專利名稱：一種抗酵母類真菌抗生素的快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗酵母類真菌抗生素的快速檢測方法的發(fā)明。
背景技術(shù)：
目前，通常用于體外篩選具有抗酵母類真菌活性的方法主要有藥典上推薦的瓊脂挖塊法(中華人民共和國藥典1990年，第二部，附錄113，化學(xué)工業(yè)出版社，中國北京)，美國臨床實驗標(biāo)準(zhǔn)(NCCCLS)(NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards.Reference method for broth dilution antifungal susceptibilitytesting of yeast.Tentative standard M27-T，PennsylvaniaNCCLS，1995.1～22.)，以及文獻(xiàn)報道的MTT法(金哲洙，王玉書，金京玲，蔡英姬，金河奎，金正勇.煙曲霉菌中抗真菌活性肽類物質(zhì)的分離與純化.中國生化藥物雜志，2001，22(1)13～15)。瓊脂挖塊法是使用最為廣泛的方法，它操作簡便，直觀，但工作量大，尤其是對于擴(kuò)散速度慢的樣品來說，該法并不適合，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有些抗真菌活性物質(zhì)在瓊脂平板上并不表現(xiàn)出活性，而用NCCCLS法能檢測到(Hiroyuki Chiba，Hitosi Agematu，Rci Kaneto，Tadashi Terasawa，Kazuya Sakai，Kazuyuki Dobashi and Takeo Yoshioka.Rhodopeptins，Novel Cyclic Tetrapeptides withAntifungal Activity from Rhodococcus sp.J Antibiotics，1999，52(8)695～699)。MTT法是新近文獻(xiàn)報道新方法，其結(jié)果準(zhǔn)確，但價格昂貴，對樣品的大量初篩不經(jīng)濟(jì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，建立一種結(jié)果準(zhǔn)確，快速，方便，價格經(jīng)濟(jì)的檢測抗酵母類真菌抗生素的新方法，該方法可應(yīng)用于研究開發(fā)抗酵母類真菌抗生素的過程中，特別是在初篩階段，以達(dá)到靈敏、快捷、用量少且相關(guān)性好的目的，并且該活性篩選模型有利于提高篩選成功率，滿足高通量篩選的需要。同時可用于抗生素的定量分析，便于進(jìn)行抗生素合成和分離純化過程中的活性檢測以及產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)本申請人發(fā)明了一種用美藍(lán)-酶聯(lián)免疫檢測儀快速測定抗酵母類真菌抗生素的方法。其原理用美藍(lán)對酵母染色可以用來鑒別酵母的死活，活的酵母，由于新陳代謝不停地在進(jìn)行著，細(xì)胞內(nèi)氧化還原值小，還原力強，能將無毒的美藍(lán)還原脫色成無色，但死酵母則無此還原力，通過顯微觀察酵母的顏色可分辨酵母的死活(沈萍，范秀榮，李廣武主編，微生物學(xué)實驗，高等教育出版社，中國北京，1999)。酶聯(lián)免疫檢測儀能通過檢測被測物的吸光值反映出被測物的顏色深淺，且與酶聯(lián)免疫檢測儀檢配套使用的96孔板適用于大批量的檢測?；谏鲜鰞牲c理論，申請人將檢測品與酵母類真菌混合在一起作用一定的時間，再加入美藍(lán)，若檢測品具有抗酵母類真菌活性，則酵母活菌數(shù)就少，還原美藍(lán)的能力就低，美藍(lán)顏色就深，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測出的吸光值就大；反之，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測出的吸光值就小。于是可以將傳統(tǒng)的酵母美藍(lán)染色和酶聯(lián)免疫檢測儀結(jié)合起來，只需從檢測品的OD630數(shù)值就能檢測其是否具有抗酵母類真菌活性，最終能通過分析酶聯(lián)免疫檢測儀檢測出的吸光值來大批量地篩選被檢測品是否具有抗酵母類真菌的活性。
本發(fā)明包括以下步驟本發(fā)明的總體技術(shù)步驟包括將靶菌液稀釋，抗生素稀釋→種板→抗生素與靶菌液共同作用→酶聯(lián)免疫檢測儀(簡稱酶標(biāo)儀)測定空白板吸光值→加入美藍(lán)染液→保溫→酶聯(lián)免疫檢測儀(簡稱酶標(biāo)儀)測定吸光值→最后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。其具體步驟是(1)將培養(yǎng)14-20h的白色念珠菌(Candida albicans)用YPD培養(yǎng)基稀釋至1～5×105CFU(細(xì)胞數(shù)，下同)/mL，在無菌的96孔板的第1列各孔中加入YPD培養(yǎng)基200μL為空白對照，從第2列到最后1列每孔中加入稀釋好的靶菌液100μL，除最后1列再加入100μL YPD培養(yǎng)基做生長對照外，其余各孔都加入無菌待測樣品100μL，每個樣品做三個重復(fù)；將板于室溫振蕩培養(yǎng)20-24h，于酶聯(lián)免疫檢測儀(MultiskanMk3酶標(biāo)儀，芬蘭雷勃分析儀器有限公司)檢測各孔的OD630(記為A0)。在每孔中加入美藍(lán)染液20μL，使其終濃度為0.05‰，室溫下靜置保溫10-20min，于酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔的OD630(記為A)；(2)制備美藍(lán)染液配制美藍(lán)(例如呂氏堿性美藍(lán)染液，按照沈萍等主編，微生物學(xué)實驗，高等教育出版社，中國北京，1999所示的方法)的A液和B液，所述的A液是將5g美藍(lán)溶于100mL95％的酒精中配制成美藍(lán)酒精飽和溶液；所述的B液是配制成0.01％的KOH水溶液。將A液30mL和B液100mL混勻，過濾；(3)制備YPD培養(yǎng)基，其配制比例如下(按照方心芳編著，應(yīng)用微生物學(xué)實驗法，中國輕工業(yè)出版社，中國北京，1993所示的方法)葡萄糖2％，胰蛋白胨2％，酵母粉1％，pH5.0～5.5，121℃滅菌20min；(4)定性檢測以吸光值A(chǔ)-A0作為最終OD630，該OD630值大于1小于2時定為有抗酵母類真菌的活性；(5)定量檢測取無菌96孔板，于每一行第一列加入YPD 200μL作為空白對照，從第二列起直到最后一列加入稀釋成105CFU/mL的Candida albicans靶菌液，每一行加入同一稀釋度的靶菌液，再從第二列起直到倒數(shù)第二列加入標(biāo)準(zhǔn)抗生素如氟康唑(中國天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司生產(chǎn)，下同，中華人民共和國國藥準(zhǔn)字X2000261)100μL，每一列加入同一稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)抗生素氟康唑，使其終濃度依次為128μg/mL，64μg/mL，32μg/mL，16μg/mL，8μg/mL，4μg/mL，2μg/mL，1 μg/mL，0.5 μg/mL，0.25μg/mL，最后一列加入YPD培養(yǎng)基100μL，作為生長對照孔；做三個重復(fù)；按上述測定方法測定OD630(A-A0值)，以抗生素濃度為橫坐標(biāo)，OD630為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(如

圖1，是以氟康唑為標(biāo)準(zhǔn)抗生素，以C.albicans為靶標(biāo)菌，使用本發(fā)明的方法獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線)。待測樣品按同樣條件操作，根據(jù)OD630從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相應(yīng)的濃度。
本發(fā)明所指的酵母類真菌包括白色念珠菌Candida albicans，，畢赤氏酵母Pichia pastoris，，新型隱球酵母Cyptococcus neoformans，，釀酒酵母Saccharomyces cerevisae，所述的菌屬于其活細(xì)胞能使美藍(lán)染液褪色的酵母菌。上述菌根據(jù)實驗的需要既可以作為靶標(biāo)菌，也可以作為靶菌液使用，附圖及其圖面的說明圖1是以氟康唑為標(biāo)準(zhǔn)抗生素，以Candida albicans為靶標(biāo)菌，使用本發(fā)明的方法獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖中橫坐標(biāo)為抗生素氟康唑濃度，下同；縱坐標(biāo)為OD630，下同。
圖2是靶菌液為畢赤氏酵母Pichia Pastoris以氟康唑為標(biāo)準(zhǔn)抗生素的曲線圖3是靶菌液為新型隱球酵母Cyptococcus neoformans以氟康唑為標(biāo)準(zhǔn)抗生素的曲線圖4是本發(fā)明的效果，即靶菌液為釀酒酵母Saccharomyces cerevisae，以氟康唑為標(biāo)準(zhǔn)抗生素的曲線。
本發(fā)明的積極效果是表1本發(fā)明與對照瓊脂挖塊法和MTT法的實施效果比較方法 優(yōu)點缺點本發(fā)明(美藍(lán)-酶聯(lián)免疫檢 用量少，快速，廉價，準(zhǔn)確，靈敏。對樣本要求無菌測法)瓊脂挖塊法(對照) 方便，直觀 工作量大，繁瑣，與樣本在瓊脂里的擴(kuò)散速度有關(guān)MTT法(對照) 用量少，快速，準(zhǔn)確，靈敏對樣本要求無菌，MTT昂貴具體實施方式
實施例1申請人分別用本發(fā)明的美藍(lán)法(具體操作見本說明書前面的描述的方法)和瓊脂挖塊法(見本說明書關(guān)于該方法的參考文獻(xiàn)所示的方法)(對照)對600個樣品進(jìn)行初步篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用本發(fā)明的美藍(lán)法篩選到的具有抗真菌活性的樣品69個，用經(jīng)典的瓊脂挖塊法(對照)篩選到的具有抗真菌活性的樣品有54個，且這54個樣本完全被包含在前面的69個樣本中，見表2。從表2可以看出本發(fā)明的方法較瓊脂挖塊法靈敏，當(dāng)樣品用本發(fā)明篩選不能檢測到活性時，用瓊脂挖塊法也檢測不到；當(dāng)樣品用瓊脂挖塊法篩選能檢測到活性時，就一定能用本發(fā)明篩選得到。在進(jìn)行抗酵母類真菌活性物質(zhì)的初篩時，由于發(fā)酵上清液中的活性物質(zhì)含量很低，用瓊脂挖塊法就有可能因樣品在瓊脂里擴(kuò)散速度慢而漏篩掉具有新結(jié)構(gòu)的活性物質(zhì)(沈萍等主編，微生物學(xué)實驗，高等教育出版社，中國北京，1999)；而本發(fā)明的方法具有試劑用量少，靈敏性高的特點，不容易漏篩有活性的樣品，可以得到較準(zhǔn)確的結(jié)果。
表2本發(fā)明與對照瓊脂挖塊法用于篩選樣品時的靈敏性比較本發(fā)明(美藍(lán)-瓊脂挖塊法(對 檢出樣品數(shù) 檢出樣品所占百分比(％)酶聯(lián)免疫檢測照)- + 00+ - 15 2.5+ + 54 9- - 531 88.5注表中“+”代表有活性，“-”代表無活性實施例2海洋微生物抗C.albicans活性的篩選申請人從中國海南島沿海采集海泥、紅樹林土壤、海藻等樣品，從中分離海洋細(xì)菌(包括放線菌)、海洋真菌(主要是絲狀真菌)等，通過發(fā)酵，離心或過濾得到無細(xì)胞發(fā)酵上清液，以C.albicans為靶標(biāo)菌，用本發(fā)明進(jìn)行初篩。表3為其中一96孔板的對94個海洋微生物發(fā)酵上清液樣品測定結(jié)果。將OD630＞1的樣品視為具有抗C.albicans活性。由表3可以看出，在94個待測的海洋微生物樣品中(除去一個生長對照孔和空白對照孔)，有22個樣品的OD630＞1(表3中有下劃線部分)，可作為進(jìn)一步篩選的出發(fā)菌。
表394個海洋微生物發(fā)酵液樣品的抗測定結(jié)果1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A 1.9201.5230.63 0.8771.3180.882 0.511.2491.2070.6471.3930.673B1.7090.729 0.597 0.537 0.6541.5881.1590.728 0.481 0.478 0.42 0.835C 0.584 0.7221.1450.594 0.9551.4090.842 0.4841.0520.623 0.636 0.844D 0.847 0.906 0.549 0.482 0.671 0.956 0.704 0.5671.1880.4491.3350.534E 0.4351.390.848 0.956 0.451 0.628 0.903 0.907 0.608 0.6131.0710.478F1.190.6841.2560.4541.5030.465 0.6071.4540.846 0.410.808 0.664G 0.7511.0380.995 0.877 0.534 0.472 0.573 0.736 0.939 0.619 0.921 0.806H 0.8071.4640.871 0.786 0.87 0.659 0.605 0.745 0.698 0.5341.0670.386注第一排第一孔(A1)為空白對照，最末一排最后一孔(H12)為生長對照孔。
實施例3海洋微生物抗C.albicans活性的定量分析按本發(fā)明所述的定量分析方法做標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。在同樣條件下對樣品測定，如表3。表3中A2孔的OD630＝1.523，從圖1可以得出它的活性相當(dāng)于濃度為8μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)抗生素(氟康唑)；又如表3中，E2孔的OD630＝1.39，同樣地可以從圖1得出它的活性相當(dāng)于濃度為4μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)抗生素(氟康唑)。從這兩個例子說明只要借助于標(biāo)準(zhǔn)抗生素曲線圖，本方法可以快速地通過樣品的OD630進(jìn)行定量分析。
注本實施例的樣品來源與制備方法如實施例3的相同。
實施例4本發(fā)明用于其它酵母類真菌靶標(biāo)菌分別以畢赤氏酵母Pichia pastoris，新型隱球酵母Cyptococcus neoformans，釀酒酵母Saccharomycescerevisae As2.346等三株酵母為靶標(biāo)菌，以氟康唑為標(biāo)準(zhǔn)抗生素，對這三株酵母在不同抗生素濃度下的活性時應(yīng)用本發(fā)明的方法檢測，得到三條標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2-4，其中圖2靶菌液為畢赤氏酵母Pichia pastoris以氟康唑為標(biāo)準(zhǔn)抗生素的曲線；圖3靶菌液為新型隱球酵母Cyptococcus neoformans以氟康唑為標(biāo)準(zhǔn)抗生素的曲線圖4靶菌液為釀酒酵母Saccharomyces cerevisae As2.346，以氟康唑為標(biāo)準(zhǔn)抗生素的曲線)。除新型隱球酵母Cyptococcus neoformans相關(guān)性偏低以外，其它兩株菌的相關(guān)性都很好，而新型隱球酵母Cyptococcus neoformans相關(guān)性偏低，與它的生長量有關(guān)，根據(jù)NCCCLS標(biāo)準(zhǔn)，該酵母的培養(yǎng)時間也比其它酵母長(National Committee for Clinical Laboratory Standards.Reference method for broth dilutionantifungal susceptibility testing of yeast.Tentative standard M27-T，PennsylvaniaNCCLS，1995.1～22.)，可以通過延長靶菌培養(yǎng)時間使相關(guān)性更好。
權(quán)利要求
1.一種抗酵母類真菌抗生素的快速檢測方法，它包括將靶菌液稀釋、抗生素稀釋、種板、抗生素與靶菌液共同作用、酶聯(lián)免疫檢測儀測定空白板吸光值、加入美藍(lán)染液、保溫、酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光值、最后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，其步驟是(1)將培養(yǎng)14-20h的白色念珠菌(Candida albicans)用YPD培養(yǎng)基稀釋至1～5×105CFU/mL，在無菌的96孔板的第1列各孔中加入YPD培養(yǎng)基200μL為空白對照，從第2列到最后1列每孔中加入稀釋好的靶菌液100μL，除最后1列再加入100μL YPD培養(yǎng)基做生長對照外，其余各孔都加入無菌待測樣品100μL，每個樣品做三個重復(fù)；將板于室溫振蕩培養(yǎng)20-24h，于酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔的OD630(記為A0)，在每孔中加入美藍(lán)染液20μL，使其終濃度為0.05-0.1‰，室溫下靜置保溫10-20min，于酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔的OD630(記為A)；(2)制備美藍(lán)染液配制美藍(lán)A液和B液，所述的A液是將5g美藍(lán)溶于100mL95％的酒精中配制成美藍(lán)酒精飽和溶液；所述的B液是配制成0.01％的KOH水溶液，將A液30mL和B液100mL混勻，過濾；(3)制備YPD培養(yǎng)基，其配制比例如下葡萄糖2％，胰蛋白胨2％，酵母粉1％，pH5.0～5.5，121℃高壓蒸汽滅菌20min；(4)定性檢測以吸光值A(chǔ)-A0作為最終OD630，該OD630值大于1小于2時定為有抗酵母類真菌的活性；(5)定量檢測取無菌96孔板，于每一行第一列加入YPD 200μL作為空白對照，從第二列起直到最后一列加入稀釋成105CFU/mL的Candida albicans靶菌液，每一行加入同一稀釋度的靶菌液，再從第二列起直到倒數(shù)第二列加入標(biāo)準(zhǔn)抗生素如氟康唑100μL，每一列加入同一稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)抗生素氟康唑，使其終濃度依次為128μg/mL，64μg/mL，32μg/mL，16μg/mL，8μg/mL，4μg/mL，2μg/mL，1μg/mL，0.5μg/mL，0.25μg/mL，最后一列加入YPD培養(yǎng)基100μL，作為生長對照孔；做三個重復(fù)；用上述測定方法測定OD630(A-A0值)，以抗生素濃度為橫坐標(biāo)，OD630為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；待測樣品按同樣條件操作，根據(jù)OD630從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相應(yīng)的濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗酵母類真菌抗生素的快速檢測方法。應(yīng)用美藍(lán)—酶聯(lián)免疫檢測儀快速測定抗酵母類真菌抗生素。其原理是活的酵母，由于新陳代謝不停地進(jìn)行，能將無毒的美藍(lán)還原脫色成無色，但死酵母無此還原力。抗生素與酵母作用后，通過酶聯(lián)免疫檢測儀檢測吸光度的變化，可反映抗生素的活性。具體步驟包括將抗生素稀釋、種板、抗生素與靶菌液共同作用、酶聯(lián)免疫檢測儀測定空白板吸光值、加入美藍(lán)染液、保溫、酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光值，最后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。本發(fā)明具有準(zhǔn)確，快速，方便，經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點。可應(yīng)用于抗酵母類真菌抗生素的研發(fā)過程中，特別是初篩階段。同時可用于定量分析，便于進(jìn)行抗生素合成和分離純化過程中的活性檢測以及產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立。
文檔編號G01N33/569GK1553187SQ0312809
公開日2004年12月8日 申請日期2003年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月4日
發(fā)明者洪葵, 肖春, 洪 葵 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所, 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究