程示意圖。
[0026]圖2為實(shí)施例1中電沉積氧化石墨烯時(shí)的循環(huán)伏安曲線(A)，ESPR曲線(B)，SPR信號(hào) 與循環(huán)次數(shù)的關(guān)系曲線圖（C)和電沉積氧化石墨烯前后的SPR芯片的SEM圖。
[0027] 圖 3 為實(shí)施例 2 中的未修飾的 SPR 芯片，rG0/Au，NTPy/rG0/Au 和 cDNA/NTPy/rGO/Au 芯片的SPR基線。
[0028] 圖4為實(shí)施例2中的dsDNA/NTPy/rGO/Au，常規(guī)的dsDNA/MPA/Au和未修飾的SPR芯片 的SPR角度迀移曲線。
[0029] 圖5為實(shí)施例3中的rG0/Au(A)，NTPy/rG0/Au(B)，和dsDNA/NTPy/rGO/Au(C)的AFM 圖。
[0030] 圖 6 為實(shí)施例4 中 cDNA/NTPy/rGO/Au，dsDNA/NTPy/rGO/Au，rDNA/dsDNA/NTPy/rGO/ 圖(A)，苯胺聚合前后的SPR響應(yīng)曲線圖（B)，苯胺聚合前后的循環(huán)伏安曲線圖（C)，苯胺聚合 前后的SEM圖（D)。
[0031] 圖7為實(shí)施例5中目標(biāo)DNA的濃度與SPR信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)線性關(guān)系曲線(A)和目標(biāo)DNA、堿 基錯(cuò)配組、雙堿基錯(cuò)配組和三堿基錯(cuò)配組的SPR信號(hào)響應(yīng)圖（B)。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 本發(fā)明的一種基于表面等離子體共振技術(shù)的核酸檢測(cè)方法，利用非共價(jià)功能化的 石墨烯納米片作為基底，以"自下到上"組裝結(jié)合cDNA作為捕獲探針，雜交檢測(cè)低濃度目標(biāo) 核酸，借助酶催化誘導(dǎo)苯胺聚合反應(yīng)形成聚苯胺沉積實(shí)現(xiàn)SPR信號(hào)的放大，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃 度核酸的超靈敏檢測(cè)，其過(guò)程如圖1所示，具體步驟如下：
[0033] 步驟1，裸SPR芯片預(yù)處理：將裸SPR芯片浸泡在由體積比為1: 3的30 % wt. H2〇2和 98 % H2S〇4組成的水虎魚(yú)酸溶液中浸泡5~20min，然后在煮沸的質(zhì)量濃度均為5 %的H2〇2和 氨水的混合溶液中浸泡5~20min，用超純水和氮?dú)饬髑逑锤蓛簦?br>[0034] 步驟2，將氧化石墨烯在濃度為0.1M的Na2S〇4溶液中超聲0.5~4h，得到濃度為0.3 ~0.6mg · ml/1的氧化石墨烯分散液，之后利用循環(huán)伏安法在預(yù)處理后的SPR芯片上電沉積 氧化石墨稀，循環(huán)電壓為-1.5~+0.5V，循環(huán)速度為50mV s'循環(huán)次數(shù)為400~600圈；
[0035] 步驟3,將0.1~2mL、濃度為2~5mM的胺基三乙酸(NTA)接枝的茈衍生物(NTPy)的 二甲基甲酰胺(DMF)溶液散布在步驟2得到的芯片上，孵育1~3h后，反復(fù)栗入/栗出DMF除去 未連接的反應(yīng)物；
[0036] 步驟4,將0.1~2mL的、濃度為10~20mM的Ni(Cl〇4)2的乙酸緩沖液滴涂到步驟3得 到的芯片上，靜置2~6h后，用乙酸緩沖液沖洗干凈；
[0037]步驟5,將含有濃度為0.1~δμΜΑ'端標(biāo)記生物素的cDNA的磷酸緩沖液和濃度為1 ~12μ的乙醇胺封閉劑滴涂到步驟4得到的芯片上，孵育后沖洗干凈得到cDNA/NTPy/rGO傳 感界面；
[0038] 步驟6，將待檢測(cè)的tDNA加入到步驟5得到的芯片上，孵育后沖洗干凈；
[0039]步驟7,將含有濃度為0.1~5μΜ、3^端標(biāo)記生物素的、與tDNA的單鏈殘基互補(bǔ)配對(duì) 的rDNA的磷酸緩沖液加入到步驟6得到的芯片上，孵育后沖洗干凈，加入親和素化辣根過(guò)氧 化物酶(HRP-SA)，SPR信號(hào)穩(wěn)定后達(dá)到構(gòu)筑的頂點(diǎn)，HRP棲息于其頂端，得到HRP-SA/rDNA/ dsDNA/NTPy/rGO；
[0040]步驟8,將含有摩爾比為5~15:1的苯胺與H2〇2的乙酸緩沖液加入到步驟7得到的芯 片上，進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，記錄SPR信號(hào)，待信號(hào)穩(wěn)定后，根據(jù)tDNA的濃度與SPR信號(hào)的線性 關(guān)系，最終計(jì)算得到待檢測(cè)的tDNA的濃度。
[0041 ]本發(fā)明步驟3中，所述的胺基三乙酸（N T A)接枝的茈衍生物（N T P y)參考文獻(xiàn) 【HOLZINGER M，BAUR J，HADDAD R，et al.Multiple functionalization of single-walled carbon nanotubes by dip coating[J].Chemical Communications,2011,47(8): 2450-2452】制備。
[0042]本發(fā)明具體實(shí)施例中，使用的核酸序列如下表所示：
[0043]表1實(shí)施例中使用的核酸序列
[0045]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0046] 實(shí)施例1
[0047] SPR芯片表面電沉積還原型氧化石墨烯納米片層，具體過(guò)程如下：
[0048] (1)裸SPR芯片在水虎魚(yú)酸(濃H2S〇4:濃H2〇2 = 1:3)浸泡10min后，然后在沸騰的H2〇2 和氨水的混合溶液(H2O2和氨水的質(zhì)量濃度均為5% )中浸泡10min，最后用超純水和乙醇沖 洗兩次后N2吹干備用；
[0049] (2)將0.5mg · mL-1 的GO溶液在0.1M Na2S〇4中超聲2h，得到0.5mg · mL-1 的GO分散 液；
[0050] (3)循環(huán)伏安掃描在線電還原GO,循環(huán)電壓為-1.5~+0.5V，循環(huán)速度為50mV s' 進(jìn)行1~600次循環(huán)，得到表面電沉積還原型氧化石墨烯納米片層的SPR芯片。
[0051] 圖2A為循環(huán)伏安曲線，其中（a)為第1次，（b)為第500次，右邊曲線顯示2個(gè)還原峰， 說(shuō)明G0內(nèi)在的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，對(duì)比(a)和(b)兩條曲線，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，峰值和基線均 增長(zhǎng)。圖2B為電沉積過(guò)程中相應(yīng)的ESPR曲線，可以看出G0不間斷的反復(fù)氧化-還原對(duì)SPR反 射率的顯著效應(yīng)，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，SPR反射率增加。圖2C為SPR信號(hào)與循環(huán)次數(shù)的關(guān)系 曲線圖，SPR響應(yīng)信號(hào)會(huì)隨電沉積過(guò)程的延長(zhǎng)而突變，且在500圈循環(huán)時(shí)達(dá)到最大值，表現(xiàn)出 rGO的附著確實(shí)有利于cDNA的安置至飽和。在超過(guò)500圈以后，SPR信號(hào)減弱，可能是rGO層的 透射率變得太低以致入射光難以穿透的負(fù)面效果。圖2D為裸的SPR芯片(a)和表面電沉積了 rGO的SPR芯片(b)的SEM圖，rGO碎片受熱力學(xué)微擾而相互堆疊褶皺，有利于提高結(jié)合率。 [0052] 實(shí)施例2
[0053] cDNA/NTPy/rGO的底層構(gòu)建及其雜交性能，合成步驟為：
[0054] (1)將0.2mL的、含2mM胺基三乙酸(NTA)接枝的茈衍生物(NTPy)的二甲基甲酰胺用 微量移液進(jìn)容器中，散布在經(jīng)500次循環(huán)的表面電沉積氧化石墨的SPR芯片上，并孵育lh以 奠基η堆積支架，并反復(fù)栗入/栗出DMF將不牢固的吸附物沖掉；
[0055] (2)連續(xù)地，將0.5mL、10mM的Ni(Cl〇4)2的乙酸緩沖液滴涂到上述處理過(guò)的芯片上， 靜置2~6h以絡(luò)合Ni2+并用乙酸緩沖液沖凈；
[0056] (3)將ΙμΜ cDNA與5μΜ乙醇胺封閉劑(封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)）的可整分混合淋洗 液被引入到步驟2得到的芯片上，通過(guò)層層組裝完成下陳的建造，形成cDNA/NTPy/rGO界面， 作為傳感界面對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行檢測(cè)。
[0057] 圖3為各芯片的SPR基線，其中，a為未修飾的SPR芯片(Au)，基礎(chǔ)的空白信號(hào)為-1630mdeg(m°);b為rG0/Au，SPR角為-815mdeg，說(shuō)明rGO的包覆提升了未修飾的裸SPR芯片 (Au)的SPR角；c為NTPy/rGO/Au，加入NTPy后rG0/Au的基線被抬高至-375mdeg，說(shuō)明NTPy中 的茈衍生物已通過(guò)非共價(jià)31-31堆砌附著到石墨烯的六方晶格上;d為cDNA/NTPy/rGO/Au，說(shuō) 明cDNA以及乙醇胺分子的引入，中止了這一自組織階段并將SPR角升級(jí)為64mdeg。
[0058] 比較NTPy/rGO修飾過(guò)的SPR芯片與常規(guī)使用的MPA修飾的SPR芯片對(duì)于cDNA的穩(wěn)定 和對(duì)tDNA的結(jié)合能力，結(jié)果如圖4所示，圖4為本實(shí)施例經(jīng)NTPy/rGO修飾過(guò)的SPR芯片、常規(guī) 使用的MPA修飾的SPR芯片、未修飾的SPR芯片與Ιμπι tDNA雜交后形成的dsDNA/NTPy/rGO/Au (線段a)、常規(guī)的dsDNA/MPA/Au(線段b)和未修飾的SPR芯片(Au，線段c)的SPR角度迀移曲 線。dsDNA/NTPy/rGO/Au的SPR角度迀移量為189mdeg(線段a所示），參照SPR推演統(tǒng)計(jì)學(xué)，所 得以dsDNA為代表的tDNA片上的密度約為1.93X10- 4nmol · mm-2，常規(guī)的dsDNA/MPA/Au的 SPR角度迀移量為85mdeg(線段b所示），測(cè)得的密度為8.87X10- 5nmol ·πιπΓ2tDNA，說(shuō)明本發(fā) 明經(jīng)NTPy/rGO修飾的芯片相對(duì)于常規(guī)方法修飾的芯片，具有更高的固定密度，可達(dá)常規(guī)的 200%。tDNA雜交前，cDNA/NTPy/rGO/Au與未經(jīng)任何修飾的SPR芯片比較，未出現(xiàn)角度波動(dòng)， 說(shuō)明NTPy/rGO具有優(yōu)秀的抗干擾能力。
[0059] 實(shí)施例3
[0060] dsDNA/NTPy/rGO的非共價(jià)組裝，其反應(yīng)過(guò)程如下：
[0061 ] 將100yL、lpM的tDNA注射進(jìn)檢測(cè)小皿中，與實(shí)施例2中合成的cDNA/NTPy/rGO芯片 進(jìn)行初始化生物識(shí)別，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的結(jié)合捕捉，形成dsDNA/NTPy/rGO，完成檢測(cè)步驟。
[0062] 圖 5 為rGO/Au (A)、NTPy/rGO/Au (B)和 d s DNA/NTPy/rGO/Au (C)原子力顯微鏡（AFM) 圖。圖5A顯示，在2 X 2μπι的掃描面積內(nèi)，rGO保持破碎的形貌，與圖2D等同，rGO的碎片占據(jù)整 個(gè)區(qū)域，并有著寬泛的尺寸分布，平面內(nèi)的平均高度約為2nm(Z- 〇ffSet = 0nm)。圖5B顯示， rGO上原位吸附NTPy，給定NTA的范德華半徑，采樣區(qū)間的平均高度提高了 6nm，說(shuō)明rGO與 NTPy通過(guò)π共輒而緊密連接。因?yàn)槭褂玫膖DNA量總是少于cDNA，將tDNA與cDNA雜交前后的 AFM圖合成圖5C，高度更高的白色部分為雜交后的dsDNA，高度較低的為未雜交上tDNA的 cDNA，比較可知，，雜交前后cDNA/NTPy下層的rGO形貌保持不變，說(shuō)明rGO與芯片基底(Au)結(jié) 合十分穩(wěn)定。
[0063] 實(shí)施例4
[0064] 頂層標(biāo)記和生物催化聚合用于DNA分析，具體步驟如下：
[0065] (1)在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，將100μL、1μΜ rDNA與tDNA的單鏈殘基互補(bǔ)配對(duì)，并暴露 其外向的生物素基團(tuán)，并加入90yL的HRP-SA與標(biāo)記生物素的rDNA結(jié)合。整個(gè)過(guò)程嚴(yán)格維持 在既設(shè)的參數(shù)下直到SPR信號(hào)達(dá)到穩(wěn)定，達(dá)到構(gòu)筑的頂點(diǎn)，HRP棲息于其頂端形成HRP-SA/ rDNA/dsDNA/NTPy/rGO 傳感界面；
[0066] (2)配制100mM苯胺和10mM H2〇2作為共溶質(zhì)的乙酸緩沖液通過(guò)檢測(cè)通道以恒定速 度傾入，在HRP-SA/rDNA/dsDNA/NTPy/rGO傳感界面進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，并用SPR儀記錄其響 應(yīng)。
[0067]如圖6A所示，cDNA/NTPy/rGO/Au的SPR角度為77mdeg(線段a);加入0· lnm tDNA后， 角度增加到l〇5mdeg(線段b);加入ΙμΜ rDNA持續(xù)溫育中，角度增加至123mdeg(線段c);緊接 著，HRP-SA落于rDNA的末端，信號(hào)提升至235mdeg的部分(線段d);并立刻催化苯胺和H2O2間 的質(zhì)子傳遞，聚合成PANi，角度增加到435mdeg(線段e)，可知，線段b到c之間信號(hào)增加了 28mdeg，線段 d和 e 之間信號(hào)凈增了200mdeg。圖 6B，設(shè)置 HRP-SA/rDNA/dsDNA/NTPy/rGO在乙 酸緩沖液中信號(hào)為Omdeg(線段a)，苯胺在HRP共存下被H 2〇2氧化，進(jìn)行自聚合PANi并形成很 強(qiáng)的SPR響應(yīng)，用HAc/NaAc除去過(guò)量苯胺和H 2〇2后，得到一條平線（線段b)，表示反應(yīng)達(dá)到終 點(diǎn)，這由低至高的輪廓跨越反映了PANi在自發(fā)地沉降，顯示了PANi的電活性以及對(duì)SPR重現(xiàn) 性的顯著影響（內(nèi)插圖為放大圖）。同時(shí)，在圖6C中CV圖可以看出，對(duì)于HRP-SA/rDNA/dsDNA/ NTPy/rGO，沒(méi)有苯胺加入時(shí)，則在0.4到-0.3V之間無(wú)峰凸顯(線段a)，這與圖6B(線段a)的情 況相同。當(dāng)苯胺加入體系時(shí)，一對(duì)準(zhǔn)可逆峰出現(xiàn)在0.17和0.086V(線段b)，就會(huì)與圖6B(線段 b)的表現(xiàn)一致，證實(shí)了 PANi在酶催化下沉積。
[0068] 實(shí)施例5
[0069] 檢驗(yàn)實(shí)施例4的檢測(cè)方法對(duì)癌癥基因檢測(cè)的特異性和穩(wěn)定性，具體方法如下：
[0070] (1)取100yL的0.1 nM如表1中的單堿基錯(cuò)配組、雙堿基錯(cuò)配組和三堿基錯(cuò)配組以及 濃度為10fM~100pM的tDNA分別與實(shí)施例2所制備cDNA/NTPy/rGO組裝層雜交，用緩沖液沖 洗后得到基線；
[0071] (2)將ΙμΜ rDNA與tDNA的單鏈殘基互補(bǔ)配對(duì)，并暴露其外向的生物素基團(tuán)，并加入 90yL的HRP-SA與標(biāo)記生物素的rDNA結(jié)合，整個(gè)過(guò)程嚴(yán)格維持在既設(shè)的參數(shù)下直到抵達(dá)平衡 的反饋；
[0072] (3)配制lOOmM苯胺和lOmM H2〇2作為共溶質(zhì)的醋酸緩沖液通過(guò)檢測(cè)通道，以恒定速 度傾入，在傳感界面進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，并用SPR儀記錄其響應(yīng)。
[0073]圖7A為tDNA的濃度與SPR角度的關(guān)系圖，tDNA的濃度與SPR角度成線性關(guān)系，線性 擬合曲線為y = 327.65 · logx-103.3,回歸系數(shù)為0.998，具有良好的線性。圖78為濃度均為 O.lnM的tDNA、單堿基錯(cuò)配組（1B)、雙堿基錯(cuò)配組（2B)和三堿基錯(cuò)配組（3B)，以tDNA的互補(bǔ) 率為100 %，單堿基錯(cuò)配組、雙堿基錯(cuò)配組和三堿基錯(cuò)配組的互補(bǔ)率為8.1 %，5.5 %和 7.0%，說(shuō)明了本檢測(cè)方法具有優(yōu)異的特異性，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)核酸的靈敏性和特異性檢 測(cè)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于表面等離子體共振技術(shù)的核酸檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟1，裸SPR芯片預(yù)處理:將裸SPR芯片依次浸泡在水虎魚(yú)酸溶液、煮沸的H2〇2和氨水的 混合溶液中，清洗干凈； 步驟2，將氧化石墨烯超聲分散于Na2S04溶液中，得到濃度為0.3~0.6mg · ml/1的氧化石 墨烯分散液，之后利用循環(huán)伏安法在預(yù)處理后的SPR芯片上電沉積氧化石墨烯，循環(huán)電壓 為-1 · 5~+0 · 5V，循環(huán)速度為50mV s'循環(huán)次數(shù)為400~600圈； 步驟3,將胺基三乙酸接枝的茈衍生物的二甲基甲酰胺溶液散布在步驟2得到的芯片 上，孵育后用二甲基甲酰胺除去未連接的反應(yīng)物； 步驟4,將含有Ni(C104)2的乙酸緩沖液滴涂到步驟3得到的芯片上，靜置后沖洗干凈； 步驟5,將含有濃度為0.1~δμΜΑ'端標(biāo)記生物素的cDNA的磷酸緩沖液和乙醇胺封閉劑 滴涂到步驟4得到的芯片上，孵育后沖洗干凈得到cDNA/NTPy/rGO傳感界面； 步驟6,將待檢測(cè)的tDNA加入到步驟5得到的芯片上，孵育后沖洗干凈； 步驟7,將含有濃度為0.1~δμΜ、〗'端標(biāo)記生物素的、與tDNA的單鏈殘基互補(bǔ)配對(duì)的 rDNA的磷酸緩沖液加入到步驟6得到的芯片上，孵育后沖洗干凈，加入親和素化辣根過(guò)氧化 物酶，3?財(cái)言號(hào)穩(wěn)定后得到冊(cè)?-34/扣嫩/(18〇嫩/犯1^/40 ; 步驟8,將含有摩爾比為5~15:1的苯胺與H2〇2的乙酸緩沖液加入到步驟7得到的芯片 上，進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，記錄SPR信號(hào)，待信號(hào)穩(wěn)定后，根據(jù)tDNA的濃度與SPR信號(hào)的線性關(guān) 系，最終計(jì)算得到待檢測(cè)的tDNA的濃度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于，步驟1中，所述的水虎魚(yú)酸溶液為 體積比為1:3的30 % wt. H2〇2和98 % H2S〇4的混合溶液，浸泡時(shí)間為5~20min;所述的雙氧水 和氨水的混合溶液中H2〇2和氨水的質(zhì)量濃度均為5%，浸泡時(shí)間為5~20min。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于，步驟2中，Na2S04溶液的濃度為0.謂，超聲時(shí)間為0.5~411。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于，步驟3中，所述的胺基三乙酸接枝 的茈衍生物的二甲基甲酰胺溶液中胺基三乙酸接枝的茈衍生物的濃度為2~5禮，胺基三乙 酸接枝的茈衍生物的二甲基甲酰胺溶液的用量為0.1~2mL，孵化時(shí)間為1~3h。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于，步驟4中，所述的含有Ni (Cl〇4) 2的 乙酸緩沖液中Ni(Cl〇4)2的濃度為10~20mM，含有Ni(Cl〇4) 2的乙酸緩沖液的用量為0.1~ 2mL，靜置時(shí)間為2~6h。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于，步驟5中，所述的乙醇胺濃度為1 ~12μΜ。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于，步驟7中，所述的親和素化辣根過(guò) 氧化物酶的濃度為500U/L。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于，步驟8中，所述的苯胺與Η2〇2的乙 酸緩沖液中，苯胺的濃度為80~11 OmM，Η2〇2的濃度為5~20mM。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于，所述的乙酸緩沖液的濃度為0.05 ~0.5M，pH為4.0~4.3;所述的磷酸緩沖液的濃度為0.5~1Μ，ρΗ為7.2~7.4,內(nèi)含0.2~ 0.25M氯化鈉。
【文檔編號(hào)】G01N21/552GK106018349SQ201610615846
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月29日
【發(fā)明人】鄧盛元, 袁培新, 鄭晨昱, 宋宏鑫, 姚傳廣, 崔宏達(dá)
【申請(qǐng)人】南京理工大學(xué)