專利名稱：快速鑒定小麥品種的毛細(xì)管電泳方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小麥品種的快速鑒定方法，特別是通過毛細(xì)管電泳手段快速鑒定小麥品種的方法。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)鞘澜缱钪匾募Z食作物之一，在三大作物中年總產(chǎn)量超僅次于玉米。小麥也是人類糧食消費(fèi)中重要的蛋白質(zhì)來源。我國(guó)一直是世界小麥生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，2002年播種面積2350萬(wàn)km2，總產(chǎn)8929萬(wàn)噸，居世界第一位。近年來我國(guó)隨著市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，在小麥種子生產(chǎn)與經(jīng)營(yíng)、新品種選育和品種權(quán)益保護(hù)以及流通加工等領(lǐng)域急需快速高效的小麥品種鑒定方法。目前，鑒定小麥品種主要采用形態(tài)鑒定、同工酶鑒定、貯藏蛋白SDS凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定和酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)鑒定、反相高效液相色譜(RP-HPLC)鑒定、分子標(biāo)記鑒定等方法。然而上述些方法均存在不同程度的局限性，如形態(tài)特征易受環(huán)境因素影響，可靠性差；同工酶、蛋白質(zhì)電泳分離時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)工費(fèi)時(shí)，多數(shù)情況下需要1-2天才能獲得分析結(jié)果，而且分辨率低，對(duì)一些親緣關(guān)系近的品種往往無法區(qū)分，其分辨度和重復(fù)性也較差，難以進(jìn)行數(shù)量化分析和不同實(shí)驗(yàn)室所得結(jié)果間的比較，另外PAGE方法還須使用有神經(jīng)毒性的丙烯酰胺以及其他污染試劑；RP-HPLC雖自動(dòng)化程度高，但儀器設(shè)備昂貴，分析成本高，分辨率也難以滿足需要；DNA分子標(biāo)記技術(shù)，如PCR、RAPD、AFLP等，近年來研究較多，準(zhǔn)確性較高，但技術(shù)復(fù)雜，費(fèi)工費(fèi)時(shí)，鑒定成本高，難以廣泛應(yīng)用。因此，現(xiàn)有的小麥品種鑒定方法還不能快速高效地對(duì)小麥品種作出鑒定。
小麥種子貯藏蛋白主要由醇溶蛋白和谷蛋白組成，它們?cè)诮M成上具有高度的異質(zhì)性和復(fù)雜性。醇溶蛋白A-PAGE是目前常用的實(shí)驗(yàn)室鑒定技術(shù)，國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)(ISTA)在1987年公布了小麥和大麥品種鑒定A-PAGE標(biāo)準(zhǔn)方法(Draper，1987)。醇溶蛋白是單體蛋白，分子量約在30000-80000道爾頓之間，在單向酸性凝膠電泳條件下，一個(gè)品種一般可分離出15-30個(gè)組分，雙向電泳可分離出多達(dá)50個(gè)組分，根據(jù)其相對(duì)遷移率可分為α、β、γ和ω四種醇溶蛋白，它們分別占其總量的25％、30％、30％和15％。醇溶蛋白由1、6部分同源染色體上的Gli-1和Gli-2位點(diǎn)編碼，具有很高的多態(tài)性，目前已鑒定并命名了100多個(gè)等位基因(Metakovsky，1991)。醇溶蛋白組成由基因型決定，不受環(huán)境因素的影響，因此可作為鑒定品種的可靠遺傳標(biāo)記。由于醇溶蛋白組成異質(zhì)性很高，高效的分離技術(shù)是品種鑒定的關(guān)鍵。毛細(xì)管電泳(CapillaryElectrophoresis，CE)是近年來分離科學(xué)發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)(Landers，1991；Xu，1993；Bean and Lookhart，2001)，在小麥蛋白質(zhì)分離和品種鑒定中具有獨(dú)特的優(yōu)越性，應(yīng)用前景廣闊。目前毛細(xì)管電泳的主要模式是毛細(xì)管區(qū)帶電泳(Capillary Free Zone Electrophoresis，CFZE)，又稱毛細(xì)管自由電泳，是CE中最基本、應(yīng)用最普遍的一種分離模式。
毛細(xì)管電泳的儀器裝置主要包括五個(gè)部分高壓電源、進(jìn)樣系統(tǒng)、毛細(xì)管柱、檢測(cè)器和記錄系統(tǒng)。制作毛細(xì)管的材料——熔融硅膠的等電點(diǎn)(pI)為1.5左右，在堿性和微酸性(PH＞2.5)溶液中，熔硅表面的硅羥基(Si-OH)電離成SiO-，使其內(nèi)表面帶負(fù)電。負(fù)電荷表面在溶液中積聚相反電荷的離子，在管壁和溶液之間形成雙電層。在高電場(chǎng)的作用下，雙電層中的水合陽(yáng)離子引起的流體整體將朝負(fù)極方向移動(dòng)，該現(xiàn)象被稱為電滲(Electroosmosis)。粒子在毛細(xì)管內(nèi)一方面受到電場(chǎng)作用而在緩沖溶液中發(fā)生定向移動(dòng)，即電泳；另一方面受到電滲的影響。粒子最終的遷移速度等于電泳流和電滲流的矢量和。樣品中的正離子電泳方向與電滲流方向一致，故最先流出；中性粒子僅在電滲流的作用下流向負(fù)極，速度較正離子慢；負(fù)離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲相反，在電滲速度大于電泳速度時(shí)，將在中性粒子之后流出，如果負(fù)離子泳流速度大于滲流速度，則無法流出。一般來說，電滲流速度大于電泳速度，所以樣品中所有組分將朝一個(gè)方向移動(dòng)，這樣各種粒子因在毛細(xì)管介質(zhì)中的遷移速度不同實(shí)現(xiàn)了分離。影響毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離效果的因素較多，主要包括操作電壓、溫度、緩沖溶液的類型與濃度、pH值、添加劑的選擇與濃度的確定，毛細(xì)管柱的改性等。在實(shí)際應(yīng)用中，需要針對(duì)的具體檢測(cè)物對(duì)這些因素進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最佳分離效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速鑒定小麥品種的毛細(xì)管電泳方法，其主要通過小麥種子貯藏蛋白中醇溶蛋白的高效分離與鑒定實(shí)現(xiàn)對(duì)小麥種子的鑒定，相對(duì)于現(xiàn)有的鑒定技術(shù)方法，其具有快速、準(zhǔn)確、成本低、可重復(fù)性好的特點(diǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)方案包括取樣及樣品制備、毛細(xì)管電泳和數(shù)據(jù)處理分析，其特征是高效毛細(xì)管電泳時(shí)的電泳緩沖液(buffer)為100-120mm磷酸-甘氨酸緩沖液，該緩沖液pH為2.5-2.8，添加有18-22％乙腈和0.04-0.06％羥脯氨酰甲基纖維素，具體電泳條件參數(shù)為毛細(xì)管長(zhǎng)度25-26cm毛細(xì)管內(nèi)徑25μm，50μm運(yùn)行電壓11-15kV毛細(xì)管溫度35-40℃樣品槽溫度10-15℃進(jìn)樣8-10kV，5-10sec在上述的技術(shù)方案中，為了能夠連續(xù)檢測(cè)樣品和保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在進(jìn)行高效毛細(xì)管電泳時(shí)，對(duì)毛細(xì)管進(jìn)行沖洗必須按沖洗程序操作，按照沖洗目的的不同，沖洗程序具體分為以下四種情況(1)對(duì)于新的毛細(xì)管在使用前要進(jìn)行預(yù)處理沖洗，沖洗程序如下H2O 4-6min0.1MNaOH 9-12minH2O 4-6min1MH3PO48-12minBuffer60-70min(2)進(jìn)樣前對(duì)毛細(xì)管進(jìn)行沖洗，沖洗程序如下H2O 5-10min0.1MNaOH 6-8minH2O 5-10min1MH3PO46-8minBuffer25-30min(3)當(dāng)一次鑒定測(cè)定多個(gè)樣品時(shí)，兩次樣品檢測(cè)之間要進(jìn)行沖洗，沖洗程序如下1MH3PO42-4minH2O 2-3minBuffer1.5-3min(4)檢測(cè)結(jié)束后對(duì)毛細(xì)管進(jìn)行沖洗，沖洗程序如下1MH3PO44-6minH2O 4-6min0.1MNaOH 2-4minH2O 10-20minN29-11min
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(1)樣品用量少只需半粒種子約15mg即可進(jìn)行多次分析，而且樣品可保存一個(gè)月以上。利用本方法可在20min內(nèi)完成一個(gè)樣品的分離，效率明顯高于常規(guī)的A-PAGE方法。
(2)分辨度高一個(gè)品種一般可分離出25-40個(gè)蛋白組分，常規(guī)A-PAGE方法只有15-25個(gè)組分，而且圖譜穩(wěn)定，不受生長(zhǎng)環(huán)境、種植年份和貯藏時(shí)間(室溫5年)的影響。對(duì)一些親緣關(guān)系很近以及A-PAGE圖譜相同的品種，用本方法仍能有效鑒定。
(3)重復(fù)性高峰遷移時(shí)間和峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別小于0.5％和4％。從進(jìn)樣到結(jié)果分析自動(dòng)化程度高，簡(jiǎn)便易于操作。
(4)從樣品制備到蛋白質(zhì)分離分析方法簡(jiǎn)單，每次可連續(xù)分離30個(gè)樣品，均由軟件控制。而且分析成本低，只需廉價(jià)毛細(xì)管和一些常用試劑，用量很少，無毒害，對(duì)環(huán)境無污染。


圖1.普通小麥品種“京411”醇溶蛋白毛細(xì)管電泳標(biāo)準(zhǔn)圖譜；圖2.中國(guó)春等七種不同小麥品種醇溶蛋白毛細(xì)管電泳比較圖譜；圖3.中品3號(hào)等四種不同小麥品種醇溶蛋白毛細(xì)管電泳比較圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1指紋標(biāo)準(zhǔn)圖譜的構(gòu)建(1)取樣及樣品制備取小麥品種“京411”單粒種子，用刀片去掉胚端，準(zhǔn)確稱量后用硫酸紙和小鐵錘扎碎成細(xì)粉，放入1ml離心管中；按1mg加7μl的比例加入30％乙醇，室溫下震蕩提取15min，10000rpm離心10min，上清液用于毛細(xì)管電泳(可在4℃下保存4周以上)。
(2)毛細(xì)管電泳
①儀器設(shè)備采用Bio-Rad公司生產(chǎn)的BioFocus 3000型高效毛細(xì)管電泳儀系統(tǒng)(配有軟件用于系統(tǒng)操作和數(shù)據(jù)處理)進(jìn)行CE分析。
②毛細(xì)管彈性石英毛細(xì)管柱，內(nèi)徑為25μm、長(zhǎng)度為25.5cm(檢測(cè)長(zhǎng)度20cm)，外層涂有聚酰亞胺保護(hù)層，內(nèi)壁均未涂層。
③電泳緩沖液100mm磷酸-甘氨酸緩沖液(pH2.50，添加有20％乙腈和0.05％羥脯氨酰甲基纖維素HPMC)。500ml磷酸-甘氨酸緩沖液的制備方法85％的磷酸1.6ml，甘氨酸2.0g，乙腈100ml，HPMC 0.25g，加入雙蒸水定容至500ml，調(diào)節(jié)pH為2.50，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，4℃保存。
④毛細(xì)管柱沖洗方法A.新毛細(xì)管預(yù)處理程序H2O5min0.1MNaOH9minH2O5min1MH3PO48minBuffer 60minB.進(jìn)樣前沖洗H2O5min0.1MNaOH6minH2O5min1MH3PO46minBuffer 25minC.樣品間沖洗程序1MH3PO44minH2O2minBuffer 3minD.結(jié)束實(shí)驗(yàn)沖洗1MH3PO45minH2O5min0.1MNaOH2minH2O15minN210min⑤電泳參數(shù)運(yùn)行電壓 15kV
毛細(xì)管溫度40℃樣品槽溫度15℃進(jìn)樣 8kV，5sec電極 由+向-⑥數(shù)據(jù)處理利用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，同時(shí)將電泳結(jié)果轉(zhuǎn)換成ASC碼，進(jìn)行Excel處理分析。
(3)指紋圖譜構(gòu)建對(duì)需鑒定的品種和雜交種及親本，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
獲得小麥品種“京411”的標(biāo)準(zhǔn)圖譜如圖1所示，從圖中可分析不同蛋白組分。
實(shí)施例2利用本發(fā)明構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)圖譜及對(duì)小麥品種進(jìn)行鑒定。
(1)取樣及樣品制備選取中國(guó)春(Chinese Spring)等七種小麥品種或親本與雜交種種子，按實(shí)施例1中方法提取醇溶蛋白，4℃保存。
(2)毛細(xì)管電泳分離①儀器設(shè)備采用Bio-Rad公司生產(chǎn)的BioFocus 3000型高效毛細(xì)管電泳儀系統(tǒng)(配有軟件用于系統(tǒng)操作和數(shù)據(jù)處理)進(jìn)行CE分析。
②毛細(xì)管彈性石英毛細(xì)管柱，內(nèi)徑為50μm、長(zhǎng)度為25cm(檢測(cè)長(zhǎng)度20cm)，外層涂有聚酰亞胺保護(hù)層，內(nèi)壁均未涂層。
③電泳緩沖液110mm磷酸-甘氨酸緩沖液(pH2.60，添加有18％乙腈和0.04％羥脯氨酰甲基纖維素HPMC)。按實(shí)施例1中方法制備緩沖液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，4℃保存。
④毛細(xì)管柱沖洗方法A.新毛細(xì)管預(yù)處理程序H2O4min0.1MNaOH12minH2O4min1MH3PO410minBuffer 65minB.進(jìn)樣前沖洗H2O8min0.1MNaOH7min
H2O 8min1MH3PO47minBuffer 27min.
C.樣品間沖洗程序1MH3PO42minH2O 3minBuffer 1.5minD.結(jié)束實(shí)驗(yàn)沖洗1MH3PO44minH2O 4min0.1MNaOH 3minH2O 10minN211min⑤電泳參數(shù)運(yùn)行電壓11kV毛細(xì)管溫度35℃樣品槽溫度10℃進(jìn)樣 9kV，8sec電極 由+向-⑥數(shù)據(jù)處理利用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，同時(shí)將分離數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成ASC碼保存，用Excel格式作圖，進(jìn)行重疊比較與鑒定。
(3)標(biāo)準(zhǔn)圖譜構(gòu)建對(duì)選定品種和雜種品種及其親本建立標(biāo)準(zhǔn)毛細(xì)管電泳圖譜，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種重復(fù)電泳20-30次，計(jì)算峰遷移時(shí)間、峰高、峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，獲得各個(gè)醇溶蛋白組分的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，作為品種真實(shí)性和純度鑒定或品種權(quán)保護(hù)的比較標(biāo)準(zhǔn)。
(4)品種鑒定如進(jìn)行品種真實(shí)性和品種權(quán)保護(hù)鑒定，隨機(jī)取樣分析10粒種子，每個(gè)樣品重復(fù)分離3次。品種純度鑒定隨機(jī)取50-100粒種子，重復(fù)分離3次，然后與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較，計(jì)算品種純度。
中國(guó)春等七種不同小麥品種醇溶蛋白毛細(xì)管電泳比較圖譜如圖2所示。實(shí)施例3利用本發(fā)明構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)圖譜及對(duì)小麥品種進(jìn)行鑒定。
(1)取樣與樣品制備選取中品3號(hào)等四種小麥品種或親本與雜交種鑒定，按實(shí)施例1中方法提取醇溶蛋白，4℃保存。
(2)毛細(xì)管電泳分離①儀器設(shè)備采用Bio-Rad公司生產(chǎn)的BioFocus 3000型高效毛細(xì)管電泳儀系統(tǒng)(配有軟件用于系統(tǒng)操作和數(shù)據(jù)處理)進(jìn)行CE分析。
②毛細(xì)管彈性石英毛細(xì)管柱，內(nèi)徑為50μm、長(zhǎng)度為26cm(檢測(cè)長(zhǎng)度20cm)，外層涂有聚酰亞胺保護(hù)層，內(nèi)壁均未涂層。
③電泳緩沖液120mm磷酸-甘氨酸緩沖液(pH2.80，添加有22％乙腈和0.06％羥脯氨酰甲基纖維素HPMC)。按實(shí)施例1中方法制備緩沖液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，4℃保存。
④毛細(xì)管柱沖洗方法A.新毛細(xì)管預(yù)處理程序H2O6min0.1MNaOH12minH2O6min1MH3PO412minBuffer 70minB.進(jìn)樣前沖洗H2O10min0.1MNaOH8minH2O10min1MH3PO48minBuffer 30minC.樣品間沖洗程序1MH3PO43minH2O3minBuffer 30minD.結(jié)束實(shí)驗(yàn)沖洗1MH3PO46minH2O6min0.1MNaOH4minH2O20minN211min⑤電泳參數(shù)運(yùn)行電壓 12kV
毛細(xì)管溫度37℃樣品槽溫度12℃進(jìn)樣 10kV，10sec電極 由+向-⑥數(shù)據(jù)處理利用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，同時(shí)將分離數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成ASC碼保存，用Excel格式作圖，進(jìn)行重疊比較與鑒定。
(3)標(biāo)準(zhǔn)圖譜構(gòu)建對(duì)選定品種和雜種品種及其親本建立標(biāo)準(zhǔn)毛細(xì)管電泳圖譜，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種重復(fù)電泳20-30次，計(jì)算峰遷移時(shí)間、峰高、峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，獲得各個(gè)醇溶蛋白組分的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，作為品種真實(shí)性和純度鑒定或品種權(quán)保護(hù)的比較標(biāo)準(zhǔn)。
(4)品種鑒定如進(jìn)行品種真實(shí)性和品種權(quán)保護(hù)鑒定，隨機(jī)取樣分析10粒種子，每個(gè)樣品重復(fù)分離3次。品種純度鑒定隨機(jī)取50-100粒種子，重復(fù)分離3次，然后與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較，計(jì)算品種純度。
中品3號(hào)等四種不同小麥品種醇溶蛋白毛細(xì)管電泳比較圖譜如圖3所示。
權(quán)利要求
1.一種快速鑒定小麥品種的毛細(xì)管電泳方法，包括取樣及樣品制備、毛細(xì)管電泳和數(shù)據(jù)處理分析，其特征是高效毛細(xì)管電泳時(shí)的電泳緩沖液為100-120mm磷酸-甘氨酸緩沖液，該緩沖液pH為2.5-2.8，添加有18-22％乙腈和0.04-0.06％羥脯氨酰甲基纖維素，具體電泳條件參數(shù)為毛細(xì)管長(zhǎng)度25-26cm毛細(xì)管內(nèi)徑25μm，50μm運(yùn)行電壓11-15kV毛細(xì)管溫度35-40℃樣品槽溫度10-15℃進(jìn)樣8-10kV，5-10sec。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管電泳方法，其特征是為了能夠連續(xù)檢測(cè)樣品和保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在進(jìn)行高效毛細(xì)管電泳時(shí)，對(duì)毛細(xì)管進(jìn)行沖洗必須按沖洗程序操作，按照沖洗目的的不同，沖洗程序具體分為以下四種情況(1)對(duì)于新的毛細(xì)管在使用前要進(jìn)行預(yù)處理沖洗，沖洗程序如下H2O 4-6min0.1M NaOH 9-12minH2O 4-6min1M H3PO48-12minBuffer 60-70min(2)進(jìn)樣前對(duì)毛細(xì)管進(jìn)行沖洗，沖洗程序如下H2O 5-10min0.1M NaOH 6-8minH2O 5-10min1M H3PO46-8minBuffer 25-30min(3)當(dāng)一次鑒定測(cè)定多個(gè)樣品時(shí)，兩次樣品檢測(cè)之間要進(jìn)行沖洗，沖洗程序如下1M H3PO42-4minH2O 2-3minBuffer1.5-3min(4)檢測(cè)結(jié)束后對(duì)毛細(xì)管進(jìn)行沖洗，沖洗程序如下1M H3PO44-6minH2O 4-6min0.1M NaOH 2-4minH2O 10-20minN29-11min。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的毛細(xì)管電泳方法，其特征在于通過本發(fā)明能夠建立小麥醇溶蛋白的標(biāo)準(zhǔn)毛細(xì)管圖譜，進(jìn)而形成對(duì)小麥品種進(jìn)行鑒定的一套完整的技術(shù)體系。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種小麥品種的快速鑒定方法，特別是通過毛細(xì)管電泳手段快速鑒定小麥品種的方法。小麥種子貯藏蛋白中醇溶蛋白具有高度的異質(zhì)性，醇溶蛋白組成由基因型決定，不受環(huán)境因素的影響，因此可作為鑒定品種的可靠遺傳標(biāo)記。本發(fā)明的提供快速鑒定小麥品種的毛細(xì)管電泳方法，主要通過小麥種子貯藏蛋白中醇溶蛋白的高效分離與鑒定實(shí)現(xiàn)對(duì)小麥種子的鑒定，相對(duì)于現(xiàn)有的鑒定技術(shù)方法，其具有快速、準(zhǔn)確、成本低、可重復(fù)性好的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N30/38GK1570622SQ20041003725
公開日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2004年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月30日
發(fā)明者晏月明, 余建中, 胡英考, 蔡民華, 姜怡, 鄭繼剛, 安學(xué)麗 申請(qǐng)人:首都師范大學(xué)