專利名稱：人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)診斷芯片和制作方法及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物檢測(cè)醫(yī)學(xué)體外診斷技術(shù)，尤其涉及一種人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)診斷芯片和制作方法及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
人乳頭瘤病毒(即Human papilloma virus，以下簡(jiǎn)稱HPV)的分型研究一直受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視，HPV各型在標(biāo)本中的確認(rèn)，取決于所用方法。目前，對(duì)HPV感染的診斷主要依賴分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病毒核苷酸序列進(jìn)行基因檢測(cè)，包括基因測(cè)序、雜交捕獲、斑點(diǎn)雜交、狹線雜交和特異型探針等方法已應(yīng)用于HPV研究，但由于各自的局限性及特殊要求，無法滿足在臨床檢測(cè)中短時(shí)間內(nèi)、高通量獲得患者感染的HPV病毒基因型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于解決上述檢測(cè)HPV病毒基因存在的問題，提供一種利用基因芯片技術(shù)快速、可靠、敏感、特異及簡(jiǎn)單的人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)診斷芯片和制作方法及檢測(cè)方法。
人乳頭瘤病毒(即Human papilloma virus，以下簡(jiǎn)稱HPV)是一種在人群中極易傳播擴(kuò)散的DNA病毒，可通過直接或間接接觸交叉?zhèn)魅荆涓腥静课浑[蔽，發(fā)病隱匿，不易早期發(fā)現(xiàn)。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計(jì)顯示，近20％的人群攜帶著HPV病毒，而且超過半數(shù)的人在感染HPV后不會(huì)有任何癥狀，因此，實(shí)際攜帶HPV的人口比例可能遠(yuǎn)不止于此。HPV各基因型與其生物學(xué)行為存在著高度相關(guān)性，不同基因型的HPV可導(dǎo)致人體不同部位的不同反應(yīng)及疾病，有不同的致病危害性。HPV感染人的皮膚和粘膜上皮細(xì)胞誘發(fā)細(xì)胞增生，產(chǎn)生乳頭樣病變，不同基因型引起的感染具有不同的臨床表現(xiàn)。
依據(jù)HPV在生殖系統(tǒng)腫瘤形成中所發(fā)揮作用的差異，將HPV分為高危組、中危組和低危組三個(gè)組。臨床統(tǒng)計(jì)表明，高危組的HPV感染是宮頸癌的主要病因，與95％以上的宮頸癌發(fā)病有關(guān)。如能及早發(fā)現(xiàn)HPV，用藥物加以間接治療，可以大大減少患宮頸癌的機(jī)會(huì)。即使不幸發(fā)現(xiàn)患有宮頸癌，只要能于宮頸癌病發(fā)的第一至第二期發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行治療，五年內(nèi)存活率達(dá)70至90％；但如果遲于第三至第四期發(fā)現(xiàn)，其五年內(nèi)存活率只有7-30％。因此及早進(jìn)行HPV基因分型，對(duì)女性健康十分必要。另外，最近文獻(xiàn)表明HPV在生殖系統(tǒng)以外區(qū)域的鱗狀細(xì)胞粘膜腫瘤中也存在，如口腔、鼻咽、食道和男性尿道等。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是芯片基質(zhì)上設(shè)置探針，包括識(shí)別所有HPV基因型的通用探針1個(gè)，HPV基因型特異探針15個(gè)，用于區(qū)分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計(jì)15種基因型，探針在芯片上微陣列排列，至少5個(gè)以上坐標(biāo)點(diǎn)控制芯片的矩形點(diǎn)樣區(qū)域，以坐標(biāo)點(diǎn)控制芯片的矩形點(diǎn)樣區(qū)域和點(diǎn)樣方向，微陣列中一個(gè)角設(shè)置2個(gè)標(biāo)點(diǎn)，為點(diǎn)樣起始點(diǎn)，指示探針排列方向，微陣列的其他3個(gè)角上為1個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，微陣列的縱列至少3列以上，微陣列的橫行至少3行以上。每個(gè)HPV探針點(diǎn)樣1個(gè)以上，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15種基因型，“+”代表陽性質(zhì)控點(diǎn)，排列方式由通用探針到各型探針由小數(shù)到大數(shù)依次排列，再加上陰性和陽性質(zhì)控點(diǎn)，點(diǎn)陣數(shù)至少18點(diǎn)以上。
PCR引物采用2對(duì)24條鏈的套式引物組合，其核苷酸序列如下表所示，

在帶正電荷的芯片基質(zhì)上固定HPV各基因型探針，探針在膜上呈雙點(diǎn)微陣列排列。
5個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)(黑色圓圈)控制芯片的點(diǎn)樣區(qū)域和點(diǎn)樣方向，左下角的雙坐標(biāo)點(diǎn)為點(diǎn)樣起始點(diǎn)。每個(gè)HPV探針可重復(fù)點(diǎn)樣2個(gè)，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56代表15種基因型，“+”代表陽性質(zhì)控點(diǎn)。
HPV基因型的通用探針1個(gè)，HPV基因型特異探針15個(gè)，包括HPV基因型HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58等共計(jì)15種基因型，各型探針序列如下表所示，

15個(gè)HPV型特異探針指的是區(qū)分15種HPV基因型的型特異探針，每一個(gè)探針對(duì)應(yīng)特定的一種基因型。1個(gè)共有探針指的是15種HPV基因型的通用探針，該探針可以和15種HPV基因型出現(xiàn)雜交信號(hào)，甚至包括其他基因型。
在特異探針末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，使其能夠固化在芯片上，特定的聚核苷酸尾巴是在每個(gè)HPV特異探針的3’末端加入20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷酸分子。將點(diǎn)好的芯片放在紫外交聯(lián)儀內(nèi)進(jìn)行照射5分鐘，使探針完全固定在芯片上，構(gòu)成檢測(cè)診斷芯片，把構(gòu)成的檢測(cè)診斷芯片置于2-8℃條件下存放。
根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物信息中心基因庫(GenBank)公布的HPV各基因型序列，選取HPV序列中相對(duì)保守而又存在型間差異的ORF L1區(qū)，結(jié)合HPV各基因型在我國(guó)的流行狀況和致病性設(shè)計(jì)所檢測(cè)基因型的PCR引物和芯片探針，探針合成時(shí)在3’末端加一段特定的聚核苷酸尾巴。
在芯片基質(zhì)上設(shè)置探針，用微孔板放置點(diǎn)樣探針和坐標(biāo)標(biāo)記，探針在芯片上矩形微陣列排列，包括識(shí)別所有HPV基因型的通用探針1個(gè)，HPV基因型特異探針15個(gè)，用于區(qū)分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58、58共計(jì)15種基因型，探針在芯片上微陣列排列，至少5個(gè)以上坐標(biāo)點(diǎn)控制芯片的矩形點(diǎn)樣區(qū)域，以坐標(biāo)點(diǎn)標(biāo)示控制芯片的矩形點(diǎn)樣區(qū)域和點(diǎn)樣方向，微陣列中一個(gè)角設(shè)置2個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，為點(diǎn)樣起始點(diǎn)，指示探針排列方向，微陣列的其他3個(gè)角上為1個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，微陣列的縱列至少3列以上，微陣列的橫行至少3行以上。每個(gè)HPV探針可重復(fù)點(diǎn)樣2個(gè)，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56代表15種基因型，“+”代表陽性質(zhì)控點(diǎn)，排列方式由通用探針到各型探針由小數(shù)到大數(shù)依次排列，再加上陰性和陽性質(zhì)控點(diǎn)，點(diǎn)陣數(shù)至少18點(diǎn)以上。
PCR引物采用2對(duì)24條鏈的套式引物組合，其核苷酸序列如下表所示，

HPV基因型的通用探針1個(gè)，HPV基因型特異探針15個(gè)，包括HPV基因型HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、5HPV6、HPV58共計(jì)15種基因型，各型探針序列如下表所示，

用DNA合成儀合成探針，在特異探針末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，即20個(gè)寡聚胸腺嘧啶核苷酸，使其能夠固化在芯片上，在DNA合成儀采用固相亞磷酰胺三酯法在每個(gè)HPV特異探針的3′末端加入20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷酸分子。使用Nunc點(diǎn)樣儀按照預(yù)先設(shè)定好的順序在帶有正電荷的芯片進(jìn)行點(diǎn)樣。
使用羅氏公司生產(chǎn)的帶有正電荷的芯片，使用Nunc點(diǎn)樣儀按預(yù)先設(shè)定好的順序進(jìn)行點(diǎn)樣。
將點(diǎn)好的芯片放在UVP紫外交聯(lián)儀內(nèi)照射固定5分鐘，使點(diǎn)樣探針固定在芯片上，構(gòu)成檢測(cè)診斷芯片，把制作成的檢測(cè)診斷芯片置于2-8℃條件下存放待用。
由于設(shè)計(jì)的探針比較短，很難固化在芯片上，因此在探針序列的3′末端加一個(gè)尾巴，即20個(gè)寡聚胸腺嘧啶核苷酸，使其能夠固化在芯片上。
設(shè)計(jì)HPV特異性引物和探針為有效擴(kuò)增各基因型HPV和提高靈敏度，采用2對(duì)24條鏈的組合套式引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)探針16個(gè)，包括HPV共用探針1個(gè)，區(qū)分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56和HPV58共計(jì)15種基因型。
取出獲得雜交信號(hào)的芯片，整張芯片背景不著色，雜交信號(hào)呈棕黃色，特異雜交點(diǎn)與非特異雜交點(diǎn)之間的差別明顯，通過點(diǎn)樣區(qū)域模式圖，比對(duì)查出HPV基因分型。
按照臨床標(biāo)本處理、套式PCR擴(kuò)增、芯片雜交、芯片洗滌、芯片顯色和芯片雜交信號(hào)的判讀進(jìn)行檢測(cè)；進(jìn)行臨床標(biāo)本處理采用活檢組織或石蠟標(biāo)本或拭子標(biāo)本。
套式PCR擴(kuò)增分為兩次進(jìn)行，第一次PCR擴(kuò)增包括標(biāo)本處理上清液5微升、一次PCR反應(yīng)混合液(含組合式上游外引物或下游外引物)44微升和Taq聚合酶1微升，總計(jì)50微升均勻混合。PCR循環(huán)條件為94℃預(yù)變性2分鐘，94℃45秒、55℃45秒、72℃45秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，保持72℃延伸5分鐘。
第二次PCR擴(kuò)增是將第一次PCR產(chǎn)物5微升、二次PCR反應(yīng)混合液(含組合式上游內(nèi)引物和DIG-dUTP或者下游內(nèi)引物和DIG-dUTP)44微升和Taq聚合酶1微升均勻混合。
PCR循環(huán)條件為94℃預(yù)變性2分鐘，94℃45秒、55℃45秒、72℃45秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，保持72℃延伸5分鐘，經(jīng)過二次PCR擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物即制作成DIG標(biāo)記的雜交探針。
將預(yù)先制作好的芯片裝入雜交袋中，并在雜交袋中加入適量雜交液，把雜交袋封好，進(jìn)行0.5-1小時(shí)的預(yù)雜交，加入5-20微升的變性探針，放入雜交箱內(nèi)，再進(jìn)行3-6小時(shí)的雜交，雜交箱溫度為45℃。
在室溫條件下用2×SSC/0.1％SDS洗滌芯片兩次，每次2min，在46℃條件下用0.2×SSC/0.1％SDS洗的芯片兩次，每次2min，然后用TNT溶液洗滌芯片5min。
將洗滌干凈的芯片裝入干凈的塑料袋中，在塑料袋內(nèi)加入10％封阻液100μl或TN900μl，混合均勻，在37℃的條件下放置30min。
加入POD抗體1μl，輕輕混合均勻，在37℃的條件下放置30min；將芯片從塑料袋中取出用TNT漂洗芯片2次，每次3min。
將芯片放入干凈的塑料袋中，取DAB顯色液10μl、DAB稀釋液10μl和滅菌水480μl，混合均勻后立即加到塑料袋中，待顯色達(dá)到理想程度后(一般顯色5-30分鐘左右)，用1×PBS終止反應(yīng)，獲得芯片雜交結(jié)果，整張芯片背景不著色，雜交信號(hào)呈棕黃色。
臨床標(biāo)本處理采用活檢組織，取50毫克活檢組織加入DNA裂解液100微升混合均勻后進(jìn)行研磨，研磨后進(jìn)行55℃溫浴1-3小時(shí)，再進(jìn)行100℃煮沸10分鐘，用12000rpm離心機(jī)離心10分鐘，取5微升上清液用做PCR擴(kuò)增模板。
臨床標(biāo)本處理采用石蠟標(biāo)本，取3-5個(gè)石蠟標(biāo)本切片進(jìn)行脫蠟，加入DNA裂解液50微升，進(jìn)行55℃溫浴1-3小時(shí)，再進(jìn)行100℃煮沸10分鐘，用12000rpm的離心機(jī)離心10分鐘，取5微升上清液用做PCR擴(kuò)增模板。
臨床標(biāo)本處理采用拭子標(biāo)本，拭子標(biāo)本用生理鹽水浸泡，用離心的方式收集細(xì)胞沉淀，加入DNA裂解液50微升，進(jìn)行55℃溫浴1-3小時(shí)，再進(jìn)行100℃煮沸10分鐘，用12000rpm離心機(jī)離心10分鐘，取5微升上清液用做PCR擴(kuò)增模板。
本發(fā)明在天津市第三中心醫(yī)院對(duì)收集的95例臨床樣本進(jìn)行分析表明，其中25例為HPV陽性感染，分型結(jié)果如下HPV6型9例、HPV11型5例、HPV16型4例、HPV33型3例、HPV52型2例、HPV16與HPV33的混合型1例、HPV16與HPV52的混合型1例，芯片雜交結(jié)果見圖2。將其中的25例的PCR產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的克隆測(cè)序，均證實(shí)芯片的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)證明HPV基因分型診斷芯片具有診斷準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、信息量大的特點(diǎn)。
本發(fā)明是人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)診斷芯片和制作方法及檢測(cè)方法。具有診斷準(zhǔn)確、快速、診斷方法簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、信息量高和易于推廣使用的特點(diǎn)，探針檢測(cè)通量大，可同時(shí)檢測(cè)15種常見的HPV基因型；操作簡(jiǎn)便、快速，不需要昂貴的儀器設(shè)備和嚴(yán)格的操作環(huán)境，從樣本處理開始僅用兩個(gè)工作日內(nèi)即可獲得檢測(cè)結(jié)果；組合式引物設(shè)計(jì)提高了PCR擴(kuò)增的效率和陽性檢出率；合理的探針設(shè)計(jì)減少了非特異性雜交反應(yīng)的發(fā)生，特異性強(qiáng)；檢測(cè)結(jié)果易于判斷，可直接通過肉眼進(jìn)行判斷，也可由計(jì)算機(jī)控制的芯片閱讀儀自動(dòng)收集和分析數(shù)據(jù)。臨床應(yīng)用的市場(chǎng)潛力巨大，具有極大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明詳細(xì)說明。


圖1 芯片微陣列探針點(diǎn)樣模式圖(A)7×4微陣列模式(B)9×3微陣列模式(C)5×6微陣列模式(D)4×7微陣列模式(E)3×12微陣列模式圖2 部分HPV基因型的芯片雜交結(jié)果(A)HPV6型(B)HPV11型(C)HPV16型(D)HPV33型(E)HPV16、33混合型(F)HPV16、52混合型(注圖中鉛筆字為標(biāo)本號(hào))具體實(shí)施方式
實(shí)施例1芯片基質(zhì)上設(shè)置探針，包括識(shí)別所有HPV基因型的通用探針1個(gè)，HPV基因型特異探針15個(gè)，用于區(qū)分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計(jì)15種基因型，探針在芯片上微陣列排列，5個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)控制芯片的矩形點(diǎn)樣區(qū)域，以坐標(biāo)點(diǎn)控制芯片的矩形點(diǎn)樣區(qū)域和點(diǎn)樣方向，微陣列中一個(gè)角設(shè)置2個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，為點(diǎn)樣起始點(diǎn)，指示探針排列方向，微陣列的其他3個(gè)角上為1個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，微陣列的縱列為4列，微陣列的橫行為7行。每個(gè)HPV35、HPV42、HPV43、HPV45、HPV56、HPV58探針點(diǎn)為1個(gè)，通用探針、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV44、HPV52探針點(diǎn)為2個(gè)，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15種基因型，“+”代表陽性質(zhì)控點(diǎn)，排列方式由通用探針到各型探針由小數(shù)到大數(shù)依次排列，再加上陰性和陽性質(zhì)控點(diǎn)，點(diǎn)陣數(shù)18點(diǎn)。
PCR引物采用2對(duì)24條鏈的套式引物組合，其核苷酸序列如下表所示，

HPV基因型的通用探針1個(gè)，HPV基因型特異探針15個(gè)，包括HPV基因型HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58等共計(jì)15種基因型，各型探針序列如下表所示，

在特異探針末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，使其能夠固化在芯片上，特定的聚核苷酸尾巴是在每個(gè)HPV特異探針的3’末端加入20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷酸分子。將點(diǎn)好的芯片放在紫外交聯(lián)儀內(nèi)進(jìn)行照射5分鐘，使探針完全固定在芯片上，構(gòu)成檢測(cè)診斷芯片，把構(gòu)成的檢測(cè)診斷芯片至于2-8℃條件下存放，如圖1(A)、圖2所示。
實(shí)施例2芯片基質(zhì)上設(shè)置探針，包括識(shí)別所有HPV基因型的通用探針1個(gè)，HPV基因型特異探針15個(gè)，用于區(qū)分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計(jì)15種基因型，探針在芯片上微陣列排列，5個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)控制芯片的矩形點(diǎn)樣區(qū)域，以坐標(biāo)點(diǎn)控制芯片的矩形點(diǎn)樣區(qū)域和點(diǎn)樣方向，微陣列中一個(gè)角設(shè)置2個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，為點(diǎn)樣起始點(diǎn)，指示探針排列方向，微陣列的其他3個(gè)角上為1個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，微陣列的縱列為3列，微陣列的橫行為9行。每個(gè)HPV35、HPV42、HPV43、HPV45、HPV56、HPV58探針點(diǎn)為1個(gè)，通用探針、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV44、HPV52探針點(diǎn)為2個(gè)，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15種基因型，“+”代表陽性質(zhì)控點(diǎn)，排列方式由通用探針到各型探針由小數(shù)到大數(shù)依次排列，再加上陰性和陽性質(zhì)控點(diǎn)，點(diǎn)陣數(shù)18點(diǎn)以上，如圖1(B)、圖2所示。
實(shí)施例3芯片基質(zhì)上設(shè)置探針，包括識(shí)別所有HPV基因型的通用探針1個(gè)，HPV基因型特異探針15個(gè)，用于區(qū)分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計(jì)15種基因型，探針在芯片上微陣列排列，5個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)控制芯片的矩形點(diǎn)樣區(qū)域，以坐標(biāo)點(diǎn)控制芯片的矩形點(diǎn)樣區(qū)域和點(diǎn)樣方向，微陣列中一個(gè)角設(shè)置2個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，為點(diǎn)樣起始點(diǎn)，指示探針排列方向，微陣列的其他3個(gè)角上為1個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，微陣列的縱列為6列，微陣列的橫行為5行。每個(gè)HPV35、HPPV42、HPV43、HPV45、HPV56、HPV58探針點(diǎn)為1個(gè)，通用探針、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV44、HPV52探針點(diǎn)為2個(gè)，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15種基因型，“+”代表陽性質(zhì)控點(diǎn)，排列方式由通用探針到各型探針由小數(shù)到大數(shù)依次排列，再加上陰性和陽性質(zhì)控點(diǎn)，點(diǎn)陣數(shù)18點(diǎn)以上，如圖1(C)、圖2所示。
實(shí)施例4芯片基質(zhì)上設(shè)置探針，包括識(shí)別所有HV基因型的通用探針1個(gè)，HPV基因型特異探針15個(gè)，用于區(qū)分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計(jì)15種基因型，探針在芯片上微陣列排列，5個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)控制芯片的矩形點(diǎn)樣區(qū)域，以坐標(biāo)點(diǎn)控制芯片的矩形點(diǎn)樣區(qū)域和點(diǎn)樣方向，微陣列中一個(gè)角設(shè)置2個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，為點(diǎn)樣起始點(diǎn)，指示探針排列方向，微陣列的其他3個(gè)角上為1個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，微陣列的縱列為7列，微陣列的橫行為4行。每個(gè)HPV35、HPV42、HPV43、HPV45、HPV56、HPV58探針點(diǎn)為1個(gè)，通用探針、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV44、HPV52探針點(diǎn)為2個(gè)，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15種基因型，“+”代表陽性質(zhì)控點(diǎn)，排列方式由通用探針到各型探針由小數(shù)到大數(shù)依次排列，再加上陰性和陽性質(zhì)控點(diǎn)，點(diǎn)陣數(shù)18點(diǎn)以上，如圖1(D)、圖2所示。
實(shí)施例5芯片基質(zhì)上設(shè)置探針，包括識(shí)別所有HPV基因型的通用探針1個(gè)，HPV基因型特異探針15個(gè)，用于區(qū)分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計(jì)15種基因型，探針在芯片上微陣列排列，5個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)控制芯片的矩形點(diǎn)樣區(qū)域，以坐標(biāo)點(diǎn)控制芯片的矩形點(diǎn)樣區(qū)域和點(diǎn)樣方向，微陣列中一個(gè)角設(shè)置2個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，為點(diǎn)樣起始點(diǎn)，指示探針排列方向，微陣列的其他3個(gè)角上為1個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，微陣列的縱列為12列，微陣列的橫行為3行以上。每個(gè)HPV35、HPV42、HPV43、HPV45、HPV56、HPV58探針點(diǎn)為1個(gè)，通用探針、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV44、HPV52探針點(diǎn)為2個(gè)，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15種基因型，“+”代表陽性質(zhì)控點(diǎn)，排列方式由通用探針到各型探針由小數(shù)到大數(shù)依次排列，再加上陰性和陽性質(zhì)控點(diǎn)，點(diǎn)陣數(shù)18點(diǎn)以上，如圖1(E)、圖2所示。
實(shí)施例6在芯片基質(zhì)上設(shè)置探針，用微孔板放置點(diǎn)樣探針和坐標(biāo)標(biāo)記，探針在芯片上矩形微陣列排列，包括識(shí)別所有HPV基因型的通用探針1個(gè)，HPV基因型特異探針15個(gè)，用于區(qū)分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計(jì)15種基因型，探針在芯片上微陣列排列，至少5個(gè)以上坐標(biāo)點(diǎn)控制芯片的矩形點(diǎn)樣區(qū)域，以坐標(biāo)點(diǎn)標(biāo)示控制芯片的矩形點(diǎn)樣區(qū)域和點(diǎn)樣方向，微陣列中一個(gè)角設(shè)置2個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，為點(diǎn)樣起始點(diǎn)，指示探針排列方向，微陣列的其他3個(gè)角上為1個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，微陣列的縱列至少3列以上，微陣列的橫行至少3行以上；每個(gè)HPV35、HPV42、HPV43、HPV45、HPV56、HPV58探針點(diǎn)為1個(gè)，通用探針、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV44、HPV52探針點(diǎn)為2個(gè)，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15種基因型，“+”代表陽性質(zhì)控點(diǎn)，排列方式由通用探針到各型探針由小數(shù)到大數(shù)依次排列，再加上陰性和陽性質(zhì)控點(diǎn)，點(diǎn)陣數(shù)至少18點(diǎn)以上。
PCR引物采用2對(duì)24條鏈的套式引物組合，其核苷酸序列如下表所示，

HPV基因型的通用探針1個(gè)，HPV基因型特異探針15個(gè)，包括HPV基因型HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計(jì)15種基因型，各型探針序列如下表所示，

用DNA合成儀合成探針，在特異探針末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，使其能夠固化在芯片上，在DNA合成儀采用固相亞磷酰胺三酯法在每個(gè)HPV特異探針的3′末端加入20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷酸分子。使用Nunc點(diǎn)樣儀按照預(yù)先設(shè)定好的順序在帶有正電荷的芯片進(jìn)行點(diǎn)樣。
使用羅氏公司生產(chǎn)的帶有正電荷的芯片，使用Nunc點(diǎn)樣儀按預(yù)先設(shè)定好的順序進(jìn)行點(diǎn)樣，如圖1、圖2所示。
將點(diǎn)好的芯片放在UVP紫外交聯(lián)儀內(nèi)照射固定5分鐘，使點(diǎn)樣探針固定在芯片上，構(gòu)成檢測(cè)診斷芯片，把制作成的檢測(cè)診斷芯片至于2-8℃條件下存放待用，如圖1、圖2所示。
設(shè)計(jì)HPV特異性引物和探針為有效擴(kuò)增各基因型HPV和提高靈敏度，采用2對(duì)24條鏈的組合套式引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)探針16個(gè)，包括HPV共用探針1個(gè)，區(qū)分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56和HPV58共計(jì)15種基因型，如圖1、圖2所示。
實(shí)施例7取出獲得雜交信號(hào)的芯片，整張芯片背景不著色，雜交信號(hào)呈棕黃色，特異雜交點(diǎn)與非特異雜交點(diǎn)之間的差別明顯，通過點(diǎn)樣區(qū)域模式圖，比對(duì)查出HPV基因分型，如圖2所示。
按照臨床標(biāo)本處理、套式PCR擴(kuò)增、芯片雜交、芯片洗滌、芯片顯色和芯片雜交信號(hào)的判讀進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)行臨床標(biāo)本處理采用活檢組織或石蠟標(biāo)本或拭子標(biāo)本。
套式PCR擴(kuò)增分為兩次進(jìn)行，第一次PCR擴(kuò)增包括標(biāo)本處理上清液5微升、一次PCR反應(yīng)混合液(含組合式上游外引物或下游外引物)44微升和Taq聚合酶1微升，總計(jì)50微升均勻混合。PCR循環(huán)條件為94℃預(yù)變性2分鐘，94℃45秒、55℃45秒、72℃45秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，保持72℃延伸5分鐘。
第二次PCR擴(kuò)增是將第一次PCR產(chǎn)物5微升、二次PCR反應(yīng)混合液(含組合式上游內(nèi)引物和DIG-dUTP或者下游內(nèi)引物和DIG-dUTP)44微升和Taq聚合酶1微升均勻混合。
PCR循環(huán)條件為94℃預(yù)變性2分鐘，94℃45秒、55℃45秒、72℃45秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，保持72℃延伸5分鐘，經(jīng)過二次PCR擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物即制作成DIG標(biāo)記的雜交探針。
將預(yù)先制作好的芯片裝入雜交袋中，并在雜交袋中加入適量雜交液，把雜交袋封好，進(jìn)行0.5--1小時(shí)的預(yù)雜交，加入5-20微升的變性探針，放入雜交箱內(nèi)，再進(jìn)行3-6小時(shí)的雜交，雜交箱溫度為45℃。
在室溫條件下用2×SSC/0.1％SDS洗滌芯片兩次，每次2min，在46℃條件下用0.2×SSC/0.1％SDS洗的芯片兩次，每次2min，然后用TNT溶液洗滌芯片5min。
將洗滌干凈的芯片裝入干凈的塑料袋中，在塑料袋內(nèi)加入10％封阻液100μl或TN900μl，混合均勻，在37℃的條件下放置30min。
加入POD抗體1μl，輕輕混合均勻，在37℃的條件下放置30min；將芯片從塑料袋中取出用TNT漂洗芯片2次，每次3min。
將芯片放入干凈的塑料袋中，取DAB顯色液10μl、DAB稀釋液10μl和滅菌水480μl，混合均勻后立即加到塑料袋中，待顯色達(dá)到理想程度后(一般顯色5-30分鐘左右)，用1×PBS終止反應(yīng)，獲得芯片雜交結(jié)果，整張芯片背景不著色，雜交信號(hào)呈棕黃色，如圖1、圖2所示。
實(shí)施例8臨床標(biāo)本處理采用活檢組織，取50毫克活檢組織加入DNA裂解液100微升混合均勻后進(jìn)行研磨，研磨后進(jìn)行55℃溫浴1-3小時(shí)，再進(jìn)行100℃煮沸10分鐘，用12000rpm離心機(jī)離心10分鐘，取5微升上清液用做PCR擴(kuò)增模板，如圖1、圖2所示。
實(shí)施例9臨床標(biāo)本處理采用石蠟標(biāo)本，取3-5個(gè)石蠟標(biāo)本切片進(jìn)行脫蠟，加入DNA裂解液50微升，進(jìn)行55℃溫浴1-3小時(shí)，再進(jìn)行100℃煮沸10分鐘，用12000rpm的離心機(jī)離心10分鐘，取5微升上清液用做PCR擴(kuò)增模板，如圖1、圖2所示。
實(shí)施例10臨床標(biāo)本處理采用拭子標(biāo)本，拭子標(biāo)本用生理鹽水浸泡，用離心的方式收集細(xì)胞沉淀，加入DNA裂解液50微升，進(jìn)行55℃溫浴1-3小時(shí)，再進(jìn)行100℃煮沸10分鐘，用12000rpm離心機(jī)離心10分鐘，取5微升上清液用做PCR擴(kuò)增模板，如圖1、圖2所示。
權(quán)利要求
1.一種人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)診斷芯片，其特征是芯片基質(zhì)上設(shè)置探針，包括識(shí)別所有HPV基因型的通用探針1個(gè)，HPV基因型特異探針15個(gè)，用于區(qū)分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計(jì)15種基因型，探針在芯片上微陣列排列，至少5個(gè)以上坐標(biāo)點(diǎn)控制芯片的矩形點(diǎn)樣區(qū)域，以坐標(biāo)點(diǎn)控制芯片的矩形點(diǎn)樣區(qū)域和點(diǎn)樣方向，微陣列中一個(gè)角設(shè)置2個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，為點(diǎn)樣起始點(diǎn)，指示探針排列方向，微陣列的其他3個(gè)角上為1個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，微陣列的縱列至少3列以上，微陣列的橫行至少3行以上；每個(gè)HPV探針點(diǎn)樣1個(gè)以上，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15種基因型，“+”代表陽性質(zhì)控點(diǎn)，排列方式由通用探針到各型探針由小數(shù)到大數(shù)依次排列，再加上陰性和陽性質(zhì)控點(diǎn)，點(diǎn)陣數(shù)至少18點(diǎn)以上；PCR引物采用2對(duì)24條鏈的套式引物組合，其核苷酸序列如下表所示，
HPV基因型的通用探針1個(gè)，HPV基因型特異探針15個(gè)，包括HPV基因型HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計(jì)15種基因型，各型探針序列如下表所示，
在特異探針末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，使其能夠固化在芯片上，特定的聚核苷酸尾巴是在每個(gè)HPV特異探針的3′末端加入20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷酸分子；將點(diǎn)好的芯片放在紫外交聯(lián)儀內(nèi)進(jìn)行照射5分鐘，使探針完全固定在芯片上，構(gòu)成檢測(cè)診斷芯片，把構(gòu)成的檢測(cè)診斷芯片置于2-8℃條件下存放。
2.一種人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)診斷芯片的制作方法，其特征是在芯片基質(zhì)上設(shè)置探針，用微孔板放置點(diǎn)樣探針和坐標(biāo)標(biāo)記，探針在芯片上矩形微陣列排列，包括識(shí)別所有HPV基因型的通用探針1個(gè)，HPV基因型特異探針15個(gè)，用于區(qū)分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計(jì)15種基因型，探針在芯片上微陣列排列，至少5個(gè)以上坐標(biāo)點(diǎn)控制芯片的矩形點(diǎn)樣區(qū)域，以坐標(biāo)點(diǎn)標(biāo)示控制芯片的矩形點(diǎn)樣區(qū)域和點(diǎn)樣方向，微陣列中一個(gè)角設(shè)置2個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，為點(diǎn)樣起始點(diǎn)，指示探針排列方向，微陣列的其他3個(gè)角上為1個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)，微陣列的縱列至少3列以上，微陣列的橫行至少3行以上；每個(gè)HPV探針重復(fù)點(diǎn)樣2個(gè)，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15種基因型，“+”代表陽性質(zhì)控點(diǎn)，排列方式由通用探針到各型探針由小數(shù)到大數(shù)依次排列，再加上陰性和陽性質(zhì)控點(diǎn)，點(diǎn)陣數(shù)至少18點(diǎn)以上；PCR引物采用2對(duì)24條鏈的套式引物組合，其核苷酸序列如下表所示，
HPV基因型的通用探針1個(gè)，HPV基因型特異探針15個(gè)，包括HPV基因型HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計(jì)15種基因型，各型探針序列如下表所示，
用DNA合成儀合成探針，在特異探針末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，使其能夠固化在芯片上，在DNA合成儀采用固相亞磷酰胺三酯法在每個(gè)HPV特異探針的3′末端加入20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷酸分子；使用Nunc點(diǎn)樣儀按照預(yù)先設(shè)定好的順序在帶有正電荷的芯片進(jìn)行點(diǎn)樣；將點(diǎn)好的芯片放在UVP紫外交聯(lián)儀內(nèi)照射固定5分鐘，使點(diǎn)樣探針固定在芯片上，構(gòu)成檢測(cè)診斷芯片，把制作成的檢測(cè)診斷芯片置于2-8℃條件下存放待用。
3.一種人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)診斷芯片的檢測(cè)方法，其特征是取出獲得雜交信號(hào)的芯片，整張芯片背景不著色，雜交信號(hào)呈棕黃色，特異雜交點(diǎn)與非特異雜交點(diǎn)之間的差別明顯，通過點(diǎn)樣區(qū)域模式圖，比對(duì)查出HPV基因分型；按照臨床標(biāo)本處理、套式PCR擴(kuò)增、芯片雜交、芯片洗滌、芯片顯色和芯片雜交信號(hào)的判讀進(jìn)行檢測(cè)；進(jìn)行臨床標(biāo)本處理采用活檢組織或石蠟標(biāo)本或拭子標(biāo)本；套式PCR擴(kuò)增分為兩次進(jìn)行，第一次PCR擴(kuò)增包括標(biāo)本處理上清液5微升、一次PCR反應(yīng)混合液(含組合式上游外引物或下游外引物)44微升和Taq聚合酶1微升，總計(jì)50微升均勻混合；PCR循環(huán)條件為94℃預(yù)變性2分鐘，94℃45秒、55℃45秒、72℃45秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，保持72℃延伸5分鐘；第二次PCR擴(kuò)增是將第一次PCR產(chǎn)物5微升、二次PCR反應(yīng)混合液(含組合式上游內(nèi)引物和DIG-dUTP或者下游內(nèi)引物和DIG-dUTP)44微升和Taq聚合酶1微升均勻混合；PCR循環(huán)條件為94℃預(yù)變性2分鐘，94℃45秒、55℃45秒、72℃45秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，保持72℃延伸5分鐘，經(jīng)過二次PCR擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物即制作成DIG標(biāo)記的雜交探針；將預(yù)先制作好的芯片裝入雜交袋中，并在雜交袋中加入適量雜交液，把雜交袋封好，進(jìn)行0.5--1小時(shí)的預(yù)雜交，加入5-20微升的變性探針，放入雜交箱內(nèi)，再進(jìn)行3-6小時(shí)的雜交，雜交箱溫度為45℃；在室溫條件下用2×SSC/0.1％SDS洗滌芯片兩次，每次2min，在46℃條件下用0.2×SSC/0.1％SDS洗的芯片兩次，每次2min，然后用TNT溶液洗滌芯片5min；將洗滌干凈的芯片裝入干凈的塑料袋中，在塑料袋內(nèi)加入10％封阻液100μl或TN 900μl，混合均勻，在37℃的條件下放置30min；加入POD抗體1μl，輕輕混合均勻，在37℃的條件下放置30min；將芯片從塑料袋中取出用TNT漂洗芯片2次，每次3min；將芯片放入干凈的塑料袋中，取DAB顯色液10μl、DAB稀釋液10μl和滅菌水480μl，混合均勻后立即加到塑料袋中，待顯色達(dá)到理想程度后(一般顯色5-30分鐘左右)，用1×PBS終止反應(yīng)，獲得芯片雜交結(jié)果，整張芯片背景不著色，雜交信號(hào)呈棕黃色。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)診斷芯片的制作方法，其特征是所述的臨床標(biāo)本處理采用活檢組織，取50毫克活檢組織加入DNA裂解液100微升混合均勻后進(jìn)行研磨，研磨后進(jìn)行55℃溫浴1-3小時(shí)，再進(jìn)行100℃煮沸10分鐘，用12000rpm離心機(jī)離心10分鐘，取5微升上清液用做PCR擴(kuò)增模板。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)診斷芯片的制作方法，其特征是所述的臨床標(biāo)本處理采用石蠟標(biāo)本，取3-5個(gè)石蠟標(biāo)本切片進(jìn)行脫蠟，加入DNA裂解液50微升，進(jìn)行55℃溫浴1-3小時(shí)，再進(jìn)行100℃煮沸10分鐘，用12000rpm的離心機(jī)離心10分鐘，取5微升上清液用做PCR擴(kuò)增模板。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)診斷芯片的制作方法，其特征是所述的臨床標(biāo)本處理采用拭子標(biāo)本，拭子標(biāo)本用生理鹽水浸泡，用離心的方式收集細(xì)胞沉淀，加入DNA裂解液50微升，進(jìn)行55℃溫浴1-3小時(shí)，再進(jìn)行100℃煮沸10分鐘，用12000rpm離心機(jī)離心10分鐘，取5微升上清液用做PCR擴(kuò)增模板。
全文摘要
本發(fā)明是人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)診斷芯片和制作方法及檢測(cè)方法。在芯片基質(zhì)上設(shè)置16種探針，探針在芯片上微陣列排列，包括通用探針1個(gè)，HPV型特異探針有15個(gè)，用于區(qū)分HPV基因型6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、52、56、58等共計(jì)15種基因型，在特異探針末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，將點(diǎn)好的芯片放在紫外交聯(lián)儀內(nèi)進(jìn)行照射5分鐘，使探針完全固定在芯片上，構(gòu)成檢測(cè)診斷芯片。PCR引物采用2對(duì)24條鏈的套式引物組合。本發(fā)明具有診斷準(zhǔn)確、快速、診斷方法簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、信息量高和易于推廣使用的特點(diǎn)，臨床應(yīng)用具有極大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1687451SQ200510013318
公開日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月13日
發(fā)明者高英堂, 方淑昌, 杜智 申請(qǐng)人:天津市紫波高科技有限公司