專利名稱：一種蜂蜜中氯霉素殘留量的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對食品中氯霉素殘留量的測定方法，更具體是對蜂蜜中殘留的微量氯霉素進行定量測定的方法。
背景技術(shù)：
氯霉素是一種廣譜抗生素，因具有廣譜性、效果好以及相對廉價等特點，曾作為農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中殺菌消毒的輔助手段及用于治療家畜禽疾病。但近年來發(fā)現(xiàn)氯霉素有嚴重的副作用，它能抑制人體骨髓造血功能而引起再生障礙性貧血癥和粒狀白細胞缺乏癥，更會導致神經(jīng)毒性和胚胎致畸；故動物性食品中的氯霉素殘留對人類的健康構(gòu)成了潛在的危害。
由于氯霉素對人體的影響無法控制，所以不可能制定安全標準。美國和歐盟規(guī)定在動物性的食品中不得檢出氯霉素，任何制造、出售或進口含有氯霉素的食品或動物飼料均為非法。
隨著我國加入WTO，國際貿(mào)易中的技術(shù)壁壘問題突現(xiàn)，并具有要求指標越來越嚴格、范圍不斷增大、往往會引起連鎖反應(yīng)的特點。歐盟曾以中國蜂蜜中氯霉素等抗生素超標為由，中止進口中國的蜂蜜。受歐盟影響，日本、加拿大、美國也由此加強了對中國蜂蜜的檢驗。按照目前的國際標準，蜂蜜產(chǎn)品中氯霉素含量不得超過0.1ppb。
蜂蜜中殘留氯霉素的檢測分別可采用微生物法、免疫法、GC、HPLC、GC-MS等分析方法，但方法檢測的靈敏度大多難以滿足目前的要求。近年來相繼有報道可采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)可對蜂蜜中殘留氯霉素進行高靈敏度的定量分析。
而在現(xiàn)行的蜂蜜中殘留氯霉素的LC-MS/MS檢測中，或采用外標法定量，或用未經(jīng)提取的氯霉素標樣作為定量的標準，影響了測定結(jié)果的可靠性。同時，因其樣品預(yù)處理采用多次液-液萃取、固相萃取或液-液萃取與固相萃取相結(jié)合的方法，其操作煩瑣費時并易引入污染，而氯霉素的色譜分離又需要一定的時間，故難以滿足實際工作尤其是批量分析的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種可快速、同時有效地對蜂蜜中殘留氯霉素進行定量測定的切實可行的并具有通用性的方法，可較好地滿足實際工作的需要。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明建立的LC-MS/MS方法以氘化氯霉素為內(nèi)標，以內(nèi)標法對蜂蜜中殘留的氯霉素進行定量。與外標法相比，利用理化性質(zhì)與氯霉素十分相似的氘化氯霉素為內(nèi)標，可對包括樣品預(yù)處理、色譜分離和質(zhì)譜檢測在內(nèi)的樣品分析全過程中所可能產(chǎn)生的各種誤差進行校正。
本發(fā)明的定量工作曲線，系在空白蜂蜜中添加氯霉素標樣后提取獲得，可避免因提取回收率不同而產(chǎn)生的影響。在樣品預(yù)處理中，采用簡便的液-液萃取法對蜂蜜中殘留的氯霉素進行凈化和富集，在樣品的色譜分離中，采用細口徑的色譜短柱和等度或梯度洗脫法實現(xiàn)氯霉素的快速色譜分離。
1.樣品處理方法液-液萃取法取適量蜂蜜樣品，于相當于蜂蜜樣品體積10-200％(V/V)的水溶液或鹽水溶液(乙酸胺、乙酸鈉、氯化銨、氯化鈉或硫酸鈉等水溶性鹽類，其濃度為重量百分比5％-飽和)混合；取適量混合液，添加內(nèi)標溶液和相當于待提取溶液體積1-10倍量的有機溶劑(乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、丙酮、乙腈、特丁基甲醚或乙醚)后旋渦混合提取，離心分離有機相后氮氣揮干，用少量與色譜流動相的組成相類似的溶液溶解殘渣后供LC-MS/MS進樣測定。
2.LC-MS/MS測定條件液相條件流動相由乙腈(或甲醇)和含甲酸或乙酸(0.01～0.5％；V/V)水溶液或醋酸銨(1～100mmol)的水溶液(用氨水調(diào)節(jié)pH＝6-9)組成，采用等度或梯度洗脫；乙腈∶1～100mmol醋酸銨水溶液用氨水調(diào)節(jié)PH6-9，以體積比計為80-20％∶20-80％，或乙腈∶含水甲酸的水溶液為以體積比計80-20％∶20-80％。色譜柱為硅膠鍵合相填料柱(C18、C8、氰基)的細徑短柱(內(nèi)徑為1.0-3.0mm；長度為30-100mm)。
質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源，負離子多反應(yīng)監(jiān)測掃描。離子選擇通道(Q1/Q3m/z)分別為氯霉素321/151或(和)321/176或(和)321/257；氘化氯霉素(內(nèi)標)326/156或(和)326/179或(和)326/262。
3.標準工作曲線的制備和樣品中氯霉素的定量取空白蜂蜜樣品，定量添加不同濃度的氯霉素標準品后按上述樣品處理方法提取后供LC-MS/MS進樣測定；以標準工作曲線樣品峰面積與內(nèi)標峰面積比為縱坐標，工作樣品濃度(ng/g)為橫坐標，按線形回歸計算后所得。
標準曲線的回歸方程為y＝b x+a…………………………………………(式1)樣品中氯霉素濃度由標準曲線計算所得由式1推得c＝(m-a)/b…………………………………………………(式2)(式中c-試樣中被測組分殘留量，單位為納克每克(ng/g)；m-試樣中樣品峰面積與內(nèi)標峰面積比。)注計算結(jié)果應(yīng)扣除空白值。
本發(fā)明樣品處理方法操作簡便，色譜分離快速，定量可靠。蜂蜜中的其他成分對氯霉素的定量無干擾；蜂蜜中氯霉素定性檢測限優(yōu)于0.1ppb(信噪比≥3)；定量限優(yōu)于0.1ppb(信噪比≥10)；線性范圍為0.1-25.6ppb，相關(guān)系數(shù)r在0.999以上；日內(nèi)及日間精密度≤15％；不同來源的蜂蜜中氯霉素的提取回收率大于75％。樣品檢測專一性強、靈敏度高。各項方法學指標均能可靠地滿足檢測蜂蜜中殘留氯霉素的實際需要。
本發(fā)明蜂蜜中殘留氯霉素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測定方法。其特點為以氘化氯霉素為內(nèi)標，采用內(nèi)標法定量；其定量工作曲線系在空白蜂蜜中添加氯霉素標樣后提取獲得；樣品處理方法簡便，蜂蜜樣品經(jīng)簡便的一次液-液萃取就可使其中的微量氯霉素得到凈化和富集；色譜分離采用細口徑的色譜短柱和乙腈或甲醇及含氨水和醋酸銨或甲酸、乙酸的水為流動相進行等度或梯度洗脫。采用本法可簡便、可靠地對蜂蜜中殘留的氯霉素進行定量檢測，各項方法學指標均可滿足實際檢測的需要。


圖1是氯霉素標準物質(zhì)碎片離子掃描圖。
圖2是氘化氯霉素碎片離子掃描圖。
圖3是氯霉素標準物質(zhì)和氘化氯霉素的選擇離子掃描圖(堿性流動相，等度洗脫)。
圖4是氯霉素標準物質(zhì)和氘化氯霉素的選擇離子掃描圖(酸性流動相，梯度洗脫)。
具體實施例方式
<實施例>
1a.樣品處理方法(液-液萃取)稱取5g試樣，精確到0.001g，準確加入5ml水后混合。精確量取上述混合液1.0ml置于10mL具塞離心管中，準確加入50μL內(nèi)標工作溶液(氘化氯霉素，D5)和3mL乙酸乙酯，在旋渦混合器旋渦混合5min，以3000r/min離心5min，吸取上層乙酸乙酯轉(zhuǎn)入另一5mL具塞離心管中，用氮氣吹干儀在55℃揮干，加入200μL流動相溶解，以10000r/min離心5min，取上清液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進樣測定。
1b.樣品處理方法(鹽析/液-液萃取)稱取5g試樣，精確到0.001g，準確加入5ml醋酸鈉飽和水溶液后混合。精確量取上述混合液1.0ml置于10mL具塞離心管中，準確加入50μL內(nèi)標工作溶液(氘化氯霉素，D5)工作溶液和3mL乙酸乙酯，在旋渦混合器旋渦混合5min，以3000r/min離心5min，吸取上層乙酸乙酯轉(zhuǎn)入另一5mL具塞離心管中，用氮氣吹干儀在55℃揮干，加入200μL流動相溶解，以10000r/min離心5min，取上清液供液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜儀進樣測定。
2a.液相色譜條件(等度洗脫)a)色譜柱CAPCELL PAK C18.MG.5μm，100mm×2.0mm(i.d)；b)流動相乙腈∶10mmol醋酸銨水溶液(用氨水調(diào)節(jié)pH＝8)＝25份∶75份；c)流速0.3ml/min；d)柱溫室溫；e)進樣量10μL。
2b.液相色譜條件(梯度洗脫)a)色譜柱CAPCELL PAK C18.MG.5μm，50mm×2.0mm(i.d)；b)流動相A乙腈，B0.02％甲酸水溶液。
梯度方式0-1.5min，80-20％B；1.5-1.6min，20％B-80％B；1.6-5.0min，80％B；5.0min，stop。
c)流速0.3ml/min；d)柱溫室溫；e)進樣量10μL。
3.質(zhì)譜條件a)離子源電噴霧離子源；b)掃描方式負離子掃描；c)檢測方式多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；d)霧化氣壓力(NEB)10；e)氣簾氣壓力(CUR)8；f)輔助氣流速(CAD)12L/min；g)電噴霧電壓(IS)-1500V；h)離子源溫度(TEM)450℃；i)定性離子對、定量離子對和測定參數(shù)

*DP去簇電壓；FP聚焦電壓；EP進口電壓；CE碰撞能量；CXP碰撞池進口能量按內(nèi)標法以峰面積或峰高法計算出蜂蜜中氯霉素的含量濃度。
在上述條件下，蜂蜜中氯霉素的檢測限為0.1ng/g(信噪比≥3)。氯霉素的色譜參考保留時間為5min(2a條件)和2.6min(2b條件)，色譜圖參見說明書附圖。
權(quán)利要求
1.一種蜂蜜中氯霉素含量測定方法，包括a、蜂蜜樣品添加氘化氯霉素內(nèi)標溶液和10-200％(V/V)的水溶液或鹽水溶液后采用液-液萃取進行預(yù)處理；b、取預(yù)處理后的樣品進行LC-MS/MS測定；采用硅膠鍵合相填料C18、C8、氰基的細徑色譜柱內(nèi)徑為1.0-3.0mm；長度為30-100mm和由乙腈或甲醇和含氨水和醋酸銨pH＝6-9或甲酸或乙酸0.01～0.5％V/V水溶液組成的流動相，進行等度或梯度洗脫；c、質(zhì)譜檢測采用電噴霧離子源，負離子多反應(yīng)監(jiān)測掃描。離子選擇通道為Q1/Q3 m/z分別為氯霉素321/151或/和321/176或/和321/257；內(nèi)標氘化氯霉素326/156或/和326/179或/和326/262。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜂蜜中氯霉素含量測定方法，其特征在于預(yù)處理樣品時在蜂蜜樣品中添加的鹽水溶液中的鹽為乙酸胺、乙酸鈉、氯化銨、氯化鈉或硫酸鈉的水溶性鹽類，其濃度為重量百分比5％-飽和。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜂蜜中氯霉素含量測定方法，其特征在于液-液萃取提取氯霉素的溶劑包括乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、丙酮、乙腈、特丁基甲醚或乙醚。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜂蜜中氯霉素含量測定方法，其特征在于色譜柱長度為30-100mm，內(nèi)徑為1.0-3.0mm，填料為C18、C8或氰基硅膠鍵合相。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜂蜜中氯霉素含量測定方法，其特征在于采用LC-MS/MS以氘化氯霉素為內(nèi)標，采用C18、C8或氰基填料的色譜柱，流動相為含乙腈或甲醇和含氨水和醋酸銨(pH＝6-9)及甲酸或乙酸(0.01～0.5％)水溶液組成，進行等度或梯度洗脫。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜂蜜中氯霉素含量測定方法，其特征在于在蜂蜜樣品中添加氘化氯霉素為內(nèi)標，以內(nèi)標法進行定量。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜂蜜中氯霉素含量測定方法，其特征在于采用流動相進行等度或梯度冼脫，乙腈∶1～100mmol醋酸銨水溶液(用氨水調(diào)節(jié)pH＝6-9)為80-20％∶20-80％V/V。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜂蜜中氯霉素含量測定方法，其特征在于采用流動相進行等度或梯度冼脫乙腈∶含甲酸的水為80-20％∶20-80％V/V。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜂蜜中氯霉素含量測定方法，其特征在于其定量工作曲線系在空白蜂蜜中添加0.1-25.6ppb的氯霉素標樣后，按權(quán)利要求2和3的方法提取后獲得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蜂蜜中氯霉素含量測定方法，包括被測樣品用一次液－液萃取的預(yù)處理，以氘化氯霉素為內(nèi)標進行LC－MS/MS檢測。
文檔編號G01N30/72GK1763521SQ20041006740
公開日2006年4月26日 申請日期2004年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月22日
發(fā)明者余琛, 陳忠敏, 賈晶瑩, 劉罡一, 龔洪崗, 馬又娥, 張淵 申請人:上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院