專利名稱：包囊的腎組織的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于將組織包囊(encapsulation)在聚合物中。
背景技術：
腎臟在維持生理內環(huán)境穩(wěn)定中起關鍵作用。其中的內環(huán)境穩(wěn)定功能為酸堿平衡、 電解質濃度的調節(jié)、血壓和血量的調節(jié)。腎臟獨立地以及通過分泌進入血流的激素和蛋白 質作用與其它器官系統(tǒng)協(xié)調實現(xiàn)這些功能。這些分泌的蛋白質包括紅細胞生成素(Epo)、尿 擴張素、腎素和維生素D，以及較少重視的蛋白質比如脂聯(lián)脂聯(lián)蛋白(adiponectin)和瘦蛋白。脂聯(lián)蛋白(也稱為AdipoQ、Acrp30、apMl和GBP28)是一種已經顯示出具有抗炎性 質的脂肪細胞-衍生的細胞因子。另外，其經由與肝臟相互交流(cross-communication)起 調節(jié)血糖水平的作用。在人類中，脂聯(lián)蛋白的正常血液濃度為5-30yg/ml。之前的研究表 明在人類和小鼠中，在長期熱量限制期間，脂聯(lián)蛋白的循環(huán)水平均升高。相反，人血漿中脂 聯(lián)蛋白的低水平與高胰島素、葡萄糖和甘油三酯以及肥胖增加相關。已經表明，在轉基因小 鼠中人脂聯(lián)蛋白的過表達引起脂肪累積的抑制，且預防了高卡路里飲食引起的早亡。而且， 糖尿病敏感性基因座定位于染色體3q27，人脂聯(lián)蛋白基因的位點。在治療糖尿病和相關并 發(fā)癥中，脂聯(lián)蛋白的血液水平增加可具有治療價值。瘦蛋白(Ieptin)是一種16-千道爾頓的蛋白質激素，其在通過降低食欲和增加代 謝來調節(jié)能量攝取和能量消耗中起關鍵作用。最近，已經表明在糖尿病性腎病的小鼠模型 中，瘦蛋白在保護腎臟免于腎臟損傷中起作用。另外，瘦蛋白通過上調血管內皮生長因子而 促進血管生成。紅細胞生成素(Epo)，一種主要由腎臟合成和分泌的30. 4kDa蛋白質，已經被成功 地用于刺激患有貧血的患者的紅細胞生成超過30年。最近，EPO除了刺激紅細胞生成之外 良好擴展的有利作用變得顯而易見(Brines等人，Kidney Int.，2006 ；70(2) :246_250)。之 前，Chong等人的研究確定了 Epo保護血管內皮抗局部缺血損傷。Chong等人，Circulation， 2002； 106 (23) :2973_9。其它的研究證實這些發(fā)現(xiàn)表明了在多種血管疾病的動物模型 中，Epo 對內皮細胞具有保護作用(Santhanam 等人，Stroke, 2005 ；36(12) :2731_7 ； Satoh 等人，Circulation,2006 ；113(11) 1442-50 ；Urao 等人，Circulation Research,2006 ； 98(11) 1405-13) 0在慢性腎衰竭中，患者由于腎臟生成的Epo不足而發(fā)展為貧血。給藥重 組體Epo作為替代治療恢復了血細胞比容和血紅蛋白濃度，避免了輸血的需要。然而，該治 療必須定期注射Epo，每周兩至四次靜脈內或皮下給予。Epo劑量給藥很麻煩，引起患者不 配合和血液Epo和血細胞比容值的周期性波動?？紤]到Epo對心血管系統(tǒng)的保護作用，以及目前與重組體Epo治療相關的挑戰(zhàn)，植入Epo-洗脫裝置可能是目前治療模式的有效替代方法。這樣的可植入裝置也可以更好地 控制血細胞比容值和甚至可能保護器官微血管系統(tǒng)免于損傷。集中于研發(fā)可替代的Epo遞送系統(tǒng)的最新研究正在進行中。研究者已經證實 了將重組體Epo包囊在不同類型的生物可吸收的聚合物中的可能性(參見，例如Yeh φ A, J. Microencapsulation, 2007 ；24(1) 82-93 ;Pistel φ A, J. of Controlled Release, 1999 ；59 (3) :309_325 ;Bittner 等人，European Journal of Pharmaceutics an Biopharmaceutics, 1998 ;45 :295_305 ;Morlock 等人，Journal of Controlled Release, 1998 ；56 105-115)。雖然可以使用若干技術實現(xiàn)將肽和小分子包囊在可生物降解的封套 中，但蛋白質的包囊具有相關挑戰(zhàn)(associated challenges).例如，難以獲得具有最小初 始速釋的連續(xù)Epo釋放特征和在微球內足夠的蛋白質裝載量。研發(fā)重組體Epo-裝載的可 植入裝置可需要頻繁的藥物_再裝載或裝置替換，以確保長期的加強的疾病控制。其他研究者較少將重點放在重組體Epo上，而是尋求遺傳工程和細胞治療方法。 Naffakah等人驗證了從遺傳修飾的細胞分泌的Epo是否可以代表用于治療慢性貧血的反 復注射劑的替代物。Naffakh等人，Human Gene Therapy, 1996 ；7(1) :11_21。在該研究中， 用逆轉錄病毒載體轉染原發(fā)性小鼠皮膚成纖維細胞，其中鼠的Epo cDNA在鼠的磷酸甘油酸 激酶啟動子控制下表達。將這些包含埋入膠原凝膠中的遺傳修飾的成纖維細胞“新器官”植 入小鼠的腹膜腔，在10個月的觀察期之后，引起血細胞比容和血清Epo濃度增加。植入分 泌Epo的成纖維細胞代表永久性體內Epo遞送的潛在方法。類似地，Orive等人研究了間接體內基因治療法的長期作用。OriveG等人， Molecular Therapy, 2005 ；12(2) :283_9。將載有分泌Epo的肌原細胞的聚合物微膠囊植入 同源和異源小鼠的腹膜和皮下組織中。在所有植入的小鼠中，高且恒定的血細胞比容水平 保持了超過100天。有趣的是，植入異源小鼠中的膠囊的作用持續(xù)至植入后210天。這些 結果證實細胞包囊技術對于長期地將Epo遞送到異源模型中的可行性。另外，許多公司也正在研發(fā)細胞包囊技術。StemCells (CytoTherapeutics)正 在研發(fā)可以通過外科手術植入和釋放物質穿過血腦屏障用于神經病學應用的細胞包囊。 Novocell Inc. (San Diego，CA)正在研發(fā)用于胰島素依賴性糖尿病的包囊胰島細胞。Islet Technology, Inc. (St. Paul,Minnesota)正在研發(fā)胰島微囊化技術，并且證實了其植入糖尿 病的狗中長期持續(xù)釋放超過3年。Amcyte Inc. (Santa Monica, CA)正在研發(fā)使用可光交 聯(lián)的(photocross-linkable)海藻酸鹽或聚乙二醇膠囊形成人工胰腺的胰島細胞。最后， MicroIslet Inc. (San Diego,CA)正在研發(fā)使用高生物相容性海藻酸鹽微囊化的豬胰島的 懸浮液，其用于注射到腹腔中。實際上，存在嘗試開發(fā)作為遞送治療劑的工具的細胞和蛋白質包囊的一些努力。 總之，本領域的狀況已經產生了非常強的且有用的數(shù)據(jù)，這些努力證實包囊作為體內Epo 的受控、長期遞送方法是有用的。然而，存在在包囊遺傳修飾的細胞可以用于治療目的之 前，必須解決的重要的安全問題。存在對克服與展開治療相關的常規(guī)問題的可植入裝置的需要。發(fā)明簡述本發(fā)明提供治療性植入物，其包括包囊在聚合物珠粒內的腎臟組織。本發(fā)明還公 開了治療對象的疾病狀態(tài)的方法，其包括將包括包囊在聚合物珠粒內的腎臟組織的治療性植入物植入所述對象內。本發(fā)明還提供制造治療性植入物的方法，其包括提供腎臟組織；混合所述腎臟 組織與包括聚合物的溶液，從而形成組織_聚合物懸浮液；將所述組織-聚合物懸浮液擠出 進入形成珠粒的溶液中，從而形成治療性植入物，其包括將所述腎臟組織包囊在其內的所 述聚合物的珠粒。


圖1描述了包囊和非包囊的切碎的大鼠腎組織的相對生存力的評價結果。圖2圖解了釋放到培養(yǎng)基中的Epo的量，如在包囊后第4天通過ELISA測定的；數(shù) 據(jù)包括沒有組織的珠粒(僅僅珠粒)的、非包囊的切碎的大鼠腎組織(僅僅組織)的和包 囊的切碎的大鼠腎組織的(含有組織的珠粒)。圖3描述了來自研究的數(shù)據(jù)，其中在培養(yǎng)四天后測量分泌到所述培養(yǎng)基中的各種 蛋白質的平均量。示例性實施方案的詳細說明盡管對作為遞送治療劑的方法的細胞包囊的興趣增加了，但是對于已經提出的包 囊整個組織片段還沒有引起注意。目前已經發(fā)現(xiàn)包囊切碎的腎組織提供了遞送天然Epo及 來自內源細胞的其它有益試劑，同時提供預防組織排異反應的免疫屏障的機會。如本文發(fā) 現(xiàn)的，移植由腎組織組成的可誘導的、分泌有益試劑的、可植入的裝置可以顯著地減緩目前 圍繞紅細胞生成-刺激劑的經濟、安全和醫(yī)學問題。腎組織包囊技術也可以使能夠研發(fā)治 療多種疾病狀態(tài)的其它治療技術。在本發(fā)明公開的內容中，單數(shù)形式“a”、“an”、和“the”包括復數(shù)對象，提及特定數(shù) 值時其至少包括所述特定值，除非上下文另有明確說明。當數(shù)值表示為近似值時，使用先行 詞“約”，應當理解該特定值構成另外的實施方案。當存在約時，所有范圍都被包括，且是可 以組合的。本發(fā)明提供包括包囊在聚合物珠粒內的腎臟組織的治療性植入物。本發(fā)明的植入 物適于引入體內，和在植入后提供治療作用。在本發(fā)明的植入物中所用的腎臟組織可以是 自身組織、同種異體組織、異種組織或其任意組合?？梢约庸に瞿I臟組織的尺寸以用于本 發(fā)明的植入物，例如通過將腎臟組織源切碎成片段。這樣的片段可以具有的尺寸為小于約 1mm，或者它們可以更大。所述片段的尺寸優(yōu)選地根據(jù)其最大尺寸來測量，例如如果所述片 段具有的長寬比大于1 1則測量縱長，如果所述片段是大致立方形的則測量側長，或者如 果所述片段是大致球形的則測量直徑等。除了切碎之外，還可以進一步加工所述片段的尺 寸以減小該組織的尺寸。例如，可以進一步切碎所述片段，使得基本上所有片段的尺寸都小 于約300 μ m、小于約150 μ m、小于約100 μ m或小于約50 μ m。在本發(fā)明的植入物中腎臟組 織的總量可以為至少約lOOmg、至少約50mg、至少約30mg或至少約10mg。各種因素，比如期 望的腎臟組織的總表面積、治療的類型、腎臟組織的類型、接受治療的對象的特征、期望治 療的疾病狀態(tài)的類型和階段、組織分泌的物質的量和類型、以及本領域技術人員理解的其 它因素，可用于確定所述植入物中腎臟組織的量、個體組織片段的尺寸或兩者。所述聚合物珠粒優(yōu)選地包括生物相容性聚合物，比如天然存在的或合成衍生的生 物聚合物。所述聚合物珠粒可以包括這樣的聚合物，如海藻酸鹽、透明質酸、羧甲基纖維素、聚乙二醇、葡聚糖、瓊脂糖、聚-L-賴氨酸、角叉菜膠、果膠、黃蓍膠、黃原膠、瓜爾膠、阿拉伯 膠、I型膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白或其任意組合。一種優(yōu)選的聚合物組合包括 海藻酸鹽和聚-L-賴氨酸。這樣的聚合物是容易市售可獲得的。術語“珠?！碑斸槍λ鼍酆衔锸褂脮r，意味著轉運的聚合物組合物通常設想是大 致球形的，但也可以是卵形的或長圓形(oblong)的。所述聚合物珠粒的精確形狀對于本發(fā) 明不重要；可以允許腎臟組織基本上包封在所述聚合物內的任何形狀都是可接受的。當根 據(jù)其最大尺寸測量時，聚合物珠?？梢跃哂械闹睆綖榧s0. 5mm至約10mm，優(yōu)選地為約3mm至 約6mm。聚合物珠粒的尺寸可以根據(jù)珠粒的特性在植入前或植入后側量。當聚合物珠粒可 以自發(fā)分化(bud)時，可以根據(jù)未分化的珠粒或根據(jù)分化形成的珠粒測量聚合物珠粒的尺 寸。所述聚合物珠粒的特征使本發(fā)明的植入物能夠從珠粒內分泌有益試劑進入到其 中植入或以其它方式包含該珠粒的周圍環(huán)境中。換句話說，所述聚合物珠粒是包囊在珠粒 內的腎臟組織分泌的物質能滲透的。所述腎臟組織可以是內源的、天然存在的組織，或者可 以包括含有基因改變的細胞，比如插入非天然存在的基因或基因的一部分。包括基因改變 或插入的腎臟組織可以物理上能夠分泌內源或天然存在的組織不能分泌的物質。所述腎臟 組織和因而本發(fā)明的植入物可以分泌內源性或改變的(例如遺傳改變的)腎臟組織物理上 能夠生成的任何化合物。例如，所述腎臟組織可以分泌一種或多種激素、激素原、蛋白質、生 長因子、營養(yǎng)因子或其任意組合。作為另外的實例，和如本文進一步描述的，所述組織可以 分泌一種或多種紅細胞生成素、MCP-1、脂聯(lián)蛋白、瘦蛋白和MMP-2。遺傳改變的腎臟組織可 以分泌的化合物是理論上來說實際是無限制的。本發(fā)明還提供治療對象的疾病狀態(tài)的方法，其包括將包括包囊在聚合物珠粒內的 腎臟組織的治療性植入物植入對象內。因為本發(fā)明的植入物能夠分泌大量有益試劑，本發(fā) 明的方法可用于治療多種疾病狀態(tài)。如本文使用的“治療”指預防性治療，或減緩任何病理 性表型。本發(fā)明提供的要治療的疾病狀態(tài)可以是貧血、中風、心血管疾病或任何腎病，即與 腎功能不適直接地或間接地相關的任何病理，例如其引起腎功能不適，或者其至少部分地 由腎功能不適引起。腎病可以是遺傳的、先天性的或獲得性的。腎病的非限制性實例包括多 囊腎病、奧爾波特綜合征(Alport' s syndrome)、遺傳性腎炎、原發(fā)性高草酸尿、胱氨酸尿 癥、腎炎、腎臟綜合征、高血壓、糖尿病、急性腎病、慢性腎病(持續(xù)性蛋白尿)、腎小管性酸 中毒、腎小球疾病和肺出血腎炎綜合征(Goodpasture' s syndrome)。用Epo治療的益處， 例如已經根據(jù)許多病理學廣泛地證實了，且容易被本領域技術人員所理解。在本發(fā)明的方 法中所用的聚合物珠粒和腎臟組織的特征可以如前對于本發(fā)明的治療性植入物所描述的。本發(fā)明還涉及制造治療性植入物的方法。用于制造治療性植入物的方法成功地使 得能夠制造可以根據(jù)本發(fā)明公開的內容使用的治療性組合物。本發(fā)明的方法包括提供腎 臟組織；混合所述腎臟組織與包括聚合物的溶液，從而形成組織_聚合物懸浮液；將所述組 織-聚合物懸浮液擠出至形成珠粒的溶液中，從而形成治療性植入物，其包括將所述腎臟 組織包囊在其內的所述聚合物的珠粒。腎臟組織可以根據(jù)以前公開的技術制備，包括選擇組織類型和加工尺寸。根據(jù)本 發(fā)明與腎臟組織混合的聚合物溶液可以包括聚合物和生長培養(yǎng)基的組合。可以如上所述確 定所述聚合物的特性。任何可接受的培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯等都可以用作本發(fā)明的生長培養(yǎng)基；
7本領域技術人員可容易地確定合適的生長培養(yǎng)基的特征，所述生長培養(yǎng)基可以包括培養(yǎng)基 的混合物。生長培養(yǎng)基的PH、葡萄糖濃度、生長因子、和存在的其它營養(yǎng)組分可以不同，但 是生長培養(yǎng)基應當滿足腎臟組織的至少一些營養(yǎng)需求，優(yōu)選地滿足大多數(shù)或所有的營養(yǎng)需 求，并且應當具有緩釋和供給腎臟組織所必需的PH及其它化學特性。一個合適的生長培養(yǎng) 基的實例是 DULBECC0，S MODIFIED EAGLES MEDIUM(DMEM ;Invitrogen，Carlsbad，CA)。生 長培養(yǎng)基是市售可獲得的，合適的培養(yǎng)基是本領域技術人員容易識別的。為了預防感染，可 以將抗生素比如青霉素、鏈霉素等加入到所述生長培養(yǎng)基中。也可以將血清比如胎牛血清 加入到所述生長培養(yǎng)基中?？梢酝ㄟ^適于形成懸浮液的任何方法實現(xiàn)腎臟組織和聚合物溶液的混合，即其中 腎臟組織基本上均勻地懸浮在聚合物溶液中的混合物，所述方法比如振蕩、攪拌或傾倒。例 如，可以通過如下方法實現(xiàn)混合將腎臟組織和聚合物溶液裝載到第一容器比如注射器中， 將溶液轉移到另一個容器中，比如通過將注射器的內含物排出到第二注射器中，將該溶液 再返回第一容器中，根據(jù)需要如此重復該循環(huán)，直到獲得懸浮液。在形成懸浮液后，將該懸浮液擠出至形成珠粒的溶液中，以便形成腎臟組織包囊 在其中的聚合物珠粒。所述擠出可以包括從注射器中噴射所述懸浮液，或者以其它方式將 該懸浮液從一個容器轉移到其中包含形成珠粒的溶液的另一個容器中，或者可選地，將形 成珠粒的溶液轉移到其中含有該懸浮液的容器中。所述形成珠粒的溶液可以是離子型的， 可以是交聯(lián)溶液，或者同時為兩者。在一個實施方案中，所述形成珠粒的溶液包括CaCl2。當 與形成珠粒的溶液組合時，可以自發(fā)地形成具有包囊的腎臟組織的聚合物珠粒。形成珠粒 的方法可以進一步例如通過振蕩該懸浮液和形成珠粒的溶液的混合物、調節(jié)該混合物的溫 度(例如升高溫度)或同時兩種方式來促進。在形成聚合物珠粒后，可以通過將該珠粒放置到交聯(lián)溶液中實現(xiàn)珠粒的化學交 聯(lián)。對于交聯(lián)，可以將珠粒轉移到聚合物的稀溶液中，該聚合物優(yōu)選地為與珠粒的主要聚合 物組分不同。例如，如果所述聚合物珠粒的主要組分包括海藻酸鹽，可以使用聚-L-賴氨酸 的稀溶液來交聯(lián)該海藻酸鹽珠粒。任選地，在其在形成珠粒的溶液中“產生”后，或者在交 聯(lián)后，可以向聚合物珠粒中加入另外的聚合物層。優(yōu)選地，所述另外的聚合物層包括與構成 所述聚合物珠粒的主要組分相同的聚合物。例如，可以向其中主要組分為海藻酸鹽的珠粒 中加入另外的海藻酸鹽層?？梢酝ㄟ^將所述珠粒置于包括其中制備另外層的聚合物的稀聚 合物溶液中來實現(xiàn)向所述聚合物珠粒中加入另外的聚合物層。在下述實施例中進一步定義本發(fā)明。應當理解給出本發(fā)明的所示實施方案僅僅是 為了示例，這些實施例不應當被看作是限制附加權利要求。從上述討論和這些實施例可知， 本領域技術人員可以容易地確定本發(fā)明的基本特征，并且在不背離其精神和范圍下，可以 進行本發(fā)明的各種改變和修飾以使其適應各種用法和條件。實施例1-治療性植入物的形成通過外科手術從雌性的Long Evans大鼠(八周齡)中切除四個腎，在冰冷卻的 不含Ca2+和Mg2+的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA)中沖洗，然后使用 解剖刀將其切成小塊(1-5_3)。然后使用300uM-鋼篩(Sigma，St Louis, M0)進一步切碎 所述組織片段。然后，用30-50mL的生長培養(yǎng)基洗滌切碎的組織三次，該生長培養(yǎng)基包含 Dulbecco' s Modified Eagles Medium(DMEM) (Invitrogen)，所述 DMEM含有 的青霉素/鏈霉素(Invitrogen)和的胎牛血清(FBS) (Hyclone，Logan，UT)。完全地除去最后的 洗滌液，將該組織片段裝入兩個注射器混合系統(tǒng)中的一個1毫升的注射器中。制備在生長 培養(yǎng)基中的1.8% (w/v)的海藻酸鹽溶液(Sigma)，將其裝入第二個1-毫升注射器中。然 后，通過在兩個注射器中都前后推動內含物將這兩種溶液混合在一起。接著，將切碎的組 織-凝膠懸浮液擠出至IOOmM的CaCl2溶液中。之后，在室溫下，在CaCl2中培養(yǎng)得到的包 囊組織珠粒，并慢慢振蕩5分鐘。然后，通過將該珠粒轉入包含F(xiàn)BS的0.05% (w/v)的 分子量24，000聚-L-賴氨酸(Sigma)中5分鐘來化學交聯(lián)，之后，用包含1 % FBS的0. 1 % (w/v)的海藻酸鹽溶液的另一層涂覆5分鐘。然后，將四至十個珠粒轉移到24孔低簇組織 培養(yǎng)皿的各個孔中，所述組織培養(yǎng)皿包含0. 5mL的生長培養(yǎng)基、或包含lOOng/ml聚-D-谷 氨酸(PDGA)的生長培養(yǎng)基(Sigma)，并在含氧量正?；蚝趿康?5%氧氣)的大氣條件下 于37°C培養(yǎng)四天。目測檢查珠粒，并使用數(shù)碼相機和Eclipse TE2000-U顯微鏡(Nikon， Japan)照像。肉眼觀察海藻酸鹽包囊的組織珠粒表明在制備球狀的包含組織的珠粒中，經過雙 向注射器系統(tǒng)人工擠出是有效的。在所述海藻酸鹽珠粒內的組織片段也是可見的，證實了 其在整個海藻酸鹽凝膠內分布均勻。實施例2-珠粒直徑的測量將十四個獨立的包含組織的珠粒放置到干凈的組織培養(yǎng)板中，使用裝備有數(shù)碼相 機的Nikon解剖顯微鏡照相。然后，使用IMAGE PR0PLUS軟件測量各個珠粒的直徑。肉眼觀察海藻酸鹽包囊的組織珠粒表明在制備球狀的包含組織的珠粒中，經過雙 向注射器系統(tǒng)人工擠出是有效的。在所述海藻酸鹽珠粒內的組織片段也是可見的，證實了 其在整個海藻酸鹽凝膠內分布均勻。從3. 72g破碎的腎組織中生成一百一十五個珠粒，每 個珠粒約32mg的組織。表1顯示了珠粒直徑的分布。表 1 發(fā)現(xiàn)十四個獨立珠粒的平均直徑為4. 56+/-0. 44mm。實施例3-細胞生存力的評價使用ALAMAR BLUE (Invitrogen)，一種響應于代謝活性減少的比色REDOX指示劑， 評價切碎的腎組織的生存力。在培養(yǎng)四天后，從非包囊的腎組織、包囊的腎組織、異丙醇固 定的組織和單獨的生長培養(yǎng)基樣品中除去用過的生長培養(yǎng)基。將包含10% ALAMAR BLUE的 1毫升生長培養(yǎng)基加入到樣品中，并在37°C、5% CO2下進一步培養(yǎng)2-4小時，同時輕輕地搖 動。然后，在 570nm 和 600nm 分光光度法地(SPECTRAMAX-190，Molecular 裝置，Sunnyvale， CA)分析用過的培養(yǎng)基。分析來自每個樣品的培養(yǎng)基，一式三份。按照制造商的說明測定 ALAMAR BLUE的減少％，其為細胞生存力的間接測量方式。在培養(yǎng)四天后，評價組織生存力。與非包囊的組織相比，包囊保持更大的組織生 存力(圖1)。在含氧量正?；蛉毖跸屡囵B(yǎng)的非包囊腎組織分別顯示出相似的相對平均生 存力為20. 9% +/-3. 4%和21. 0% +/-1. 9%。然而，在含氧量正常條件下培養(yǎng)的包囊腎組 織顯示出相對平均組織生存力增加。包囊的組織顯示出的相對平均組織生存力為83. 5% +/-4. 5%。在缺氧條件下培養(yǎng)的包囊腎組織引起降低的組織生存力，為31. 3% +/-3. 4%。 如預期的，組織固定引起組織生存力顯著地降低，為5.0% +/-0. 084%。實施例4-Epo分泌分析在培養(yǎng)四天后，收集用過的培養(yǎng)基，使用Quantikine Mouse/RatErythropoietin ELISA試劑盒(R&D系統(tǒng)，MN)測定釋放到該培養(yǎng)基中的Epo的量。在540nm分光光度法 (SPECTRAMAX-190, Molecular 裝置，Sunnyvale, CA)測定 ELISA 板。通過將未知樣品的吸 光度值與線性回歸的標準曲線的比較來分析數(shù)據(jù)。在包囊后第4天，通過ELISA測定釋放到所述培養(yǎng)基中的Epo的量。將該數(shù)據(jù)標 準化成僅僅用生長培養(yǎng)基得到的吸光度值(修正均數(shù))。在由8-10個珠粒獲得的用過的培 養(yǎng)基上進行每個測量。也計算平均標準誤差(SEM)。將顯示在下述表2中的數(shù)據(jù)以圖形形 式表示在圖2中。表2 在圖2中，數(shù)據(jù)條代表三次測量的平均值，誤差條代表SEM。在由8-10個珠粒獲得 的用過的培養(yǎng)基上進行每次測量。結果表明切碎的腎組織生成了 45. 8+/-3. 3pg/mL的Epo進入周圍培養(yǎng)介質中。同 樣地，海藻酸鹽包囊不能阻止Epo從切碎的組織中釋放出，生成了 79. 3+/-28. 6pg/mL的 Epo0為了測定Epo的生成是否能夠是化學增強的，制備珠粒并培養(yǎng)在pDGA中。結果表明 PDGA處理對于Epo的生成沒有影響，產生了 60. 9+/-10. 5pg/mL的Epo。作為陰性對照，測 定來自沒有組織的珠粒的Epo生成。如所預期的，從這些樣品中沒有檢測到可測量的Epo。實施例5-營養(yǎng)因子分泌分析在培養(yǎng)四天后，收獲來自珠粒的用過的培養(yǎng)基。通過離心從用過的培養(yǎng)基中除 去細胞碎片，并將該培養(yǎng)基在_80°C貯存。在分析時，通過用具有Searchlight Proteome Arrays (Pierce Biotechnology Inc.)的ELISA測定用過的培養(yǎng)基的下述蛋白因子白細 胞介素_4(IL-4)、單核細胞趨化蛋白-1 (MCP-I)、RANTES、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 (GMCSF)、白細胞介素-IO(IL-IO)、脂聯(lián)蛋白、瘦蛋白、基質金屬蛋白酶_2 (MMP-2)。與源自沒有組織包囊的珠粒的用過的培養(yǎng)基相比較，包含腎組織片段的珠粒分 泌增加量的 MCP-I (50. 6+/-8. 9pg/mL)、脂聯(lián)蛋白 132，060. 6+/-11，226. 7pg/mL)、瘦蛋白 (10. 3+/-2. 6pg/mL)和 MMP-2 (945. 2+/-13. 3pg/mL)及低至不可檢測量的 IL-4、RANTES, GMCSF和IL-10。如下表3所示，每個處理組包含三個樣品(1、2、3)。表 3 STD =標準偏差，SEM =平均標準誤差。將此處顯示的數(shù)據(jù)以圖形形式表示在圖3 中，其中數(shù)據(jù)條代表在培養(yǎng)四天后分泌到所述培養(yǎng)基中的蛋白質的平均量。用從沒有組織 的珠粒獲得的背景測量結果減去顯示的數(shù)據(jù)。誤差線代表SEM。實施例6-紅細胞生成刺激活性的評價將大鼠紅細胞系統(tǒng)的CD34+細胞(Lonza, Walkersville MD)以15，000個細胞/ cm2再懸浮在含有10% FBS的IMDM中。然后，將珠粒調理的培養(yǎng)基加入到甲基纖維素菌落 形成性測定培養(yǎng)基(MethoCultGF H4534, StemCell Technologies, Vancouver BC)中。將 細胞加入到甲基纖維素中，并隨后在37°C的5% C02恒溫箱中進行平板培養(yǎng)12-14天。通 過相差顯微鏡檢查計數(shù)包含多于50個細胞的菌落。來源于包囊的大鼠腎組織的調理培養(yǎng)基已經之前顯示出包含Epo。目前，當通過 BFU-E活性測定時，調理培養(yǎng)基顯示出具有紅細胞生成刺激活性(ESA)。實施例7-包囊的腎臟組織片段的腎臟保護作用的評價該研究的目的是評價腎病大鼠模型中海藻酸鹽包囊的大鼠腎組織片段的腎臟保 護作用。將具有初始重量200_250g的Sprague Dawley大鼠(糖尿病的或非糖尿病的)用 于這些試驗。腹膜內注射(5mg/kg)氯胺酮鹽酸鹽和甲苯噻嗪鹽酸鹽的4 1溶液來麻醉 大鼠。通過兩階段腎切除程序誘導腎衰竭。使用結扎絲線切除左腎的上部和下部(一個腎 的三分之二)，同時保護腎囊。十天后，切除右腎，留下總腎質量的約1/6(5/6腎切除)。施 用軟壓甲基纖維素止血，并用可吸收的4-0 Vicryl縫線逐層縫合腹膜和皮膚。在5/6的腎切除程序后五周，移植在包囊下的珠粒。作為對照，給5/6腎切除的大 鼠注射單獨的纖維蛋白基質。在第0天(5/6腎切除之前)和第1天(細胞移植當天)、第7、 14、21、28和35天(尸體剖檢當天)獲得血清樣品。使用VETACE CHEMISTRY ANALYZER (Alpha Wassermann Diagnostic Technologies, LLC, West Caldwell, NJ)定量血液尿素氣禾口肌酸 酐。
在細胞移植后五周，通過二氧化碳窒息處死所有組中的動物。切除腎進行組織學 和轉錄分析。將每個腎的一半在液氮中快速冷凍用于RT-PCR分析。由研究協(xié)調者從冷凍 的腎組織中分離信使RNA，利用包含促-纖維變性的和炎癥基因的低密度微點陣卡片進行 轉錄分析。將剩余的corneal腎切片固定在10%的中性緩沖的福爾馬林中用于下游組織學 分析。對用于組織學固定腎組織進行組織學處理，切片(5μm-厚度)，并用蘇木精/曙紅 染色。按獸醫(yī)病理學對腎小管損害進行評價和評級。在該研究中，囊下移植海藻酸鹽包囊的腎組織片段將減緩5/6腎切除的嚙齒類中 或糖尿病性腎病的嚙齒類模型中腎臟損傷的發(fā)展。與對照動物相比，hUTC處理的動物中血 清肌酸酐和血液尿素氮值都顯著地降低。另外，所述珠粒降低了糖尿病性腎病的嚙齒類模 型中的血糖水平。組織學損傷評價顯示處理的動物中腎小管壞死和腎小管擴張減少。盡管對作為遞送治療劑的方法的細胞包囊的興趣增加了，但是對于包囊整個組織 片段還沒有引起注意。本文證實了包囊的腎組織片段將Epo及其它有益試劑分泌到培養(yǎng)基 中。因此，本文公開的治療性植入物和治療方法可以提供許多疾病狀態(tài)的治療。將在該文件中引用或描述的每篇專利、專利申請和公布的全部內容引入本文作為 參考。
權利要求
治療性植入物，其包括包囊在聚合物珠粒內的腎臟組織。
2.根據(jù)權利要求1的治療性植入物，其中所述腎臟組織為自身組織、同種異體組織、異 種組織或其任意組合。
3.根據(jù)權利要求1的治療性植入物，其中所述腎臟組織包括遺傳改變的細胞。
4.根據(jù)權利要求1的治療性植入物，其中所述腎臟組織包括腎臟組織片段，且其中所 述片段具有小于約Imm的尺寸。
5.根據(jù)權利要求1的治療性植入物，其中所述腎臟組織包括腎臟組織片段，且其中所 述片段具有小于約300 μ m的尺寸。
6.根據(jù)權利要求1的治療性植入物，其包括至少約30mg的腎臟組織。
7.根據(jù)權利要求1的治療性植入物，其中所述聚合物珠粒包括海藻酸鹽、透明質酸、羧 甲基纖維素、聚乙二醇、葡聚糖、瓊脂糖、聚-L-賴氨酸、角叉菜膠、果膠、黃蓍膠、黃原膠、瓜 爾膠、阿拉伯膠、I型膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白或其任意組合。
8.根據(jù)權利要求1的治療性植入物，其中所述聚合物珠粒包括海藻酸鹽和聚-L-賴氨酸。
9.根據(jù)權利要求1的治療性植入物，其中所述聚合物珠粒具有約3mm至約6mm的直徑。
10.根據(jù)權利要求1的治療性植入物，其中所述組織分泌一種或多種激素、激素原、蛋 白質、生長因子或其任意組合。
11.根據(jù)權利要求10的治療性植入物，其中所述組織分泌一種或多種紅細胞生成素、 MCP-I、脂聯(lián)蛋白、瘦蛋白和MMP-2。
12.治療對象的疾病狀態(tài)的方法，其包括將包括包囊在聚合物珠粒內的腎臟組織的治 療性植入物植入所述對象內。
13.根據(jù)權利要求12的方法，其中所述疾病狀態(tài)為貧血、中風、心血管疾病或腎病。
14.根據(jù)權利要求12的方法，其中所述腎臟組織為自身組織、同種異體組織、異種組織 或其任意組合。
15.根據(jù)權利要求12的方法，其中所述腎臟組織包括遺傳改變的細胞。
16.根據(jù)權利要求12的方法，其中所述腎臟組織包括腎臟組織片段，且其中所述片段 具有小于約Imm的尺寸。
17.根據(jù)權利要求12的方法，其中所述腎臟組織包括腎臟組織片段，其中所述片段具 有小于約300 μ m的尺寸。
18.根據(jù)權利要求12的方法，其中所述治療性植入物包括至少約30mg的腎臟組織。
19.根據(jù)權利要求12的方法，其中所述聚合物珠粒包括海藻酸鹽、透明質酸、羧甲基纖 維素、聚乙二醇、葡聚糖、瓊脂糖、聚-L-賴氨酸、角叉菜膠、果膠、黃蓍膠、黃原膠、瓜爾膠、 阿拉伯膠、I型膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白或其任意組合。
20.根據(jù)權利要求12的方法，其中所述聚合物珠粒包括海藻酸鹽和聚-L-賴氨酸。
21.根據(jù)權利要求12的方法，其中所述聚合物珠粒具有約3mm至約6mm的直徑。
22.根據(jù)權利要求12的方法，其中所述組織分泌一種或多種激素、激素原、蛋白質、生 長因子或其任意組合。
23.根據(jù)權利要求22的方法，其中所述組織分泌一種或多種紅細胞生成素、MCP-IJg 聯(lián)蛋白、瘦蛋白和MMP-2。
24.制造治療性植入物的方法，其包括 提供腎臟組織；使所述腎臟組織與包括聚合物的溶液混合，從而形成組織_聚合物懸浮液； 將所述組織-聚合物懸浮液擠出至形成珠粒的溶液中，從而形成治療性植入物，其包 括將所述腎臟組織包囊在其內的所述聚合物的珠粒。
25.根據(jù)權利要求24的方法，其中所述溶液包括聚合物，該聚合物包括海藻酸鹽、透明質酸、羧甲基纖維素、聚乙二醇、葡聚糖、瓊脂糖、聚-L-賴氨酸、角叉菜 膠、果膠、黃蓍膠、黃原膠、瓜爾膠、阿拉伯膠、I型膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白或 其任意組合；和生長培養(yǎng)基。
26.根據(jù)權利要求
27.根據(jù)權利要求
28.根據(jù)權利要求
29.根據(jù)權利要求 24的方法，其中所述形成珠粒的溶液包括交聯(lián)溶液。 24的方法，其中所述形成珠粒的溶液包括離子溶液。 24的方法，其中所述形成珠粒的溶液包括CaCl2。 28的方法，其進一步包括用另外的聚合物層涂覆所述珠粒。
全文摘要
本發(fā)明提供治療性植入物，其包括包囊在聚合物珠粒內的腎臟組織。本發(fā)明還公開了治療對象的疾病狀態(tài)的方法，其包括將包括包囊在聚合物珠粒內的腎臟組織的治療性植入物植入所述對象內。本發(fā)明還提供制造治療性植入物的方法，其包括提供腎臟組織；混合所述腎臟組織與包括聚合物的溶液，從而形成組織-聚合物懸浮液；將所述組織-聚合物懸浮液擠出形成珠粒的溶液中，從而形成治療性植入物，其包括將所述腎臟組織包囊在其內的所述聚合物的珠粒。
文檔編號A61L27/22GK101903049SQ200880121614
公開日2010年12月1日 申請日期2008年12月17日 優(yōu)先權日2007年12月20日
發(fā)明者A·西達, B·C·克雷默, C·S·布恩蘇西索, D·C·科爾特 申請人:伊西康公司