專利名稱：上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器，該生物傳感器可對(duì)基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)免疫層析試紙進(jìn)行結(jié)果判讀，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體、抗原、抗體、違禁藥品、重大疾病(腫瘤、癌癥和糖尿病等)標(biāo)志物等多種目標(biāo)被檢物的定性定量以及多重檢測(cè)。
背景技術(shù)：
上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料(Up-Converting Phosphor，下稱UCP)是一種可對(duì)能量進(jìn)行上轉(zhuǎn)的無(wú)機(jī)合成物，即UCP可吸收低能量的(長(zhǎng)波長(zhǎng))紅外光，但卻發(fā)射高能量的(短波長(zhǎng))可見(jiàn)光。UCP是由幾種稀土金屬元素?fù)诫s于某些晶體的晶格中構(gòu)成的。在這種材料中有三種主要的成分主基質(zhì)、吸收子和發(fā)射子。
上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料發(fā)出的磷光光子能量高于激發(fā)光，即發(fā)射光波長(zhǎng)短于激發(fā)光。具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光性能的材料是由稀土金屬元素?cái)v雜于晶體的晶格中而構(gòu)成的化合物，其發(fā)光機(jī)理是上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料通過(guò)吸收兩個(gè)紅外光子發(fā)出一個(gè)可見(jiàn)光子。將這種上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料制備成納米級(jí)顆粒，標(biāo)記于生物分子，在紅外光激發(fā)下該顆粒將發(fā)出可見(jiàn)磷光。根據(jù)磷光的有無(wú)及其強(qiáng)弱，可判斷被檢生物分子的屬性及其含量。與傳統(tǒng)標(biāo)記物相比，將上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料作為標(biāo)記物應(yīng)用于生物分析中，具有無(wú)本底干擾、無(wú)焠滅、可進(jìn)行多重分析和定量分析等優(yōu)點(diǎn)。
附圖1中描述了UCP顆粒在生物檢測(cè)領(lǐng)域中應(yīng)用的原理示意圖。將上轉(zhuǎn)換發(fā)光顆粒與生物活性分子通過(guò)共價(jià)鍵相連接制備標(biāo)記物，該標(biāo)記物在層析的過(guò)程中通過(guò)免疫反應(yīng)固定于固相載體的表面，并在紅外光的激發(fā)下發(fā)射出可見(jiàn)光。由此實(shí)現(xiàn)上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料與免疫層析技術(shù)相結(jié)合對(duì)生物樣品中的目標(biāo)被檢物進(jìn)行檢測(cè)。
現(xiàn)有技術(shù)中，判讀上轉(zhuǎn)換標(biāo)記顆粒發(fā)光情況的方法通常是，在紅外激光照射下，通過(guò)肉眼來(lái)觀察其發(fā)光情況。這種方法存在如下缺點(diǎn)1、只能定性觀察生物反應(yīng)的陽(yáng)性與陰性，不能判斷陽(yáng)性反應(yīng)的程度，即無(wú)法進(jìn)行定量判讀。
2、判讀結(jié)果受操作者主觀判斷能力與經(jīng)驗(yàn)的影響很大，如果磷光強(qiáng)度很弱，則肉眼無(wú)法看到。所以這種判讀方法結(jié)果不可靠，且靈敏度低。
3、操作者容易受到被檢生物樣品的污染，同時(shí)操作者又可能對(duì)生物樣品造成污染，因?yàn)椴僮髡弑仨毢芸拷粰z樣品才能觀察到標(biāo)記物的發(fā)光情況。
目前，免疫層析技術(shù)中所使用的標(biāo)記物通常為酶、膠體金以及著色膠珠標(biāo)記物，這幾種標(biāo)記物應(yīng)用于免疫層析技術(shù)中有兩個(gè)共同點(diǎn)物理吸附交聯(lián)法與通過(guò)顏色判斷結(jié)果。其中物理吸附法(即通過(guò)疏水性以及靜電吸附制備標(biāo)記物)的脆弱性使得基于該種標(biāo)記物的免疫層析對(duì)于反應(yīng)的條件要求極為苛刻，從而一些有效的非特異去除試劑，如吐溫20(Tween 20)、吹通100(Triton 100)、十二烷基磺酸鈉(SDS)等，由于對(duì)疏水性以及靜電性的影響改變而只能在低濃度使用，由此便造成了基于該種標(biāo)記物的免疫層析試紙假陽(yáng)性率、假陰性率較高的必然結(jié)果；另外通過(guò)顏色判斷結(jié)果在使用操作簡(jiǎn)便的同時(shí)必然受觀察者主觀影響大、靈敏度低，且只能停留在定性水平，而絕對(duì)無(wú)法實(shí)現(xiàn)精確定量。這些缺點(diǎn)大大的限制了免疫層析技術(shù)在生物檢測(cè)中的應(yīng)用范圍。
UCP作為標(biāo)記物應(yīng)用于免疫層析技術(shù)，不僅提高了檢測(cè)靈敏度與穩(wěn)定性，并且以其發(fā)光標(biāo)記物的特點(diǎn)可與儀器結(jié)合對(duì)目標(biāo)被檢物進(jìn)行多重定量檢測(cè)。因此，人們希望開(kāi)發(fā)出一種生物傳感器對(duì)基于UCP的免疫層析試紙進(jìn)行結(jié)果判讀，從而最終實(shí)現(xiàn)對(duì)多種目標(biāo)被檢物的快速多重定量檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供的上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器，其結(jié)構(gòu)特征在于包含激發(fā)光路、磷光圖像接收光路、圖像處理系統(tǒng)，該傳感器可對(duì)基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)免疫層析試紙進(jìn)行結(jié)果判讀，所述的激發(fā)光路由紅外激發(fā)光源和一維聚焦鏡組成；所述的用以判讀的試紙條安裝于特制的外殼中，呈細(xì)長(zhǎng)形，在試紙條上設(shè)置了多個(gè)功能帶，如一個(gè)質(zhì)控帶和一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)帶，功能帶以一定間距平行排列，其方向垂直于試紙條長(zhǎng)邊方向；所述的磷光圖像接收光路包括成像物鏡、濾光片和圖像接收器；所述的激發(fā)光路與磷光圖像接收光路分置于試紙條兩側(cè)，兩者的光軸與試紙條法線之間各存在一個(gè)夾角，而且兩個(gè)夾角通常是不相等的；所述的一維聚焦鏡將紅外激發(fā)光源發(fā)出的光束變換成一條高光強(qiáng)[例如強(qiáng)度為0.1-0.3，優(yōu)選0.15瓦/平方厘米(W/cm2)]的焦線，且焦線方向與試紙條的長(zhǎng)邊一致，從而將試紙條上的各功能帶全部照明。
所述的磷光圖像接收光路中的成像物鏡由前鏡組和后鏡組組成，在兩個(gè)鏡組中間安裝了濾光片。
所述的圖像處理系統(tǒng)主要用于分析、保存磷光圖像，給出判讀結(jié)果。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列技術(shù)效果1、判讀效率高。激發(fā)光路中采用高強(qiáng)度的紅外光焦線照明試紙條，而且同時(shí)將試紙條上的各功能帶照明；磷光圖像接收光路將試紙條上各功能帶的磷光圖像成像于圖像接收器上；所以各功能帶發(fā)出的磷光強(qiáng)度可同時(shí)判讀；且磷光信號(hào)強(qiáng)度與功能帶位置一一對(duì)應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)多重判讀。
2、操作簡(jiǎn)單。激發(fā)光路、磷光圖像接收光路和試紙條三者相對(duì)位置固定，判讀時(shí)只將試紙條置于激發(fā)光路焦線處，無(wú)需運(yùn)動(dòng)即可判讀出各功能帶的發(fā)光強(qiáng)度。
3、可以定量判讀。圖像處理系統(tǒng)將試紙條磷光圖像處理后，可給出各功能帶的磷光強(qiáng)度值。
本發(fā)明的上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器中采用的試紙條為基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)免疫層析試紙。
附圖2中顯示了試紙條的一般結(jié)構(gòu)包括樣品墊10(Sample Pad)，結(jié)合墊11(Conjugate Pad或結(jié)合物釋放墊Conjugate Release Pad)，分析膜12(AnalyticalMembrane)，吸水墊13(Wicking Pad)、塑料背板14(其中一面涂有粘膠)(LaminatingCard)。樣品墊10、結(jié)合墊11、膜12、吸水墊13通過(guò)粘膠15固定于塑料背板14上。
a.樣品墊10是使用過(guò)程中滴加被檢樣品的部位；b.結(jié)合墊11中固定有UCP-抗體、UCP-抗原等UCP-生物活性分子結(jié)合物，在加入檢測(cè)樣品后，其可在試紙條上發(fā)生免疫反應(yīng)；c.分析膜12是層析試紙的核心部分，檢測(cè)帶17、質(zhì)控帶18均固定于分析膜12的某一具體位置；d.吸水墊13在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中，通過(guò)虹吸作用提供液體流過(guò)整個(gè)試紙條的動(dòng)力。
各個(gè)部分之間的重疊區(qū)域16保證了液體在試紙條上流動(dòng)的連續(xù)性。當(dāng)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，將樣品滴加到樣品墊10上，樣品通過(guò)滲透與虹吸作用進(jìn)入結(jié)合墊11，使其中的UCP結(jié)合物重新溶解游離，并在吸水墊13的虹吸作用下，離開(kāi)結(jié)合墊11進(jìn)入膜12，在其內(nèi)部向吸水墊13的方向流動(dòng)。此過(guò)程中UCP結(jié)合物、目標(biāo)被檢物、檢測(cè)帶17、質(zhì)控帶18之間將特異地發(fā)生一定的免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生具有指示性的信號(hào)。
本發(fā)明中試紙條的裝配，包括以下步驟A.將塑料背板12剪切成7.4×30cm規(guī)格的條帶；B.將處理過(guò)的分析膜12粘于塑料背板14上21mm-46mm的位置，質(zhì)控帶18向上，檢測(cè)帶17向下；C.將處理過(guò)的結(jié)合墊11粘于塑料背板14上12mm的位置，上端壓于分析膜12的下端，重疊1mm；D.將處理過(guò)的樣品墊10粘于塑料背板14上，下端與塑料背板14平齊，上端壓于結(jié)合墊11的下端，重疊3mm；E.將吸水墊13粘于塑料背板14上，上端與塑料背板14平齊，下端壓于分析膜12的上端，重疊2mm；F.將裝配成形的條帶用切條機(jī)剪切成4mm寬的試紙條；G.將試紙條裝入塑料外殼，干燥器中保存?zhèn)溆谩?br> 附圖3中為粘貼時(shí)各部分之間的重疊關(guān)系。
附圖4為試紙條裝配完畢后各部分的結(jié)構(gòu)與尺寸，其中樣品墊10重疊后的凈暴露長(zhǎng)度為15mm，結(jié)合墊11重疊后的凈暴露長(zhǎng)度為7mm，分析膜12重疊后的凈暴露長(zhǎng)度為22mm，吸水墊13重疊后的凈暴露長(zhǎng)度為30mm。裝配完畢并經(jīng)過(guò)剪切的試紙條便可以裝入試紙條的外殼中。
試紙條的外殼參見(jiàn)附圖5，其包括加樣孔20、結(jié)果判讀窗口21和終點(diǎn)指示窗口22。其中，結(jié)果判讀窗口21中對(duì)應(yīng)檢測(cè)帶17、質(zhì)控帶18。所述終點(diǎn)指示窗口22中對(duì)應(yīng)終點(diǎn)指示帶19。其中通過(guò)加樣孔20將樣品點(diǎn)加到試紙條上后，在吸水墊13的虹吸作用下液體樣品依次經(jīng)過(guò)檢測(cè)帶17、質(zhì)控帶18。當(dāng)終點(diǎn)指示帶19變?yōu)榫G色后，用生物傳感器對(duì)外殼上結(jié)果判讀窗口21中的各條帶進(jìn)行判讀，就可以得到結(jié)果。
試紙條外殼分為上片和下片，參見(jiàn)附圖6。23、24為咬合齒釘，將二者壓緊便可以使試紙條外殼的上下片合為一體；25為擋板，26為倒釘，六個(gè)擋板與三個(gè)倒釘可將試紙條牢固地卡在外殼內(nèi)，防止移動(dòng)；27為壓板，將上下片蓋緊后，壓板的位置處于試紙條上樣品墊與結(jié)合墊、結(jié)合墊與膜重疊處，以此來(lái)增加試紙條各部分的連接，保證檢測(cè)中液體流動(dòng)的連續(xù)性。
如圖6所示，將試紙條放入外殼的下片，將上片與下片蓋緊，便成為可以用于檢測(cè)的成品。
依據(jù)在試紙條上所發(fā)生免疫反應(yīng)方式的不同，可分為夾心模式、競(jìng)爭(zhēng)模式與間接模式。
A.夾心模式基于夾心模式的試紙條可用于檢測(cè)樣品中存在的病原體、微生物以及大分子抗原、抗體等。其中，對(duì)病原體、微生物以及大分子抗原進(jìn)行檢測(cè)的模式為雙抗體夾心，對(duì)抗體進(jìn)行檢測(cè)為雙抗原夾心。以下主要以雙抗體夾心為例進(jìn)行說(shuō)明。
在試紙條的制備過(guò)程中，首先將UCP與被檢物特異性抗體A(即，可與被檢物特異性結(jié)合的抗體，但其只可結(jié)合于被檢物上的A位點(diǎn))相結(jié)合，并固定于結(jié)合墊11內(nèi)；然后，將被檢物特異性抗體B(即，可與被檢物特異性結(jié)合的抗體，但其只可結(jié)合于被檢物上的B位點(diǎn)；注此處所使用的抗體也可以為被檢物特異性多克隆抗體。)固定于分析膜12上作為檢測(cè)帶17，將二抗(即，可與被檢物特異性抗體A特異性結(jié)合的抗體)固定于分析膜12上作為質(zhì)控帶18，將變色范圍5.5-9.0的精密pH試紙貼于吸水墊上作為終點(diǎn)指示帶19。
附圖7是生物樣品中含有待測(cè)物，亦即陽(yáng)性樣品檢測(cè)的示意圖，樣品中的被檢物首先和結(jié)合墊中的UCP-抗體A相結(jié)合，即UCP-抗體A結(jié)合于被檢物上的A位點(diǎn)。然后，二者形成的免疫復(fù)合物(UCP-抗體A-被檢物)以及游離的UCP-抗體A結(jié)合物，與樣品中的液體基質(zhì)一起在吸水墊的帶動(dòng)下進(jìn)入分析膜。當(dāng)其流過(guò)檢測(cè)帶時(shí)，檢測(cè)帶上的抗體B將與免疫復(fù)合物(UCP-抗體A-被檢物)中被檢物上的B位點(diǎn)相結(jié)合形成UCP-抗體A-被檢物-抗體B復(fù)合物，并被固定于檢測(cè)帶上。而游離UCP-抗體A不與抗體B結(jié)合，在吸水墊的帶動(dòng)下繼續(xù)流動(dòng)。當(dāng)通過(guò)質(zhì)控帶時(shí)，與其上的二抗(即，可與抗體A特異性結(jié)合的抗體)結(jié)合并被固定于質(zhì)控帶上。殘余的液體基質(zhì)繼續(xù)向吸水墊流動(dòng)，并與其上pH試紙內(nèi)的指示劑發(fā)生反應(yīng)，使其由黃色變?yōu)榫G色。終點(diǎn)指示帶發(fā)生顏色變化的試紙條便可以進(jìn)行結(jié)果判讀。使用上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器(UPT生物傳感器)對(duì)試紙條進(jìn)行判讀，陽(yáng)性檢測(cè)中試紙條的檢測(cè)帶與質(zhì)控帶上均有可見(jiàn)磷光產(chǎn)生，其所對(duì)應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度分別為T與C。檢測(cè)帶上磷光光強(qiáng)T與質(zhì)控帶上磷光光強(qiáng)C的比值，即T/C，與樣品中含有的被檢物濃度成正比。
附圖8是生物樣品中不含有待測(cè)物，亦即陰性樣品檢測(cè)的示意圖。由于樣品中不含有被檢物，因而重新溶解游離，并隨樣品的液體基質(zhì)一起進(jìn)入膜的只有UCP-抗體A。由此，只有在質(zhì)控帶上發(fā)生UCP-抗體A與二抗的免疫反應(yīng)，并將UCP-抗體A固定其上。這樣陰性檢測(cè)中的試紙條在最終的UPT生物傳感器判讀下，只有質(zhì)控帶上有可見(jiàn)磷光產(chǎn)生。
將夾心模式系統(tǒng)中的抗體A與抗體B換為抗原A與抗原B，既可以雙抗原夾心對(duì)某種病原體感染所產(chǎn)生的抗體進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)原理、結(jié)果指征與以上的雙抗體夾心檢測(cè)抗原相同。
B.競(jìng)爭(zhēng)模式基于競(jìng)爭(zhēng)模式的試紙條可用于檢測(cè)樣品中存在的小分子抗原。
在試紙條的制備過(guò)程中，首先將UCP與被檢物特異性抗體A相結(jié)合，并固定于結(jié)合墊內(nèi)；然后，將與被檢物相同的抗原(均含有抗體A可特異性結(jié)合的A位點(diǎn))固定于膜上作為檢測(cè)帶，將二抗(即，可與被檢物特異性抗體A特異性結(jié)合的抗體)固定于膜上作為質(zhì)控帶，將變色范圍5.5-9.0的精密pH試紙貼于吸水墊上作為終點(diǎn)指示帶。
當(dāng)對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可分為兩種情況被檢物濃度高、被檢物濃度較低。
附圖9為被檢物濃度高時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)的示意圖。當(dāng)樣品中被檢物濃度高時(shí)，加樣后樣品中的被檢物和結(jié)合墊中的UCP-抗體A全部結(jié)合，即UCP-抗體A結(jié)合于被檢物上的A點(diǎn)。因而，在吸水墊的帶動(dòng)下，與樣品中的液體基質(zhì)一起進(jìn)入膜的只有UCP-抗體A-被檢物免疫復(fù)合物。當(dāng)其流過(guò)檢測(cè)帶時(shí)，由于免疫復(fù)合物中UCP標(biāo)記的抗體A已與被檢物結(jié)合，所以不能與檢測(cè)帶上含有A位點(diǎn)的抗原結(jié)合。UCP-抗體A-被檢物免疫復(fù)合物繼續(xù)流動(dòng)，當(dāng)流過(guò)質(zhì)控帶時(shí)發(fā)生免疫復(fù)合物中抗體A與二抗的免疫反應(yīng)，并將UCP-抗體A-被檢物免疫復(fù)合物固定其上。殘余的液體基質(zhì)繼續(xù)向吸水墊流動(dòng)，并與其上pH試紙內(nèi)的指示劑發(fā)生反應(yīng)，使其由黃色變?yōu)榫G色。對(duì)變色后的試紙條進(jìn)行傳感器判讀，在紅外光的照射下只有質(zhì)控帶上有可見(jiàn)磷光產(chǎn)生。
附圖10為被檢物濃度低時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)的示意圖。當(dāng)樣品中被檢物濃度較低時(shí)，加樣后樣品中的被檢物首先和結(jié)合墊中的UCP-抗體A相結(jié)合。然后，二者形成的免疫復(fù)合物(UCP-抗體A-被檢物)以及游離的UCP-抗體A結(jié)合物，與樣品中的液體基質(zhì)一起在吸水墊的帶動(dòng)下進(jìn)入膜。當(dāng)其流過(guò)檢測(cè)帶時(shí)，由于免疫復(fù)合物中UCP標(biāo)記的抗體A已與被檢物結(jié)合，因而只有游離的UCP-抗體A結(jié)合物可與檢測(cè)帶上含有A位點(diǎn)的抗原結(jié)合，并被固定。剩余的UCP-抗體A-被檢物免疫復(fù)合物繼續(xù)流動(dòng)，當(dāng)流過(guò)質(zhì)控帶時(shí)發(fā)生免疫復(fù)合物中抗體A與二抗的免疫反應(yīng)，并將UCP-抗體A-被檢物免疫復(fù)合物固定其上。這樣試紙條在最終的紅外光照射下，檢測(cè)帶與質(zhì)控帶上均有可見(jiàn)磷光產(chǎn)生，其所對(duì)應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度分別為T與C。檢測(cè)帶上磷光光強(qiáng)T與質(zhì)控帶上磷光光強(qiáng)C的比值，即T/C，與樣品中含有的被檢物濃度成反比。
附圖11為對(duì)陰性樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)的示意圖。由于樣品中不含有被檢物，因而重新溶解游離，并隨樣品的液體基質(zhì)一起進(jìn)入膜的只有UCP-抗體A。其與檢測(cè)帶上含有A位點(diǎn)的抗原，質(zhì)控帶上的二抗均可結(jié)合。這樣試紙條在最終的紅外光照射下，檢測(cè)帶與質(zhì)控帶上均有可見(jiàn)磷光產(chǎn)生。但此時(shí)的T/C值與陽(yáng)性檢測(cè)低濃度時(shí)相比達(dá)到最強(qiáng)。
C.間接模式基于間接模式的試紙條可用于檢測(cè)多種動(dòng)物(包括人)受某種病原體感染后血清中的相應(yīng)抗體。
在試紙條的制備過(guò)程中，首先將UCP與葡萄球菌蛋白A(SPA)相結(jié)合，并固定于結(jié)合墊內(nèi)；然后，將某種病原體的表面抗原固定于膜上作為檢測(cè)帶，將羊IgG固定于膜上作為質(zhì)控帶，將變色范圍5.5-9.0的精密pH試紙貼于吸水墊上作為終點(diǎn)指示帶。
附圖12為對(duì)陽(yáng)性血清樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)的間接免疫反應(yīng)示意圖。加樣后樣品中的液體基質(zhì)使UCP-SPA結(jié)合物重新溶解游離并與血清樣品中存在的各種IgG(免疫球蛋白G，其中包括一部分病原體特異性抗體IgG)相結(jié)合。在吸水墊的帶動(dòng)下，UCP-SPA-IgG結(jié)合物與游離的UCP-SPA一起流動(dòng)進(jìn)入膜。當(dāng)流過(guò)檢測(cè)帶時(shí)，UCP-SPA-IgG結(jié)合物中的UCP-SPA-病原體特異性抗體IgG通過(guò)病原體特異性抗體IgG與檢測(cè)帶上的病原體抗原發(fā)生特異的免疫結(jié)合反應(yīng)，并結(jié)合于其上。游離的UCP-SPA和其它的一些UCP-SPA-IgG結(jié)合物(其中不含有UCP-SPA-病原體特異性抗體IgG)將繼續(xù)流動(dòng)，并在通過(guò)質(zhì)控帶時(shí)UCP-SPA與其上的羊IgG相結(jié)合。殘余的液體基質(zhì)繼續(xù)向吸水墊流動(dòng)，并與其上pH試紙內(nèi)的指示劑發(fā)生反應(yīng)，使其由黃色變?yōu)榫G色。對(duì)變色后的試紙條進(jìn)行傳感器判讀，在紅外光照射下質(zhì)控帶與檢測(cè)帶上均有可見(jiàn)磷光，其所對(duì)應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度分別為T與C。檢測(cè)帶上磷光光強(qiáng)T與質(zhì)控帶上磷光光強(qiáng)C的比值，即T/C，與血清樣品中病原體特異性抗體IgG的濃度成正比。(注葡萄球菌蛋白A，即SPA，的特性是可以與多種動(dòng)物的IgG發(fā)生結(jié)合。)附圖13為對(duì)陰性血清樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)的間接免疫反應(yīng)示意圖。由于樣品中不含有病原體特異性抗體IgG，因而重新溶解游離，并隨樣品的液體基質(zhì)一起進(jìn)入膜的只有UCP-SPA與其它的一些UCP-SPA-IgG結(jié)合物(其中不含有UCP-SPA-病原體特異性抗體IgG)。其中UCP-SPA與質(zhì)控帶上的羊IgG結(jié)合，而檢測(cè)帶上的病原體抗原未參加任何反應(yīng)。這樣試紙條在最終的紅外光照射下，只有質(zhì)控帶上有可見(jiàn)磷光產(chǎn)生。
該試紙條結(jié)構(gòu)中包括一外殼，所述外殼上包括加樣孔，結(jié)果判讀窗口和終點(diǎn)指示窗口。通過(guò)加樣孔，將生物樣品添加到樣品墊上；結(jié)果判讀窗口對(duì)應(yīng)于分析膜上的檢測(cè)帶和質(zhì)控帶；終點(diǎn)指示窗口對(duì)應(yīng)于吸水墊上的終點(diǎn)指示帶。
UCP所標(biāo)記的生物活性分子，包括抗原、抗體、葡萄球菌蛋白A、外源凝激素、多聚核苷酸、受體配體、藥物、細(xì)胞等。
UCP顆粒的直徑為200-300nm。并且，可以對(duì)UCP顆粒的表面進(jìn)行了修飾。
當(dāng)用于雙抗體夾心免疫檢測(cè)方法時(shí)，其中，結(jié)合墊上固定有UCP標(biāo)記的第一特異性抗體，該特異性抗體可與待測(cè)物的一個(gè)位點(diǎn)相結(jié)合；分析膜的檢測(cè)帶上固定有與待測(cè)物的另一個(gè)位點(diǎn)相結(jié)合的第二特異性抗體，質(zhì)控帶上固定有可與第一特異性抗體發(fā)生特異性結(jié)合的抗體。
當(dāng)用于雙抗原夾心免疫檢測(cè)方法時(shí)，其中，結(jié)合墊上固定有UCP標(biāo)記的抗原A；分析膜的檢測(cè)帶上固定有抗原B，抗原A與抗原B可以結(jié)合于目標(biāo)被檢抗體的不同位點(diǎn)；質(zhì)控帶上固定有可與抗原A發(fā)生特異性結(jié)合的抗體。
當(dāng)用于競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)方法時(shí)，其中，結(jié)合墊上固定有UCP標(biāo)記的特異性抗體，該抗體可與待測(cè)物的一個(gè)位點(diǎn)相結(jié)合；分析膜的檢測(cè)帶上固定有與待測(cè)物具有相同的上述位點(diǎn)的抗原，質(zhì)控帶上固定有可與上述特異性抗體發(fā)生特異性結(jié)合的抗體。
當(dāng)用于間接免疫檢測(cè)方法時(shí)，其中，結(jié)合墊上固定有UCP標(biāo)記的葡萄球菌蛋白A；分析膜的檢測(cè)帶上固定有某種病原體的表面抗原，質(zhì)控帶上固定有IgG。
本發(fā)明中提到的上述試紙條的制備方法如下，其包括以下步驟1)UCP-生物活性分子的制備對(duì)UCP顆粒進(jìn)行表面修飾，與生物活性分子進(jìn)行連接，在UCP保存液中進(jìn)行保存；取一定量的保存于UCP保存液中的UCP-生物活性分子結(jié)合物，離心，并棄去上清液；在沉降的UCP生物活性分子結(jié)合物中加入稀釋液，并充分混勻，制備成懸濁液；2)樣品墊的制備選用纖維素膜作為樣品墊固相材料，剪切成具有一定規(guī)格的條帶；將樣品墊放入樣品墊封閉液中浸泡；將樣品墊從封閉液中取出，烘干，使樣品墊充分干燥；3)結(jié)合墊的制備選用玻璃纖維素膜作為結(jié)合墊固相材料，剪切成具有一定規(guī)格的條帶；在該條帶上加上UCP-生物活性分子結(jié)合物的懸濁液；烘干條帶，使結(jié)合墊充分干燥；
4)分析膜的制備選用硝酸纖維素膜作為分析膜固相材料，剪切成具有一定規(guī)格的條帶；在條帶上的不同位置噴點(diǎn)生物活性分子，制成檢測(cè)帶和質(zhì)控帶；烘干該條帶，使分析膜充分干燥；5)裝配該試紙條將處理過(guò)的分析膜粘貼于塑料背板上，質(zhì)控帶向上，檢測(cè)帶向下；將處理過(guò)的結(jié)合墊粘貼于塑料背板上，上端壓于分析膜的下端，并相互重疊；將處理過(guò)的樣品墊粘貼于塑料背板上，下端與塑料背板平齊，上端壓于結(jié)合墊的下端，并相互重疊；將吸水墊粘貼于塑料背板上，上端與塑料背板平齊，下端壓于分析膜的上端，并與分析膜相互重疊；將裝配成形的條帶剪切成一定規(guī)格的試紙條。
由此制備成本發(fā)明的免疫層析用試紙條，該試紙條可以裝入外殼中，在干燥條件下備用。該外殼可以是塑料的。
其中，所述UCP保存液為pH＝7.2 0.03mol/L磷酸鹽緩沖液(PB)，含有0.1％BSA，0.05％Tween20，0.02％NaN3。
其中，所述UCP生物活性分子的稀釋液為pH＝7.2 0.03mol/L磷酸鹽緩沖液(PB)，含有1％蔗糖，1％BSA。
其中，所述樣品墊封閉液為pH＝7.2 0.03mol/L磷酸鹽緩沖液(PB)，含有5％BSA，0.1％Tween20。
其中，可將變色范圍5.5-9.0的精密pH試紙貼于吸水墊作為終點(diǎn)指示帶。
應(yīng)用UPT生物傳感器對(duì)多種試紙條進(jìn)行結(jié)果判讀，可實(shí)現(xiàn)冠狀病毒(SARA病毒)，鼠疫FI-抗原，鼠疫感染抗體以及違禁藥品等多種目標(biāo)被檢物的精確定量檢測(cè)。
本發(fā)明的目的在于克服上述在先技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種前所未有的上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器，其可以充分利用UCP的上轉(zhuǎn)換發(fā)光特性，在UCP經(jīng)過(guò)表面修飾與活化、作為生物標(biāo)記物與免疫層析技術(shù)相結(jié)合后，對(duì)基于UCP的各種免疫層析試紙進(jìn)行快速結(jié)果判讀。最終實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體、病原體感染所產(chǎn)生的抗體、違禁藥品、重大疾病(腫瘤、癌癥和糖尿病等)標(biāo)志物等多種目標(biāo)被檢物的定性、定量及多重檢測(cè)，以滿足生物恐怖劑檢測(cè)、傳染病和重大疾病的輔助診斷以及民用醫(yī)療保健的需求。其具有定量精確、快速，并可進(jìn)行多重檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。


圖1UCP顆粒用于生物檢測(cè)領(lǐng)域的原理示意圖；
圖2免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3裝配試紙條時(shí)，各部分的粘貼示意圖；圖4試紙條的結(jié)構(gòu)與尺寸；圖5試紙條外殼的俯視圖；圖6試紙條外殼的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，分為上片和下片；圖7夾心免疫反應(yīng)為陽(yáng)性的反應(yīng)示意圖；圖8夾心免疫反應(yīng)為陰性的反應(yīng)示意圖；圖9競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)為陽(yáng)性時(shí)，待測(cè)物為高濃度的反應(yīng)示意圖；圖10競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)為陽(yáng)性時(shí)，待測(cè)物為低濃度的反應(yīng)示意圖；圖11競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)為陰性的反應(yīng)示意圖；圖12間接免疫反應(yīng)為陽(yáng)性的反應(yīng)示意圖；圖13間接免疫反應(yīng)為陰性的反應(yīng)示意圖；圖14UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為乙肝表面抗原陰性檢測(cè)，右為陽(yáng)性檢測(cè))；圖15乙肝病毒表面抗原檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；圖16UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為SARS病毒陰性檢測(cè)，右為陽(yáng)性檢測(cè))；圖17SARS病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；圖18UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為鼠疫FI-抗原陰性檢測(cè)，右為陽(yáng)性檢測(cè))；圖19鼠疫FI-Ag檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；圖20UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為安非他命陰性檢測(cè)，右為陽(yáng)性檢測(cè))；圖21安非他命檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖；圖22UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為鼠疫感染抗體陰性檢測(cè)，右為陽(yáng)性檢測(cè))；圖23鼠疫抗體檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；圖24UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為SARS病毒感染抗體陰性檢測(cè)，右為陽(yáng)性檢測(cè))；圖25SARS病毒抗體檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；圖26上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器的立體結(jié)構(gòu)示意圖；圖27上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器中激發(fā)光路光軸、試紙條法線和磷光圖像接收光路光軸的平面結(jié)構(gòu)示意圖；圖28上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的發(fā)射光譜曲線；
圖29濾光片的透過(guò)率曲線。
實(shí)驗(yàn)例1雙抗體夾心模式檢測(cè)乙肝表面抗原HBs-Ag一、UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖14UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為乙肝表面抗原陰性檢測(cè)，右為陽(yáng)性檢測(cè))二、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制1、將提純的乙肝表面抗原HBs-Ag標(biāo)準(zhǔn)品用1∶10稀釋的正常人血清(以pH＝7.20.03mol/LPB緩沖液稀釋)作為稀釋液配置系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為0pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、150pg/ml、200pg/ml、250pg/ml、300pg/ml、400pg/ml、500pg/ml、600pg/ml、700pg/ml、800pg/ml、900pg/ml、1000pg/ml、1100pg/ml、1200pg/ml、1300pg/ml、1400pg/ml、1500pg/ml、1600pg/ml的20份樣品；2、每個(gè)樣品分別用10個(gè)UPT試紙條檢測(cè)10次，10次檢測(cè)中傳感器判讀得到的T值與C值分別取平均值，最終根據(jù)二者的比值得出與每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的T/C結(jié)果，列于下表1表1乙肝病毒表面抗原檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

3、以T/C值作為X，以乙肝表面抗原HBs-Ag濃度作為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，經(jīng)統(tǒng)計(jì)擬和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的表達(dá)式為Y＝268.73X+103.06，擬和系數(shù)的平方為R2＝0.975；結(jié)果見(jiàn)圖15乙肝病毒表面抗原檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
4、乙肝表面抗原濃度的計(jì)算公式為
血清樣品中含有的乙肝表面抗原HBs-Ag濃度(pg/ml)＝10Y＝10×(268.73X+103.06)＝2687.3X+1030.6三、實(shí)際檢測(cè)結(jié)果1、檢測(cè)準(zhǔn)確性將50份購(gòu)自生物制品鑒定所的乙肝病人血清盤(其中含13份陽(yáng)性，37份陰性)同時(shí)用膠體金免疫層析試紙與本系統(tǒng)(UPT試紙條與傳感器)進(jìn)行雙盲檢測(cè)膠體金免疫層析試紙法——11份陽(yáng)性，39份陰性(即，兩份陽(yáng)性漏檢)；UPT試紙條與傳感器法——13份陽(yáng)性，37份陰性，與實(shí)際結(jié)果完全吻合；同時(shí)與膠體金免疫層析試紙的定性檢測(cè)相對(duì)，UPT試紙條與傳感器法給出了每份樣品的最終準(zhǔn)確濃度。
2、檢測(cè)穩(wěn)定性將一份乙肝病人血清用pH＝7.20.03mol/L PB緩沖液10倍稀釋，用UPT試紙條與傳感器重復(fù)檢測(cè)10次，結(jié)果列于下表2表2乙肝病毒表面抗原檢測(cè)重復(fù)性

同一份血清重復(fù)測(cè)量的變異系數(shù)(CV)＝2.621％結(jié)論在乙肝表面抗原HBs-Ag檢測(cè)中，UPT試紙條與傳感器法與膠體金免疫層析試紙法相比具有更高的靈敏度，且在實(shí)現(xiàn)精確定量檢測(cè)的同時(shí)具有很好的穩(wěn)定性。
實(shí)驗(yàn)例2雙抗體夾心模式檢測(cè)冠狀病毒(SARS病毒)一、PT生物傳感器結(jié)果判讀圖16UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為SARS病毒陰性檢測(cè)，右為陽(yáng)性檢測(cè))。
二、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制1、將經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、記數(shù)并滅活的SARS病毒用pH＝7.20.03mol/L PB緩沖液作為稀釋液配置系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為0org/ml、100org/ml、200org/ml、300org/ml、400org/ml、500org/ml、600org/ml、700org/ml、800org/ml、900org/ml、1000org/ml、1100org/ml、1200org/ml、1300org/ml、1400org/ml、1500org/ml、1600org/ml、1700org/ml、1800org/ml、1900org/ml、2000org/ml的21份樣品；2、每個(gè)樣品分別用10個(gè)UPT試紙條檢測(cè)10次，10次檢測(cè)中傳感器判讀得到的T值與C值分別取平均值，最終根據(jù)二者的比值得出與每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的T/C結(jié)果，列于下表3表3SARS病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

3、以T/C值作為X，以SARS病毒濃度作為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，經(jīng)統(tǒng)計(jì)擬和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的表達(dá)式為Y＝337.2X+216.12，擬和系數(shù)的平方為R2＝0.9631；結(jié)果見(jiàn)圖17SARS病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
4、SARS病毒濃度的計(jì)算公式為樣品中含有的SARS病毒濃度(org/ml)＝10Y＝10×(337.2X+216.12)＝3372X+2161.2三、實(shí)際檢測(cè)結(jié)果1、檢測(cè)準(zhǔn)確性將30份待檢樣品(其中含6份陽(yáng)性，24份陰性)用本系統(tǒng)(UPT試紙條與傳感器)進(jìn)行雙盲檢測(cè)UPT試紙條與傳感器法——6份陽(yáng)性，24份陰性，與實(shí)際結(jié)果完全吻合；同時(shí)UPT試紙條與傳感器法給出了每份樣品的最終精確濃度。
2、檢測(cè)穩(wěn)定性將一份待檢樣品用pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液10倍稀釋，用UPT試紙條與傳感器檢測(cè)10次，結(jié)果列于下表4
表4SARS病毒檢測(cè)重復(fù)性

同一份待檢樣品重復(fù)測(cè)量的變異系數(shù)(CV)＝1.03％結(jié)論在SARS病毒檢測(cè)中，UPT試紙條與傳感器法具有很好的靈敏度與穩(wěn)定性，且實(shí)現(xiàn)了精確定量。
實(shí)驗(yàn)例3競(jìng)爭(zhēng)模式檢測(cè)鼠疫FI-抗原(鼠疫FI-Ag)一、PT生物傳感器結(jié)果判讀見(jiàn)圖18UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為鼠疫FI-抗原陰性檢測(cè)，右為陽(yáng)性檢測(cè))。
二、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制1、將提純的鼠疫FI-Ag標(biāo)準(zhǔn)品用pH＝7.2 0.03mol/LPB緩沖液作為稀釋液配置系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為0pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、300pg/ml、400pg/ml、500pg/ml、600pg/ml、700ng/ml、800pg/ml、900pg/ml、1000pg/ml、1100pg/ml、1200pg/ml、1300pg/ml、1400pg/ml、1500pg/ml、1600pg/ml、1700pg/ml、1800pg/ml、1900pg/ml、2000pg/ml的21份樣品；2、每個(gè)樣品分別用10個(gè)UPT試紙條檢測(cè)10次，10次檢測(cè)中傳感器判讀得到的T值與C值分別取平均值，最終根據(jù)二者的比值得出與每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的T/C結(jié)果，列于下表5表5鼠疫FI-Ag檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

3、以T/C值作為X，以鼠疫FI-Ag濃度作為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，經(jīng)統(tǒng)計(jì)擬和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的表達(dá)式為Y＝-324.63X+2058.5，擬和系數(shù)的平方為R2＝0.9993；結(jié)果見(jiàn)圖19鼠疫FI-Ag檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
4、鼠疫FI-Ag濃度的計(jì)算公式為樣品中含有的鼠疫FI-Ag濃度(pg/ml)＝10Y＝10×(-324.63X+2058.5)＝-3246.3X+20585三、實(shí)際檢測(cè)結(jié)果1、檢測(cè)準(zhǔn)確性將32份待檢樣品(其中含19份陽(yáng)性，13份陰性)用本系統(tǒng)(UPT試紙條與傳感器)進(jìn)行雙盲檢測(cè)UPT試紙條與傳感器法——19份陽(yáng)性，13份陰性，與實(shí)際結(jié)果完全吻合；同時(shí)UPT試紙條與傳感器法給出了每份樣品的最終精確濃度。
2、檢測(cè)穩(wěn)定性將一份待檢樣品用pH＝7.20.03mol/L PB緩沖液10倍稀釋，用UPT試紙條與傳感器檢測(cè)10次，結(jié)果列于下表6表6鼠疫FI-Ag檢測(cè)重復(fù)性

同一份待檢樣品重復(fù)測(cè)量的變異系數(shù)(CV)＝1.034％結(jié)論在鼠疫FI-Ag檢測(cè)中，UPT試紙條與傳感器法具有很好的靈敏度與穩(wěn)定性，且實(shí)現(xiàn)了精確定量檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)例4競(jìng)爭(zhēng)模式檢測(cè)違禁藥品(以檢測(cè)安非他命為例進(jìn)行說(shuō)明)一、UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖20UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為安非他命陰性檢測(cè)，右為陽(yáng)性檢測(cè))二、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制1、將純品安非他命用pH＝7.2 0.03mol/LPB緩沖液作為稀釋液配置系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為0pg/ml、10pg/ml、20pg/ml、30pg/ml、40pg/ml、50pg/ml、70pg/ml、90ng/ml、110pg/ml、130pg/ml、150pg/ml、170pg/ml、190pg/ml、210pg/ml、230pg/ml、250pg/ml、270pg/ml、290pg/ml、310pg/ml、330pg/ml的20份樣品；2、每個(gè)樣品分別用10個(gè)UPT試紙條檢測(cè)10次，10次檢測(cè)中傳感器判讀得到的T值與C值分別取平均值，最終根據(jù)二者的比值得出與每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的T/C結(jié)果，列于下表7表7安非他命檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

3、以T/C值作為X，以安非他命濃度作為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，經(jīng)統(tǒng)計(jì)擬和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的表達(dá)式為Y＝-51.985X+296.45，擬和系數(shù)的平方為R2＝0.9529；結(jié)果見(jiàn)圖21安非他命檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
4、安非他命的濃度計(jì)算公式為樣品中含有的安非他命濃度(pg/ml)＝10Y＝10×(-51.985X+296.45)＝-519.85X+2964.5三、實(shí)際檢測(cè)結(jié)果1、檢測(cè)準(zhǔn)確性將44份待檢樣品(其中含23份陽(yáng)性，21份陰性)用本系統(tǒng)(UPT試紙條與傳感器)進(jìn)行雙盲檢測(cè)UPT試紙條與傳感器法——23份陽(yáng)性，21份陰性，與實(shí)際結(jié)果完全吻合；同時(shí)UPT試紙條與傳感器法給出了每份樣品的最終精確濃度。
2、檢測(cè)穩(wěn)定性將一份待檢樣品用pH＝7.2 0.03mol/LPB緩沖液10倍稀釋，用UPT試紙條與傳感器檢測(cè)10次，結(jié)果列于下表8
表8安非他命檢測(cè)重復(fù)性

同一份待檢樣品重復(fù)測(cè)量的變異系數(shù)(CV)＝0.423％結(jié)論在安非他命檢測(cè)中，UPT試紙條與傳感器法具有很好的靈敏度與穩(wěn)定性，且實(shí)現(xiàn)了精確定量檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)例5間接模式檢測(cè)鼠疫感染抗體(以檢測(cè)兔感染鼠疫產(chǎn)生抗體為例進(jìn)行說(shuō)明)一、UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖22UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為鼠疫感染抗體陰性檢測(cè)，右為陽(yáng)性檢測(cè))二、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制1、將提純的兔抗鼠疫IgG標(biāo)準(zhǔn)品用1∶10稀釋的正常兔血清(以pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液稀釋)作為稀釋液配置系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、6ng/ml、8ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml、60ng/ml、65ng/ml、70ng/ml、75ng/ml、80ng/ml的20份樣品；2、每個(gè)樣品分別用10個(gè)UPT試紙條檢測(cè)10次，10次檢測(cè)中傳感器判讀得到的T值與C值分別取平均值，最終根據(jù)二者的比值得出與每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的T/C結(jié)果，列于下表9表9鼠疫抗體檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

3、以T/C值作為X，以鼠疫抗體濃度作為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，經(jīng)統(tǒng)計(jì)擬和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的表達(dá)式為Y＝14.129X-0.3076，擬和系數(shù)的平方為R2＝0.9749；結(jié)果見(jiàn)圖23鼠疫抗體檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
4、鼠疫抗體濃度的計(jì)算公式為兔血清中含有的鼠疫抗體濃度(ng/ml)＝10Y＝10×(14.129X-0.3076)＝141.29X-3.076三、實(shí)際檢測(cè)結(jié)果1、檢測(cè)準(zhǔn)確性將100份兔血清(其中含31份陽(yáng)性，69份陰性)同時(shí)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)與本系統(tǒng)(UPT試紙條與傳感器)進(jìn)行雙盲檢測(cè)ELISA法——23份陽(yáng)性，77份陰性；UPT試紙條與傳感器法——31份陽(yáng)性(包括ELISA中的23份陰性，并從ELISA確定的77份陰性樣品中又檢出8份陽(yáng)性)，69份陰性，與實(shí)際結(jié)果完全吻合；同時(shí)與ELISA的定性檢測(cè)相對(duì)，UPT試紙條與傳感器法給出了每份樣品的最終精確濃度。
2、檢測(cè)穩(wěn)定性將一份感染鼠疫家兔的血清用pH＝7.2 0.03mol/LPB緩沖液10倍稀釋，用UPT試紙條與傳感器檢測(cè)10次，結(jié)果列于下表10表10鼠疫抗體檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

同一份血清重復(fù)測(cè)量的變異系數(shù)(CV)＝1.408％結(jié)論在鼠疫感染抗體檢測(cè)中，UPT試紙條與傳感器法與ELISA法相比具有更高的靈敏度，且在實(shí)現(xiàn)精確定量的同時(shí)具有很好的穩(wěn)定性。
實(shí)驗(yàn)例6間接模式檢測(cè)SARS病毒感染抗體一、UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖24UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為SARS病毒感染抗體陰性檢測(cè)，右為陽(yáng)性檢測(cè))二、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制1、將從SARS病人血清中提純的人抗SARS病毒IgG標(biāo)準(zhǔn)品用1∶10稀釋的正常人血清(以pH＝7.20.03mol/L PB緩沖液稀釋)作為稀釋液配置系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為0ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、8ng/ml、10ng/ml、12ng/ml、14ng/ml、16ng/ml、18ng/ml、20ng/ml、22ng/ml、24ng/ml、26ng/ml、28ng/ml、30ng/ml、32ng/ml、34ng/ml的21份樣品；2、每個(gè)樣品分別用10個(gè)UPT試紙條檢測(cè)10次，10次檢測(cè)中傳感器判讀得到的T值與C值分別取平均值，最終根據(jù)二者的比值得出與每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的T/C結(jié)果，列于下表11表11SARS病毒抗體檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

3、以T/C值作為X，以SARS病毒抗體濃度作為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，經(jīng)統(tǒng)計(jì)擬和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的表達(dá)式為Y＝5.7365X+0.8012，擬和系數(shù)的平方為R2＝0.9841；結(jié)果見(jiàn)圖25SARS病毒抗體檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
4、SARS病毒抗體濃度的計(jì)算公式為人血清中含有的SARS病毒抗體濃度(ng/ml)＝10Y＝10×(5.7365X+0.8012)＝57.365X+8.012三、實(shí)際檢測(cè)結(jié)果1、檢測(cè)準(zhǔn)確性
將45份可能感染SARS病毒的病人血清(最終確診其中含17份陽(yáng)性，28份陰性)同時(shí)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)與本系統(tǒng)(UP試紙條與傳感器)進(jìn)行雙盲檢測(cè)ELISA法——17份陽(yáng)性，28份陰性，與實(shí)際結(jié)果完全吻合，檢測(cè)歷時(shí)2小時(shí)左右；UPT試紙條與傳感器法——17份陽(yáng)性，28份陰性，與實(shí)際結(jié)果完全吻合，檢測(cè)歷時(shí)半個(gè)小時(shí)左右；與ELISA法相比，UPT試紙條與傳感器法檢測(cè)更為快速，且在ELISA法定性檢測(cè)的基礎(chǔ)上定量地給出了每份樣品的最終精確濃度。
2、檢測(cè)穩(wěn)定性將一份SARS病人血清用pH＝7.2 0.03mol/LPB緩沖液10倍稀釋，用UPT試紙條與傳感器檢測(cè)10次，結(jié)果列于下表12表12SARS病毒抗體檢測(cè)重復(fù)性

同一份血清重復(fù)測(cè)量的變異系數(shù)(CV)＝0.819％結(jié)論在SARS病毒感染抗體檢測(cè)中，UPT試紙條與傳感器法與ELISA法相比更為快速、可實(shí)現(xiàn)精確定量檢測(cè)，且穩(wěn)定性很好。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)解釋。
實(shí)施例1上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器的結(jié)構(gòu)參閱圖26和圖27。由圖可知，本發(fā)明上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器包括激發(fā)光路、磷光圖像接收光路、圖像處理系統(tǒng)，分別用于照明試紙條3、接收試紙條3發(fā)出的磷光圖像、對(duì)試紙條3發(fā)出的磷光圖像進(jìn)行分析與處理，上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器中試紙條結(jié)構(gòu)示意圖參閱圖5。
在激發(fā)光路上，沿光軸依次設(shè)置紅外激發(fā)光源1、一維聚焦鏡2，其光軸為010。在磷光圖像接收光路上，沿光軸依次設(shè)置前鏡組5、濾光片6、后鏡組7和圖像接收器8，其光軸為002。磷光圖像接收光路的物面與試紙條3的上表面重合，磷光圖像接收光路的像面與圖像接收器8的敏感面重合。試紙條3安裝于特制的外殼4中，其法線為003。激發(fā)光路形成的焦線AA照明試紙條3，焦線AA與試紙條3的長(zhǎng)邊平行，且與試紙條3的對(duì)稱線重合。激發(fā)光路的光軸010、試紙條3的法線003和磷光圖像接收光路的光軸002位于同一個(gè)平面內(nèi)，激發(fā)光路的光軸010與試紙條3的法線003的夾角為B1，磷光圖像接收光路的光軸002與試紙條3的法線003的夾角為B2。
所說(shuō)的激發(fā)光路由紅外激發(fā)光源1、一維聚焦鏡2組成，其作用是產(chǎn)生一條強(qiáng)度為0.1-0.3瓦/平方厘米(W/cm2)的細(xì)長(zhǎng)紅外光焦線AA，照明試紙條3的所有功能帶。紅外激發(fā)光源1通常是經(jīng)過(guò)準(zhǔn)直的半導(dǎo)體激光器，發(fā)出平行光束，其波長(zhǎng)一般為980nm附近。一維聚焦鏡2可以是柱面透鏡、棱鏡或其他可以產(chǎn)生焦線的光學(xué)元件。
所說(shuō)的試紙條3上含有兩個(gè)功能帶，即檢測(cè)帶、質(zhì)控帶。其中檢測(cè)帶將根據(jù)不同的檢測(cè)模式與待檢測(cè)樣品中目標(biāo)被檢物以及UCP標(biāo)記物發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，其上結(jié)合UCP所產(chǎn)生的信號(hào)為T；質(zhì)控帶通過(guò)免疫反應(yīng)結(jié)合UCP所產(chǎn)生的信號(hào)為C，T與C的比值，即T/C便是與不同濃度目標(biāo)被檢物對(duì)應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果，其將與待檢測(cè)樣品中目標(biāo)被檢物的濃度呈一定的線形關(guān)系，同時(shí)C對(duì)于試紙條的生物學(xué)反應(yīng)性能具有監(jiān)控作用；所說(shuō)的磷光圖像接收光路由前鏡組5、濾光片6、后鏡組7和圖像接收器8組成；磷光圖像接收光路的物方孔徑半角為U2。前鏡組5將試紙條3上各功能帶發(fā)出的磷光準(zhǔn)直成平行光。濾光片6濾除磷光信號(hào)中包含的雜光，以提高信噪比；它對(duì)磷光信號(hào)具有盡可能高的透過(guò)率(大于90％)，而對(duì)激發(fā)光具有盡可能低的透過(guò)率(小于10-5)。后鏡組7將濾除雜光后的磷光信號(hào)聚焦成像于圖像接收器8的敏感面上。圖像接收器8可以是一個(gè)線陣CCD攝像機(jī)，也可以是一個(gè)一維光電二極管陣列，其敏感元件的排列方向與試紙條3的細(xì)長(zhǎng)方向一致。所以圖像接收器8可以對(duì)應(yīng)地測(cè)量試紙條3上各功能帶發(fā)出的磷光強(qiáng)度。
所說(shuō)的激發(fā)光路光軸010與試紙條3法線003的夾角為B1、以及磷光圖像接收光路光軸002與試紙條3法線003的夾角為B2，且B1≠B2，通常B1＞B2-U2，或B1＜B2-U2，U2為磷光圖像接收光路的物方孔徑半角。這種設(shè)計(jì)的目的是阻止照明光線的反射光進(jìn)入磷光圖像接收光路，以減小雜光。
與在先技術(shù)相比，本發(fā)明的特點(diǎn)在于激發(fā)光路產(chǎn)生高強(qiáng)度紅外激光焦線AA，同時(shí)將試紙條3上的各功能帶照明；磷光圖像接收光路對(duì)試紙條3上的各功能帶同時(shí)成像；夾角B1與夾角B2不等，且滿足B1＞B2-U2，或B1＜B2-U2。
上述特點(diǎn)使本發(fā)明具有判讀效率高、判讀靈敏度高、可進(jìn)行多重定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器的工作過(guò)程是首先將安裝于外殼4中的試紙條3放到判讀位置。由紅外激發(fā)光源1發(fā)出的平行光束經(jīng)一維聚焦鏡2形成焦線AA，焦線AA位于試紙條3的上表面，且與試紙條3的細(xì)長(zhǎng)方向平行，這樣將試紙條3上的各功能帶全部照明。由試紙條3上各功能帶發(fā)出的磷光信號(hào)經(jīng)前鏡組5準(zhǔn)直后變成平行光，經(jīng)濾光片6濾除雜光后被后鏡組7聚焦成像于圖像接收器8的敏感面上。圖像處理系統(tǒng)9對(duì)圖像接收器8輸出的試紙條磷光圖像進(jìn)行分析與處理，給出試紙條3上各功能帶磷光信號(hào)的幅度，進(jìn)而給出被檢生物分子的屬性和含量。
圖26和圖27是本發(fā)明的最佳實(shí)施例，其具體結(jié)構(gòu)和參數(shù)敘述如下激發(fā)光路中的紅外激發(fā)光源1發(fā)出的平行光束的截面尺寸為4mm×1mm，中心波長(zhǎng)為980nm，功率為30mW；一維聚焦鏡2為平凸柱面透鏡，其焦距為20mm。焦線AA的尺寸為20mm×1mm，略小于試紙條3的結(jié)果判讀窗口尺寸。結(jié)果判讀窗口中試紙條上的兩條帶分別為距終點(diǎn)指示窗一側(cè)結(jié)果判讀窗口內(nèi)沿12.2mm處為檢測(cè)帶、7.2mm處為質(zhì)控帶。研究中采用的上轉(zhuǎn)換磷光材料是(YYbEr)F3(氟化釔鐿鉺)，在紅外光激發(fā)下發(fā)出的磷光光譜如圖28所示，其主峰值波長(zhǎng)為541.5nm。磷光圖像接收光路中的前鏡組5的焦距為40mm，物方孔徑半角U2＝20°；濾光片6的光譜透過(guò)率曲線如圖29所示，在541.5nm波長(zhǎng)處的透過(guò)率大于90％，而在980nm波長(zhǎng)處的透過(guò)率小于10-5。后鏡組7的焦距為40mm，所以磷光圖像接收光路的放大倍率為-1倍。圖像接收器8是一個(gè)線陣CCD攝像機(jī)，其敏感面長(zhǎng)度為22mm，共含有2200個(gè)像素，像素尺寸為10μm×10μm。所以圖像接收器8對(duì)試紙條3的空間判讀分辨率為10μm。
最佳實(shí)施例對(duì)純上轉(zhuǎn)換磷光材料的判讀靈敏度優(yōu)于1μg/L，可同時(shí)檢測(cè)4種以上的生物物質(zhì)。
實(shí)施例2雙抗體夾心檢測(cè)乙肝表面抗原HBs-Ag(1)免疫層析液相材料準(zhǔn)備A.UCP-抗體結(jié)合物a.利用已建立的表面修飾與活化方法對(duì)直徑200-300nm的UCP顆粒進(jìn)行表面修飾，并與抗乙肝表面抗原HBs-Ag單克隆抗體進(jìn)行連接，在UCP保存液(pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液中，含0.1％BSA、0.05％Tween20、0.02％NaN3)中以濃度1mg/mL，4℃保存?zhèn)溆?；b.將保存于UCP保存液中的1mg/mL UCP-抗體結(jié)合物6mL，12000r/min，4℃，離心30min，盡量棄盡上清；c.向離心管中的UCP-抗體結(jié)合物沉降，加入3mL結(jié)合物稀釋液(pH＝7.2 0.03mol/LPB緩沖液中，含1％蔗糖、1％BSA)渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL UCP-抗體結(jié)合物)d.將懸濁液倒入試劑瓶中，4℃保存?zhèn)溆茫籅.樣品墊封閉液a.用天平精確稱量BSA(牛血清白蛋白)1g，放入小燒杯中；b.燒杯中加入pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液20mL，玻璃棒攪拌充分混勻；c.BAS溶液中加入Tween20(吐溫20)20μL，玻璃棒攪拌充分混勻(終濃度5％BAS，0.1％Tween 20)d.4℃保存?zhèn)溆?；C.檢測(cè)帶蛋白a.用天平精確稱量純化的兔抗HBs-Ag多克隆抗體2mg，置于1.5mL的微離心管中；b.微離心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL)；c.分裝為50μL每管，-20℃凍存?zhèn)溆?；D.質(zhì)控帶蛋白；a.用天平精確稱量純化的羊抗鼠IgG抗體2mg，置于1.5mL的微離心管中；b.微離心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL)；c.分裝為50μL每管，-20℃凍存?zhèn)溆茫?2)免疫層析固相載體材料準(zhǔn)備A.樣品墊a.選用纖維素膜(Cellulose Membrane)作為樣品墊固相材料，將其剪切成1.5×30.0cm規(guī)格的條帶；b.將樣品墊放入長(zhǎng)形平皿中，樣品墊封閉液加于其上，常溫浸泡30min；c.將樣品墊由封閉液中取出，放于干凈的平皿中；d.37℃烘干3小時(shí)，使樣品墊充分干燥；e.封閉后的樣品墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；B.結(jié)合墊
a.選用玻璃纖維素膜(Glass Fiber)作為結(jié)合墊固相材料，將其剪切成1.0×30.0cm規(guī)格的條帶；b.將4℃保存?zhèn)溆玫?mg/mL UCP-抗體結(jié)合物(pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液，含1％蔗糖、1％BSA)超聲10s；c.將結(jié)合墊放入長(zhǎng)形平皿中，UCP-抗體結(jié)合物懸濁液加于其上；d.將結(jié)合墊取出放于干凈的平皿中；e.37℃烘干2.5小時(shí)，使結(jié)合墊充分干燥；f.處理后的結(jié)合墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫籆.分析膜a.以孔徑為12μm的硝酸纖維素膜(Nitrocellulose Membrane)作為固相材料，將其剪切成2.5×30cm規(guī)格的條帶；；b.用點(diǎn)樣儀在2.5cm寬的膜上，從下向上1cm處噴點(diǎn)2mg/mL兔抗HBs-Ag多克隆抗體，2μL/cm，作為檢測(cè)帶；c.用點(diǎn)樣儀在2.5cm寬的膜上，從下向上1.5cm處噴點(diǎn)2mg/mL羊抗鼠IgG抗體，2μL/cm，作為質(zhì)控帶；d.37℃烘干2小時(shí)，使膜充分干燥；e.點(diǎn)樣后的膜在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；D.吸水墊a.選用纖維素膜(Cellulose Membrane)作為吸水墊固相材料，將其剪切成3.0×30cm規(guī)格的條帶；b.將變色范圍5.5-9.0的精密pH試紙固定于吸水墊從下向上2.0cm處，作為終點(diǎn)指示帶；c.吸水墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫?3)免疫層析試紙條檢測(cè)A.將待檢測(cè)血清樣品用pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液10倍稀釋；B.100μL稀釋后的樣品加于試紙條外殼上的加樣孔中；C.待終點(diǎn)指示窗中的終點(diǎn)指示帶變?yōu)榫G色后，便可以用傳感器判讀外殼上結(jié)果判讀窗口中的檢測(cè)帶與質(zhì)控帶，以得出結(jié)果。
實(shí)施例3雙抗體夾心檢測(cè)冠狀病毒(SARS病毒)
(1)免疫層析液相材料準(zhǔn)備A.UCP-抗體結(jié)合物a.利用已建立的表面修飾與活化方法對(duì)直徑200-300nm的UCP顆粒進(jìn)行表面修飾，并與純化的兔抗SARS病毒抗體進(jìn)行連接，在UCP保存液(pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液中，含0.1％BSA、0.05％Tween20、0.02％NaN3)中以濃度1mg/mL，4℃保存?zhèn)溆茫籦.將保存于UCP保存液中的1mg/mL UCP-抗體結(jié)合物6mL，12000r/min，4℃，離心30min，盡量棄盡上清；c.向離心管中的UCP-抗體結(jié)合物沉降，加入3mL結(jié)合物稀釋液(pH＝7.2 0.03mol/LPB緩沖液中，含1％蔗糖、1％BSA)渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL UCP-抗體結(jié)合物)d.將懸濁液倒入試劑瓶中，4℃保存?zhèn)溆?；B.樣品墊封閉液a.用天平精確稱量BSA(牛血清白蛋白)1g，放入小燒杯中；b.燒杯中加入pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液20mL，玻璃棒攪拌充分混勻；c.BAS溶液中加入Tween 20(吐溫20)20μL，玻璃棒攪拌充分混勻(終濃度5％BAS，0.1％Tween 20)；d.4℃保存?zhèn)溆?；C.檢測(cè)帶蛋白a.用天平精確稱量純化的羊抗SARS病毒抗體2mg，置于1.5mL的微離心管中；b.微離心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL)；c.分裝為50μL每管，-20℃凍存?zhèn)溆?；D.質(zhì)控帶蛋白；a.用天平精確稱量純化的羊抗兔IgG抗體2mg，置于1.5mL微離心管中；b.微離心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL)；c.分裝為50μL每管，-20℃凍存?zhèn)溆茫?2)免疫層析固相載體材料準(zhǔn)備A.樣品墊a.選用纖維素膜(Cellulose Membrane)作為樣品墊固相材料，將其剪切成1.5×30.0cm規(guī)格的條帶；b.將樣品墊放入長(zhǎng)形平皿中，樣品墊封閉液加于其上，常溫浸泡30min；c.將樣品墊由封閉液中取出，放于干凈的平皿中；d.37℃烘干3小時(shí)，使樣品墊充分干燥；e.封閉后的樣品墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；B.結(jié)合墊a.選用玻璃纖維素膜(Glass Fiber)作為結(jié)合墊固相材料，將其剪切成1.0×30.0cm規(guī)格的條帶；b.將4℃保存?zhèn)溆玫?mg/mL UCP-抗體結(jié)合物(pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液，含1％蔗糖、1％BSA)超聲10s；c.將結(jié)合墊放入長(zhǎng)形平皿中，UCP-抗體結(jié)合物懸濁液加于其上；d.將結(jié)合墊取出放于干凈的平皿中；e.37℃烘干2.5小時(shí)，使結(jié)合墊充分干燥；f.處理后的結(jié)合墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；C.分析膜a.以孔徑為12μm的硝酸纖維素膜(Nitrocellulose Membrane)作為固相材料，將其剪切成2.5×30cm規(guī)格的條帶；；b.用點(diǎn)樣儀在2.5cm寬的膜上，從下向上1cm處噴點(diǎn)2mg/mL羊抗SARS病毒抗體，2μL/cm，作為檢測(cè)帶；c.用點(diǎn)樣儀在2.5cm寬的膜上，從下向上1.5cm處噴點(diǎn)2mg/mL羊抗兔IgG抗體，2μL/cm，作為質(zhì)控帶；d.37℃烘干2小時(shí)，使膜充分干燥；e.點(diǎn)樣后的膜在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；D.吸水墊a.選用纖維素膜(Cellulose Membrane)作為吸水墊固相材料，將其剪切成3.0×30cm規(guī)格的條帶；b.將變色范圍5.5-9.0的精密pH試紙固定于吸水墊從下向上2.0cm處，作為終點(diǎn)指示帶；c.吸水墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫?
(3)免疫層析試紙條檢測(cè)A.將待檢測(cè)血清樣品用pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液10倍稀釋；B.100μL稀釋后的樣品加于試紙條外殼上的加樣孔中；C.待終點(diǎn)指示窗中的終點(diǎn)指示帶變?yōu)榫G色后，便可以用傳感器判讀外殼上結(jié)果判讀窗口中的檢測(cè)帶與質(zhì)控帶，以得出結(jié)果。
實(shí)施例4鼠疫FI-Ag(鼠疫FI-抗原)檢測(cè)(1)免疫層析液相材料準(zhǔn)備A.UCP-抗體結(jié)合物a.利用已建立的表面修飾與活化方法對(duì)直徑200-300nm的UCP顆粒進(jìn)行表面修飾，并與純化的兔抗鼠疫抗體進(jìn)行連接，在UCP保存液(pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液中，含0.1％BSA、0.05％Tween20、0.02％NaN3)中以濃度1mg/mL，4℃保存?zhèn)溆?；b.將保存于UCP保存液中的1mg/mL UCP-抗體結(jié)合物6mL，12000r/min，4℃，離心30min，盡量棄盡上清；c.向離心管中的UCP-抗體結(jié)合物沉降，加入3mL結(jié)合物稀釋液(pH＝7.2 0.03mol/LPB緩沖液中，含1％蔗糖、1％BSA)渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL UCP-抗體結(jié)合物)d.將懸濁液倒入試劑瓶中，4℃保存?zhèn)溆?；B.樣品墊封閉液a.用天平精確稱量BSA(牛血清白蛋白)1g，放入小燒杯中；b.燒杯中加入pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液20mL，玻璃棒攪拌充分混勻；c.BAS溶液中加入Tween20(吐溫20)20μL，玻璃棒攪拌充分混勻(終濃度5％BAS，0.1％Tween 20)d.4℃保存?zhèn)溆茫籆.檢測(cè)帶蛋白a.用天平精確稱量鼠疫FI-抗原2mg，置于1.5mL的微離心管中；b.微離心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL)；c.分裝為50μL每管，-20℃凍存?zhèn)溆?；D.質(zhì)控帶蛋白a.用天平精確稱量純化的羊抗兔IgG抗體2mg，置于1.5mL的微離心管中；
b.微離心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL)；c.分裝為50μL每管，-20℃凍存?zhèn)溆茫?2)免疫層析固相載體材料準(zhǔn)備A.樣品墊a.選用纖維素膜(Cellulose Membrane)作為樣品墊固相材料，將其剪切成1.5×30.0cm規(guī)格的條帶；b.將樣品墊放入長(zhǎng)形平皿中，樣品墊封閉液加于其上，常溫浸泡30min；c.將樣品墊由封閉液中取出，放于干凈的平皿中；d.37℃烘干3小時(shí)，使樣品墊充分干燥；e.封閉后的樣品墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；B.結(jié)合墊a.選用玻璃纖維素膜(Glass Fiber)作為結(jié)合墊固相材料，將其剪切成1.0×30.0cm規(guī)格的條帶；b.將4℃保存?zhèn)溆玫?mg/mL UCP-抗體結(jié)合物(pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液，含1％蔗糖、1％BSA)超聲10s；c.將結(jié)合墊放入長(zhǎng)形平皿中，UCP-抗體結(jié)合物懸濁液加于其上；d.將結(jié)合墊取出放于干凈的平皿中；f.37℃烘干2.5小時(shí)，使結(jié)合墊充分干燥；g.處理后的結(jié)合墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫籆.分析膜a.以孔徑為12μm的硝酸纖維素膜(Nitrocellulose Membrane)作為固相材料，將其剪切成2.5×30cm規(guī)格的條帶；；b.用點(diǎn)樣儀在2.5cm寬的膜上，從下向上1cm處噴點(diǎn)2mg/mL鼠疫FI-抗原，2μL/cm，作為檢測(cè)帶；c.用點(diǎn)樣儀在2.5cm寬的膜上，從下向上1.5cm處噴點(diǎn)2mg/mL羊抗兔IgG抗體，2μL/cm，作為質(zhì)控帶；d.37℃烘干2小時(shí)，使膜充分干燥；e.點(diǎn)樣后的膜在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫?
D.吸水墊a.選用纖維素膜(Cellulose Membrane)作為吸水墊固相材料，將其剪切成3.0×30cm規(guī)格的條帶；b.將變色范圍5.5-9.0的精密pH試紙固定于吸水墊從下向上2.0cm處，作為終點(diǎn)指示帶；c.吸水墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫?3)免疫層析試紙條檢測(cè)A.將待檢測(cè)樣品用pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液10倍稀釋；B.100μL稀釋后的樣品加于試紙條外殼上的加樣孔中；C.待終點(diǎn)指示窗中的終點(diǎn)指示帶變?yōu)榫G色后，便可以用傳感器判讀外殼上結(jié)果判讀窗口中的檢測(cè)帶與質(zhì)控帶，以得出結(jié)果。
實(shí)施例5違禁藥品檢測(cè)(1)免疫層析液相材料準(zhǔn)備A.UCP-抗體結(jié)合物a.利用已建立的表面修飾與活化方法對(duì)直徑200-300nm的UCP顆粒進(jìn)行表面修飾，并與純化的兔抗違禁藥品抗體或結(jié)合配基(違禁藥品包括安非他命、甲基安非他命、苯環(huán)己哌啶和鴉片酊等藥物分子)進(jìn)行連接，在UCP保存液(pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液中，含0.1％BSA、0.05％Tween20、0.02％NaN3)中以濃度1mg/mL，4℃保存?zhèn)溆?；b.將保存于UCP保存液中的1mg/mL UCP-抗體結(jié)合物6mL，12000r/min，4℃，離心30min，盡量棄盡上清；c.向離心管中的UCP-抗體結(jié)合物沉降，加入3mL結(jié)合物稀釋液(pH＝7.2 0.03mol/LPB緩沖液中，含1％蔗糖、1％BSA)渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL UCP-抗體結(jié)合物)d.將懸濁液倒入試劑瓶中，4℃保存?zhèn)溆茫籅.樣品墊封閉液a.用天平精確稱量BSA(牛血清白蛋白)1g，放入小燒杯中；b.燒杯中加入pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液20mL，玻璃棒攪拌充分混勻；c.BAS溶液中加入Tween 20(吐溫20)20μL，玻璃棒攪拌充分混勻(終濃度5％BAS，0.1％Tween 20)d.4℃保存?zhèn)溆茫?
C.檢測(cè)帶蛋白a.用天平精確稱量BSA-違禁藥品分子復(fù)合物2mg，置于1.5mL的微離心管中；b.微離心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL)；c.分裝為50μL每管，-20℃凍存?zhèn)溆?；D.質(zhì)控帶蛋白a.用天平精確稱量純化的羊抗兔IgG抗體2mg，置于1.5mL微離心管中；b.微離心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL)；c.分裝為50μL每管，-20℃凍存?zhèn)溆茫?2)免疫層析固相載體材料準(zhǔn)備A.樣品墊a.選用纖維素膜(Cellulose Membrane)作為樣品墊固相材料，將其剪切成1.5×30.0cm規(guī)格的條帶；b.將樣品墊放入長(zhǎng)形平皿中，樣品墊封閉液加于其上，常溫浸泡30min；c.將樣品墊由封閉液中取出，放于干凈的平皿中；d.37℃烘干3小時(shí)，使樣品墊充分干燥；e.封閉后的樣品墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；B.結(jié)合墊a.選用玻璃纖維素膜(Glass Fiber)作為結(jié)合墊固相材料，將其剪切成1.0×30.0cm規(guī)格的條帶；b.將4℃保存?zhèn)溆玫?mg/mL UCP-抗體結(jié)合物(pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液，含1％蔗糖、1％BSA)超聲10s；c.將結(jié)合墊放入長(zhǎng)形平皿中，UCP-抗體結(jié)合物懸濁液加于其上；d.將結(jié)合墊取出放于干凈的平皿中；e.37℃烘干2.5小時(shí)，使結(jié)合墊充分干燥；f.處理后的結(jié)合墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；C.分析膜a.以孔徑為12μm的硝酸纖維素膜(Nitrocellulose Membrane)作為固相材料，將其剪切成2.5×30cm規(guī)格的條帶；；b.用點(diǎn)樣儀在2.5cm寬的膜上，從下向上1cm處噴點(diǎn)2mg/mL BSA-違禁藥品分子復(fù)合物，2μL/cm，作為檢測(cè)帶；c.用點(diǎn)樣儀在2.5cm寬的膜上，從下向上1.5cm處噴點(diǎn)2mg/mL羊抗兔IgG抗體，2μL/cm，作為質(zhì)控帶；d.37℃烘干2小時(shí)，使膜充分干燥；e.點(diǎn)樣后的膜在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫籇.吸水墊a.選用纖維素膜(Cellulose Membrane)作為吸水墊固相材料，將其剪切成3.0×30cm規(guī)格的條帶；b.將變色范圍5.5-9.0的精密pH試紙固定于吸水墊從下向上2.0cm處，作為終點(diǎn)指示帶；c.吸水墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫?3)免疫層析試紙條檢測(cè)A.將待檢測(cè)樣品用pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液10倍稀釋；B.100μL稀釋后的樣品加于試紙條外殼上的加樣孔中；C.待終點(diǎn)指示窗中的終點(diǎn)指示帶變?yōu)榫G色后，便可以用傳感器判讀外殼上結(jié)果判讀窗口中的檢測(cè)帶與質(zhì)控帶，以得出結(jié)果。
實(shí)施例6鼠疫感染抗體檢測(cè)(1)免疫層析液相材料準(zhǔn)備A.UCP-SPA結(jié)合物a.利用已建立的表面修飾與活化方法對(duì)直徑200-300nm的UCP顆粒進(jìn)行表面修飾，并與SPA(葡萄球菌蛋白A)進(jìn)行連接，在UCP保存液(pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液中，含0.1％BSA、0.05％Tween20、0.02％NaN3)中以濃度1mg/mL，4℃保存?zhèn)溆?；b.將保存于UCP保存液中的1mg/mL UCP-SPA結(jié)合物6mL，12000r/min，4℃，離心30min，盡量棄盡上清；c.向離心管中的UCP-SPA結(jié)合物沉降，加入3mL結(jié)合物稀釋液(pH＝7.2 0.03mol/LPB緩沖液中，含1％蔗糖、1％BSA)渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL UCP-SPA結(jié)合物)d.將懸濁液倒入試劑瓶中，4℃保存?zhèn)溆茫?
B.樣品墊封閉液a.用天平精確稱量BSA(牛血清白蛋白)1g，放入小燒杯中；b.燒杯中加入pH＝7.2 0.03mol/LPB緩沖液20mL，玻璃棒攪拌充分混勻；c.BAS溶液中加入Tween20(吐溫20)20μL，玻璃棒攪拌充分混勻(終濃度5％BAS，0.1％Tween 20)；d.4℃保存?zhèn)溆茫籆.檢測(cè)帶蛋白a.用天平精確稱量鼠疫FI-Ag(鼠疫FI-Ag)2mg，置于1.5mL的微離心管中；b.微離心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL鼠疫FI-Ag)；c.分裝為50μL每管，-20℃凍存?zhèn)溆?；D.質(zhì)控帶蛋白a.用天平精確稱量羊IgG 2mg，置于1mL的微離心管中；b.微離心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL羊IgG)；c.分裝為50μL每管，-20℃凍存?zhèn)溆茫?2)免疫層析固相載體材料準(zhǔn)備A.樣品墊a.選用纖維素膜(Cellulose Membrane)作為樣品墊固相材料，將其剪切成1.5×30.0cm規(guī)格的條帶；b.將樣品墊放入長(zhǎng)形平皿中，樣品墊封閉液加于其上，常溫浸泡30min；c.將樣品墊由封閉液中取出，放于干凈的平皿中；d.37℃烘干3小時(shí)，使樣品墊充分干燥；e.封閉后的樣品墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；B.結(jié)合墊a.選用玻璃纖維素膜(Glass Fiber)作為結(jié)合墊固相材料，將其剪切成1.0×30.0cm規(guī)格的條帶；b.將4℃保存?zhèn)溆玫?mg/mL UCP-SPA(pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液，含1％蔗糖、1％BSA)超聲10s；
c.將結(jié)合墊放入長(zhǎng)形平皿中，UCP-SPA結(jié)合物懸濁液加于其上；d.將結(jié)合墊取出放于干凈的平皿中；e.37℃烘干2.5小時(shí)，使結(jié)合墊充分干燥；f.處理后的結(jié)合墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；C.分析膜a.以孔徑為12μm的硝酸纖維素膜(Nitrocellulose Membrane)作為固相材料，將其剪切成2.5×30cm規(guī)格的條帶；；b.用點(diǎn)樣儀在2.5cm寬的膜上，從下向上1cm處噴點(diǎn)2mg/mL鼠疫F1-Ag，2μL/cm，作為檢測(cè)帶；c.用點(diǎn)樣儀在2.5cm寬的膜上，從下向上1.5cm處噴點(diǎn)2mg/mL羊IgG，2μL/cm，作為質(zhì)控帶；d.37℃烘干2小時(shí)，使膜充分干燥；e.點(diǎn)樣后的膜在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫籇.吸水墊a.選用纖維素膜(Cellulose Membrane)作為吸水墊固相材料，將其剪切成3.0×30cm規(guī)格的條帶；b.將變色范圍5.5-9.0的精密pH試紙固定于吸水墊從下向上2.0cm處，作為終點(diǎn)指示帶；c.吸水墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫?3)免疫層析試紙條檢測(cè)A.待檢測(cè)血清樣品用pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液10倍稀釋；B.100μL稀釋后的樣品加于試紙條外殼上的加樣孔中；C.待終點(diǎn)指示窗中的終點(diǎn)指示帶變?yōu)榫G色后，便可以用傳感器判讀外殼上結(jié)果判讀窗口中的檢測(cè)帶與質(zhì)控帶，以得出結(jié)果。
實(shí)施例7SARS病毒感染抗體檢測(cè)(1)免疫層析液相材料準(zhǔn)備A.UCP-SPA結(jié)合物a.利用已建立的表面修飾與活化方法對(duì)直徑200-300nm的UCP顆粒進(jìn)行表面修飾，并與SPA(葡萄球菌蛋白A)進(jìn)行連接，在UCP保存液(pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液中，含0.1％BSA、0.05％Tween20、0.02％NaN3)中以濃度1mg/mL，4℃保存?zhèn)溆?；b.將保存于UCP保存液中的1mg/mL UCP-SPA結(jié)合物6mL，12000r/min，4℃，離心30min，盡量棄盡上清；c.向離心管中的UCP-SPA結(jié)合物沉降，加入3mL結(jié)合物稀釋液(pH＝7.2 0.03mol/LPB緩沖液中，含1％蔗糖、1％BSA)渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL UCP-SPA結(jié)合物)d.將懸濁液倒入試劑瓶中，4℃保存?zhèn)溆?；B.樣品墊封閉液a.用天平精確稱量BSA(牛血清白蛋白)1g，放入小燒杯中；b.燒杯中加入pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液20mL，玻璃棒攪拌充分混勻；c.BAS溶液中加入Tween 20(吐溫20)20μL，玻璃棒攪拌充分混勻(終濃度5％BAS，0.1％Tween 20)d.4℃保存?zhèn)溆?；C.檢測(cè)帶蛋白a.用天平精確稱量純化的SARS病毒表面N蛋白2mg，置于1.5mL的微離心管中；b.微離心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL SARS病毒表面N抗原)；c.分裝為50μL每管，-20℃凍存?zhèn)溆?；D.質(zhì)控帶蛋白a.用天平精確稱量純化的羊IgG 2mg，置于1mL的微離心管中；b.微離心管中加入1mL pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL羊IgG)；c.分裝為50μL每管，-20℃凍存?zhèn)溆茫?2)免疫層析固相載體材料準(zhǔn)備A.樣品墊a.選用纖維素膜(Cellulose Membrane)作為樣品墊固相材料，將其剪切成1.5×30.0cm規(guī)格的條帶；b.將樣品墊放入長(zhǎng)形平皿中，樣品墊封閉液加于其上，常溫浸泡30min；c.將樣品墊由封閉液中取出，放于干凈的平皿中；d.37℃烘干3小時(shí)，使樣品墊充分干燥；
e.封閉后的樣品墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；B.結(jié)合墊a.選用玻璃纖維素膜(Glass Fiber)作為結(jié)合墊固相材料，將其剪切成1.0×30.0cm規(guī)格的條帶；b.將4℃保存?zhèn)溆玫?mg/mL UCP-SPA結(jié)合物(pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液，含1％蔗糖、1％BSA)超聲10s；c.將結(jié)合墊放入長(zhǎng)形平皿中，UCP-SPA結(jié)合物懸濁液加于其上；d.將結(jié)合墊取出放于干凈的平皿中；e.37℃烘干2.5小時(shí)，使結(jié)合墊充分干燥；f.處理后的結(jié)合墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；C.分析膜a.以孔徑為12μm的硝酸纖維素膜(Nitrocellulose Membrane)作為固相材料，將其剪切成2.5×30cm規(guī)格的條帶；b.用點(diǎn)樣儀在2.5cm寬的膜上，從下向上1cm處噴點(diǎn)2mg/mL SARS病毒表面N蛋白，2μL/cm，作為檢測(cè)帶；c.用點(diǎn)樣儀在2.5cm寬的膜上，從下向上1.5cm處噴點(diǎn)2mg/mL羊IgG，2μL/cm，作為質(zhì)控帶；d.37℃烘干2小時(shí)，使膜充分干燥；e.點(diǎn)樣后的膜在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；D.吸水墊a.選用纖維素膜(Cellulose Membrane)作為吸水墊固相材料，將其剪切成3.0×30cm規(guī)格的條帶；b.將變色范圍5.5-9.0的精密pH試紙固定于吸水墊從下向上2.0cm處，作為終點(diǎn)指示帶；c.吸水墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫?3)免疫層析試紙條檢測(cè)A.將待檢測(cè)血清樣品用pH＝7.2 0.03mol/L PB緩沖液10倍稀釋；B.100μL稀釋后的樣品加于試紙條外殼上的加樣孔中；C.待終點(diǎn)指示窗中的終點(diǎn)指示帶變?yōu)榫G色后，便可以用傳感器判讀外殼上結(jié)果判讀窗口中的檢測(cè)帶與質(zhì)控帶，以得出結(jié)果。
上述實(shí)施例有助于理解本發(fā)明，但是并不是對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出適當(dāng)?shù)男薷暮妥儎?dòng)，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種可以對(duì)基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)免疫層析試紙進(jìn)行結(jié)果判讀的上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器，包含激發(fā)光路、磷光圖像接收光路和圖像處理系統(tǒng)，其特征在于所述的激發(fā)光路由紅外激發(fā)光源和一維聚焦鏡組成；所述的磷光圖像接收光路包括成像物鏡、濾光片和圖像接收器。
2.如權(quán)利要求1所述的上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器，其中所述的激發(fā)光路與磷光圖像接收光路分置于試紙條兩側(cè)，兩者的光軸與試紙條法線之間各存在一個(gè)夾角，而且兩個(gè)夾角是不相等的。
3.如權(quán)利要求1所述的上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器，其中所述的一維聚焦鏡將紅外激發(fā)光源發(fā)出的光束變換成一條高強(qiáng)度的焦線，且焦線方向與試紙條的長(zhǎng)邊一致，從而將試紙條上的各功能帶全部照明。
4.如權(quán)利要求1所述的上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器，其中所述的磷光圖像接收光路中的成像物鏡由前鏡組和后鏡組組成，在兩個(gè)鏡組中間安裝了濾光片。
5.如權(quán)利要求1所述的上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器，其中所述的圖像處理系統(tǒng)可以分析、保存磷光圖像，給出判讀結(jié)果。
6.如權(quán)利要求1所述的上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器在對(duì)病原體、抗原、抗體、違禁藥品、重大疾病標(biāo)志物的定性定量檢測(cè)方面的用途。
7.如權(quán)利要求1所述的上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器在對(duì)基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)免疫層析試紙進(jìn)行定量結(jié)果判讀方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器，其包含激發(fā)光路、磷光圖像接收光路、圖像處理系統(tǒng)，該生物傳感器可對(duì)基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)免疫層析試紙進(jìn)行結(jié)果判讀，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體、抗原、抗體、違禁藥品、重大疾病(腫瘤、癌癥和糖尿病等)標(biāo)志物等多種目標(biāo)被檢物的定性定量以及多重檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK1690693SQ20041003410
公開(kāi)日2005年11月2日 申請(qǐng)日期2004年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月23日
發(fā)明者黃惠杰, 周蕾, 趙永凱, 楊瑞馥, 黃立華, 王津, 盧健, 郭兆彪, 鄭巖, 侯秀杰 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海光學(xué)精密機(jī)械研究所