專利名稱：一種集成于芯片毛細(xì)管電泳的電化學(xué)檢測(cè)方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種集成于芯片毛細(xì)管電泳的新型電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)及專用裝置，具體地說(shuō)，是在集成電化學(xué)技術(shù)和芯片毛細(xì)管電泳分離技術(shù)的過(guò)程中，通過(guò)精確控制電化學(xué)工作電極的位置，對(duì)樣品進(jìn)行高效分離和高靈敏度檢測(cè)。
背景技術(shù)：
目前分析科學(xué)的研究前沿?zé)狳c(diǎn)之一就是微全分析系統(tǒng)。傳統(tǒng)的分析儀器和手段都需要大量的人力物力，整個(gè)過(guò)程自動(dòng)化程度非常低，同時(shí)試劑和能源的消耗量較大，這些都給分析科學(xué)在今后的發(fā)展造成了不利影響。在此背景之下，微全分析系統(tǒng)的研究應(yīng)運(yùn)而生。微全分析系統(tǒng)可以將實(shí)驗(yàn)室整個(gè)分析流程如樣品處理、樣品過(guò)濾、樣品分離和樣品檢測(cè)等集成在一小塊芯片上進(jìn)行，可以實(shí)現(xiàn)整個(gè)分析流程的自動(dòng)化和微型化，為今后分析儀器成為消費(fèi)型產(chǎn)品走入千家萬(wàn)戶奠定了基礎(chǔ)。
目前的微全分析系統(tǒng)的研究中熱點(diǎn)較多，其中一個(gè)重要的熱點(diǎn)就是集成于芯片的高靈敏度檢測(cè)技術(shù)。目前成功商品化的檢測(cè)方法是激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)方法，其能夠在柱檢測(cè)通過(guò)激光能夠受激發(fā)出熒光的物質(zhì)，靈敏度極高，分離效率也較高。但是所檢測(cè)的物質(zhì)通常必須衍生化，同時(shí)使用激光的成本較高。這樣進(jìn)一步的商品化已經(jīng)難以實(shí)現(xiàn)。相比而言，電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)是一種高靈敏度、易于微型化的檢測(cè)技術(shù)。電化學(xué)檢測(cè)方法的原理研究基礎(chǔ)深厚，比較成熟，儀器商品化程度比較高，微型化的程度也比較高，其完全可能在未來(lái)成為被大眾接受的檢測(cè)方法。
但是，目前發(fā)展的三種電化學(xué)檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。安培法可以檢測(cè)有電活性的物質(zhì)，靈敏度相對(duì)較高，但是工作電極容易被污染；電導(dǎo)法可以檢測(cè)影響溶液電導(dǎo)的物質(zhì)，通用性較好，但是靈敏度不高；電位法可以檢測(cè)特定的物質(zhì)，選擇性比較高，但相對(duì)來(lái)說(shuō)應(yīng)用范圍較窄。另一個(gè)關(guān)鍵性的問(wèn)題是工作電極的精確定位，由于管道的微型化，這已成為一個(gè)普遍問(wèn)題。
因此，在芯片中集成新型的低成本、高靈敏度、通用型的電化學(xué)檢測(cè)方法，是將微全分析系統(tǒng)早日商品化并走向千家萬(wàn)戶的必經(jīng)之路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明使用簡(jiǎn)單的儀器設(shè)備，克服了現(xiàn)有技術(shù)的一些缺點(diǎn)。通過(guò)精確控制電化學(xué)工作電極的位置，實(shí)現(xiàn)了恒電位下對(duì)非電活性物質(zhì)的高靈敏度檢測(cè)，同時(shí)保持了對(duì)電活性物質(zhì)的高靈敏度檢測(cè)；還提供了一種方便和有效地監(jiān)控電滲流的方法，非常有利于微全分析系統(tǒng)的商品化應(yīng)用。
本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是微流控芯片固定在芯片支持平臺(tái)上，將電化學(xué)工作電極固定在三維調(diào)節(jié)器上，然后將緩沖液注入電化學(xué)檢測(cè)池；用真空泵使芯片的加樣和分離管道都充滿緩沖液；將分離高壓電極、分離接地電極、加樣高壓電極、加樣接地電極、電化學(xué)參比電極、電化學(xué)對(duì)電極放在檢測(cè)位置固定；將各電極連接在所用的電化學(xué)儀和芯片毛細(xì)管電泳用高壓電源上，首先利用芯片毛細(xì)管專用高壓電源監(jiān)控分離管道和加樣管道是否暢通，然后在分離管道上加較長(zhǎng)時(shí)間的高壓，同時(shí)將工作電極活化；其中鉑電極用來(lái)作為微管道的分離高壓、加樣高壓、分離接地和加樣接地電極，在管道通暢且電極處理好之后，將工作電極夾在與三維調(diào)節(jié)器配套的光纖夾上，在體視顯微鏡下將工作電極的前端放置在微管道的。其特征是通過(guò)精密的三維調(diào)節(jié)裝置將超微圓盤碳纖維工作電極放置在微管道的內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)了對(duì)非電活性和電活性物質(zhì)的高效分離檢測(cè)。工作電極放在微管道的內(nèi)部出口內(nèi)大約30-100微米。尤其是50微米左右。
整個(gè)裝置由一個(gè)集成微型三維調(diào)節(jié)器的芯片支持平臺(tái)構(gòu)成，同時(shí)包括微流控芯片、一臺(tái)芯片毛細(xì)管專用高壓電源、一個(gè)真空泵、一個(gè)超聲清洗儀、一個(gè)紅外燈、若干根鉑電極、一個(gè)體視顯微鏡、微電極玻璃拉制儀等組成。將微流控芯片固定在芯片支持平臺(tái)上。將做好的超微圓盤工作電極夾在與三維調(diào)節(jié)器配套的光纖夾上，用真空硅脂防漏，注意在工作電極和管道口之間保持一定的距離。在檢測(cè)池中加好緩沖液后，用真空泵使緩沖液充滿管道。首先利用芯片毛細(xì)管專用高壓電源監(jiān)控分離管道和加樣管道是否暢通，然后在分離管道上加較長(zhǎng)時(shí)間的高壓，同時(shí)將工作電極活化。在管道通暢且電極處理好之后，在體視顯微鏡下將超微圓盤工作電極的前端放置在微管道的出口內(nèi)大約50微米。
其中鉑電極用來(lái)作為微管道的分離高壓、加樣高壓、分離接地和加樣接地電極，使用的超微圓盤工作電極用直徑5-20微米，一般在5-10微米，如8微米左右的碳纖維制作而成。也可采用其它直徑為5-20微米的其它如金電極、鉑電極、銅電極等。過(guò)程如下，在玻璃微電極拉制儀上將玻璃毛細(xì)管拉成尖端，在顯微鏡下將單根碳纖維穿入其尖端后露出大約1毫米長(zhǎng)度，用膠水固定，在后面灌入碳粉，用直徑為500微米的銅絲塞緊碳粉，用膠水在末端固定。將制成的碳纖維電極在電化學(xué)工作站上用陰極電泳漆電鍍，然后在170攝氏度下烘20分鐘。使用前在顯微鏡下將碳纖維電極的前端用干凈的手術(shù)刀切平備用。
該技術(shù)的最佳運(yùn)行參數(shù)是分離電壓200V/cm～500V/cm；工作電極檢測(cè)電位+1V-1V(非電活性物質(zhì))和0V+2V(電活性物質(zhì))；運(yùn)行緩沖液PBS(磷酸鹽)溶液用于電活性物質(zhì)，Tris溶液用于非電活性物質(zhì)。
本發(fā)明的具體效果如下使用該裝置徹底解決了芯片毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測(cè)中工作電極與管道口的對(duì)準(zhǔn)問(wèn)題，確保了檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性；更重要的，在保持可以對(duì)電活性物質(zhì)如多巴胺和腎上腺素進(jìn)行高效分離檢測(cè)的同時(shí)，可以使用該裝置可以對(duì)非電活性物質(zhì)如鈉離子、鉀離子和鋰離子等進(jìn)行檢測(cè)；另外還可使用該裝置對(duì)芯片毛細(xì)管的狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)控，為芯片毛細(xì)管電泳在生產(chǎn)上的應(yīng)用提供了條件；芯片和工作電極可分開(kāi)更換，可進(jìn)一步降低成本和消耗。


圖1為芯片毛細(xì)管電泳集成電化學(xué)系統(tǒng)的俯視構(gòu)造示意圖。圖中1，帶有毛細(xì)管的芯片；2，恒電位電化學(xué)儀；3，芯片毛細(xì)管電泳用高壓電源；4，計(jì)算機(jī)；5，芯片底座；6，整個(gè)支持平臺(tái)的底座；7，分離高壓電極；8，分離接地電極；9，加樣高壓電極；10，加樣接地電極；11，電化學(xué)工作電極；12，電化學(xué)參比電極；13，電化學(xué)對(duì)電極；14，精密三維調(diào)節(jié)器；15，帶有隔離孔的隔離片；16，電化學(xué)檢測(cè)池。
圖2為芯片毛細(xì)管電泳集成電化學(xué)系統(tǒng)的側(cè)視圖。圖中17，電化學(xué)檢測(cè)池的圍堰；15，帶有隔離孔的隔離片；14，精密三維調(diào)節(jié)器；6，整個(gè)支持平臺(tái)的底座；5，芯片底座；1，帶有毛細(xì)管的芯片；18，芯片底座和總底座之間的支架；11，電化學(xué)工作電極。
圖3為電化學(xué)工作電極的放大構(gòu)造示意圖。圖中11-1，碳或其他可作電極材料的纖維；11-2，連接線(銅絲或其它導(dǎo)電材料)；11-3，陰極電泳漆；11-4，碳粉；11-5，玻璃管。
圖4為本系統(tǒng)的原理圖。圖中21，分離高壓端；22，分離接地端；11，電化學(xué)工作電極；12，電化學(xué)參比電極；13，電化學(xué)對(duì)電極；23，分離通道的反電動(dòng)勢(shì)；24，分離通道和接地電極之間的溶液內(nèi)阻；25，分離通道中高壓端到電化學(xué)工作電極之間的溶液內(nèi)阻；26，分離通道電化學(xué)工作電極到電化學(xué)檢測(cè)池之間的溶液電阻；27，分離通道和電化學(xué)檢測(cè)池的接點(diǎn)；28，電化學(xué)工作電極上的法拉第阻抗；29，電化學(xué)工作電極上的充電電容電容；30，電化學(xué)檢測(cè)池中參比電極的溶液內(nèi)阻；31，電化學(xué)檢測(cè)池中對(duì)電極的溶液內(nèi)阻。
圖5為不同濃度PBS進(jìn)樣分離檢測(cè)的電泳圖。
圖6為圖5中峰面積和進(jìn)樣PBS濃度倒數(shù)的關(guān)系圖。
圖7為不同濃度鈉離子和鋰離子進(jìn)樣分離檢測(cè)的電泳圖。
圖8為不同濃度多巴胺和腎上腺素進(jìn)樣分離檢測(cè)的電泳圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用的水均為二次蒸餾水，分離檢測(cè)的樣品均為純物質(zhì)。氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、多巴胺和腎上腺素等的母液均用二次蒸餾水配制成10mM的濃度，使用前用分離的運(yùn)行緩沖液稀釋至所需的濃度。分離檢測(cè)氯化鋰、氯化鈉和氯化鉀可用磷酸鹽緩沖液，也可以用Tris緩沖液；分離檢測(cè)多巴胺和腎上腺素可以用磷酸鹽緩沖液。
在圖1所示的芯片毛細(xì)管電泳集成電化學(xué)系統(tǒng)中，實(shí)驗(yàn)前先將芯片(1)洗凈烘干，然后用雙面膠固定在芯片支持平臺(tái)(5)上，將電化學(xué)工作電極(11)固定在三維調(diào)節(jié)器上(14)，隔離片(15)上的隔離孔用真空硅脂填滿，然后將緩沖液注入電化學(xué)檢測(cè)池(16)；用真空泵使芯片的加樣和分離管道都充滿緩沖液；將分離高壓電極(7)、分離接地電極(8)、加樣高壓電極(9)、加樣接地電極(10)、電化學(xué)參比電極(12)、電化學(xué)對(duì)電極(13)等放在適當(dāng)?shù)奈恢霉潭?；將各電極連接在所用的電化學(xué)儀(2)和芯片毛細(xì)管電泳用高壓電源(3)上。電化學(xué)儀(2)和芯片毛細(xì)管電泳用高壓電源(3)均和計(jì)算機(jī)(4)相連。
這種新型的構(gòu)形可以在電化學(xué)恒電位模式下對(duì)電活性和非電活性物質(zhì)進(jìn)行高靈敏度的檢測(cè)。在圖4所描述的原理示意圖中，施加分離高壓后，由于電化學(xué)檢測(cè)池中電化學(xué)參比電極之間的溶液內(nèi)阻(30)、電化學(xué)檢測(cè)池中對(duì)電極之間的溶液內(nèi)阻(31)以及電化學(xué)檢測(cè)池和分離接地電極之間的溶液內(nèi)阻(26)和微管道中溶液的內(nèi)阻相比很小，因此在電化學(xué)工作電極和電化學(xué)檢測(cè)池之間產(chǎn)生的電位降可以認(rèn)為是電化學(xué)工作電極和分離通道與電化學(xué)檢測(cè)池的接點(diǎn)(27)之間的電位降。當(dāng)樣品塞通過(guò)電化學(xué)工作電極到達(dá)電化學(xué)檢測(cè)池的時(shí)候，溶液電阻的變化將產(chǎn)生作用在工作電極充電電容(29)上的電勢(shì)降。另一方面，樣品中具有氧化還原活性的物質(zhì)將在工作電極上導(dǎo)致法拉第阻抗和氧化還原電位的變化。
對(duì)于非電活性樣品，溶液電阻的變化導(dǎo)致溶液中溶解氧還原電位的變化，進(jìn)而引起電流的變化。因此，在一定的條件下，非電活性物質(zhì)的測(cè)定可以通過(guò)測(cè)量氧電流的變化得以實(shí)現(xiàn)。
我們使用磷酸鹽緩沖液對(duì)以上原理進(jìn)行了驗(yàn)證。在運(yùn)行緩沖液為10mM PBS時(shí)，用7mM到15mM的PBS溶液進(jìn)樣，考慮到溶液濃度與電阻之間的關(guān)系，工作電極電位的變化可寫成ΔE=-isΔRBC=-is(1000lΛcA-1000lΛc0A)=a+b/c]]>wherea=1000lisΛc0A,]]>b=-1000lisΛA,]]>c0＝-b/a其中c0和c分別代表運(yùn)行緩沖液和進(jìn)樣溶液的濃度，A為分離管道的截面面積，L代表電化學(xué)工作電極伸入管道的距離，A為PBS的當(dāng)量電導(dǎo)。所得的電泳圖見(jiàn)附圖5，將得到的峰電流和濃度的倒數(shù)作圖得到附圖6，符合氧動(dòng)力學(xué)伏安曲線。很明顯這種方式也可以用來(lái)精確測(cè)定芯片毛細(xì)管電泳中的電滲流。
接下來(lái)我們利用本系統(tǒng)分別對(duì)非電活性物質(zhì)(鋰離子和鈉離子)和電活性物質(zhì)(多巴胺和腎上腺素)進(jìn)行了分離檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)的電泳圖見(jiàn)圖7和圖8。圖7中鋰離子和鈉離子的峰高在濃度從200μM到1000μM呈現(xiàn)線性關(guān)系，而圖8中多巴胺和腎上腺素的峰高在50μM到200μM的濃度范圍內(nèi)也同樣呈線性。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明了新系統(tǒng)的高靈敏度、高分離效率和很強(qiáng)的通用性。
權(quán)利要求
1.一種集成于芯片毛細(xì)管電泳的電化學(xué)檢測(cè)方法，微流控芯片固定在芯片支持平臺(tái)上，將電化學(xué)工作電極固定在三維調(diào)節(jié)器上，然后將緩沖液注入電化學(xué)檢測(cè)池；用真空泵使芯片的加樣和分離管道都充滿緩沖液；將分離高壓電極、分離接地電極、加樣高壓電極、加樣接地電極、電化學(xué)參比電極、電化學(xué)對(duì)電極放在檢測(cè)位置固定；將各電極連接在所用的電化學(xué)儀和芯片毛細(xì)管電泳用高壓電源上，其特征是首先利用芯片毛細(xì)管專用高壓電源監(jiān)控分離管道和加樣管道是否暢通，然后在分離管道上加較長(zhǎng)時(shí)間的高壓，同時(shí)將工作電極活化；其中鉑電極用來(lái)作為微管道的分離高壓、加樣高壓、分離接地和加樣接地電極，在管道通暢且電極處理好之后，將工作電極夾在與三維調(diào)節(jié)器配套的光纖夾上，在體視顯微鏡下將工作電極的前端放置在微管道的，通過(guò)精密的三維調(diào)節(jié)裝置將工作電極放置在微管道的內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)了對(duì)非電活性和電活性物質(zhì)的高效分離檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的集成于芯片毛細(xì)管電泳的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征是工作電極放在微管道的內(nèi)部出口內(nèi)大約30-100微米。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的集成于芯片毛細(xì)管電泳的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征是在芯片支持平臺(tái)上的電化學(xué)檢測(cè)池和三維調(diào)節(jié)器之間有一個(gè)特殊設(shè)計(jì)的隔離片，在隔離片上有一個(gè)隔離孔供電化學(xué)工作電極穿過(guò)，孔的大小要確保工作電極有一定的活動(dòng)范圍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的集成于芯片毛細(xì)管電泳的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征是通過(guò)集成的電化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行芯片毛細(xì)管電泳的恒電位檢測(cè)，包括電化學(xué)工作站、工作電極、作為對(duì)電極的鉑電極或其它電極、作為參比電極的Ag/AgCl或其它電極。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的集成于芯片毛細(xì)管電泳的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征是在檢測(cè)非電活性物質(zhì)時(shí)最佳的檢測(cè)運(yùn)行參數(shù)是工作電位-0.5到+2V；運(yùn)行緩沖液電導(dǎo)率與被測(cè)物有較大差異的水溶液；在檢測(cè)電活性物質(zhì)時(shí)最佳的檢測(cè)運(yùn)行參數(shù)是工作電位-0.5到+2V；運(yùn)行緩沖液水溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的集成于芯片毛細(xì)管電泳的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征是電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征是工作電極材料采用直徑為小于5-20微米的碳纖維材料，也可采用其它直徑為5-20微米的其它如金電極、鉑電極、銅電極等。
7.一種集成于芯片毛細(xì)管電泳的電化學(xué)檢測(cè)裝置，其特征是工作電極為單根碳纖維圓盤工作電極，用直徑5-10微米的碳纖維，單根碳纖維穿玻璃毛細(xì)管尖端后露出大約1毫米長(zhǎng)度，用膠水固定，在后面灌入碳粉，用直徑為500微米的銅絲塞緊碳粉，用膠水在末端固定，將制成的碳纖維電極，陰極電泳漆電鍍，烘干。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的集成于芯片毛細(xì)管電泳的電化學(xué)檢測(cè)裝置，其特征是單根金屬纖維圓盤工作電極，采用直徑為5-20微米的其它如金電極、鉑電極、銅電極。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于芯片毛細(xì)管電泳過(guò)程中新測(cè)試原理而建立起的新的電化學(xué)檢測(cè)方法及裝置，先利用芯片毛細(xì)管專用高壓電源監(jiān)控分離管道和加樣管道是否暢通，然后在分離管道上加較長(zhǎng)時(shí)間的高壓，將工作電極活化；在管道通暢且電極處理好之后，將工作電極夾在與三維調(diào)節(jié)器配套的光纖夾上，在體視顯微鏡下將工作電極的前端放置在微管道的。通過(guò)精密的三維調(diào)節(jié)裝置將超微圓盤碳纖維工作電極放置在微管道的內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)了對(duì)非電活性和電活性物質(zhì)的高效分離檢測(cè)。突破了原有電化學(xué)測(cè)試技術(shù)的檢測(cè)范圍，既能檢測(cè)電活性物質(zhì)，而且又能檢測(cè)非電活性物質(zhì)。通過(guò)正確控制特殊部位的電位和工作電極的位置，對(duì)無(wú)機(jī)、有機(jī)樣品進(jìn)行高效分離和高靈敏度檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N27/447GK1563972SQ200410014599
公開(kāi)日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月9日
發(fā)明者陳洪淵, 徐靜娟, 鮑寧, 夏興華 申請(qǐng)人:南京大學(xué)