專利名稱：檢測和分型人乳頭瘤病毒的擴(kuò)增－雜交方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了改進(jìn)的檢測和分型人乳頭瘤病毒(HPV)的方法。
本發(fā)明的一個(gè)方面定義了這樣的HPV基因組區(qū)域，其適用于設(shè)計(jì)HPV屬特異和HPV基因型特異的雜交寡核苷酸探針，有利地是這些基因組區(qū)域互相靠近并在一個(gè)擴(kuò)增子中。
本發(fā)明的另一方面涉及屬特異和基因型特異探針的序列。
本發(fā)明的另一方面涉及適用于擴(kuò)增HPV基因型并檢測HPV基因型擴(kuò)增產(chǎn)物的優(yōu)化方法及試劑的優(yōu)化配制(試劑盒)。
背景技術(shù)：
已確定很多的乳頭瘤病毒序列，見此處引用作為參考的出版物HPV-6de Villiers等人，J.Virology，40(1981)；HPV-11Dartmann等人，Virology151，124-130(1986)；HPV-16Seedorf等人，Virology145，181-185(1985)；HPV-18Cole和Danos，Journal of Molecular Biology93，599-608(1987)；HPV-31Goldsborough等人，Virology171，306-311(1989)；HPV-33Cole和Streeck，J.Virology，58，991-995(1986)；HPV-54Favre等人，J.Cancer45，40-46(1990)；HPV-56Lrincz，J.，Gen.Virol.70，3099(1989)。
在多數(shù)出版物中已報(bào)道HPV的檢測和分型，除了Southern印跡和其它雜交技術(shù)外，最廣泛使用的是基于PCR的方法，因?yàn)榇祟惙椒赏瑫r(shí)提供高靈敏性和特異性，以及該測試法的靈活性使之可根據(jù)分析需要而進(jìn)行較多控制。
人乳頭瘤病毒是乳頭瘤病毒科(Papillomaviridae)的成員，是具有8000bp環(huán)狀基因組的DNA腫瘤病毒。該病毒顯示強(qiáng)烈的上皮細(xì)胞嗜性，并且僅在分化的上皮細(xì)胞中增殖。懷疑乳頭瘤病毒在多種不同的人類疾病中扮演病因?qū)W角色，例如，在不同的皮膚病例如在疣、尖銳濕疣和皮膚腫瘤及其它疾病如宮頸癌、肛門生殖癌、喉癌中。已公知，人乳頭瘤病毒與這些腫瘤的發(fā)病率顯示強(qiáng)烈的相關(guān)，這點(diǎn)甚至對(duì)這些腫瘤的癌前期損害(CIN，VIN，VAIN，PIN，PAIN)也是如此。HPV在99％宮頸癌病人中可檢測到。在宮頸癌的形成中，這種緊密的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)系可能是HPV的作用導(dǎo)致的。但以流行病學(xué)資料為基礎(chǔ)，在感染的病人中，不同HPV基因型在形成宮頸癌中不會(huì)造成相同的風(fēng)險(xiǎn)水平。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)基因型可分為低風(fēng)險(xiǎn)、中等風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)，除了這些，也存在未分類的基因型。因?yàn)轱L(fēng)險(xiǎn)在很大的范圍內(nèi)變化，并且HPV感染的發(fā)病率很高，所以確定基因型極為重要。
HPV病毒不可培養(yǎng)。在HPV的診斷中，可使用HPV血清學(xué)試驗(yàn)，該試驗(yàn)可檢測與病毒(過去或現(xiàn)在感染)的接觸，但不能確切鑒定基因型，并且不能證明現(xiàn)在的感染，這就是為什么它們的作用主要限于流行病學(xué)研究。
對(duì)乳頭瘤病毒而言，不存在準(zhǔn)確的血清學(xué)分類(血清型)，所以檢測該病毒DNA基因組的方法用于確定其型別。根據(jù)檢測是否通過擴(kuò)增進(jìn)行，這些可分為2組。在后來方法的一個(gè)實(shí)施方案中，使用全長基因組RNA探針檢測變性的HPV DNA基因組，并用特異抗體(Hibrid Capture-Digene)檢測異源二聚體。根據(jù)另一個(gè)方法，Southern印跡法用于檢測不同的HPV基因型。這些方法的缺點(diǎn)是相對(duì)不敏感和部分缺少特異性。在雜交捕獲方法中，許多出版物報(bào)道不同的交叉反應(yīng)，從而在臨床條件下導(dǎo)致假陽性。作者報(bào)道，僅在使用高(1ng/ml)DNA濃度的臨床對(duì)照，該方法的交叉反應(yīng)是可接受的，其中交叉反應(yīng)表明靈敏性和特異性之間存在不希望有的聯(lián)系。
通過擴(kuò)增方法，該問題未出現(xiàn)，因?yàn)榕c靈敏性(擴(kuò)增)相關(guān)的反應(yīng)分別從與特異性(檢測)相關(guān)的反應(yīng)中實(shí)施而來。通常擴(kuò)增技術(shù)在選擇的擴(kuò)增基因組片段、引物數(shù)和應(yīng)用的檢測技術(shù)方面不同。使用最頻繁的引物是GP5+-GP6+、MY9-MY11和不同的型特異PCR反應(yīng)。使用最頻繁的檢測技術(shù)是序列特異雜交、限制片段長度多態(tài)性(RFLP)和線性探針試驗(yàn)(LiPA)。除了這些技術(shù)外，也使用(但較不常用)對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行測序和通過dUTP摻入產(chǎn)生的胸苷模式。
擴(kuò)增技術(shù)的分析特征在很寬的范圍內(nèi)變化。該方法的特征在于可擴(kuò)增的基因型、基因型擴(kuò)增的分析靈敏性、檢測的特異性及可信度。在該領(lǐng)域中，考慮將MY9-MY11簡并引物系統(tǒng)作為參照反應(yīng)。在MY9-MY11系統(tǒng)的情況下，存在LiPA雜交檢測系統(tǒng)(Innogenetics)。但在該系統(tǒng)中，控制引物的簡并合成是困難的，這是因?yàn)楹铣芍挟a(chǎn)生的引物種類的相對(duì)比例在每次的合成中是變化的，這會(huì)導(dǎo)致對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)行分析的不可預(yù)測的變化，第二，與其它普及的反應(yīng)比較，該反應(yīng)可擴(kuò)增最少的型別。從文獻(xiàn)中已眾所周知，如果HPV基因型51型特異引物加入反應(yīng)中，該系統(tǒng)僅可在這種情況下擴(kuò)增基因型51。使用簡并的引物合成時(shí)，引物種類的相對(duì)比例不可改變，并且不能改變引物比率以獲得基因型較好的分析特性和均衡擴(kuò)增。
僅通過使用仔細(xì)選擇的、優(yōu)化的生殖器HPV序列的引物對(duì)，GP5+-GP6+反應(yīng)可解決相同的問題，這兩個(gè)引物系統(tǒng)易于處理，但靈活性較低。GP5+-GP6+系統(tǒng)可擴(kuò)增許多已知的HPV基因型，但該系統(tǒng)的分析特征未優(yōu)化(靈敏性對(duì)不同的基因型不平衡)，并且除了對(duì)解鏈溫度和Mg2+濃度進(jìn)行有限的優(yōu)化外，對(duì)兩引物法的優(yōu)化是受限的，例如對(duì)個(gè)體基因型檢測的靈敏性進(jìn)行平衡是非常困難的。將GP5+-GP6+系統(tǒng)應(yīng)用于擴(kuò)增其它基因型是困難的，在任何情況下，這將影響其將來的應(yīng)用，因?yàn)闄z測新基因型的需要是長期存在的?；蛐偷蔫b定還未充分得到解決。
另一個(gè)眾所周知廣泛的基因型特異擴(kuò)增方法是L1C方法具有2種形式的雙引物系統(tǒng)用于擴(kuò)增更多的基因型，一種形式是使用(帶有LC1引物)L1C2或新L1C2引物。L1C擴(kuò)增子的詳細(xì)描述見文獻(xiàn)[Jpn.J.CancerResearch82，524-531(1991)]。
基本上，擴(kuò)增后的檢測法必須滿足2條要求常規(guī)診斷的適用性(簡單、成本、時(shí)間)和需要適當(dāng)水平的分辨能力。相當(dāng)多的方法由于其辨別能力而不適用，因此使用RFLP是受限的，因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短、無足夠的診斷用限制性位點(diǎn)、以及基因型常常僅分為小組。同樣的，將SSCP的復(fù)雜模式適應(yīng)于具體基因型是困難的，此外，這些反應(yīng)的穩(wěn)定性也不令人滿意。從診斷上來說為了滿足常規(guī)需求，分辨能力是尤其重要的。從簡單性和分辨能力的方面來說，如果樣本不是基因型的混合物，測序是理想的方法，因?yàn)樽詣?dòng)化得到解決，并且可檢測每種基因型(或其亞型)。但實(shí)際上，它并未得到廣泛使用，因?yàn)樗馨嘿F且費(fèi)時(shí)，在常規(guī)診斷實(shí)驗(yàn)室它的應(yīng)用不可接受，并且在為混合樣本的情況下，不能確定任何基因型。雜交方法的優(yōu)點(diǎn)是它們的分辨能力或嚴(yán)格性可輕易得到改變，因?yàn)榉磻?yīng)的幾個(gè)參數(shù)可在廣泛的范圍內(nèi)改變，一些雜交形式易于自動(dòng)化、不是很昂貴，并且在平行進(jìn)行(一些雜交形式)的情況下，即使費(fèi)時(shí)也是無關(guān)緊要的。
因此，需要新的HPV擴(kuò)增檢測方法，這些方法應(yīng)能消除當(dāng)前方法的缺點(diǎn)，這些方法應(yīng)便宜、易于重復(fù)和自動(dòng)化。本發(fā)明描述了引物是獨(dú)立合成的分子的擴(kuò)增和雜交測試法，因此，它們的相對(duì)比例可輕易得到控制和優(yōu)化，并且擴(kuò)增具有平衡的靈敏性。雜交反應(yīng)是以高度平行模式實(shí)施的，其為低花費(fèi)、快速、靈活和可自動(dòng)化的反應(yīng)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供/定義了位于一致擴(kuò)增子(consensus amplicon)內(nèi)部的人乳頭瘤病毒基因組區(qū)域(它是一個(gè)這樣的區(qū)域，用與該擴(kuò)增子側(cè)翼的保守序列結(jié)合的引物可擴(kuò)增該區(qū)域)。其中這些基因組區(qū)域的特征在于其具有基因型特異的DNA序列，所述基因型特異的DNA序列適用于設(shè)計(jì)基因型特異的雜交探針。
本發(fā)明的另一方面提供/定義了在該一致擴(kuò)增子中的另外HPV基因組區(qū)域，其中這些基因組區(qū)域的特征在于其具有HPV屬特異的保守DNA序列，所述HPV屬特異的保守DNA序列適用于設(shè)計(jì)屬特異的雜交探針。
本發(fā)明的一個(gè)基本組成部分是在一個(gè)一致擴(kuò)增子中存在2個(gè)基因組片段，所述2個(gè)基因組片段適用于設(shè)計(jì)屬特異的和基因型特異的雜交探針。
在另一方面，本發(fā)明提供了在擴(kuò)增反應(yīng)中引物的用途，擴(kuò)增中可優(yōu)化DNA序列和其濃度，以及反應(yīng)循環(huán)的條件，用于人乳頭瘤病毒基因型的均衡的靈敏性擴(kuò)增。
本發(fā)明提供檢測和基因分型人乳頭瘤病毒(HPV)的方法，其中該方法包括以下步驟a)從生物樣本中分離的核酸分子使用本發(fā)明的引物混合物擴(kuò)增，并且結(jié)果產(chǎn)生雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物，b1)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，將上述擴(kuò)增產(chǎn)物與HPV屬特異雜交探針或與其混合物雜交，并檢測給定情況下HPV一致擴(kuò)增子的存在；和/或b2)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，將上述擴(kuò)增產(chǎn)物與本發(fā)明的基因型特異雜交探針混合物雜交，并檢測相應(yīng)的HPV基因型組；和/或b3)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，將上述擴(kuò)增產(chǎn)物與本發(fā)明的型特異雜交探針或其混合物雜交，并檢測和確定給定情況下中存在的HPV基因型。
總之本發(fā)明的方法可用于擴(kuò)增/檢測HPV基因型的特定組、采用屬特異探針對(duì)HPV基因組DNA進(jìn)行檢測、對(duì)HPV基因組進(jìn)行集合的(組的)或個(gè)別的基因分型。該方法可用于評(píng)估或確定在特定時(shí)間發(fā)現(xiàn)患者感染的HPV病毒所導(dǎo)致的或相關(guān)的后期疾病的風(fēng)險(xiǎn)，并且尤其采用型特異檢測。本發(fā)明提供的方法適用于在特定群體中篩選HPV的存在，并且也適用于在特定個(gè)體中加強(qiáng)、支持或證實(shí)細(xì)胞學(xué)診斷(篩選)。
發(fā)明詳述為有助于理解本發(fā)明，幾個(gè)術(shù)語定義如下。
術(shù)語“核酸”和“寡核苷酸”指探針、引物和其它短DNA、RNA、PNA(肽核酸)以及其它化學(xué)寡聚體，其中它們可序列特異地結(jié)合于DNA、RNA或PNA模板(靶分子)上。
術(shù)語“雜交”指兩個(gè)核酸序列的序列特異性結(jié)合。使用的條件相當(dāng)程度上決定了雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性，因此雜交可在較低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下進(jìn)行，即使核酸并非正好互補(bǔ)。在一些情況下，核酸探針與一組彼此之間相關(guān)性較近或較遠(yuǎn)的序列結(jié)合是必要的。熟悉核酸技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定這些條件，如果滿足這些條件，則結(jié)合適當(dāng)?shù)厥翘禺惖幕蚍翘禺惖摹?br> 術(shù)語“探針”指一組與互補(bǔ)和部分互補(bǔ)核酸顯示序列特異雜交的寡核苷酸。為實(shí)施雜交后的步驟，或?yàn)楦淖兯鼈兊碾s交特性，可修飾寡核苷酸的結(jié)構(gòu)。
術(shù)語“型特異性探針”指一組在嚴(yán)謹(jǐn)條件下僅與與它們精確互補(bǔ)的靶區(qū)域結(jié)合的寡核苷酸。適用于這種需要的雜交條件在本領(lǐng)域已眾所周知(見，如Sambrook等，1985，Molecular Cloning Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.USA)。一般地，在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH下，嚴(yán)謹(jǐn)條件選擇為低于特異序列的解鏈溫度(Tm)約5℃。Tm是在存在適當(dāng)?shù)幕パa(bǔ)靶分子時(shí)，50％探針是結(jié)合狀態(tài)的溫度(在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH下)。降低雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性(例如提高鹽濃度或降低溫度)將允許與非精確互補(bǔ)序列結(jié)合。假如為非精確互補(bǔ)模板，不與模板中的模板核酸結(jié)合的核苷酸是“錯(cuò)配核苷酸”。
術(shù)語“引物”指在一定條件下可作為DNA合成(啟動(dòng))起始點(diǎn)的核苷酸，其中在該條件下，與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成在核酸模板上得到誘導(dǎo)，即在四種不同核苷三磷酸和用于聚合的試劑(即DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)存在下、在適當(dāng)?shù)木彌_液和適合的溫度下。引物優(yōu)選為單鏈DNA分子。引物的適當(dāng)長度一般為15-40個(gè)核苷酸。引物不需要反映模板的確切序列，因此，通過改變結(jié)合(反應(yīng))溫度，類似的靶分子組可作為合成(一致擴(kuò)增子)的模板。為使它可與固相結(jié)合以及為了其它目的，具有化學(xué)特征的基團(tuán)可連接至引物寡核苷酸。
本發(fā)明中的術(shù)語“引物”也指一組連續(xù)相關(guān)的寡核苷酸，其中該組寡核苷酸可引發(fā)某組模板序列(如上所述)。另外，該組的成員由這樣的寡核苷酸組成，所述寡核苷酸可與一組給定模板核酸中的一些或所有成員形成錯(cuò)配。但在適當(dāng)?shù)臈l件下，這些引物也可參與啟動(dòng)。術(shù)語“一致引物(consensus primer)”指可用于引發(fā)相關(guān)模板核酸的特定區(qū)域的引物或引物組。這些區(qū)域的特征是，它們的變異性顯著低于全部核酸的變異性，即它們是保守的，因此在這些序列上所選擇的一致引物可引發(fā)模板核酸序列的所有組。一致引物不必要是單一引物，它可是一組引物。
術(shù)語“熱穩(wěn)定聚合酶”指在95℃保持相對(duì)穩(wěn)定、并可催化核苷三磷酸聚合以形成與靶序列的一條核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的酶。純化的熱穩(wěn)定聚合酶在美國專利號(hào)4,889,818中進(jìn)行了描述，此處引用作為參考，并且商業(yè)上可從例如Applera獲得。
在本發(fā)明中，DNA的擴(kuò)增通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實(shí)施，已在美國專利號(hào)4,683,195、4,683,202和4,965,188中公開。
本發(fā)明研發(fā)了優(yōu)化的PCR條件，用于擴(kuò)增大量不同的HPV基因型，所述優(yōu)化為優(yōu)化引物濃度、引物序列和循環(huán)條件。擴(kuò)增的第一部分用穩(wěn)定上升的嚴(yán)謹(jǐn)性進(jìn)行，目標(biāo)在于對(duì)基因型的擴(kuò)增(其中對(duì)基因型，引物包含多的錯(cuò)配核苷酸)始于與其它基因型相同的擴(kuò)增效率進(jìn)行，但隨后升高的結(jié)合溫度使反應(yīng)有利于所用的較大量引物。當(dāng)引物的最佳混合存在時(shí)，理論上該方法的引物結(jié)合序列將移向共有序列，因此對(duì)基因型進(jìn)行均衡的靈敏性擴(kuò)增是可能的。
雖然聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是優(yōu)選的擴(kuò)增方法，但在任何公知的方法中可使用提及的基因組區(qū)域和寡核苷酸。例如，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Wu和Wallace1989，Genomics 4560-569)、TAS擴(kuò)增系統(tǒng)(Kwoh等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173-1177)和自我維持的序列復(fù)制(Guatelli等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874-1878)也可用于靶序列的正確擴(kuò)增。同樣，在Q-β-復(fù)制酶系統(tǒng)(Kramer和Lizardi，1989，Nature 339401-402)中，可擴(kuò)增序列特異的探針。
在本發(fā)明中，引物選自一組或多或少互補(bǔ)的、適于擴(kuò)增HPV一致擴(kuò)增子的序列。有效的引發(fā)是在存在錯(cuò)配核苷酸時(shí)使用精心設(shè)計(jì)的退火溫度和合適的引物濃度進(jìn)行的。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中中，本發(fā)明的引物(SEQ.ID.NO1-40，70-72)與已知引物(SEQ.ID.NO73-75)以合適的試劑形式使用。這允許檢測更多的HPV基因型，至少為47種已知的基因型。從實(shí)施例4中可看出，在反應(yīng)中包括引物SEQ.ID.NO.37，可實(shí)施擴(kuò)增根據(jù)本發(fā)明的HPV-35基因型。在反應(yīng)中沒有該引物而僅包括已知的引物則不能擴(kuò)增HPV-35基因型。本發(fā)明的另一方面涉及HPV L1基因的型特異引物，其包括SEQ.ID.NO1-36序列中所述的核苷酸序列之一。
本發(fā)明的另一方面涉及這樣的引物混合物，其中包括L1C1、L1C2或新L1C2引物以及選自SEQ.ID.NO1-40，70-72的引物。此外，本發(fā)明涉及應(yīng)用這種引物混合物用于HPV 3、4、6、7、9、10、11、12、13、14、16、18、20、24、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、39、39、40、41、42、44、45、51、52、53、54、55、56、58、49、60、61、66、67、68、72、74或77基因型的擴(kuò)增。
本發(fā)明的另一方面涉及采用本發(fā)明的引物混合物擴(kuò)增產(chǎn)生的擴(kuò)增子，如上面提及，但HPV-6、-11、-16、-18、-31、-33、-42、-52、和-58擴(kuò)增子除外。
本發(fā)明的關(guān)鍵組成部分是在擴(kuò)增子中屬和型特異基因組片段的存在。這些基因組片段可實(shí)現(xiàn)雜交和檢測的高度特異性。因此，本發(fā)明也涉及擴(kuò)增子的基因組片段，所述片段的特征在于是自擴(kuò)增子3′末端(3’-5’)從-80bp至-30bp延伸的基因型特異的不同基因組片段。這些基因組片段是長約40bp的雙鏈DNA片段，其序列在SEQ.ID.NO77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109和111序列中給出。
本發(fā)明的另一方面涉及擴(kuò)增子的另一基因組片段，其自擴(kuò)增子的3’末端以3′-5′方向從-150bp至-105bp延伸，其特征在于為基因型中高度保守的低復(fù)雜序列，顯示的是HPV屬特異性。這些基因組片段為雙鏈DNA，通常包含23bp，并且它們的上鏈具有下述序列之一SEQ.ID.NO76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108和110。
在擴(kuò)增子的雜交檢測期間，使用了設(shè)計(jì)用于上面提及的基因組片段的屬或型特異的雜交探針。所述屬寡核苷酸探針通常用于檢測HPV擴(kuò)增子(其為擴(kuò)增的HPV DNA)，而型特異的探針可用于進(jìn)一步檢測個(gè)體基因型的分型。上述兩種雜交探針可以是DNA、RNA或PNA。
本發(fā)明方法中使用的屬探針具有類似于一致引物的性能，差別在于其5’末端不是優(yōu)選的錯(cuò)配核苷酸對(duì)的位置。這些屬探針可作為雜交探針和引物使用，在本發(fā)明中它們用作探針。
因此，本發(fā)明涉及包括SEQ.ID.NO41-49序列中所列出序列之一的屬(一致)雜交探針或引物。
在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，探針SEQ.ID.NO41-49作為屬探針使用。
在型特異探針的情況下，探針與對(duì)應(yīng)的基因型序列100％互補(bǔ)。在它們的設(shè)計(jì)中，重要的是排除以下可能性，即是否其它基因型與該探針或其部分顯示高水平的互補(bǔ)性。由于在本發(fā)明擴(kuò)增子中的型特異片段長約40bp，可選擇重疊探針，這在理論上和實(shí)驗(yàn)上都是充分可行的。在實(shí)施例5中證明，可設(shè)計(jì)和使用適當(dāng)?shù)木哂懈咛禺愋?與已研究的70個(gè)基因型比較)的探針，并且在使用的雜交條件下，即使在室溫下它們也保持它們的特異性。因?yàn)樵谕瑯与s交條件下，探針的雜交是特異的，所以也可使用探針混合物。因此，從實(shí)踐的觀點(diǎn)，可使用較一致的反應(yīng)條件。因此，本發(fā)明涉及型特異探針的序列，其可用于HPV擴(kuò)增和檢測以及基因分型試驗(yàn)，并且包括SEQ.ID.NO50-67中所列出的序列之一。
雖然本發(fā)明涉及雜交的任一實(shí)施方案，但在商業(yè)上固相雜交是優(yōu)選的。
此處所稱的固相(正向)雜交為將探針結(jié)合至固定的靶核酸(擴(kuò)增子)，而反向雜交為將靶核酸(擴(kuò)增子)結(jié)合至固定的探針。在本方法中，采用不同的洗滌溶液移去未結(jié)合的反應(yīng)產(chǎn)物。在第一種情況下，探針的標(biāo)記必須適合后期的顯示，而在反向形式中標(biāo)記擴(kuò)增子。兩種系統(tǒng)均可在微量滴定板中實(shí)現(xiàn)。由于固定能力有限，在本發(fā)明中正向雜交系統(tǒng)是優(yōu)選的，因?yàn)榇罅康母鞣N探針組成了使用的探針混合物。
在US 6,214,979中描述的方法可同樣進(jìn)行應(yīng)用，在該方法中，在擴(kuò)增期間將探針加至反應(yīng)中。在該進(jìn)程期間，Taq聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性分解探針，并且檢測產(chǎn)生的分解產(chǎn)物可用于檢測靶核酸的存在。其它方法有已知的主要是基于雜交的稱為實(shí)時(shí)檢測系統(tǒng)，但這些方法僅在它們的實(shí)施和檢測方法中不同，在理論上序列特異探針-擴(kuò)增子的結(jié)合是相同的。
對(duì)于固定，可對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行標(biāo)記。從本發(fā)明的多種可能性，優(yōu)選用生物素標(biāo)記引物，并在擴(kuò)增反應(yīng)中使用經(jīng)標(biāo)記的引物。當(dāng)存在吸附于固相的親和素或鏈親和素時(shí)，生物素導(dǎo)致擴(kuò)增子的固定，這是因?yàn)橛H和素和生物素結(jié)合的高特異和穩(wěn)定性。在給定的反應(yīng)中，僅與一條或另一條鏈雜交的引物得到生物素標(biāo)記，所以在雜交前可移去另一條鏈。
為了檢測目的，可對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記，其中標(biāo)記物可用不同的方法檢測，例如檢測方法可基于熒光、放射性、比色法、X-射線衍射、吸附、磁力、酶活性等。因此，合適的標(biāo)記物包括但并不限于熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、同位素、電濃縮物質(zhì)、酶或可形成特異結(jié)合的配體。也可使用上面提及的系統(tǒng)組合。在本發(fā)明中，優(yōu)選熒光素與抗熒光素-HRPO抗體的特異結(jié)合，所述結(jié)合通過在存在HPPA底物和H2O2時(shí)進(jìn)行辣根過氧化物酶氧化反應(yīng)而檢測(見實(shí)施例2)。在本發(fā)明中，使用生物素標(biāo)記的正向或反向引物。經(jīng)標(biāo)記引物和抗熒光素-HRPO均為商業(yè)可獲得的。用于洗滌的化學(xué)品和多種溶液也一般是可獲得的。也可構(gòu)建或使用利用堿性磷酸酶或任何其它可根據(jù)其活性而檢測的酶系統(tǒng)。除熒光檢測外，發(fā)光法和比色法也是可接受的檢測方法，這些方法用于本系統(tǒng)醫(yī)學(xué)診斷應(yīng)用。
在診斷期間包括內(nèi)對(duì)照的本發(fā)明方法可識(shí)別假陰性反應(yīng)，并且從診斷學(xué)觀點(diǎn)來看這是優(yōu)選的。多種人工或天然DNA可用作內(nèi)對(duì)照。那些不增加反應(yīng)使用的引物數(shù)量、以及內(nèi)對(duì)照的量和分析性能的系統(tǒng)是優(yōu)選的，靶核酸適合于標(biāo)準(zhǔn)化。在本發(fā)明中，如上面提及，在將以重組質(zhì)粒形式(實(shí)施例6)的人工制備的核酸序列(SEQ.ID.NO68)加至樣本。在本發(fā)明中，與HPV DNA的雜交檢測相平行來實(shí)施內(nèi)對(duì)照的檢測，并且僅底物的顯影是分開的。探針是洋地黃皂苷元標(biāo)記(SEQ.ID.NO69)的，并且可采用結(jié)合抗洋地黃皂苷元抗體的堿性磷酸酶進(jìn)行檢測。但其他檢測技術(shù)也適用于檢測內(nèi)部探針。
但使用瓊脂糖凝膠電泳或其它合適的技術(shù)，也可根據(jù)遷移率的差別實(shí)施對(duì)內(nèi)對(duì)照的檢測。
對(duì)于HPV DNA的擴(kuò)增和檢測，本發(fā)明的方法適于產(chǎn)生試劑的一致單位(試劑盒)。在這種形式中，試劑盒包含所有的下述試劑或任何它們的組合和其它試劑引物、引物混合物、緩沖液、熱穩(wěn)定聚合酶、陽性對(duì)照HPVDNA、非HPV DNA、內(nèi)對(duì)照DNA、探針或探針混合物、抗體-酶結(jié)合物。
本發(fā)明引物和探針序列的描述是例證性的。許多屬和型特異的探針變體可采用屬或型特異HPV基因組區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)，因此，對(duì)于變體只要它們選自本發(fā)明的基因組區(qū)域，均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
利用下述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的闡述。雖然根據(jù)本發(fā)明的方法應(yīng)用在任何HPV基因組的擴(kuò)增，但在下述實(shí)施例中僅使用醫(yī)學(xué)上更為重要的生殖器HPV基因組。應(yīng)當(dāng)注意到，這些實(shí)施例僅是例證性的，并非為限制本發(fā)明的范圍而構(gòu)建的。
實(shí)施例1合成寡核苷酸引物本發(fā)明方法使用的寡核苷酸引物是商業(yè)來源的(IDT，USA)。合成的引物具有5’氨基。使用NHS-酯用于生物素、熒光素和洋地黃皂苷元標(biāo)記。標(biāo)記的核苷酸經(jīng)HPLC純化。
實(shí)施例2樣本的處理、DNA的制備婦科專家采用細(xì)胞刷取出樣本，并轉(zhuǎn)移入PBS溶液(10mM磷酸鹽緩沖液pH＝7.4，Sigma，NaCl 138mM、KCl 2.7mM)中。在樣本管中對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理。在裂解前，離心(2000g，10分鐘)樣本，棄上清，并加入1ml PBS溶液，渦旋，再次離心，棄上清。在處理的最后，向樣本中加入250μL裂解液(0.5mg/ml蛋白酶K、0.01M TRIS-HCl pH＝8、0.001M EDTA pH＝8，溶于蒸餾水中)，其中包含HPV試驗(yàn)的內(nèi)對(duì)照(SEQ.ID.NO68)，渦旋，在56℃孵育30分鐘。此后在TECAN RSP150遙控儀器上進(jìn)行進(jìn)一步的液體處理加入200μL結(jié)合液(5.5M GUSCN、20mM EDTA、10mM TRIS-HClpH＝6.5、65mM二硫蘇糖醇、40克/升二氧化硅，SIGMA Cat.No.28，851-3、蒸餾水)，并通過柱過濾從可溶組分中分離二氧化硅。再次過濾，用200μl無二氧化硅的結(jié)合液(5.5M GUSCN、20mM EDTA、10mMTRIS-HCl pH＝6.5、65mM二硫蘇糖醇、蒸餾水)洗滌二氧化硅2次，并再次使用200μl洗滌液洗滌2次(25％異丙醇、25％96％乙醇、50％蒸餾水、0.1M NaCl)，最后采用200μl 96％乙醇。風(fēng)干二氧化硅后，用200μl 10mMTRIS溶液pH＝8.0洗脫DNA。洗脫的DNA冷凍儲(chǔ)存于-20℃，直至進(jìn)一步使用。
實(shí)施例3HPV檢測的概述擴(kuò)增總反應(yīng)體積是25μl，包括下述組分10μl DNA、2.5μl 10×聚合酶緩沖液(終濃度10mM TRIS-HCl(pH＝9.0)、50mM KCl、0.1％TritonX-100(Promega)、2mM MgCl2)、每種dNTP(ATP、CTP、GTP、TTP)250μM、4μM引物混合物SEQ.ID.NO35、37-40、73-75和1U Taq DNA聚合酶(Promega)。反應(yīng)在GeneAmp 9700 PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行，參數(shù)如下循環(huán)195℃ 4分鐘；循環(huán)2-4094℃ 30秒，48℃ 1分鐘和72℃ 45秒；循環(huán)4172℃ 3分鐘。
雜交和檢測在固相上進(jìn)行雜交。24小時(shí)前，用鏈親和素(0.02mg/ml鏈親和素，溶于PBS溶液中)包被96孔聚苯乙烯板(Costar)。在室溫孵育板，并且在24小時(shí)后用250μl洗滌液(25 mM TRIS pH＝7.5、125mM NaCl、20mM MgCl2、3％Tween-20)洗滌板2次。將上面提及的PCR反應(yīng)的20μl產(chǎn)物用140μl蒸餾水稀釋，從該溶液中取5μl與45μl結(jié)合緩沖液(25mM TRIS pH＝7.5、125mM NaCl、5mM EDTA-Na2、5×Denhardt溶液、0.1％Tween-20)混合，并加入鏈親和素包被板的孔中。在振搖下于室溫孵育30分鐘。然后將50μl洗脫緩沖液(100mM NaOH、300mM NaCl)加至混合物中，在室溫再孵育3分鐘，并且用250μl洗滌液(25mM TRIS pH＝7.5、125mMNaCl、20mM MgCl2、3％Tween-20)洗滌板3次。洗滌后，加入50μl雜交緩沖液(5×SSC(0.3 M檸檬酸鈉pH＝7、3M NaCl)、1×Denhardt溶液、0.1％SDS)，其中含熒光素標(biāo)記的探針(每種探針5nM)?；旌衔镌?0℃、持續(xù)搖動(dòng)下孵育30分鐘，并用250μl高嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌液(0.05×SSC、0.3％Tween-20)洗滌6次。此后，向反應(yīng)中加入50μl結(jié)合緩沖液(25mM TRISpH＝7.5、125mM NaCl、2mM MgCl2、0.3％Tween-20、1％BSA)，其中含抗熒光素-POD(Roche)抗體(0.0015 E/反應(yīng))。板在室溫孵育30分鐘，持續(xù)搖動(dòng)，并用250μl高嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌液(0.05×SSC、0.3％Tween-20)洗滌6次。用135μl底物溶液顯色(5體積[45mM羥基苯基丙酸(HPPA)，溶于0.1M TRIS-HCl pH＝9.0]+1體積
)。孵育20分鐘后，向反應(yīng)混合物中加入65μl終止液
。熒光信號(hào)采用SpectraMax板熒光計(jì)在324/410nm下測量。如果樣本值是3個(gè)平行陰性對(duì)照樣本平均值的3倍以上，樣本認(rèn)定為陽性。
實(shí)施例4擴(kuò)增的比較研究將含有來自不同基因型的經(jīng)克隆HPV L1區(qū)的質(zhì)粒作為樣本，并且將它們應(yīng)用在反應(yīng)(10ng/反應(yīng))中，使用本發(fā)明方法擴(kuò)增并檢測HPV DNA。根據(jù)實(shí)施例3的描述實(shí)施PCR反應(yīng)和雜交，不同之處在于引物的組成改變。無L1F2(SEQ.ID.NO37)的反應(yīng)不會(huì)導(dǎo)致基因型HPV35的擴(kuò)增，而使用L1F2引物導(dǎo)致基因型HPV35的有效檢測。
實(shí)施例5幾種HPV基因型的檢測將含有來自不同基因型的經(jīng)克隆HPV L1區(qū)的質(zhì)粒作為樣本，并且將它們應(yīng)用在反應(yīng)(10ng/反應(yīng))中，使用本發(fā)明方法擴(kuò)增并檢測HPV DNA。根據(jù)實(shí)施例3的描述實(shí)施PCR反應(yīng)和雜交。用制備的包含克隆HPV L1區(qū)的質(zhì)粒嘗試對(duì)下述HPV基因型的擴(kuò)增和分型1-24、26-42、45、47-68、72-74、76-77和86。采用瓊脂糖凝膠電泳證明下述基因型的擴(kuò)增3、6-7、10-11、13-14、16、18、20、24、26、29、30-36、39-40、42、45、51、52-55、58-62、66-68和72。使用SEQ.ID.NO41-49屬特異雜交探針混合物(使用實(shí)施例3所述的條件)可檢測到下述基因型3-4、6-7、9-14、16、18、20、24、26、29、30-37、39-42、45、51、52-55、58-62、66-68、72、74和77。數(shù)據(jù)顯示，部分基因型僅可通過雜交檢測，這不令人驚訝，因?yàn)殡s交的靈敏性是瓊脂糖凝膠電泳的10-100倍。也可從數(shù)據(jù)看出，屬特異雜交檢測了所有瓊脂糖凝膠電泳陽性基因型，表明它確實(shí)是屬特異的。
實(shí)施例6檢測HPV-35型將含有來自不同基因型的經(jīng)克隆HPV L1區(qū)的質(zhì)粒作為樣本，并且將它們應(yīng)用在反應(yīng)(10ng/反應(yīng))中，使用本發(fā)明方法擴(kuò)增并檢測HPV DNA。根據(jù)實(shí)施例3的描述實(shí)施PCR反應(yīng)和雜交。雜交探針是為基因型HPV35設(shè)計(jì)的寡核苷酸(SEQ.ID.NO58)。嘗試對(duì)下列基因型的擴(kuò)增子進(jìn)行檢測3-4、6-7、9-14、16、18、20、24、26、29、30-37、39-42、45、51、52-55、58-62、66-68、72、74、77。該探針僅檢測對(duì)應(yīng)的HPV35基因型擴(kuò)增子。
實(shí)施例7采用內(nèi)對(duì)照檢測HPV根據(jù)實(shí)施例3，對(duì)實(shí)施例2制備的樣本進(jìn)行檢測，不同之處在于除型特異探針和抗熒光素POD以及抗洋地黃皂苷元-ALP(1∶2000，JacksonImmuno Research)抗體外，在結(jié)合步驟中同時(shí)存在采用洋地黃皂苷元(其量與型特異探針的量相同)標(biāo)記的內(nèi)對(duì)照探針。POD反應(yīng)(見實(shí)施例2)顯影后，按照如下實(shí)施ALP顯影底物溶液是用100mM TRIS pH＝9.0、0.5mM MgCl2緩沖液配制的6.25mg/100ml 4-甲基-7-羥基香豆素(umbelliferil)-磷酸。HPPA顯影后，微量滴定板用(25mM TRIS pH＝7.5、125mM NaCl、20mM MgCl2、3％Tween-20)洗滌一次，將150μl底物溶液加至每個(gè)反應(yīng)孔。孵育30分鐘后，采用SpectraMax板熒光計(jì)在355/460nm下測量熒光信號(hào)。如果樣本值是3個(gè)平行陰性對(duì)照樣本平均值的3倍以上，認(rèn)定樣本為陽性。
型特異探針可檢測足夠型別。除了HPV擴(kuò)增和內(nèi)對(duì)照之間存在強(qiáng)競爭的情況外，在每一反應(yīng)中對(duì)內(nèi)對(duì)照的檢測為陽性。沒有被抑制的反應(yīng)(HPV DNA或內(nèi)對(duì)照DNA在所有樣本中擴(kuò)增)。內(nèi)對(duì)照充分排除了假陰性結(jié)果的可能性。
序列表<110>類基因有限責(zé)任公司<120>檢測和分型人乳頭瘤病毒的擴(kuò)增-雜交方法<130>P36945WO<140>PCT/HU03/00020<141>2003-03-10<150>HU P0200981<151>2002-03-14<160>120<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(L1CF6)<400>1cgtaaacgta ttcccttatt tttt 24<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
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<223>PCR引物(L1CR51)
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<223>PCR引物(L1CF58)
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<223>PCR引物(L1CR58)<400>30cagtataggg tctttagggt g21<210>31<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>PCR引物(L1CF66)<400>33ccgtaaacgt attccctatt ttttt25<210>34<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(L1CR66)
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<223>PCR引物(L1CF68)<400>35cgtaaacacc ttccttattt tttt 24<210>36<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(L1CR68)<400>36caatacagag tgtttagggt t21<210>37<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(L1F2)<400>37cgtaaagcta taccatattt tttt 24<210>38<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(L1F3)<400>38cgtaaacacg ttccatattt tttt 24<210>39<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(L1F4)
<400>39cgtaaacgtg tttcctattt tttt24<210>40<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(L1R2)<400>40cagtacagag tttttagaat t 21<210>41<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>屬特異的雜交探針(PK1)<400>41cgcaccaaca tattttatta tgg 23<210>42<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>屬特異的雜交探針(PK2)<400>42cgcacaagca tctattatta tgc 23<210>43<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>屬特異的雜交探針(PK3)<400>43cgcacaagca tattttatca tgc 23<210>44<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>屬特異的雜交探針(PK4)
<400>44cgcaccagta tattttatca tgc23<210>45<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>屬特異的雜交探針(PK5)<400>45cgcacaagca tttactatca tgc23<210>46<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>屬特異的雜交探針(PK6)<400>46cgcaccaact acttttacca tgc23<210>47<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>屬特異的雜交探針(PK7)<400>47cgtaccagta ttttctacca cgc23<210>48<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>屬特異的雜交探針(PK8)<400>48cgcacaggca tatattacta tgc23<210>49<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>屬特異的雜交探針(PK9)
<400>49cgcaccaaca tatattatca tgc23<210>50<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV-6型特異的雜交探針(P6)<400>50ttttgttagc ccgttttatg20<210>51<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV-11型特異的雜交探針(P11)<400>51acaactgttt ttgttaactt ttt23<210>52<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV-42型特異的雜交探針(P42)<400>52tgtcttattt ggcctttttg20<210>53<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV-44型特異的雜交探針(P44)<400>53gtcttgtttg ctggtcgtat20<210>54<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV-16型特異的雜交探針(P16)
<400>54ctaatatttt gttattgtta ggttt25<210>55<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV-18型特異的雜交探針(P18)<400>55tatcctgctt attgccacc 19<210>56<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV-31型特異的雜交探針(P31)<400>56ggattgtcag atttaggtatgg22<210>57<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV-33型特異的雜交探針(P33)<400>57tttttagcgt tagtaggatt ttt 23<210>58<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV-35型特異的雜交探針(P35)<400>58tgctatttta ttagaatctt gtttt25<210>59<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV-39型特異的雜交探針(P39)<400>59accaccattc atacccact19<210>60<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV-45型特異的雜交探針(P45)<400>60acctgcacca ttaggtacaa 20<210>61<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV-51型特異的雜交探針(P51)<400>61gcgttgaggt tttaggtatt 20<210>62<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV-52型特異的雜交探針(P52)<400>62caattaccac tactggtgtt t 21<210>63<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV-56型特異的雜交探針(P56)<400>63tgtttgtttt ggtattgtcc t 21<210>64<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV-58型特異的雜交探針(P58)<400>64gttattggga cttttgatgg20<210>65<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV-59型特異的雜交探針(P59)<400>65tcctgtctac cattaccacc20<210>66<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV-66型特異的雜交探針(P66)<400>66ttggtaccag atttggaaac20<210>67<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV-68型特異的雜交探針(P68)<400>67cccagacata ggaaccttaa20<210>68<211>198<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>內(nèi)對(duì)照寡核苷酸分子<400>68cgtaaacgtt ttccctattt ttttagtcaa tgagacgggt aatgacgata cagtatgacg 60atagagtaga tagatagaga tagataccca tatacagata atgacataga tccccataga120cagtttatac agatcagtag cagtttttat atatgagatg atgataggac acaccagcaa180tatagggtat ttagggta 198
<210>69<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>內(nèi)對(duì)照擴(kuò)增子特異的雜交探針(IC-P1)<400>69tgacatagat ccccatagac a21<210>70<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(L1F5)<400>70cgtaaacgta ttccctattt tttt 24<210>71<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(L1F6)<400>71cgtaaacgtt ttccatattt tttt 24<210>72<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(L1R3)<400>72cagtacagag tttttagagt g21<210>73<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(L1C1)<400>73cgtaaacgtt ttccctattt tttt 24
<210>74<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(L1C2)<400>74caatacagag tatttagggt a21<210>75<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(new L1C2)<400>75caatataggg tatttagggt a21<210>76<211>23<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒6型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-6擴(kuò)增子的屬特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>76cgcaccaaca tattttatca tgc 23<210>77<211>39<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒6型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-6擴(kuò)增子的型特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>77ccttattttt ccataaaacg ggctaacaaa actgttgtg 39<210>78<211>23<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒11型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-11擴(kuò)增子的屬特異探針結(jié)合位點(diǎn)
<400>78cgcaccaaca tattttatca tgc23<210>79<211>39<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒11型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-11擴(kuò)增子的型特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>79ccatattact ctatcaaaaa agttaacaaa acagttgta 39<210>80<211>23<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒42型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-42擴(kuò)增子的屬特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>80cgcaccaact acttttacca tgc23<210>81<211>42<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒42型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-42擴(kuò)增子的型特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>81ccttattact ctattacaaa aagccaaata agacatctat cc 42<210>82<211>23<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒44型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-44擴(kuò)增子的屬特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>82cgcaccaaca tatattaccatgc 23<210>83<211>39<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒44型
<220>
<221>misc_feature<223>HPV-44擴(kuò)增子的型特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>83ccttattttg ccatacgacc agcaaacaag acacttgtg39<210>84<211>23<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒16型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-16擴(kuò)增子的屬特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>84cgcacaaaca tatattatca tgc 23<210>85<211>40<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒16型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-16擴(kuò)增子的型特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>85ttttcctatt aaaaaaccta acaataacaa aatattagtt 40<210>86<211>23<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒18型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-18擴(kuò)增子的屬特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>86cccacaagca tattttatca tgc 23<210>87<211>41<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒18型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-18擴(kuò)增子的型特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>87attttagggt tcctgcaggt ggtggcaata agcaggatat t 41
<210>88<211>23<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒31型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-31擴(kuò)增子的屬特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>88cgaaccaaca tatattatca cgc23<210>89<211>40<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒31型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-31擴(kuò)增子的型特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>89ttccatacct aaatctgaca atcctaaaaa aatagttgta 40<210>90<211>23<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒33型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-33擴(kuò)增子的屬特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>90cgcacaagca tttattatta tgc23<210>91<211>40<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒33型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-33擴(kuò)增子的型特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>91ttctattaaa aatcctacta acgctaaaaa attattggta 40<210>92<211>23<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒35型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-35擴(kuò)增子的屬特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>92cgcacaaaca tctactatca tgc23<210>93<211>40<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒35型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-35擴(kuò)增子的型特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>93ctatgctatt aaaaaacaag attctaataa aatagcagta 40<210>94<211>23<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒39型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-39擴(kuò)增子的屬特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>94cgcacaggca tatattatta tgc23<210>95<211>41<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒39型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-39擴(kuò)增子的型特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>95attttaaagt gggtatgaat ggtggtcgca agcaggacat t41<210>96<211>23<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒45型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-45擴(kuò)增子的屬特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>96cgcacaagca tattttatca tgc23
<210>97<211>40<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒45型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-45擴(kuò)增子的型特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>97tagggttgta cctaatggtg caggtaataa acaggctgtt 40<210>98<211>23<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒51型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-51擴(kuò)增子的屬特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>98cgcaccggca tatattacta tgc 23<210>99<211>40<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒51型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-51擴(kuò)增子的型特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>99ctattttcca atacctaaaa cctcaacgcg tgctgctatt 40<210>100<211>23<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒52型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-52擴(kuò)增子的屬特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>100cgcacaagca tctattatta tgc 23<210>101<211>41<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒52型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-52擴(kuò)增子的型特異探針結(jié)合位點(diǎn)
<400>101taaaaacacc agtagtggta atggtaaaaa agttttagtt c41<210>102<211>23<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒56型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-56擴(kuò)增子的屬特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>102cgcactagta tattttatca tgc 23<210>103<211>41<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒56型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-56擴(kuò)增子的型特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>103ctattactct gtgactaagg acaataccaa aacaaacatt c 41<210>104<211>23<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒58型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-58擴(kuò)增子的屬特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>104cgcacaagca tttattatta tgc 23<210>105<211>41<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒58型<220>
<221>misc_faature<223>HPV-58擴(kuò)增子的型特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>105ttccatcaaa agtcccaata acaataaaaa agtattagtt c 41<210>106<211>23<212>DNA
<213>人乳頭瘤病毒59型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-59擴(kuò)增子的屬特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>106cgtaccagta ttttctacca cgc23<210>107<211>41<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒59型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-59擴(kuò)增子的型特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>107ttttaaagta cctaaaggtg gtaatggtag acaggatgtt c 41<210>108<211>23<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒66型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-66擴(kuò)增子的屬特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>108cgtaccagta tattttatca tgc23<210>109<211>41<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒66型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-66擴(kuò)增子的型特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>109ttattactct gtttccaaat ctggtaccaa aacaaacatc c41<210>110<211>23<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒68型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-68擴(kuò)增子的屬特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>110cgcactggca tgtattacta tgc23
<210>111<211>40<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒68型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-68擴(kuò)增子的型特異探針結(jié)合位點(diǎn)<400>111ttttaaggtt cctatgtctg ggggccgcaa gcagggcatt40<210>112<211>244<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒44型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-44擴(kuò)增子<400>112cgtaaacgtg tttccttgtt ttttgcagat gtggcggcct agtgaaaacc aggtatatgt 60gcctcctccc gccccagtat ccaaagtaat acctacggat gcctatgtca aacgcaccaa120catatattac catgctagca gttctagact tcttgctgtg ggcaaccctt attttgccat180acgaccagca aacaagacac ttgtgcctaa ggtttcggga tttcaatata gggtttttaa240gatg 244<210>113<211>253<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒35型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-35擴(kuò)增子<400>113cgtaaagcta tcccatattt ttttgcagat gtctctgtgg cggtctaacg aagccactgt 60ctacctgcct ccagtgtcag tgtctaaggt tgttagcact gatgaatatg taacacgcac120aaacatctac tatcatgcag gcagttctag gctattagct gtgggtcacc catactatgc180tattaaaaaa caagattcta ataaaatagc agtacccaag gtatctggtt tgcaatacag240agtatttaga gta 253<210>114<211>253<212>DNA
<213>人乳頭瘤病毒39型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-39擴(kuò)增子<400>114cgtaaacgta ttccctattt tttttcagat ggctatgtgg cggtctagtg acagcatggt 60gtatttgcct ccaccttctg tggcgaaggt tgtcaatact gatgattatg ttacacgcac120aggcatatat tattatgctg gcagctctag attattaaca gtaggacatc catattttaa180agtgggtatg aatggtggtc gcaagcagga cattccaaag gtgtctgcat atcaatatag240ggtatttcgc gtg 253<210>115<211>256<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒45型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-45擴(kuò)增子<400>115cgtaaacgta ttccctattt ttttgcagat ggctttgtgg cggcctagtg acagtacggt 60atatcttcca ccaccttctg tggccagagt tgtcagcact gatgattatg tgtctcgcac120aagcatattt tatcatgcag gcagttcccg attattaact gtaggcaatc catattttag180ggttgtacct aatggtgcag gtaataaaca ggctgttcct aaggtatccg catatcagta240tagggtgttt agagta256<210>116<211>250<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒51型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-51擴(kuò)增子<400>116cgtaaacgta taccctattt ttttacagat ggcattgtgg cgcactaatg acagcaaggt 60gtatttgcca cctgcacctg tgtctcgaat tgtgaataca gaagaatata tcacacgcac120cggcatatat tactatgcag gcagttccag actaataaca ttaggacatc cctattttcc180aatacctaaa acctcaacgc gtgctgctat tcctaaagta tctgcatttc aatacagggt240atttagggta 250
<210>117<211>250<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒56型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-56擴(kuò)增子<400>117cgtaaacgta ttccctattt ttttgcagat ggcgacgtgg cggcctagtg aaaataaggt 60gtatctacct ccaacacctg tttcaaaggt tgtggcaacg gattcctatg taaaacgcac120tagtatattt tatcatgcag gcagttcacg attgcttgcc gtaggacatc cctattactc180tgtgactaag gacaatacca aaacaaacat tcccaaagtt agtgcatatc aatatagggt240atttagggta 250<210>118<211>253<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒59型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-59擴(kuò)增子<400>118ctgaaactgg ttccctattt ttttacagat ggctctatgg cgttctagtg acaacaaggt 60gtatctacct ccaccttcgg tagctaaggt tgtcagcact gatgagtatg tcacccgtac120cagtattttc taccacgcag gcagttccag acttcttaca gttggacatc catattttaa180agtacctaaa ggtggtaatg gtagacagga tgttcctaag gtgtctgcat atcaatacag240agtatttagg gtt 253<210>119<211>250<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒66型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-66擴(kuò)增子<400>119cgtaaacgta ttccctattt ttttgcagat ggcgatgtgg cggcctagtg acaataaggt 60gtacctacct ccaacacctg tttcaaaggt tgtggcaacg gatacatatg taaaacgtac120cagtatattt tatcatgcag gtagctctag gttgcttgct gttggccatc cttattactc180tgtttccaaa tctggtacca aaacaaacat ccctaaagtt agtgcatatc agtatagagt240
gtttagggta 250<210>120<211>253<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒68型<220>
<221>misc_feature<223>HPV-68擴(kuò)增子<400>120cgtaaacacc ttccttattt ttttacagat ggcattgtgg cgagctagcg acaacatggt 60gtatttgcct cccccctcag tggcgaaggt tgtcaataca gatgattatg tgacacgcac120tggcatgtat tactatgctg gtacatctag gttattaact gtaggccatc catattttaa180ggttcctatg tctgggggcc gcaagcaggg cattcctaag gtgtctgcat atcaatacag240agtgtttagg gtt 25權(quán)利要求
1.人乳頭瘤病毒(HPV)L1基因的一致引物，其中所述引物由下述核苷酸序列之一組成SEQ.ID.NO37-40或SEQ.ID.NO70-72。
2.人乳頭瘤病毒(HPV)L1基因的型特異引物，其中所述引物由下述核苷酸序列之一組成SEQ.ID.NO1-36。
3.擴(kuò)增用引物混合物，其中所述混合物由一條或多條以下引物組成SEQ.ID.NO37-40、70-72和/或SEQ.ID.NO1-36以及L1C1、L1C2或新L1C2引物。
4.權(quán)利要求3的引物混合物的用途，用于擴(kuò)增人乳頭瘤病毒的基因型3、4、6、7、9、10、11、12、13、14、16、18、20、24、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、39、40、41、42、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、60、61、66、67、68、72、74或77。
5.使用權(quán)利要求3的引物混合物通過擴(kuò)增可制備的擴(kuò)增子，其中HPV-6、-11、-1 6、-18、-31、-33、-42、-52和-58型的擴(kuò)增子除外。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的擴(kuò)增子，其核苷酸序列包括SEQ.ID.NO112-120序列之一。
7.基因型3、4、6、7、9、10、11、12、13、14、16、18、20、24、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、39、40、41、42、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、60、61、66、67、68、72、74或77的擴(kuò)增子的基因組區(qū)域，其是使用權(quán)利要求3的引物混合物通過擴(kuò)增可制備的擴(kuò)增子的特征片段，該特征片段自擴(kuò)增子的3′末端從-80bp延伸至-30bp，以及每一HPV基因型的不同特征性片段。
8.權(quán)利要求7的基因組區(qū)域，其具有以下所列出的序列之一SEQ.ID.NO77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109和111。
9.使用權(quán)利要求3的引物混合物通過擴(kuò)增可制備的擴(kuò)增子的基因組片段，其自擴(kuò)增子的3′末端從-150bp至-105bp延伸，HPV的一致片段。
10.權(quán)利要求9的基因組片段，其具有以下所列出的序列之一SEQ.ID.NO76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108和110。
11.雜交探針，其是HPV基因型特異的，并與權(quán)利要求8的序列之一互補(bǔ)。
12.如權(quán)利要求11所述的雜交探針，其具有以下所列出的序列之一SEQ.ID.NO50-67。
13.雜交探針或引物，其是HPV一致探針或引物，并與權(quán)利要求10的序列之一互補(bǔ)。
14.如權(quán)利要求13所述的雜交探針，其具有以下所列出的序列之一SEQ.ID.NO41-49。
15.如權(quán)利要求11或13的雜交探針，其是DNA、RNA或PNA。
16.從生物樣本中檢測多種HPV基因型的方法，其包括以下步驟a)使用權(quán)利要求3的引物混合物，對(duì)從生物樣本中提取的核酸分子進(jìn)行擴(kuò)增而制備一種或多種擴(kuò)增子；和b1)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與權(quán)利要求14的探針雜交，或與其混合物雜交，并檢測在給定情況下存在的HPV基因型；和/或b2)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與權(quán)利要求12的探針混合物雜交，并分離和檢測HPV基因型組；和/或b3)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與權(quán)利要求12的探針雜交，并檢測和分型在給定情況下存在的HPV基因型。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其包括檢測低和高風(fēng)險(xiǎn)HPV基因型組。
18.權(quán)利要求16或17的方法，其還包括檢測作為內(nèi)對(duì)照的合成寡核苷酸。
19.權(quán)利要求18的方法，其中SEQ.ID.NO68序列用作內(nèi)對(duì)照，并且將SEQ.ID.NO69作為雜交探針用于檢測。
20.檢測和分型HPV的試劑盒，其包括i)權(quán)利要求1、2或3的引物；ii)任選地內(nèi)對(duì)照引物；iii)權(quán)利要求12或14的雜交探針；iv)任選地檢測內(nèi)對(duì)照的雜交探針；以及v)常規(guī)的擴(kuò)增和雜交試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了檢測和分型人乳頭瘤病毒(HPV)的擴(kuò)增和雜交方法，以及本方法中使用的引物和雜交探針。本發(fā)明涉及適于設(shè)計(jì)HPV屬特異和HPV基因型特異寡核苷酸雜交探針的HPV基因組的具體部分。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1646705SQ03808429
公開日2005年7月27日 申請(qǐng)日期2003年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月14日
發(fā)明者C·耶奈伊, T·陶卡奇 申請(qǐng)人:類基因有限責(zé)任公司