專利名稱：一種在離體腎組織中檢測樹突狀細胞分布的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在離體腎組織中檢測樹突狀細胞分布的方法。
背景技術(shù)：
樹突狀細胞系由美國學(xué)者Steinman等于1973年首先發(fā)現(xiàn)，因其成熟時具有特殊的樹突狀外型而得名。樹突狀細胞是機體中功能最強的專職抗原遞呈細胞，廣泛分布予除腦和睪丸以外的所有器官、組織，但含量極少。其既能直接激活初始型T淋巴細胞，啟動早期特異性免疫應(yīng)答；又能誘導(dǎo)免疫耐受，已成為免疫學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(Turley SJ.Dendritic cellsIncitingand inhibiting autoimmunity.Curr Opin Immunol.2002，14(6)765-770)。新近研究證實，在炎癥或病損狀態(tài)下，未成熟期樹突狀細胞可由黏附分子選擇素介導(dǎo)下，從血循環(huán)遷移至外周炎癥組織，并具有極強的抗原內(nèi)吞和加工處理能力，但其激活初始T細胞的能力較弱；成熟的樹突狀細胞表達豐富的與抗原遞呈有關(guān)的MHC-II類分子(如HLA-DR)、共刺激分子CD80與CD86、LFA-3和CD40等，通過這些共刺激分子的介導(dǎo)，樹突狀細胞和T細胞結(jié)合并有效地激活初始T細胞，產(chǎn)生免疫炎癥反應(yīng)。近年對腎臟疾病免疫病理機制已引起高度重視，并注意到淋巴細胞、單核巨噬細胞以及腎小管上皮細胞等免疫炎癥細胞以及相關(guān)致炎因子和介質(zhì)，在腎臟疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用，然而對樹突狀細胞及其誘導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)在腎臟疾病機制中的作用尚缺乏研究。原因之一是由于目前缺乏能有效鑒定樹突狀細胞的組合性標(biāo)記檢測方法。
另一方面，近年來國內(nèi)外對組織細胞如樹突狀細胞熒光共定位多數(shù)是在激光掃描共聚焦顯微鏡下完成(Bell D，Chomarat P，Broyles D，et al.In breastcarcinoma tissue，immature dendritic cells reside within the tumor，whereasmature dendritic cells are located in peritumoral areas.J Exp Med，1999，190(10)1417-1426)。其中熒光標(biāo)記是細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究中最常用的檢測方法，通常使用熒光顯微鏡可以觀察樣本中特殊熒光標(biāo)記的強弱和分布特征，但無法進行數(shù)據(jù)分析和量化檢測。故樹突狀細胞在外周組織尤其腎組織中分布尚缺乏定量分析手段。
而熒光圖像分析，其特點為可精確測定細胞的幾何參數(shù)如面積周長等，亦能測定細胞組分的數(shù)量密度和分布面積密度，并可就熒光顯色的光強度作定量分析。該方法是通過多功能全自動顯微鏡進行熒光共定位測量，可進行精確的定性、定量和定位檢測，并能獲得真實高分辨率彩色圖像。但目前該方法尚未應(yīng)用于樹突狀細胞在外周組織尤其腎組織中分布的檢測。
因此，有關(guān)樹突狀細胞在離體腎組織，特別是在腎炎腎組織中的分布狀況、定量測定、相應(yīng)作用以及與疾病關(guān)系，迄今尚不清楚，有必要加以研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為解決上述課題，提供一種在離體腎組織中檢測樹突狀細胞分布的新方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種在離體腎組織中檢測樹突狀細胞分布的方法，其特征在于該方法采用低照度熒光圖像分析檢測法。
該方法可用于離體腎組織中樹突狀細胞分布的定性、定量和定位檢測。
本發(fā)明的方法包括下列步驟1)離體腎組織進行免疫熒光雙標(biāo)記染色；2)低照度熒光圖像采集；3)熒光圖像分析處理。
其中，在上述的免疫熒光雙標(biāo)記染色的過程中選用的一抗為抗CD1a抗體和抗CD80抗體。
所述的抗CD1a抗體可選用以體積比為1∶200稀釋的羊抗人多克隆抗體。
該抗CD80抗體可選用以體積比為1∶200稀釋的鼠抗人單克隆抗體。
相應(yīng)的，在上述的免疫熒光雙標(biāo)記染色的過程中選用的熒光二抗可以為以體積比為1∶200稀釋的抗小鼠IgG-FITC和抗山羊IgG-RPE。
另外，所述的低照度熒光圖像采集是通過多功能全自動顯微鏡和數(shù)碼照相機來完成。
所述的熒光圖像分析處理是采用KS400圖像分析處理系統(tǒng)來完成。
本發(fā)明方法中的熒光雙標(biāo)記染色選用的CD1a和CD80雙表型，是目前確認(rèn)的人類樹突狀細胞相對特異性標(biāo)志，而CD80的出現(xiàn)則標(biāo)志著樹突狀細胞處于成熟階段。而本發(fā)明使用的多功能全自動顯微鏡有其可進行精確的定性、定量和定位檢測，并能獲得真實高分辨率彩色圖像的獨特優(yōu)點。首先，利用該顯微鏡特有的三色熒光濾色片，同時可觀察和獲得樣本的真彩色熒光圖像，真實反映出樣本中熒光標(biāo)記的實際情況。若熒光較弱可以通過單通道分別采集紅、綠或藍色熒光圖像，再組合成真彩色圖像。碰到極弱的熒光也可借用共聚焦顯微鏡方法，通過不同的熒光濾色片分別采集各單色熒光圖像，再經(jīng)過偽彩色圖像編碼組合成模擬彩色圖像。結(jié)合熒光圖像和透射光原圖，可以精確顯示熒光共定位的確切部位，且熒光強度可通過灰度值和參考標(biāo)準(zhǔn)值比較，進行精確的定量分析。其次，KS400圖像分析系統(tǒng)，界面良好，適合于不同研究目的的編程和操作。操作者可以方便地通過陰影校正、對比度增強來改善像質(zhì)，并選取合適的灰度閾值分割開所測細胞組分，形成計算機便于處理的二值圖，再經(jīng)去除碎片等圖像畫面整理后，然后進行模式識別對樣本中所測細胞組分作出幾何形態(tài)學(xué)測量、熒光強度測量以及定位分析，最后獲得檢測分析的數(shù)值。
故本發(fā)明通過熒光雙標(biāo)記染色和圖像分析，對樹突狀細胞在離體腎組織中的分布進行了定性、定量和定位檢測，從而為探討特異性免疫反應(yīng)在腎炎尤其腎小管間質(zhì)病變中的作用，以及進一步闡明腎臟免疫病理機制提供新的依據(jù)或研究思路。


圖1為樹突狀細胞在離體正常腎組織中的分布熒光圖像照片(×200)。
圖2為樹突狀細胞在離體腎炎腎組織的腎小管間質(zhì)中的分布熒光圖像照片(×200)。
具體實施例方式
實施例1步驟1免疫熒光雙標(biāo)記染色(1)離體腎組織石蠟切片二甲苯3-5ml脫蠟(15分鐘，15分鐘，45分鐘)。
(2)依次加入100％，95％，85％(體積百分比)酒精5ml，每步10min，去酒精，加雙蒸水3-5ml，10分鐘后棄水。
(3)PBS(pH7.4)洗3次，每次洗5分鐘。
(4)0.3％(重量百分比)BSA(牛血清白蛋白+PBS)封閉20分鐘，37℃或室溫。
(5)滴加1∶200(體積比)稀釋的一抗(鼠抗人CD80單抗，購自BD生物科學(xué)公司；羊抗人CD1a多抗，購自Stanta Cruz生物技術(shù)公司)，均50μl/片，4℃過夜。
(6)PBS(pH7.4)洗3次，每次洗5分鐘。
(7)滴加1∶200(體積比)稀釋的熒光二抗(抗小鼠IgG-FITC和抗山羊IgG-RPE，Jackson公司)，均50μl/片，37℃孵育1小時。
(8)PBS(pH7.4)振蕩洗滌45分鐘。
(9)擦干后熒光專用封閉液封片。
(10)采用PBS代替一抗作陰性對照。
步驟2低照度熒光圖像采集使用德國蔡司公司(ZEISS)的多功能全自動顯微鏡(Axioplan 2 imaging)和數(shù)碼相機(AxioCam，分辨率3900×3090像素)。樣本置于顯微鏡特有的掃描載物臺上，由計算機控制樣本沿X、Y軸向移動，每個樣本選取有代表性的4-5個視野，選用特有的三色熒光激發(fā)濾色片進行觀察。CD1a陽性染色以紅色熒光為主，CD80陽性染色以綠色熒光為主，二者雙標(biāo)記共定位陽性染色為黃色熒光，表現(xiàn)后者熒光染色的細胞即為所測的樹突狀細胞。隨后通過數(shù)碼相機實時采集真彩色的熒光圖像輸入至KS400圖像分析處理系統(tǒng)。
步驟3熒光圖像分析處理使用德國蔡司公司的KS400圖像分析處理系統(tǒng)和KS400圖像分析處理軟件(Ver3.0版)，依次調(diào)出存盤的熒光圖像，進行陰影校正和對比度增強，改善圖像像質(zhì)，然后根據(jù)共定位雙標(biāo)記熒光的顏色進行閾值分割，把識別的樹突狀細胞二值化，二值圖像經(jīng)整理后進行特征提取，經(jīng)模式識別后，測量共定位陽性染色樹突狀細胞的分布面積、數(shù)量及密度。所有測量結(jié)果轉(zhuǎn)換成Excel數(shù)據(jù)文件，作進一步分析處理。
應(yīng)用實施例一、對象和方法1.研究對象本研究133例腎炎患者均為2000至2001年間瑞金醫(yī)院腎內(nèi)科收治住院病人，其中男54名，女79名，平均年齡(37.3±5.47)歲。所有患者均采用經(jīng)皮腎活檢術(shù)，離體腎組織標(biāo)本常規(guī)石蠟固定切片，進行光鏡(包括HE、PAS、Masson和Jones染色)、免疫熒光和電鏡檢查。根據(jù)臨床表現(xiàn)和病理確定診斷。133例患者分別為IgA腎病33例、局灶節(jié)段硬化性腎小球腎炎10例，輕微病變7例，局灶或彌漫增生性腎炎6例，微小病變4例、膜性腎病2例、狼瘡性腎炎35例和急慢性間質(zhì)性腎炎36例。此外10例正常人腎組織作為對照。
2.實驗方法按上述實施例1的方法。
3.統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SAS6.04統(tǒng)計軟件包進行分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，采用t檢驗和Spearman等級相關(guān)分析，P＜0.05差異有顯著性。
二、結(jié)果1.樹突狀細胞在腎組織中分布低照度熒光顯微鏡(多功能全自動顯微鏡)觀察下，正常腎組織中基本未見樹突狀細胞分布或僅見極細小且淡染的雙染色顆粒(如圖1所示)。而腎炎腎組織中樹突狀細胞的分布面積、數(shù)量和密度均顯著增多，均P＜0.01(具體結(jié)果見表1)。
表1正常和腎炎腎組織中樹突狀細胞分布面積、數(shù)量和密度比較雙染細胞總面積 雙染細胞總數(shù)雙染細胞密度(mm2)(個) (個/mm2)正常組(n＝10)309.5±208.8 59.8±40.2 628±424腎炎組(n＝133) 3826.5±1067.6*686.1±201.7*7744±2170*與正常組比較，*P＜0.012.樹突狀細胞在腎炎腎組織中分布的特點在腎炎腎組織中，樹突狀細胞主要分布于腎小管、腎間質(zhì)和腎血管，以腎小管間質(zhì)分布最多(見圖2)，而腎小球基本未見樹突狀細胞。
3.樹突狀細胞在腎炎腎小管間質(zhì)分布的變化根據(jù)腎小管間質(zhì)病變(指腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化和炎細胞浸潤)程度，將腎炎病例分為3組輕度組(病變范圍＜20％，n＝63)；中度組(病變范圍20～50％，n＝44)；重度組(病變范圍＞50％，n＝26)。經(jīng)觀察，樹突狀細胞在腎炎腎小管間質(zhì)的分布面積、數(shù)量和密度，隨腎小管間質(zhì)病變程度加重而明顯增多，且病變重度組又顯著大于輕度組和中度組患者，均P＜0.001(見表2)。此外上述樹突狀細胞分布狀況與腎小管間質(zhì)病變程度呈正相關(guān)，r分別為0.438、0.439、0.437，均P＜0.01。
表2三組病例腎組織中樹突狀細胞的分布面積、數(shù)量和密度比較雙染細胞總面積雙染細胞總數(shù)雙染細胞密度(mm2) (個)(個/mm2)輕度組(n＝63) 1349.7±416.7 260.5±47.5 2848±848.1中度組(n＝44) 3467.7±1430.4*668.2±275.6*7041.4±2904.7*
重度組(n＝26) 7988.7±5428.8*△1539.3±1046.0*△16222.2±11024.7*△與輕度組比較，*P＜0.001；與中度組比較，△P＜0.001三、結(jié)論上述實驗研究發(fā)現(xiàn)雙染色陽性細胞即樹突狀細胞在正常腎組織中分布極少；進一步發(fā)現(xiàn)，樹突狀細胞在腎炎腎組織中分布，以腎小管間質(zhì)部位為主，且其分布狀況與小管間質(zhì)病變的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，提示樹突狀細胞在腎小管間質(zhì)遷移聚集，可能是腎小管間質(zhì)病變發(fā)生乃至進展的重要參與因素。進一步推測，腎炎時樹突狀細胞可趨集于腎小管間質(zhì)部位并被激活，繼而有效地激活CD4+T細胞，及相應(yīng)釋放大量促炎和抗炎因子，從而啟動和/或促進了局部免疫病理反應(yīng)及組織損傷。
綜上所述，本發(fā)明利用熒光圖像分析法，對樹突狀細胞在離體腎組織中分布定位進行了檢測。利用和借鑒該方法，同樣也可對其他各類擬作熒光標(biāo)記的組織和細胞，進行定性、定量和定位分析檢測。
權(quán)利要求
1.一種在離體腎組織中檢測樹突狀細胞分布的方法，其特征在于該方法采用低照度熒光圖像分析檢測法。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于該方法用于離體腎組織中樹突狀細胞分布的定性、定量和定位檢測。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于該方法包括下列步驟1)離體腎組織進行免疫熒光雙標(biāo)記染色；2)低照度熒光圖像采集；3)熒光圖像分析處理。
4.如權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于所述的免疫熒光雙標(biāo)記染色的過程中選用的一抗為抗CDla抗體和抗CD80抗體。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于該抗CDla抗體為以體積比為1∶200稀釋的羊抗人多克隆抗體。
6.如權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于該抗CD80抗體為以體積比為1∶200稀釋的鼠抗人單克隆抗體。
7.如權(quán)利要求3-6任一權(quán)利要求所述的檢測方法，其特征在于所述的免疫熒光雙標(biāo)記染色的過程中選用的二抗為以體積比為1∶200稀釋的抗小鼠IgG-FITC和抗山羊IgG-RPE。
8.如權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于所述的低照度熒光圖像采集是通過多功能全自動顯微鏡及數(shù)碼照相機來完成。
9.如權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于所述的熒光圖像分析處理是采用KS400圖像分析處理系統(tǒng)來完成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在離體腎組織中檢測樹突狀細胞分布的方法，其特征在于該方法采用低照度熒光圖像分析檢測法。本發(fā)明通過熒光雙標(biāo)記染色和熒光圖像分析，對樹突狀細胞在離體腎組織中的分布進行了定性、定量和定位檢測，從而為探討特異性免疫反應(yīng)在腎炎尤其腎小管間質(zhì)病變中的作用，以及進一步闡明腎臟免疫病理機制提供新的依據(jù)或研究思路。
文檔編號G01N33/533GK1621838SQ20031010897
公開日2005年6月1日 申請日期2003年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月28日
發(fā)明者周同, 胡慶沈, 陳玉英 申請人:上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院