專利名稱：抗原呈遞細胞的質量分析的制作方法
背景技術：
抗原呈遞細胞(APC)對于引發(fā)有效的免疫應答很重要。APC不僅將抗原呈遞給具有抗原-特異性受體的T細胞，而且還提供了T細胞活化所必需的信號。這種信號涉及多種細胞表面分子以及細胞因子和/或生長因子的產生?；罨醯幕蛭粗旅舻腡細胞所必需的這種信號被確認不同于預先致敏的記憶T細胞的再活化所必需的信號。
APC包括單核細胞、B細胞和樹突細胞。盡管單核細胞和B細胞的抗原呈遞能力似乎局限于預先致敏的T細胞的再活化，但是它們已被證實是感受態(tài)的APC。這些細胞類型不能直接活化功能性的原初的或未致敏的T細胞群。
另一方面，樹突細胞既能活化原初T細胞又能活化預先致敏的T細胞。樹突細胞是具有不同形態(tài)并具有廣泛的包括血液在內的組織分布的異種細胞群(參見，例如Steinman，Ann.Rev.Immunol.9271-96(1991))。樹突細胞的細胞表面不同尋常，具有面紗狀突起的特征。成熟樹突細胞被通稱作CD11c+HLA-DR+、CD86+、CD54+、CD3-、CD19-、CD14-、CD11c+和HLA-DR+。
樹突細胞吸收、加工并呈遞抗原，從而刺激未致敏的原初T細胞和記憶T細胞產生應答。它們對MHC-限制性T細胞的致敏能力很高并能非常有效地將抗原呈遞給T細胞。樹突細胞既能呈遞自身-抗原(例如，在T細胞的發(fā)生與耐受過程中)又能呈遞外源抗原(例如，在免疫應答過程中)。另外，樹突細胞還直接與非淋巴組織發(fā)生關系并監(jiān)測非淋巴組織的損傷信號(例如局部缺血、感染或炎癥)或腫瘤生長。一旦有信號，樹突細胞就通過釋放激活淋巴細胞和單核細胞的細胞因子來啟動免疫應答反應。
由于它們能有效進行抗原呈遞，所以人們在把樹突細胞用作體內和體外免疫刺激劑方面的興趣愈來愈大。具體地是，針對靶抗原制備出成熟的樹突細胞然后再將這些樹突細胞施用到受試者(例如患者)身上從而激發(fā)針對所述抗原的免疫應答。例如，未成熟的樹突細胞可以通過與靶抗原和成熟劑接觸來產生特異于所述靶抗原的活化成熟樹突細胞。另外，細胞群中的成熟抗原-特異性樹突細胞可以通過增殖來增加特異于所述靶抗原的樹突細胞的數目。
樹突細胞以及樹突細胞前體可以通過多種方法來進行分離。這些細胞類型通常以很低的概率(例如通常小于約1％的白血細胞)存在。因此，分離樹突細胞和樹突細胞前體的方法通常需要單獨進行大量的純化或與體外培養(yǎng)結合進行大量的純化來提供足夠數目的細胞。用于純化樹突細胞及其前體的方法包括，例如密度梯度分離、熒光激活的細胞篩選、免疫學細胞分離技術如淘選技術(panning)、補體溶解、玫瑰花結技術、磁性細胞分離技術、尼龍羊毛分離法以及這些方法的結合(參見，例如，O’Doherty等，J.Exp.Med.1781067-76(1993)；Young和Steinman，J.Exp.Med.1711315-32(1990)；Freudenthal和Steinman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA877698-702(1990)；Macatonia等，Immunol.67285-89(1989)；Markowicz和Engleman，J.Clin.Invest.85955-61(1990)；Bernhard等，Cancer Res.551090-104(1995)；Caux等，Nature 360258-61(1992)；美國專利US5994126和US5851756)。
由于可以用來制備樹突細胞的方法有多種，所以樹突細胞制劑的特征也是多樣化的。例如，在針對抗原的應答過程中，樹突細胞活化原初T細胞的能力可以不同。T細胞的活化需要兩個信號。第一個信號是通過T細胞受體(TCR)來傳遞的并決定T細胞的抗原特異性(“抗原-特異性信號”)。第二個信號或共-刺激信號可以通過T細胞和樹突細胞上的多個受體/配體對(共-刺激對)來傳遞。這些在T細胞和樹突細胞上表達的共-刺激對分別包括CD28/CD152(CTLA-4)和CD80/CD86；4-1BB和4-1BBL；CD27和CD70；LFA-1和CD54。
樹突細胞制劑向T細胞呈遞抗原的能力可以不同。例如，制劑可以不含呈遞靶抗原的樹突細胞。另外。樹突細胞制劑僅僅向T細胞呈遞少量的靶抗原。這種制劑作為體內和體外免疫刺激制劑的實用性已被降低。
多種試驗被用來評價樹突細胞制劑的質量。這些試驗包括，例如，確定制劑中的樹突細胞的數目或比例(例如，成熟和/或未成熟的)、某些細胞表面標記的存在、樹突細胞呈遞靶抗原的能力、刺激T細胞活化的能力等等。
一種確定APC制劑質量的方法是“免疫-表型法”，其確定起著某些APC-特異性標記物(例如，“樹突細胞”標記物CD83和/或CD11c)作用的細胞的數目或比例。然而，免疫表型法不能提供有關制劑參與T細胞活化的能力的信息。
混合型白細胞反應(MLR)是一種用來測定白細胞與異源抗原發(fā)生反應的試驗。同源白細胞(即，具有相同的HLA標記)不發(fā)生任何交叉反應，而異源性白細胞(具有不同的HLA標記)則發(fā)生不同程度的交叉反應，這些交叉反應取決于HLA標記之間的差異程度。因此，當MLR反應被用于測定異源抗原的交叉反應時，通常不用來確定樹突細胞制劑在其它意義上的功能。
因此，仍然需要測定樹突細胞制劑質量的方法。本發(fā)明滿足了這種需要以及滿足了更多的需求。
本發(fā)明的概述本發(fā)明提供了抗原呈遞細胞制劑的質量評價方法，該抗原呈遞細胞制劑被用于T細胞的刺激或給受試者施用的免疫刺激組合物的制備。
在一個實施方案中，提供了一種用于確定抗原呈遞細胞(APC)的抗原-非依賴性的、共刺激活性的方法。該方法包括以下步驟提供具有已知功能活性和基本上不具共刺激活性的T細胞以及提供一種具有未知共刺激活性的抗原呈遞細胞(APC)的樣品。使所述T細胞與亞最適濃度的抗原模擬物接觸。所述T細胞還與未知共刺激活性的APC樣品接觸。接著確定與抗原模擬物和APC樣品接觸過的所述T細胞的活化并與T細胞的標準活化指數進行比較從而確定APC的抗原非依賴性共刺激活性。還可以對被細胞吸收、加工和/或呈遞的預定抗原進行定性或定量測定。通常，抗原的吸收、加工和/或呈遞是通過，例如，western印跡、流式細胞計數或抗原-特異性T細胞的活化來進行確定。
被用于本發(fā)明方法中的T細胞與未知活性的抗原呈遞細胞可以是同源或異源的。通常，被用于本發(fā)明方法中的T細胞分離自外周血單核細胞。被用于該方法中的T細胞含有源自外周血單核細胞樣品的T細胞而不含在細胞表面表達MHC II型、CD14、CD54、CD80、CD83和/或CD86分子的細胞。
被用于本發(fā)明方法中的抗原模擬物通常是CD3結合劑，諸如，但不限于，特異于CD3的抗體、植物凝集素或非植物源的促細胞分裂原。被用于本發(fā)明方法中的抗原呈遞細胞通常是未成熟的樹突細胞或成熟的樹突細胞。成熟的樹突細胞可以是那些源自與樹突細胞成熟劑進行體外接觸的未成熟樹突細胞的樹突細胞。
本發(fā)明方法中的T細胞的活化可以通過以下方法來測定，例如，測定摻入到增殖T細胞的DNA中的放射性標記的胸腺嘧啶脫氧核苷的量，分析T細胞細胞因子即IFNγ(γ-干擾素)或白細胞介素-2的產生，或者分析T細胞活化標記物諸如但不限于CD25、CD69、CD44或CD125的調節(jié)?？梢源_定體外或體內T細胞因子的量。而且，可以例如通過利用特異于T細胞活性標記物的標記性抗體來確定T細胞活化標記物的調節(jié)作用。
本發(fā)明的方法通過將抗原呈遞細胞的T細胞活化與本方法中使用的T細胞標準活化指數進行比較來確定抗原呈遞細胞的抗原-非依賴性共刺激活性。所述標準活化指數可以被表示為一種閾值或者也可以被表示為一個數值范圍，每個數值都與樹突細胞的預定質量有關。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了一種用于確定樹突細胞制劑的抗原-非依賴性的共刺激活性的方法。該方法包括使第一數量的T細胞與亞最適數量的抗原模擬物進行接觸并與未知共刺激活性的樹突細胞制劑第一樣品接觸，其中所述第一數量的T細胞基本不具有共刺激活性并具有已知的功能活性。確定第一數量的T細胞的第一活化值。然后使第二數量的T細胞與樹突細胞制劑的第二樣品或亞最適數量的抗原模擬物進行接觸，從而確定第二數量的T細胞的第二活化值。將第一與第二活化值進行比較從而確定樹突細胞制備物的共刺激活性。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了一種用于確定樹突細胞制劑質量的方法。該方法包括以下步驟提供一種具有未知共刺激活性以及針對預定抗原的未知抗原呈遞能力的樹突細胞制劑；測定所述樹突細胞制劑的共刺激活性；和定性或定量測定所述樹突細胞制劑針對預定抗原的抗原呈遞能力。通過結合這些值可以評估所述樹突細胞制劑活化用于預定抗原的T細胞的質量。
所述樹突細胞制劑的共刺激活性可以通過以下方法來確定提供具有已知功能活性而且基本上不具共刺激活性的T細胞，使之與亞最適數量的抗原模擬物以及與第一樹突細胞制劑樣品接觸，然后確定被接觸的T細胞的活化，并將確定的被接觸T細胞的活化與T細胞的標準活化指數進行比較從而確定樹突細胞制劑的共刺激活性。
樹突細胞制劑對預測抗原的呈遞可以通過以下方法來測定使第二樹突細胞制劑樣品與預定抗原進行接觸并且確定預測抗原的量，而不管預定抗原是否已被樹突細胞制劑所吸收、被進行了加工，還是已被呈遞到第二樹突細胞制劑樣品的細胞表面。
本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明提供了評價抗原呈遞細胞諸如樹突細胞制劑用于T細胞刺激或作為給受試者施用的免疫刺激組合物的質量的方法。用于分析T細胞的抗原-非依賴性的共-刺激(也被稱作共刺激活性)和APC對預定抗原進行呈遞的試驗可以被用來確定APC制劑的質量。
一方面，APC制劑的質量可以通過抗原-非依賴性T細胞共-刺激(或效力)分析試驗來確定。通常，功能活性已知的T細胞與模擬抗原特異性信號的抗原模擬物接觸。該T細胞還與共刺激活性未知的APC接觸。然后可以測定T細胞的活化并且將該活化用來確定APC的質量。
另一方面，APC制劑的質量可以根據APC呈遞預定抗原的能力來確定。通常，使APC制劑與預定抗原接觸。在適當溫育一段時間以使抗原吸收后，就可以確定APC呈遞的預定抗原。
抗原-非依賴性的T細胞共-刺激(效力)分析試驗為了通過抗原-非依賴性的T細胞共-刺激分析試驗來確定APC的質量，使功能活性已知的T細胞與模擬抗原特異性信號的抗原模擬物接觸。使共刺激活性未知的APC與T細胞接觸，然后測定T細胞的活化并將該活化用來確定APC的質量。T細胞的活化可以在T細胞和APC的共培養(yǎng)期間或之后來確定。如本文所使用的，T細胞的活化可以通過檢測T細胞在與APC接觸而發(fā)生應答時的一種或多種功能的變化來確定。適當的T細胞功能包括，例如，DNA復制量的增加以及伴隨著的細胞增殖的增強，胞外和/或胞內細胞因子產生的變化，T細胞活化標記物的變化和T細胞對抗原呈遞細胞的其它應答反應(例如，抗原-特異性信號和共-刺激信號)。
被用于該試驗的T細胞可以是富集的T細胞制劑、APC-缺乏的T細胞制劑或基本上純化的T細胞制劑(下文)。所述T細胞具有已知功能活性。如本文所使用的，已知功能活性是指T細胞針對相同共-刺激信號(來自APC)和相同濃度的抗原模擬物的可重復應答，例如，所述已知功能活性可以是在針對相同量的共-刺激信號和抗原模擬物的應答中的一種預定的增殖(例如，通過摻入3H-胸腺嘧啶脫氧核苷所測定的DNA復制)、胞外細胞因子的產生、胞內細胞因子的產生和/或T細胞活化標記物的表達。T細胞的預定功能活性可以在本文記載的方法之前、同時或之后確定。
所述抗原模擬物可以，例如是一種多克隆抗體、一種單克隆抗體、抗體的抗原結合片段或能夠與T細胞受體結合而提供抗原模擬信號的其它分子。在某些實施方案中，抗原模擬物是CD3結合物，諸如CD3結合抗體或其抗原結合片段。在一個具體的實施方案中，CD3結合物是一種單克隆抗體，該單克隆抗體與T細胞受體(例如OKT3)的恒定CD3組分結合(參見，例如，Thomas等，J.Immunol.1516840-52(1993)；其公開內容被引入本文作參考)。在另一個實施方案中，CD3結合物可以是一種與CD3或T細胞受體的其它部分結合并模擬抗原特異性信號的多克隆抗體。
在另一個實施方案中，所述抗原模擬物可以是，例如一種植物凝集素或促細胞分裂原，該凝集素或促細胞分裂原以亞最適濃度與由APC提供的共-刺激信號共同提供一種刺激來激活T細胞。然而，在沒有共-刺激信號存在的情況下，該亞最適濃度或量的凝集素或促細胞分裂原不足以刺激最大化的T細胞活化。合適的植物凝集素包括，例如，伴刀豆凝集素A、植物凝集物、小麥胚芽凝集素、美洲商陸細胞分裂原等。非植物源的合適促細胞分裂原包括，例如，葡萄球菌內毒素A、鏈球菌蛋白A、乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)等。
T細胞通常與亞最適濃度或量的抗原模擬物接觸。如本文所使用的，“亞最適濃度”或“亞最適量”是指本身不能刺激最大化的T細胞活化的抗原模擬物的濃度或量。在一個典型的實施方案中，所述亞最適濃度或量的抗原模擬物使得T細胞對一個由APC提供的所需范圍的共-刺激信號產生線性應答(即，激活)。在另一個實施方案中，在來自APC的共-刺激信號的閾值水平之上，所述亞最適濃度或量的抗原模擬物使得T細胞活化。
在某些實施方案中，抗-CD3抗體的適量范圍可以是約0.05至約20ng/100μl，或約50ng/100μl，或更高。在其它實施方案中，使用亞最適濃度或量的植物凝集素和非植物源的促細胞分裂原。在其它實施方案中，所使用的植物凝集素或非植物源的促細胞分裂原的亞最適濃度或量取決于所選擇的組分。通常采用的植物凝集素或非植物源的促細胞分裂原的最適濃度對于本技術領域的技術人員是已知的并且可以容易地選出亞最適濃度。例如，PHA的最適濃度是1至5μg/μl，在本發(fā)明的一個實施方案中，小于1μg/μl將被用作亞最適濃度。適量的T細胞與APC可以進行接觸。在某些實施方案中，以低比例的APC/T細胞來進行分析試驗。所述APC與T細胞的比例范圍，例如約為1∶3至約1∶100。
與APC共培養(yǎng)前，T細胞可以與抗原模擬物接觸。例如，T細胞可以與被固定在組織培養(yǎng)板或微滴板孔中的亞最適濃度的抗原模擬物接觸?；蛘?，所述T細胞、APC和抗原模擬物可以在同一時間或大約同一時間進行接觸。
在一個范例性質的實施方案中，所述抗原模擬物可以被固定在培養(yǎng)皿(例如，平底96孔板)中。96孔板的每個孔中的抗原模擬物，例如抗-CD3單克隆抗體的適量范圍，例如，約0.1至約50ng，或更多。固定后，通常沖洗所述的孔從而除去未結合的抗原模擬物。在其它實施方案中，可以采用不同的培養(yǎng)時間和條件。
合適的APC制劑包括，例如，樹突細胞和單核細胞。在其它的實施方案中，APC可以是被活化的非標稱APC，諸如B細胞、T細胞或上皮細胞或內皮細胞。APC可以是未成熟的或成熟的。APC和T細胞通常進行約6小時至約48小時的共培養(yǎng)，然而較長或較短的時間也在本發(fā)明的保護范圍內。共培養(yǎng)通常進行足夠長的時間以使T細胞活化，但是大量的未成熟APC或APC前體的分化和/或成熟則需要較短的時間。
T細胞的活化可以在T細胞與APC的共培養(yǎng)期間和/或之后來確定。用于T細胞活化的合適試驗包括，例如DNA復制試驗(例如，3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入法)，胞外和/或細胞因子的產生試驗(例如，ELISA，流式細胞計數等)和T細胞活化標記物試驗(例如，流式細胞計數)。
T細胞的活化可能與T細胞的增殖如DNA復制有關，DNA復制可以通過，例如被標記的胸腺嘧啶脫氧核苷摻入法(例如，3H-胸腺嘧啶脫氧核苷或其它合適的標記物)來進行測定。T細胞與APC的共培養(yǎng)物可以進行約6至約24小時的脈沖標記(例如，3H-胸腺嘧啶脫氧核苷，約1μCi/孔)。然后收集所述細胞(例如利用細胞收集器)并通過液體閃爍光譜測定所摻入的放射量。在某些實施方案中，可以在與T細胞進行共培養(yǎng)之前使APC失活從而阻止APC的DNA復制。或者，在確定摻入標記物量之前可以將所述T細胞與APC分離。
還可以通過胞外或胞內細胞因子的產生來測定T細胞的活化，所述細胞因子的產生例如是IFNγ和/或IL-2等的產生。胞外細胞因子的產生可以通過測定培養(yǎng)基中的一種或多種細胞因子的濃度變化來測定。通常可以采用免疫分析試驗(例如，ELISA試驗、三明治試驗、免疫沉淀試驗或western印跡)，然而其它試驗也是適用的(參見，例如，Harlow和Lane，Using Antibodies，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，New York(1999)，其公開內容被引入本文作為參考)。針對胞內細胞因子水平，可以采用免疫分析試驗或其它試驗。在分析胞內細胞因子水平之前，任選地將T細胞與APC分離(例如，通過基于T細胞標記物表達收集)(參見，例如，Harlow和Lane，見上文)。
在其它實施方案中，T細胞活化可以通過T細胞活化標記物的調節(jié)作用來確定。這種標記物包括，例如CD25(也被稱作白介素-2受體α鏈)、CD69(也被稱作VEA或AIM)、CD44(也被稱作Pgp-1)、CD125(也被稱作IL-2受體β鏈)等。T細胞活化標記物的調節(jié)作用可以通過，例如確定蛋白質或mRNA的水平變化來測定。例如，蛋白質的水平變化可以采用抗T細胞活化標記物、轉錄因子或與T細胞活化有關的其它蛋白質的標記性抗體通過免疫分析試驗如ELISA或western印跡等試驗經流式細胞計數來測定。mRNA水平的變化可以確定編碼T細胞活化標記物、轉錄因子等的信息。mRNA水平可以通過，例如，Northern印跡、聚合酶鏈式反應(例如RT-PCR)、其它雜交試驗(例如利用GeneChipe探針陣列等的分析試驗)或其它分析試驗來確定(參見，例如Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratozy Manual，第三版，Cold Spring Harbor Publish.，Cold Spring Harbor，NY(2001)；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，第四版，John Wiley和Sons，紐約(1999)；美國專利US5,445,934；5,532,128；5,556,752；5,242,974；5,384,261；5,405,783；5,412,087；5,424,186；5,429,807；5,436,327；5,472,672；5,527,681；5,529,756；5,545,531；5,554,501；5,561,071；5,571,639；5,593,839；5,599,695；5,624,711；5,658,734；和5,700,637；其公開內容被引入本文作參考)。
由活化分析試驗確定的T細胞的活化(確定的活化)可任選地通過與抗原模擬物和/或APC單獨接觸的T細胞的背景活化來調節(jié)(即，降低)。
另外，可以任選地將所述活化針對T細胞制劑中的非-T細胞(例如，B細胞、NK細胞等)的背景水平調節(jié)。
所確定的活化(消除或沒有消除背景活化)可與T細胞的標準活化指數進行比較從而確定APC(例如樹突細胞)的共刺激活性。如本文所使用的，標準活化指數是指一種量值或系列值，可能與抗原非依賴性、APC的共刺激活性有關。例如，標準活化指數可以是一種閾值(例如，3H-胸腺嘧啶脫氧核苷的摻入水平、胞外或胞內細胞因子的產生水平、或一種或多種T細胞活化標記物的存在與否)。標準活化指數還可以是一系列與由APC對T細胞產生的不同水平的共-刺激有關的值(例如，不同的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷的摻入量、不同的胞外或胞內細胞因子的產生量、或T細胞活化標記物的存在與否)。在其它實施方案中，所述標準活化指數可以是定性的(例如，一種或多種T細胞活化標記物的存在與否、細胞因子的產生與否等)。例如，在某些實施方案中，所述標準活化指數可以與15000cpm的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷的摻入有關，該3H-胸腺嘧啶脫氧核苷的摻入用于測定T細胞活化的程度或水平，其可能與APC的共-刺激的程度或水平(或效力)成正比。
在某些實施方案中，標準活化指數可以被計算成由T細胞和抗-CD3抗體與APC(未知效力的)的接觸而產生的活化(例如，cpm)相對由T細胞與抗-CD3抗體接觸(沒有APC)而產生的活化之比。所得到的值可以是APC共刺激活性或效力的指標。
標準活化指數可以利用單個的T細胞制劑來確定，或者可以基于一種或多種T細胞制劑被標準化。在某些實施方案中，標準活化指數可以利用對照T細胞制劑或T細胞系和對照APC制劑或APC細胞系來確定。
被確定的活化以及相應的標準活化指數(或指標)通常與APC的共刺激活性成正比。因此，APC共刺激活性可以被用于，例如，對研究用途、動物研究用途的、臨床試驗用途的以及其它非臨床用途的APC進行定性。另外，APC共刺激活性分析試驗可以被用來確定APC制劑的一致性或作為APC產品的質量對照試驗(例如細胞疫苗產品)。
APC抗原呈遞試驗根據本發(fā)明的另一個方面，提供了用于確定APC制劑的質量的方法，該方法通過確定APC制劑對預定抗原的呈遞來實現(xiàn)。如上文所討論的，APC制劑在吸收、加工和呈遞抗原方面的能力可以不同。例如，成熟的樹突細胞一般在吸收、加工和呈遞新抗原方面的能力較低。相反，未成熟樹突細胞一般能夠有效地吸收抗原，但直到成熟后才能有效地加工和呈遞抗原。根據待分析細胞的類型，抗原呈遞可以是確定APC吸收、加工和呈遞某些預定抗原或一組抗原或抗原樣品的能力的尺度，或與APC吸收、加工和呈遞某些預定抗原或一組抗原或抗原樣品的能力有關。
為了確定抗原的呈遞，使APC樣品與一種或多種預定抗原接觸。對所述APC進行培養(yǎng)以便吸收以及任選地加工和/或呈遞預定抗原(或其表位)。由APC呈遞的預定抗原的量可能與通過例如測定在APC內部進行裝載和/或加工的呈遞、和/或通常有MHC分子參與的在APC表面進行的呈遞有關。這些分析試驗被統(tǒng)稱為“呈遞試驗”或“呈遞”。
所述預定抗原可以例如是細菌或病毒抗原，腫瘤特異性或腫瘤相關抗原(例如腫瘤細胞溶胞產物、腫瘤細胞膜制劑、腫瘤分離抗原、融合蛋白或脂質體)或其它抗原。在一個范例性的實施方案中，所述抗原是前列腺特異性膜抗原(PSMA)。
在某些實施方案中，預定抗原呈遞的量可能與APC對抗原的裝載有關。例如，APC可以裝載抗原，收集細胞并任選地沖洗掉保留在細胞外部的抗原?？梢灾苽浼毎芙猱a物并通過免疫試驗來對所述溶胞產物進行分析從而確定由APC裝載的預定抗原的量。這種試驗包括western印跡、ELISA試驗，免疫沉淀等(參見例如，Harlow和Lane，見上文)。
在另外的實施方案中，預定抗原的呈遞可以通過檢測在APC表面上呈遞的抗原(或其表位)來確定。例如，與預定抗原接觸的APC可以采用增溶劑(例如TWEEN，十二烷基磺酸鈉或NP40)通過滲透壓休克等來進行處理。釋放出的抗原(或其表位)可以通過例如免疫試驗(例如ELISA，免疫沉淀等)來檢測。所述預定抗原或抗體可任選地進行檢測性標記(例如利用放射性同位素、熒光團、化學發(fā)光標記物、酶等)，而且釋放出的抗原可以利用適當的檢測手段(例如閃爍計數器)來檢測。
在相關的實施方案中，抗原呈遞可以通過流式細胞計數來確定。例如APC可以與預定抗原接觸，而且是在培養(yǎng)一段時間后，可以采用抗原-特異性標記物對被接觸的APC進行染色從而可以檢測出細胞表面所呈遞的抗原量。合適的標記物可以包括，例如被標記的抗體或其它對所述抗原或其片段具有特異性的結合試劑。
抗原呈遞還可以利用抗原-特異性T細胞如抗原-特異性T細胞系來進行確定?？梢詫PC與預定抗原進行接觸并一直培養(yǎng)到進行抗原的吸收、加工和呈遞。如本文所討論的，抗原呈遞可以通過測定抗原-特異性T細胞的活化(例如通過確定DNA的復制、胞外或胞內細胞因子的產生、T細胞的活化等)來確定。
T細胞和APC制備物用于本發(fā)明的T細胞可以按照本技術領域中已知的方法來制備。對于抗原-非依賴性的共-刺激試驗來說，T細胞可以是一種富集的T細胞制劑、一種APC-缺乏的T細胞制劑或基本純的T細胞制劑(見下文)。T細胞或亞型T細胞可以從多種淋巴組織中得到。這些組織包括，但不限于脾、淋巴結和外周血。T細胞可以是一種混合的T細胞群或一種純化的T細胞亞型。
在某些實施方案中，所述T細胞是一種富集的細胞制劑，其中細胞的數目或百分比針對分離的T細胞群而增加。在其它實施方案中，所述T細胞基本上不含APC，其中大多數(例如＞75％)的APC已被從T細胞中分離出來。在一個范例性的實施方案中，外周血單核細胞(PBMC)可以利用諸如肝素化小瓶從血液中得到。PBMC可以通過離心(例如利用HISTOPAQUE1077(Sigma Aldrich Co.))來從血紅細胞中分離并且從界面回收PBMC。可以任選地沖洗(如用PBS)回收到的PBMC。
T細胞的純化可以通過例如正或負篩選來實現(xiàn)，所述正或負篩選包括但不限于使用針對CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD14、CD19和/或MHC II型分子的抗體。本發(fā)明使用的T細胞制劑通常是CD4+或D4+與CD8+的混合群。在某些實施方案中，T細胞制劑至少含有約50％的T細胞。在另外的實施方案中，所述T細胞可以是一種分離的T細胞系。
可以制備其中已去除了共-刺激信號的APC-缺乏的T細胞。共-刺激信號可以通過例如利用抗MHC II型分子的抗體而進行的“淘選(panning)”來去除。例如，T細胞或PBMC可以與偶聯(lián)了MHC II型分子-特異性抗體的磁珠子接觸以便去除共-刺激信號。如本文所采用的，基本上不含共-刺激信號的T細胞一般具有微乎其微的T細胞活化(例如，小于約5％，或小于約1％的完全被激活的T細胞的活性)。
APC可以由多種來源制備，包括人和非人靈長目、其它哺乳動物和脊椎動物。在某些實施方案中，APC可以由人或非人脊椎動物的血來制備。APC還可以分離自富集的白細胞群體。白細胞群體可以通過本技術領域中的技術人員已知的方法來制備。這些方法通常包括收集肝素化血液、單采血液成分術(apheresis)或白細胞提取法(leukopheresis)、血沉棕黃層的制備、玫瑰花結、離心、密度梯度離心(例如利用Ficoll(諸如FICOLL-PAQUE)、PERCOLL(膠體硅石顆粒)、蔗糖等)、非白細胞的差異溶胞、過濾等。白細胞群體還可以通過以下步驟來制備收集受試者的血液、去纖維蛋白化以去除血小板并將血紅細胞溶胞來制備。所述白細胞群體可以任選地富集單核的樹突細胞前體。
根據富集的白細胞群體的所需用途，可以從多種受試者身上獲得血細胞群體。受試者可以是健康的受試者?；蛘?，可以從需要進行免疫刺激的受試者，諸如癌癥患者或其它將受益于免疫刺激的患者身上獲取血細胞。同樣，血細胞還可以從需要進行免疫抑制的受試者，諸如患有自身免疫疾病(例如類風濕關節(jié)炎、糖尿病、狼瘡、多發(fā)硬化癥等)的患者身上獲取。白細胞群體還可以從HLA-匹配的健康個體身上獲取。
在某些實施方案中，單核的樹突細胞前體可以通過例如使富集的白細胞或單細胞與單核樹突細胞前體粘附底物接觸來分離(參見，例如美國臨時專利申請60/307,978(2001年7月25日申請的)；其公開內容被本文引入作為參考)。簡單地說，當富集的白細胞或單核細胞群與底物接觸時，細胞群中的單核樹突細胞前體或單核細胞粘附到底物上。其它白細胞對底物則表現(xiàn)出較低的結合力，因此使得單核樹突細胞前體優(yōu)先富集在底物的表面上。
合適的底物包括微粒型底物，諸如玻璃微粒、塑料微粒、玻璃包被的塑料微粒、玻璃包被的聚苯乙烯微粒、微毛細血管的膜和微絨毛狀的膜。任選地可對底物表面進行處理以便增強單核樹突細胞前體對底物的粘附力。底物表面可以包被一層例如蛋白質；細胞因子，諸如粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素-4和/或白細胞介素13；血漿，諸如自體或異體血漿；結合單核細胞的蛋白等。
在富集了白細胞或單核細胞的細胞群與粘附單核樹突細胞前體的底物接觸后，單核樹突細胞前體則與底物粘合從而形成在底物表面上含單核樹突細胞前體的復合體?？梢詫魏藰渫患毎绑w的結合力進行監(jiān)測，例如通過采用抗細胞表面標記物抗體，例如抗-CD14抗體的抗體檢測法，F(xiàn)ACS正向和側散射分析等來進行監(jiān)測。在某些實施方案中，白細胞群與底物接觸約5至約300分鐘，更典型地約30至約120分鐘。
單核樹突細胞前體復合體可任選地用適當的沖洗緩沖液進行沖洗以便去除非特異結合的白細胞。合適的沖洗緩沖液包括組織培養(yǎng)基(例如AIM-V，RPMI 1640，DMEM，X-VIVO 15等)、磷酸鹽緩沖鹽水、Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水等。所述培養(yǎng)基可以添加氨基酸、維生素和/或激素以便提高單核樹突細胞前體的存活率和/或增殖力。沖洗的效力可以通過對沖洗緩沖液進行的FACS正和側散射分析、對洗脫細胞染色檢測細胞表面標記等來監(jiān)測。典型地，將所述復合體沖洗幾次從而去除非特異結合的白細胞。
可以將粘附的單核樹突細胞前體從底物上洗脫下來。例如，可以采用含0.4％EDTA的磷酸鹽緩沖鹽水或其它非毒性螯合劑進行處理以便將所述前體從底物上洗脫下來。典型地。不需要使用胰蛋白酶或其它蛋白酶而將所述單核樹突細胞前體從底物上洗脫下來。
在其它實施方案中，可以根據本技術領域的技術人員已知的其它方法來分離所述樹突細胞(參見，例如O′Doherty等，J.Exp.Med.1781067-76(1993)；Young和Steinman，J.Exp.Med.1711315-32(1990)；Freudenthal和Steinman，Proc.Natl.Acad Sci.USA 877698-702(1990)；Macatonia等，Immunol.67285-89(1989)；Markowicz和Engleman，J.Clin.Invest.85955-61(1990)；美國專利US 5,994,126和5,851,756；其公開內容被本文引入作為參考)。用于免疫選擇樹突細胞的方法包括，例如利用針對與樹突細胞前體相關的細胞表面標記的抗體，諸如偶聯(lián)在底物上的抗-CD34和/或抗-CD14抗體(參見例如Bernhard等，Cancer Res.551099-104(1995)；Caux等，Nature 360258-61(1992))或與完全分化的樹突細胞相關的細胞表面標記，諸如CD11c，CD54，CD83，CD80，CD86等的抗體。
在其它實施方案中，APC可以是炎癥或其它活化條件下的非-標稱的APC。例如，非-標稱的APC可以包括受γ-干擾素刺激的上皮細胞、T細胞、B細胞和/或被因子或誘導APC活化條件激活的單核細胞。這種非-標稱APC可以根據本技術領域已知的方法來制備。
APC的培養(yǎng)、擴增和分化根據需要，按照APC的類型，APC可以被培養(yǎng)、擴增、分化和/或熟化?？梢栽谌魏魏线m的培養(yǎng)器，諸如培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)袋、培養(yǎng)反應器等中對APC進行培養(yǎng)(參見例如美國臨時專利申請US60/307,978(2001年7月25日申請的))。
在某些實施方案中，可以在合適的培養(yǎng)或生產培養(yǎng)基中培養(yǎng)APC以便維持和/或擴增制劑中的APC數目。所述培養(yǎng)基可以根據分離的APC類型來選擇。例如成熟的APC，諸如成熟的樹突細胞可以在適于其維持和擴增的生長培養(yǎng)基，例如AIM-V、RPMI 1640、DMEM、X-VIVO 15等中進行培養(yǎng)。所述培養(yǎng)基中可以添加氨基酸、維生素、抗生素、雙價陽離子等。另外，所述生長培養(yǎng)基中也可含有細胞因子、生長因子和/或激素。例如，為了維持和/或擴增成熟樹突細胞，細胞因子，諸如粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或白細胞介素-4(IL-4)典型地是以約500單位/ml的濃度進行添加。
在其它實施方案中，可以對未成熟的APC進行培養(yǎng)和/或擴增。因為未成熟的樹突細胞保留了攝取和加工新抗原的能力所以它們在本發(fā)明的某些方面是優(yōu)選的(參見例如Koch等，J.Immunol.15593-100(1995))。在一個范例性的實施方案中，未成熟的樹突細胞可以在適于其維持和培養(yǎng)的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基是諸如AIM-V、RPMI 1640、DMEM、X-VIVO 15等。所述培養(yǎng)基中可以添加氨基酸、維生素、抗生素、雙價陽離子等。另外，所述培養(yǎng)基中還可含有細胞因子、生長因子和/或激素。例如，為了維持和/或擴增未成熟的樹突細胞，細胞因子，諸如粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或白細胞介素-4(IL-4)典型地是以約500單位/ml的濃度進行添加。
其它未成熟的APC可以根據技術人員已知的方法進行類似的培養(yǎng)或擴增。
可以使未成熟APC的制劑成熟而形成成熟的APC。根據未成熟APC的類型，APC可以在暴露給抗原(例如預定抗原)期間或之后成熟。
在某些實施方案中，未成熟樹突細胞的制劑可以被成熟。合適的成熟因子包括，例如細胞因子(例如TNF-α)、細菌產物(例如BCG)等。
在本發(fā)明的某些方面，需要制備特異于預定抗原的APC。這種抗原可以是，例如細菌和病毒抗原、腫瘤特異性的或腫瘤相關抗原(例如腫瘤細胞溶胞產物、腫瘤細胞膜制劑、從腫瘤分離出的抗原、融合蛋白或脂質體)或其它抗原。在一個范例性的實施方案中，未成熟的樹突細胞是在癌癥免疫療法和/或腫瘤生長抑制的前列腺特異性膜抗原(PSMA)存在的條件下進行培養(yǎng)的。APC典型地是與預定抗原一起進行培養(yǎng)并且培養(yǎng)適當時間以便吸收和加工抗原。
另一方面，分離的APC前體被用來制備未成熟或成熟的APC制劑。按照技術人員所知道的，APC前體可以培養(yǎng)、分化和/或成熟。
在某些實施方案中，單核樹突細胞前體可以在有適當培養(yǎng)基(例如AIM-V，RPMI 1640，DMEM，X-VIVO 15等)存在的條件下進行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基中添加了添加氨基酸、維生素、細胞因子(例如GM-CSF和/或IL-4)、雙價陽離子等以便促進單核樹突細胞前體向未成熟樹突細胞的分化。典型的細胞因子組合是約各500單位/ml的GM-CSF和IL-4。
下面的實施例只是提供用來說明本發(fā)明的各個方面而無論如何不應當被解釋為是對本發(fā)明的限制。
實施例實施例1共-刺激試驗在該實施例中，一種抗原-非依賴性的共-刺激試驗被用來測定樹突細胞制劑的質量。
按照以下方法由26個不同的人受試者制備樹突細胞制劑將PBMC從每位患者的白細胞提取法(leukophereses)血中分離出來后在添加了5％的自體血漿的OptiMEM培養(yǎng)基(Gibco-BRL)中培養(yǎng)6天，接著在有BCG(一種樹突細胞成熟劑)存在的條件下再培養(yǎng)一天。
按照以下方法制備外周血單核細胞(PBMC)白細胞提取法(Leukopheresed)血用緩沖鹽水稀釋后覆蓋上FICOLL溶液并以2000rpm旋轉20分鐘。界面處的白細胞被分離出來。利用磁珠子篩選法將共-刺激成分從PBMC中除去。簡單地說，就是MCH II型的抗體被偶聯(lián)到磁珠子上(Dynal Corp.，紐約)。將磁珠子加到PBMC中以便除去含有MHC II型分子的細胞以2-10個珠子/細胞的密度將珠子加到PBMC中并溫育1小時。溫育后，利用磁性裝置將結合了珠子的細胞(APC)除去。所得到的PBMC群大部分不含APC而且含有大于50％的T細胞。
按照以下方法進行增殖試驗將1×104的樹突細胞加到96-孔培養(yǎng)板的每個孔中并與1ng的抗-CD3抗體進行接觸(BD Pharmingen，San Diego，加利福尼亞)。然后，加入1×105的富集T細胞(見上文)，結果使得每孔的最終體積達到0.2ml。將所述板溫育26小時，然后用3H-胸腺嘧啶脫氧核苷進行脈沖。將該板繼續(xù)溫育18小時，然后進行收集并測定摻入的標記物。
T細胞增殖(δcpm)的測定為在有抗-CD3抗體存在下受樹突細胞制劑的樣品刺激的T細胞中的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入量與只受樹突細胞制劑的樣品刺激的T細胞中的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入量的差值。每一樹突細胞制劑的平均δcpm為一式三份樣品的平均值。
下面的表1顯示了該試驗的結果。
表1共-刺激試驗
只與抗-CD3抗體一起進行溫育的T細胞的平均cpm約為370。這種低水平的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入量表明抗-CD3的抗體是以亞最適濃度加入的。只與樹突細胞制劑樣品進行共培養(yǎng)的T細胞的平均cpm為約2281cpm。相反，與抗-CD3的抗體和樹突細胞進行共培養(yǎng)的T細胞的平均δcpm是39747cpm，其標準差為14972cpm。δcpm值的分布是正常的，但明顯偏向δcpm值范圍的較高端值。
得自正常人供體的樹突細胞制劑對照樣品的平均δcpm約為51260，其標準差為12,911cpm。基于這些數據，增殖程度為15000δcpm或大于15000δcpm的樹突細胞制劑被發(fā)現(xiàn)具有可接受的質量。
實施例2抗原非依賴性共-刺激試驗的特異性該共-刺激試驗基于某些類型的APC刺激抗原-非依賴性的T細胞增殖的能力。進行以下研究以便確定該試驗的特異性。
樹突細胞制劑中最常見的非-樹突細胞類型制備好后被單獨用于共-刺激試驗并被摻入到特征(對照)樹突細胞制備物中。通過利用抗體進行負篩選的磁珠子分離方法由外周血單核細胞(PBMC)純化出T細胞、B細胞和單核細胞。對于T細胞來說，使用的是針對HLA-DR、CD19和CD56的抗體，對于B細胞使用針對CD2、CD3和CD14的抗體。對于單核細胞來說，使用的是針對CD3、CD19和CD56的抗體。
按照以下步驟實施所述試驗如實施例1所記載的，只是在增殖試驗中，以T細胞、B細胞核單核細胞代替樹突細胞。取代樹突細胞使用的T細胞經照射以避免增殖。然后加入同種異體的指示T細胞并且在40小時后按照上文所述方法對增殖情況進行測定。
在共-刺激試驗中取代樹突細胞而使用的T和B淋巴細胞在任何測試濃度下都不能刺激T細胞。如下表2所示，當以樹突細胞的細胞數目的2.5倍加入從PBMC中分離的單核細胞時，該單核細胞能夠刺激T細胞的增殖(3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入法)。然而，該增殖比利用同等數目的樹突細胞所獲得的增殖低得多。
表2單核細胞 樹突細胞的細胞數目δCPM的細胞數目δCPM5×103～1600050×103～3900025×103～6000 25×103～4300013×103～2000 13×103～320006.3×103～06.3×103～160003.1×103～03.1×103～70001.6×103～01.6×103～20000.8×103～00.8×103～00.4×103～00.45×103～0樹突細胞制劑中的CD14陽性、CD11c陽性細胞和CD14陰性、CD11c陽性細胞被發(fā)現(xiàn)具有同等的共刺激活性并且兩者被認為都屬于樹突細胞。
實施例3樹突細胞的定性CD11c陽性、CD14陽性細胞和CD11c陽性、CD14陰性細胞的共刺激出活性是通過利用抗CD14的標記抗體(Pharmingen)的熒光激活細胞分類法(FACS)從樹突細胞制備物中分離出來的。
在這些試驗中，得自樹突細胞制劑的CD11陽性、CD14陽性細胞和CD11c陽性、CD14陰性細胞似乎具有同等的共刺激活性。因此，兩種細胞類型被統(tǒng)稱作樹突細胞。
實施例4樹突細胞的存活力對共-刺激試驗的影響根據本發(fā)明，測定了死亡細胞對試驗的可能影響。簡要地說，通過利用1％的甲醛處理30分鐘或通過加熱到56℃保持1小時將樹突細胞殺死。在共-刺激試驗中檢測這些死亡(被殺死的)細胞懸浮液。將死亡細胞與活的樹突細胞以一定的比例混合。除了以下記載的不同方面以外，其它按照上述實施例1中所記載的方式實施該試驗，如下列表3和表4所示，加熱殺死的樹突細胞基本上沒有保留本發(fā)明共-刺激試驗中的活性。正如碘化丙錠染色所測定的結果，甲醛處理的樹突細胞仍然保留了約20％的活性樹突細胞；這些細胞保留了低水平的共刺激活性。在第三個試驗中，被殺死細胞的加入沒有對該試驗產生干擾。
表3細胞存活力對共-刺激試驗的影響
表4死亡細胞對共-刺激試驗的影響
實施例5抗原-非依賴性的共-刺激試驗的線性加入數目增加的樹突細胞至固定數目的指示T細胞確定樹突細胞數目與3H-胸腺嘧啶脫氧核苷試驗之間的關系。將0，2000，6000或10000個樹突細胞加到各孔中。如實施例1所記載的(例如每孔1ng的抗-CD3抗體與105個T細胞)，采用以下培養(yǎng)條件?？偱囵B(yǎng)時間是40小時；最后18小時的培養(yǎng)是在有3H-胸腺嘧啶脫氧核苷存在的條件下進行的。
指示T細胞對3H-胸腺嘧啶脫氧核苷的吸收量基本上是隨著樹突細胞數目的增加而線性增大的。特別是，觀測到的δ分別為0，約7000cpm，約15000cpm和約27000cpm。公式y(tǒng)＝2.7183-134.13(R2＝0.9879)接近該線性關系。這些結果表明共-刺激試驗可線性依賴于DC的數目。
實施例6精確度實施例1的共-刺激試驗的精確度是通過三個操作者對同-批次(lot)的樹突細胞進行試驗測定的。每個操作者對所述批次的樹突細胞做三次試驗，在連續(xù)的三天里每天做一次。數據分析是一式兩份(試驗內方差)、可重復的(試驗間方差(variance))和可再現(xiàn)的(操作者間方差)。原始數據如下表5所示。方差系數(CV)范圍是從1.25至16.18，低水平的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入量觀察到較高的CV。
表5共-刺激試驗的精確度-原始數據
所有條件都是按一式三份進行的，三份cpm值是以一式兩份測量值測定的。利用δcpm分析可重復性和可再現(xiàn)性。每個操作者的δcpm的平均值、標準誤差和試驗間方差(CV)系數如以下表6所示。1號操作者的CV是57.8％，2號操作者的是14.4％以及3號操作者的是19.6％。再現(xiàn)性是由三個操作者的δcpm的平均值的CV表示的并且為14％。
表6重復性和再現(xiàn)性
實施例6按照以下方式分析負載PSMA的樹突細胞將該負載的樹突細胞用洗滌劑溶胞，并在7.5％SDS PAGE凝膠的每條泳道中對相當于5×105個細胞的溶胞物進行電泳。在150伏特下電泳約1小時將所述溶胞蛋白離解后，將所述蛋白轉移到PVDF或尼龍膜上。利用PSMA-特異性單克隆抗體，4D8(ATCC HB 12487；美國專利US6150508)進行western印跡分析。通過化學發(fā)光并對膠片曝光來觀測抗體的結合情況。通過共-定位跑膠的標準PSMA蛋白來確定PSMA。
以上提供的實施例是用來進行說明的，而不是用來限制本發(fā)明的保護范圍的。針對本發(fā)明的其它變化形式對于本技術領域的的技術人員來說是顯而易見的并且都被包含在所附的權利要求內。因此本文所引用的所有出版物、專利、專利申請和其它參考文獻只是被引入作為參考。
權利要求
1.一種用于確定抗原呈遞細胞(APC)的抗原-非依賴性的、共刺激活性的方法，包括提供具有已知功能活性和基本上不具有共刺激活性的T細胞；提供未知共刺激活性的APC的樣品；使所述T細胞與亞最適濃度的抗原模擬物接觸；使所述T細胞與未知共刺激活性的APC樣品接觸；確定與抗原模擬物和APC樣品接觸過的所述T細胞的活化；和將確定的T細胞的活化與T細胞的標準活化指數進行比較從而確定APC的共刺激活性。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述T細胞和APC是同源的。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述T細胞和APC是異源的。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述抗原模擬物是CD3結合劑、植物凝集素或促細胞分裂原。
5.如權利要求4所述的方法，其中CD3結合劑是抗-CD3的抗體。
6.如權利要求1所述的方法，其中APC是樹突細胞。
7.如權利要求6所述的方法，其中樹突細胞是源自與樹突細胞成熟劑進行體外接觸的未成熟樹突細胞的成熟樹突細胞。
8.如權利要求6所述的方法，其中樹突細胞是未成熟樹突細胞。
9.如權利要求1所述的方法，其中T細胞基本上不含在其細胞表面表達CD14、CD54、CD80、CD83或CD86分子的外周血單個核細胞。
10.如權利要求1所述的方法，其中T細胞基本上不含在細胞表面表達MHC II型分子的外周血單個核細胞。
11.如權利要求1所述的方法，其中所述T細胞的活化是通過3H-胸腺嘧啶脫氧核苷吸收試驗確定的。
12.如權利要求1所述的方法，其中所述T細胞的活化是通過分析T細胞的細胞因子的產生來確定的。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述被分析的T細胞細胞因子的產生是IFNγ或白介素2的產生。
14.如權利要求12所述的方法，其中所述被分析的T細胞細胞因子的產生是胞外細胞因子的產生。
15.如權利要求12所述的方法，其中所述被分析的T細胞細胞因子的產生是胞內細胞因子的產生。
16.如權利要求1所述的方法，其中所述T細胞的活化是通過檢測T細胞活化標記物表達的調節(jié)作用來確定的。
17.如權利要求16所述的方法，其中所述T細胞活化標記物是CD25、CD69、CD44或CD125。
18.如權利要求16所述的方法，其中所述T細胞活化標記物是利用能夠與T細胞活化標記物結合的標記的抗體進行檢測的。
19.如權利要求1所述的方法，其中將所確定的活化與標準活化指數進行的比較包括將所確定的T細胞活化與僅接觸過樹突細胞樣品的T細胞的活化進行比較從而確定樹突細胞的性質。
20.如權利要求1所述的方法，其中所述標準活化指數是一個閾值。
21.如權利要求1所述的方法，其中所述標準活化指數是一個數值范圍，每一數值與預定的樹突細胞的性質有關。
22.如權利要求1所述的方法，進一步包括確定APC對預定抗原的呈遞。
23.如權利要求23所述的方法，其中預定抗原的呈遞是通過western印跡、流式細胞計數或抗原-特異性T細胞的活化來確定的。
24.一種用于確定樹突細胞制劑的抗原-非依賴性的共刺激活性的方法，包括使第一數量的T細胞與亞最適數量的抗原模擬物進行接觸并與未知共刺激活性的樹突細胞制劑的第一樣品接觸，其中所述第一數量的T細胞基本不具有共刺激活性并具有已知的功能活性；確定第一數量的T細胞的第一活化值；使第二數量的T細胞與樹突細胞制劑的第二樣品或亞最適數量的抗原模擬物進行接觸；確定第二數量的T細胞的第二活化值；和將第一與第二活化值進行比較從而確定樹突細胞制劑的共刺激活性。
25.如權利要求24所述的方法，其中所述T細胞與樹突細胞制劑是異源的。
26.如權利要求24所述的方法，其中所述T細胞與樹突細胞制劑是同源的。
27.如權利要求24所述的方法，其中所述抗原模擬物是抗-CD3的抗體、植物凝集素或促細胞分裂原。
28.如權利要求24所述的方法，進一步包括確定樹突細胞對預定抗原的呈遞。
29.如權利要求28所述的方法，其中預定抗原的呈遞是通過western印跡、細胞計數或抗原-特異性T細胞的活化來確定的。
30.一種用于確定樹突細胞制劑質量的方法，包括(1)提供共刺激活性未知以及針對預定抗原的抗原呈遞能力未知的樹突細胞制劑；(2)確定所述樹突細胞制劑的共刺激活性，所述共刺激活性的確定包括(a)提供已知功能活性和基本上不具共刺激活性的T細胞；(b)使所述T細胞與亞最適數量的抗原模擬物和樹突細胞制劑第一樣品接觸；(c)確定被接觸的T細胞的活化；和(d)將被確定的接觸T細胞的活性與T細胞的標準活化指數進行比較從而確定樹突細胞制劑的共刺激活性。(3)測定所述樹突細胞制劑對預定抗原的呈遞，所述呈遞的確定包括(a)使樹突細胞制劑的第二樣品與預定抗原接觸；和(b)確定由所述樹突細胞呈遞的預定抗原的量；和(4)在確定的共刺激活性和確定的預定抗原的抗原-特異性呈遞的基礎上確定樹突細胞的質量。
31.如權利要求30所述的方法，其中所述抗原模擬物是CD3結合物、植物凝集素或促細胞分裂原。
32.如權利要求31所述的方法，其中CD3結合物是抗-CD3的抗體。
33.如權利要求30所述的方法，其中樹突細胞是源自與成熟劑進行體外接觸的未成熟樹突細胞的成熟樹突細胞。
34.如權利要求30所述的方法，其中樹突細胞是未成熟樹突細胞。
35.如權利要求30所述的方法，其中T細胞基本上不含在細胞表面表達MHC II型、CD14、CD54、CD80、CD83或CD86分子的外周血單個核細胞。
36.如權利要求30所述的方法，其中所述T細胞的活化是通過3H-胸腺嘧啶脫氧核苷增殖試驗測定的。
37.如權利要求30所述的方法，其中所述T細胞的活化是通過分析T細胞的細胞因子的產生來確定的。
38.如權利要求37所述的方法，其中所述的T細胞細胞因子的產生是IFNγ或白介素2的產生。
39.如權利要求37所述的方法，其中所述的T細胞細胞因子的產生是胞外細胞因子的產生。
40.如權利要求37所述的方法，其中所述T細胞細胞因子的產生是胞內細胞因子的產生。
41.如權利要求30所述的方法，其中所述T細胞的活化是通過至少一種T細胞活化標記物的表達來確定的。
42.如權利要求41所述的方法，其中所述T細胞活化標記物是CD25、CD69、CD44或CD125。
43.如權利要求41所述的方法，其中所述T細胞活化標記物是利用能夠與T細胞活化標記物結合的標記的抗體進行檢測的。
44.如權利要求30所述的方法，其中測定共刺激活性包括將所確定的T細胞活化與T細胞的標準活化指數進行比較。
45.如權利要求44所述的方法，其中所述標準活化指數是一個閾值。
46.如權利要求44所述的方法，其中所述標準活化指數是一個數值范圍，所述數值與不同的預定共刺激活性有關。
47.如權利要求30所述的方法，其中預定抗原的呈遞是通過westen印跡、流式細胞計數或抗原-特異性T細胞的活化來確定的。
全文摘要
本發(fā)明提供了評估抗原呈遞細胞制劑，諸如樹突細胞制劑的質量的方法。提供了用于測定T細胞的抗原－非依賴性共－刺激作用和用于測定APC對預定抗原的呈遞的試驗。
文檔編號G01N33/569GK1659285SQ03812711
公開日2005年8月24日 申請日期2003年5月8日 優(yōu)先權日2002年5月8日
發(fā)明者V·G·尚卡, P·A·洛奇, A·N·布魯內勒 申請人:西北生物治療藥物公司