專(zhuān)利名稱(chēng)：微生物高效中和抗原的篩選和鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選和鑒定微生物高效中和抗原蛋白的方法。
(2)背景技術(shù)人類(lèi)和動(dòng)物的傳染病是由微生物所引起，可以通過(guò)免疫接種來(lái)預(yù)防。目前，預(yù)防用疫苗的發(fā)展趨勢(shì)是增強(qiáng)免疫效果、簡(jiǎn)化接種程序、提高預(yù)防接種效益。研制疫苗必須獲得具有免疫保護(hù)作用的高效中和蛋白。但采用常規(guī)方法從全部微生物蛋白質(zhì)中鑒定全部具有免疫中和功能的蛋白質(zhì)，并比較其免疫保護(hù)效率十分困難。目前主要采用的方法包括熱滅活法、福爾馬林滅活法、減毒活疫苗法、用細(xì)菌生物膜制備法等，熱滅活或福爾馬林滅活后對(duì)有效成分進(jìn)行提取、超聲波制備分離有效成分，上述方法并非在對(duì)所有保護(hù)性抗原進(jìn)行比較的基礎(chǔ)上，優(yōu)選出最佳中和抗原進(jìn)行制備。另外，為了盡可能減少接種后的副作用，往往利用DNA重組技術(shù)制備僅含中和原性的純化疫苗，這就需要先選定病原體編碼的具有高效中和原性的基因片段。但采用常規(guī)方法從全部微生物蛋白質(zhì)中鑒定免疫原性蛋白十分困難，且并非所有免疫原性蛋白均具有中和原性。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)具有高通量篩選的特征，是功能基因組研究的重要平臺(tái)，通過(guò)由蛋白質(zhì)組學(xué)與Western blotting技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)(immunoproteomics)技術(shù)，已在患者血清中鑒定了白色鏈球菌(Candida albicans)和砂眼衣原體(Chlamydia trachomatis)的免疫原性蛋白質(zhì)。這些免疫性抗原可作為監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的一種指標(biāo)，將成為研制新疫苗的對(duì)象，有助于擺脫傳統(tǒng)的疫苗研制的束縛，加快新疫苗的研制。由于并非所有免疫原性蛋白均具有中和原性，故采用免疫蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)只能從眾多的微生物蛋白質(zhì)中篩選出免疫原性蛋白卻不能確定其是否具有中和原性。
(3)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的旨在提供一種利用雙向電泳(2-D)技術(shù)使微生物蛋白質(zhì)展示在一個(gè)平面上，再確定具有免疫原性的蛋白質(zhì)，最后通過(guò)免疫和攻毒保護(hù)試驗(yàn)，根據(jù)保護(hù)率確定具有中和作用的免疫原的快速篩選和鑒定微生物高效中和抗原蛋白的方法。
本發(fā)明所說(shuō)的微生物高效中和抗原的篩選和鑒定方法的具體步驟如下1)2-D電泳分離微生物蛋白質(zhì)將微生物收集后，超聲波破碎，加入裂解液，離心處理2次，然后進(jìn)行雙向電泳(2-D)。
2)Western blotting2-D電泳后，進(jìn)行免疫轉(zhuǎn)印，分別采用抗目的微生物的特異性抗體和酶標(biāo)抗體為第一和第二抗體。用DAB或ECL顯色，陽(yáng)性點(diǎn)即為具有免疫原性的蛋白質(zhì)。
3)中和抗原及其中和能力的確定根據(jù)Western blotting的結(jié)果，取出具有免疫原性的全部蛋白質(zhì)，累積收集，每種蛋白點(diǎn)免疫一組易感試驗(yàn)動(dòng)物，7-10天后，加強(qiáng)免疫1-2次，每次間隔7-10天，然后取50倍半數(shù)致死量的微生物進(jìn)行免疫保護(hù)性攻毒試驗(yàn)，根據(jù)保護(hù)率確定具有中和抗原的蛋白點(diǎn)及其保護(hù)效果。
4)中和抗原的定性取出具有中和原性的全部蛋白質(zhì)，按質(zhì)譜樣品處理方法進(jìn)行分析樣品制備，然后進(jìn)行質(zhì)譜和生物信息分析，以確定抗原的蛋白質(zhì)種類(lèi)。
本發(fā)明先利用2-D技術(shù)使細(xì)菌或病毒蛋白質(zhì)展示在一個(gè)平面上，再采用Westernblotting確定具有免疫原性的蛋白質(zhì)，取這些蛋白質(zhì)分別免疫易感試驗(yàn)動(dòng)物。然后進(jìn)行免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)，根據(jù)保護(hù)率確定具有中和作用的免疫原。最后利用質(zhì)譜技術(shù)和生物信息分析確定具有中和作用的蛋白質(zhì)。本發(fā)明可迅速確定具有中和保護(hù)作用的免疫原，達(dá)到高效、快速、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的優(yōu)選保護(hù)性免疫原的目的。一方面可以確定具有中和保護(hù)原性的位點(diǎn)，另一方面避免了基因克隆的盲目性，為基因克隆奠定了扎實(shí)基礎(chǔ)，提高了制備高效疫苗靶點(diǎn)的效率。
(4)


圖1為嗜水氣單胞菌細(xì)胞外膜蛋白質(zhì)的2-D電泳圖譜。
圖2為嗜水氣單胞菌膜蛋白中免疫原性蛋白的Western blotting結(jié)果。
圖3為代表性(P5)肽質(zhì)量指紋圖譜。
圖4為P2點(diǎn)的Q-TOF肽序列分析圖。
圖5為溶藻弧菌細(xì)胞外膜的2-D電泳圖譜。
圖6為溶藻弧菌細(xì)胞外膜的Western blotting結(jié)果圖。
(5)具體實(shí)施方式
實(shí)施例11、細(xì)菌培養(yǎng)、計(jì)數(shù)、收集和破碎實(shí)驗(yàn)采用的嗜水氣單胞菌PPD(134/91)，由新加坡國(guó)立大學(xué)生物學(xué)系Sin YM教授惠贈(zèng)。將嗜水氣單胞菌接種于LB培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)18h，作為種子菌。而后以1∶50(菌液∶培養(yǎng)基)比例接種于上述同種培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)18h。培養(yǎng)結(jié)束后，取2mL菌液進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。其余培養(yǎng)液于4000rpm離心10min，收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體3次，稱(chēng)菌體重，再用以1∶3(重量∶體積)的比例加入超聲破碎緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA)。用Virsonic 475超聲細(xì)胞破碎儀(VirTis公司產(chǎn)品)超聲破碎。
2、抗嗜水氣單胞菌抗體的制備培養(yǎng)18h的嗜水氣單胞菌，4000rpm離心10min；用0.65％生理鹽水懸浮，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將菌液稀釋至1×108個(gè)/mL；注射小鼠，每只0.1mL，對(duì)照組注射生理鹽水；每隔1周注射1次；第3周免疫后的第10天處死小鼠取血，靜置；4000rpm離心10min，取出血清，分裝，-20℃保存。
3、外膜蛋白的提取超聲破碎后的細(xì)菌液，2500g，4℃離心10min，收集上清。上清液100,000g，4℃離心40min。棄上清，沉淀用2％月桂?；彼徕c(配于50mmol/LTris-HCl，pH7.4)洗滌，室溫放置20min。沉淀溶于一定體積超聲緩沖液中。用Bradford法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)濃度。
4、雙向凝膠電泳雙向電泳操作步驟第一向預(yù)電泳200V 15min，300V 30min，400V 2h，上樣后電壓400V，18h.等電聚焦后迅速取出膠條，平衡后移至10％ SDS-PAGE膠上繼續(xù)電泳，其一端外側(cè)加上標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，1％瓊脂糖封固。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，掃描，輸出照片。見(jiàn)圖1，結(jié)果顯示，比較清楚的蛋白點(diǎn)有54個(gè)。
5、Western-blot方法雙向電泳結(jié)束后，進(jìn)行電轉(zhuǎn)，恒壓40V電轉(zhuǎn)過(guò)夜；電轉(zhuǎn)結(jié)束后，用麗春紅染色檢測(cè)電轉(zhuǎn)的效果；洗去麗春紅，加封閉液封閉，室溫孵育1h；TTBS洗膜3次，每次5min；加入鼠抗嗜水氣單胞菌抗體(用封閉液配制)，室溫孵育1h；取出膜，TTBS洗膜3次，每次10min；加入HPO-山羊抗鼠抗體(用封閉液配制)，室溫孵育1h；取出膜，TTBS洗膜3次，每次10min；50mmol/L pH7.4 Tris-HCl洗膜5min；DAB顯色；終止反應(yīng)，掃描，封好膜，保存。Western-blot分析，結(jié)果有8個(gè)抗原出現(xiàn)明顯的結(jié)合反應(yīng)(見(jiàn)圖2)，分別編號(hào)為P1-8，圖2A為具有免疫原性蛋白在膜蛋白2-D分子解剖圖譜中的位置；圖2B為Western blotting結(jié)果顯示的免疫原性蛋白。
6、實(shí)驗(yàn)用魚(yú)實(shí)驗(yàn)鯉魚(yú)購(gòu)自集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院養(yǎng)殖場(chǎng)，外表健康無(wú)病，平均體重約50g。每天分早晚2次按體重1％投喂人工配合飼料，并用增氧泵增氧。馴養(yǎng)15天，確定無(wú)異常后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間控制水溫為27±1℃。
7、凝膠抗原免疫實(shí)驗(yàn)收集與免疫原性蛋白點(diǎn)對(duì)應(yīng)的蛋白條帶切成碎片，于少量蒸餾水中透析過(guò)夜。膠碎片反復(fù)凍融后與等體積完全佐劑(卡介苗∶羊毛脂∶石蠟油＝1∶4∶16v/v)混合，用注射器反復(fù)抽吸后，超聲處理2min。將買(mǎi)回已飼養(yǎng)2星期的鯉魚(yú)分組，每組16條。制備好的凝膠抗原腹腔注射免疫鯉魚(yú)，10μg/尾，對(duì)照組不加免疫處理。注射3次，每次間隔10天，實(shí)驗(yàn)組第2次和第3次使用不完全佐劑。第3次免疫結(jié)束后的第10天取血，玻片凝集法測(cè)定免疫效價(jià)。結(jié)果以t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
8、攻毒菌液制備嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophia)復(fù)蘇后轉(zhuǎn)接普通斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24h，用0.85％無(wú)菌生理鹽水洗下菌苔。然后在顯微鏡下用10倍稀釋法計(jì)數(shù)，推算菌懸液的活菌數(shù)。按50倍于半數(shù)致死量(LD50)進(jìn)行攻毒。
9、攻毒實(shí)驗(yàn)每一實(shí)驗(yàn)組再分成2小組，每組16尾，于免疫結(jié)束后的第10天分別腹腔注射制備好的嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌活菌液，前者為1.5×108個(gè)細(xì)菌/尾，后者為109個(gè)細(xì)菌/尾。對(duì)照組代之于等量生理鹽水。觀察其2周病死率，計(jì)算凝膠抗原的免疫保護(hù)率，結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。表1為其免疫保護(hù)作用的結(jié)果。從表1可見(jiàn)，8種免疫原蛋白質(zhì)的免疫保護(hù)作用相互間具有明顯差異，其中第8號(hào)無(wú)任何保護(hù)作用，而第6號(hào)的保護(hù)作用高達(dá)71.4％。保護(hù)作用與抗體效價(jià)無(wú)明顯關(guān)系。
表1攻毒的免疫保護(hù)性試驗(yàn)
*P＜0.0110、質(zhì)譜樣品的制備用一干凈解剖刀切下目的蛋白點(diǎn)，從無(wú)蛋白質(zhì)污染區(qū)切下一塊大致相同的膠塊為對(duì)照，把膠塊切成約1mm3大小，置于0.5ml Eppendorf中，接著按以下步驟進(jìn)行用50％ACN洗膠塊以脫掉考馬斯亮藍(lán)(2-3次×15min)，棄50％ACN；100％ACN覆蓋膠塊至白色，棄ACN；接著用0.1mol/L NH4HCO3泡脹，然后反復(fù)用ACN/0.1mol/LNH4HCO3洗至無(wú)色，真空離心干燥。用10mmol/LDTT/0.1mol/LNH4HCO3于56℃還原45min后，再用新鮮配置的55mmol/L碘乙酰胺/0.1mol/L NH4HCO3烷基化，避光30min。重復(fù)上述步驟至脫色干凈。真空離心干燥后加入Trypsin(12.5μg/mL)冰上孵育45min，吸掉多余酶液后加入無(wú)酶消化液，37℃過(guò)夜。依次用5％TFA和50％ACN/2.5％TFA反復(fù)抽提1-2次，合并上清液，真空離心干燥。點(diǎn)樣前加1-2μl 0.1％TFA溶解樣品。
11、肽質(zhì)量指紋圖譜的樣品的分析和數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)質(zhì)譜樣品使用德國(guó)BRUKER公司的ReFlexTMIII MALDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，反射模式，離子源加速電壓1為20kv，加速電壓2為23kv，N2激光波長(zhǎng)337nm，脈沖寬度為3ns，離子延遲提取2000ns，真空度1.4×10-7Torr，質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加50次，并用標(biāo)準(zhǔn)Maker峰作為外標(biāo)校正質(zhì)譜峰，正離子譜測(cè)定，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(見(jiàn)圖3)。從圖中可以看出，肽質(zhì)量指紋圖譜信號(hào)都較強(qiáng)且基線平穩(wěn)，適合于下一步的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定。
通過(guò)Mascot(http//www.matrixscience.com.)數(shù)據(jù)庫(kù)選擇NCBI，種屬選擇otherproteobacteria.Peptident(http//www.expasy.org/tools/peptident.htmL)，數(shù)據(jù)庫(kù)選擇swiss-prot，種屬選擇other bacteria.用ExPASy Molecular Biology Server網(wǎng)站提供的Peptident軟件(http//www.expasy.org/tools/peptident.html)進(jìn)行查詢(xún)。查詢(xún)條件肽質(zhì)量指紋圖譜中的肽片段質(zhì)量控制在800-3500，表觀Mr的誤差范圍為±20％，對(duì)表觀pI值未做要求，肽片段分子量最大容許誤差范圍為±0.5Da，每個(gè)肽允許有2個(gè)不完全裂解位點(diǎn)，物種來(lái)源選擇細(xì)菌，離子選擇[M+H]+和monoisotopic，最少匹配肽片段數(shù)規(guī)定為4，半胱胺酸為碘乙酰胺處理。
12、蛋白序列檢測(cè)樣品的處理、分析和數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)質(zhì)譜樣品使用ESI-MS/MS Q-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。挖取蛋白點(diǎn)切成碎塊，加100μl 50mmol/l NH4HCO3/50％(v/v)乙氰脫色5min，去上清，重復(fù)3次，加100％乙氰使膠塊縮水變白后，去上清，重復(fù)3次，抽干。加適量10mmol/lDTT/0.1mol/l NH4HCO3，充入N2，56℃水浴60min，去上清，加等體積55mmol/l碘乙酰胺/0.1mol/l NH4HCO3，充入N2，室溫避光60min。去上清，加100μl 0.1mol/lNH4HCO3，5min后加等體積乙氰，5min后去上清，重復(fù)1次，抽干，加適量消化液(50mmol/l NH4HCO3，12.5ng/μl Trypsin)，4℃30min后吸出殘余液體，加適量50mmol/l NH4HCO3，37℃過(guò)夜。6000rpm離心10min，取上清，加20mmol/l NH4HCO3，混勻，6000rpm離心10min，加10μl 5％甲酸/50％乙氰，10min，6000rpm離心10min，合并上清，抽干，加0.5％甲酸溶解。溶液經(jīng)過(guò)Zip/Tip純化和濃縮以后進(jìn)行質(zhì)譜分析。肽指紋圖譜匹配使用PepIdent(www.expasy.org/tools/peptident.pl)。參數(shù)設(shè)置為物種來(lái)源-細(xì)菌；Mw-表觀分子量±30％；pI-不設(shè)限制；酶-胰酶；允許忽略的酶切位點(diǎn)-1；修飾類(lèi)型-碘乙?；?。氨基酸序列結(jié)構(gòu)域匹配使用Prosite Scan(www.expasy.org/tools/prositescan.pl)。氨基酸序列同源性搜索使用Blast(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)。搜索結(jié)果如表2所示。P2點(diǎn)肽序列分析結(jié)果見(jiàn)圖4，圖4a為肽譜圖，圖4 b、c為部分序列圖。
表2嗜水氣單胞菌P1-8部分OMP MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果
實(shí)施例2除細(xì)菌改為溶藻弧菌外，其余均與實(shí)施例1相同。結(jié)果如下1、溶藻弧菌細(xì)胞外膜的2-D電泳圖譜采用2-D電泳技術(shù)，對(duì)鰻弧菌的細(xì)胞外膜進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約40蛋白點(diǎn)，見(jiàn)圖5。
2、免疫原性蛋白確定采用Western blotting技術(shù)，分別以鼠抗溶藻弧菌和HP-兔抗小鼠為第一和第二抗體，按試驗(yàn)程序進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果有5個(gè)抗原出現(xiàn)明顯的結(jié)合反應(yīng)，分別編號(hào)為1-5。溶藻弧菌細(xì)胞外膜的Western blotting的結(jié)果見(jiàn)圖6。
3、MALDI-TOF肽質(zhì)量指紋譜分析和Q-TOF的肽序列分析采用生物質(zhì)譜對(duì)5個(gè)具有免疫原性的蛋白點(diǎn)進(jìn)行分析，其中對(duì)點(diǎn)2和5進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析，點(diǎn)1、3和4進(jìn)行Q-TOF的肽序列分析，分別得到各自的肽質(zhì)量指紋圖譜和Q-TOF的肽序列分析。
根據(jù)獲得的肽指紋譜數(shù)據(jù)和分子量范圍及其他一些參數(shù)，通過(guò)Peptident軟件查詢(xún)SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)中與之匹配的蛋白質(zhì)，搜索結(jié)果如表3所示。
表3溶藻弧菌P1-5的MALDI-TOF-MS和Q-TOF鑒定結(jié)果
注點(diǎn)1、3、4為和Q-TOF的肽序列分析，點(diǎn)2和5為肽質(zhì)量指紋譜分析。
1、免疫攻毒試驗(yàn)按免疫攻毒試驗(yàn)方案，對(duì)免疫后的鯉魚(yú)進(jìn)行攻毒。結(jié)果表明，點(diǎn)3、4具有較好的免疫保護(hù)作用，參見(jiàn)表4。
表4溶藻弧菌攻毒的免疫保護(hù)性試驗(yàn)
*P＜0.05；**P＜0.0權(quán)利要求
1.微生物高效中和抗原的篩選和鑒定方法，其特征在于所說(shuō)的微生物高效中和抗原的篩選和鑒定方法的具體步驟如下1)2-D電泳分離微生物蛋白質(zhì)將微生物收集后，超聲波破碎，加入裂解液，離心處理2次，然后進(jìn)行雙向電泳(2-D)；2)Western blotting2-D電泳后，進(jìn)行免疫轉(zhuǎn)印，分別采用抗目的微生物的特異性抗體和酶標(biāo)抗體為第一和第二抗體，用DAB或ECL顯色，陽(yáng)性點(diǎn)即為具有免疫原性的蛋白質(zhì)；3)中和抗原及其中和能力的確定根據(jù)Western blotting的結(jié)果，取出具有免疫原性的全部蛋白質(zhì)，累積收集，每種蛋白點(diǎn)免疫一組易感試驗(yàn)動(dòng)物，7-10天后，加強(qiáng)免疫1-2次，每次間隔7-10天，然后取50倍半數(shù)致死量的微生物進(jìn)行免疫保護(hù)性攻毒試驗(yàn)，根據(jù)保護(hù)率確定具有中和抗原的蛋白點(diǎn)及其保護(hù)效果；4)中和抗原的定性取出具有中和原性的全部蛋白質(zhì)，按質(zhì)譜樣品處理方法進(jìn)行分析樣品制備，然后進(jìn)行質(zhì)譜和生物信息分析，以確定抗原的蛋白質(zhì)種類(lèi)。
2.如權(quán)利要求1所述的微生物高效中和抗原的篩選和鑒定方法，其特征在于所說(shuō)的微生物為病毒，細(xì)菌。
全文摘要
涉及一種篩選和鑒定微生物高效中和抗原蛋白的方法，利用2－D技術(shù)使細(xì)菌或病毒蛋白質(zhì)展示在一個(gè)平面上，再采用Western blotting確定具有免疫原性的蛋白質(zhì)，取這些蛋白質(zhì)分別免疫易感試驗(yàn)動(dòng)物。然后進(jìn)行免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)，根據(jù)保護(hù)率確定具有中和作用的免疫原，最后利用質(zhì)譜技術(shù)和生物信息分析確定具有中和作用的蛋白質(zhì)。其可迅速確定具有中和保護(hù)作用的免疫原，達(dá)到高效、快速、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的優(yōu)選保護(hù)性免疫原的目的。一方面可以確定具有中和保護(hù)原性的位點(diǎn)，另一方面避免了基因克隆的盲目性，為基因克隆奠定了扎實(shí)基礎(chǔ)，提高了制備高效疫苗靶點(diǎn)的效率。
文檔編號(hào)G01N23/22GK1566956SQ0314503
公開(kāi)日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2003年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月18日
發(fā)明者彭宣憲, 陳子珺, 王三英 申請(qǐng)人:廈門(mén)大學(xué)