專利名稱：通過間期細(xì)胞核的探針熒光原位雜交檢測染色體間不平衡的方法及系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過間期細(xì)胞核的熒光探針原位雜交(FISH)(hybridation in situ de sondes fluorescents)，檢測染色體間不平衡的方法。它還涉及實(shí)施所述方法的一系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
新生嬰兒身上最常見的組成染色體不平衡涉及染色體21、18、13及性染色體。三體性染色體21(唐氏先天愚征)即為最常見的一種異常嬰兒患病率約為千分之1.7(Stoll et al，1998)。
三體性染色體21發(fā)病數(shù)隨母親年齡增大而增加，尤其母親年齡超過35歲時(shí)，所以若高齡生育，建議作產(chǎn)前檢查。現(xiàn)在的趨勢是晚育35歲以上才生小孩的母親的百分比在四年間，從8％增至19％(Stoll et al，1994)。顯然，這個(gè)比例還會(huì)繼續(xù)增加，但從現(xiàn)在開始，法國每年新生嬰兒數(shù)為750 000個(gè)，需作三體性染色體21檢查的可能約為每年150 000例。
自70年代以來，羊膜腔穿刺術(shù)后的產(chǎn)前檢查采用的是傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)，所述細(xì)胞遺傳學(xué)可確定中期染色體的染色體組型，并可檢測染色體異常數(shù)。這種技術(shù)的主要缺點(diǎn)在于取樣與得出診斷結(jié)果之間的等待期相對較長(2周)。另外，可利用中期不能百分百保證(失敗率為1％)，由于母細(xì)胞的存在，可能會(huì)出現(xiàn)假陰性(Vermaet al，1998)。
最近，熒光探針的原位雜交(FISH)可直接應(yīng)用在間期細(xì)胞核上，無需細(xì)胞培養(yǎng)。所述技術(shù)在于借助熒光探針，標(biāo)注出染色體(如可參見US 5 756 696)或染色體區(qū)，并計(jì)算信號(hào)，即放射出熒光信號(hào)的染色體(Pierluigi et al，1996；Steinborn et al，1996；Wei et al，1997；Eiben et al，1999)。因此，可在較短時(shí)間內(nèi)得出結(jié)果(幾天)，分析也只需取樣少量細(xì)胞(幾百個(gè))，而細(xì)胞培養(yǎng)則必需更多細(xì)胞(至少好幾萬)。
不同類型的探針可用于這些研究覆蓋染色體21中心區(qū)或長臂區(qū)的探針(cosmide，YAC)(Soloviev et al，1995，Van Opstad et al，1995；Pierluigi et al，1996；Steinborn et al，1996)。通過用這些探針對染色體21所作的部分標(biāo)注，可估計(jì)復(fù)制數(shù)。因此，必須人工或自動(dòng)計(jì)算信號(hào)，以檢測出對應(yīng)染色體21的有三個(gè)信號(hào)的細(xì)胞。
不少研究證明了胎兒細(xì)胞(cellules fétales)原位雜交技術(shù)的可靠性。但很少研究可獲得FISH技術(shù)與傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳診斷法之間直接比較的結(jié)果(Pierluigi et al，1996；Steinborn et al，1996；Wei et al，1997；Eiben et al，1999；Thein et al，2000)。這些研究的工作人員證明了這兩種方法之間的一致性高達(dá)97--100％，但也強(qiáng)調(diào)詮釋間期FISH結(jié)果的困難性。這些困難通常與必需一名人工操作員有關(guān)，所述操作員需識(shí)別并計(jì)算熒光信號(hào)。但不同操作員之間存在一定程度的變化，尤其地，信號(hào)異常數(shù)的細(xì)胞核數(shù)目的統(tǒng)計(jì)含義，會(huì)在診斷時(shí)造成一些問題。觀察者之間的差異不僅因?yàn)椴捎昧瞬煌膶Α包c(diǎn)”(即熒光信號(hào))的定義標(biāo)準(zhǔn)，例如，其大小、強(qiáng)度、結(jié)構(gòu)，還因?yàn)辄c(diǎn)通常在沿核內(nèi)垂直軸Z的不同焦點(diǎn)平面里。
因此，根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)得到的結(jié)果也大為不同，所述標(biāo)準(zhǔn)本身又取決于各實(shí)驗(yàn)室中的樣本準(zhǔn)備。極大的偏差是由“定點(diǎn)(cut-off)”的確定造成的，即一“正性臨界”值，根據(jù)所述值，樣本可被視為異常(Ruangvutilert et al，2000)。所述值很難確定，因?yàn)樵趯φ涨闆r中，存在三個(gè)信號(hào)的細(xì)胞核的百分比在被分析核的10至20％之間。所述數(shù)目視研究而不同，因?yàn)楸环治黾?xì)胞數(shù)本身又在50到200之間變化，這可解釋所述統(tǒng)計(jì)結(jié)果的極大差異性。另外，要對所述檢測進(jìn)行醫(yī)學(xué)解釋，重要的是要可靠地識(shí)別有染色體數(shù)目異常的細(xì)胞核(嵌合mosaique))的比例的值。
本發(fā)明的目的在于提出一種自動(dòng)化檢測方法，甚至從其概念就可看出，所述方法因此可消除由于人工操作員讀取產(chǎn)生的困難，可解決由于樣本準(zhǔn)備的差異而造成的問題，到目前為止，這仍影響著分析的結(jié)果。
所述目的依靠一檢測方法得以實(shí)現(xiàn)，所述方法即使用一信息化系統(tǒng)，通過對間期細(xì)胞核作探針熒光原位雜交，以檢測染色體間的不平衡，所述檢測方法包括以下階段——對兩不同染色體作探針熒光原位雜交，——用不同熒光染料顯現(xiàn)各探針，——測量所有細(xì)胞核的分別對應(yīng)于所顯現(xiàn)各探針的信號(hào)強(qiáng)度，所述測量，一方面在對照細(xì)胞群體內(nèi)、另一方面在被檢測細(xì)胞群體內(nèi)實(shí)施，——計(jì)算分別對應(yīng)所述探針的所述信號(hào)之間的比，所述比率計(jì)算，一方面需計(jì)算所述對照細(xì)胞群體的比以提供一參考比，另一方面，需計(jì)算所述被檢測細(xì)胞群體的比，——比較對應(yīng)于被檢測細(xì)胞群體的信號(hào)之間的比與參考比，——處理所述比較結(jié)果，以檢測染色體間的不平衡。
本發(fā)明在于通過原位雜交提供一種技術(shù)，所述技術(shù)可利用與所研究的細(xì)胞對應(yīng)的一特殊序列的探針，辨識(shí)出AND(或ARN)序列。所述技術(shù)基于核苷酸的補(bǔ)充性上(A/T，A/U，G/C)，它可在染色體、細(xì)胞或組織培養(yǎng)的精確的物理化學(xué)條件下實(shí)施。原位雜交方法的結(jié)果即在探針與目標(biāo)之間形成雜交。原位雜交包括一變性階段，這個(gè)所謂探針與目標(biāo)的原位雜交階段，及一檢測雜交或探針階段，在熒光原位雜交范圍內(nèi)，探針以熒光團(tuán)標(biāo)記著，熒光標(biāo)記顯現(xiàn)出雜交。所述技術(shù)的最新發(fā)展可使甚至在準(zhǔn)備的同時(shí)看到分別由不同熒光團(tuán)顯現(xiàn)的多個(gè)探針。
有利地是，測量分別對應(yīng)于各探針的兩個(gè)或多個(gè)信號(hào)可通過圖象細(xì)胞計(jì)數(shù)法來實(shí)施。例如，兩探針可分別用一綠色熒光染料和一紅色熒光染料顯現(xiàn)。
因此，發(fā)展出一種圖象細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，所述方法既有通過FISH法分析間期細(xì)胞核的優(yōu)點(diǎn)，又具備快速、準(zhǔn)確、可量化及客觀的讀取信號(hào)的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗皇苡^察者的影響。
所述方法在于使用染色體的染色體染色或染色體區(qū)，所述染色體一方面具有不平衡的染色體，另一方面還有另一染色體(常染色體或性染色體)，選擇該后一染色體是為了使利用染色體染色所獲得的雜交信號(hào)與由不平衡的染色體染色所獲得的信號(hào)進(jìn)行比較。實(shí)際上，參考染色體和不平衡染色體在可能的測量范圍內(nèi)大小相近。因此，例如，所述方法在于，一方面使用染色體21、另一方面使用染色體20或22的染色圖象或染色區(qū)；染色體20或22可當(dāng)作參考染色體，因?yàn)橛萌旧w21的圖象所獲得的雜交信號(hào)可與用大小相近的染色體20或22的圖象所獲得的信號(hào)相比較。至于染色體13的非整倍性(例如三體性染色體13)，參考染色體最好選擇染色體14或15。至于染色體18的非整倍性(例如三體性染色體18)，參考染色體最好選擇染色體17、19或20。至于染色體X的非整倍性，例如，參考染色體最好選擇染色體6、7、8、9、10、11和12。至于染色體Y的非整倍性，參考染色體最好選擇染色體19、20、21和22。
根據(jù)一最佳實(shí)施方式，原位雜交中所實(shí)施的探針為染色體染色探針。所謂“染色體染色探針”或“染色體染色”即指一探針，所述探針的成分在雜交條件下，適于和一目標(biāo)雜交，所述目標(biāo)包括一有多染色體組的預(yù)定染色體。若在與探針的所述成分發(fā)生雜交的樣本中僅有一個(gè)所述染色體片段存在，則這一片段發(fā)生雜交并被識(shí)別出來。事實(shí)上，染色探針可與第二、第三等......混合，以便同時(shí)對預(yù)定的第二、第三......染色體作出標(biāo)記和進(jìn)行檢測。目前，市場上有各種不同的染色探針(GIBCO-BRL；ONCOR BOEHRINGER-MANHEIM；......)。它們的制作或通過IRS-PCR放大法(如可參見WO 00 22164)，或通過使用染色體的已退化起爆劑PCR的DOT-PCR法，或通過染色體分類隔離出的染色體片段，或使用流體血細(xì)胞計(jì)數(shù)法或染色體微解剖法。另外，本發(fā)明中所實(shí)施的探針為這類探針，所述探針覆蓋中心區(qū)(衛(wèi)星ANDα)，一染色體臂(例如聚合序列TTAGGn)的全部或部分，或一個(gè)或多個(gè)染色體的特殊重復(fù)AND序列的特殊性(典型衛(wèi)星AND 1、2及3)。
根據(jù)一最佳實(shí)施方式，染色體染色探針由一非同位素實(shí)體如發(fā)光劑、著色劑或其它來標(biāo)記。所述標(biāo)記可間接實(shí)施用酶、生物素、抗生物素蛋白、steptavidine、digoxygénine、半抗原或其它可用發(fā)光劑或著色劑來顯現(xiàn)的物質(zhì)。根據(jù)激勵(lì)能量源的發(fā)光劑可歸為幾類發(fā)光無線電波、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光激發(fā)光(包括熒光和磷光)?！盁晒狻币辉~通常指當(dāng)所述物質(zhì)被一能量源如紫外線激勵(lì)時(shí)，一種可發(fā)光物質(zhì)(如熒光團(tuán))的特性。最好用熒光來標(biāo)記探針。
在本發(fā)明中，發(fā)明者提出對動(dòng)物或人體間期細(xì)胞——最好在來自羊水或母體血液的胎兒細(xì)胞內(nèi)——進(jìn)行染色體間不平衡的檢測。例如，先天或后天(如癌癥)染色體不平衡檢測還可在循環(huán)血液細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、口腔細(xì)胞中進(jìn)行，更廣泛地說，可在方便可用的任何細(xì)胞類型中進(jìn)行，以實(shí)施診斷檢查。
在本發(fā)明中，發(fā)明者提出檢測染色體間的不平衡，而不是檢測被分析染色體的復(fù)制數(shù)目——染色體21、22(例如)的探針原位雜交后，各探針可用不同熒光團(tuán)顯現(xiàn)(綠和紅)；——利用圖象血細(xì)胞計(jì)數(shù)，在系統(tǒng)識(shí)別后，可在對照細(xì)胞群體及待檢測細(xì)胞群體內(nèi)，測量最少上百個(gè)細(xì)胞核(例如500)的各探針的強(qiáng)度；——計(jì)算各探針的兩強(qiáng)度信號(hào)之間的比，將其與正常的基準(zhǔn)值相比較，這樣可確定至少有一個(gè)多余數(shù)字的染色體存在(例如染色體21)。這樣，染色體間的不平衡則大于1，若為三體性染色體，則等于1.5。計(jì)算各探針的兩強(qiáng)度信號(hào)之間的比，還可通過與正?；鶞?zhǔn)值相比，確定是否存在單染色體。若有，則染色體間的不平衡為0.5。
根據(jù)本發(fā)明的檢測方法與現(xiàn)行的檢測方法相比，其優(yōu)點(diǎn)在于——由于采用FISH技術(shù)，根據(jù)本發(fā)明的檢測方法可避免與細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的所有缺陷，得出結(jié)果也更快(幾天)，且可采用的細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)學(xué)上數(shù)量相當(dāng)大，甚至對貧細(xì)胞樣本也沒有限制(細(xì)胞數(shù)約在500與約上千之間)。
——采用所述方法，不再存在所有與人工操作員讀取和解釋相關(guān)的困難，因?yàn)槭怯尚畔⒒到y(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行分析。尤其地，間期細(xì)胞核的識(shí)別——在所述核中，與各探針雜交相關(guān)的所有熒光性強(qiáng)度測量——使得分析比采用目前所用的熒光信號(hào)的識(shí)別及計(jì)數(shù)(計(jì)算點(diǎn)或《spot counting》Tkachuk et al，1991)的方法簡單可靠得多。
另外，即使使用小尺寸的探針，也可給出用于計(jì)數(shù)的更高分辨率的信號(hào)，所述信號(hào)因而更容易與背景噪音雜交在一起，因此信號(hào)與噪音之比很小，尤其因?yàn)檠蛩邪械鞍踪|(zhì)膜，所述膜是主要的背景噪音源。發(fā)明者使用染色體染色的方法，由于所獲得信號(hào)的尺寸，可確保信號(hào)與噪音之比大于用小尺寸信號(hào)計(jì)數(shù)法的信噪比。
由于羊水采樣的特征，背景噪音的估測及消減可在困難條件下檢測出三體性染色體細(xì)胞。
另外，與樣本準(zhǔn)備相關(guān)的差異問題不會(huì)再影響到分析。實(shí)驗(yàn)條件的可能變化不會(huì)改變熒光性之比，因?yàn)閮尚盘?hào)會(huì)同樣受到影響。利用最佳的統(tǒng)計(jì)準(zhǔn)確度，能更可靠地檢測細(xì)胞群體內(nèi)兩個(gè)群體的存在，因?yàn)槟芸焖俜治龈鄶?shù)量的細(xì)胞核。這樣可識(shí)別感染了母細(xì)胞的病例或嵌合病例(即只有部分胎兒細(xì)胞出現(xiàn)異常)。
最后，無論所改變的染色體性質(zhì)如何，都可更可靠地檢測特殊病例，包括細(xì)胞等臂染色體(des iso chromosomes)21或易位t(21；21)(Stoll et al，1998)。用染色體染色顯現(xiàn)出一斑點(diǎn)，所述斑點(diǎn)的大小及強(qiáng)度都應(yīng)增加一倍；考慮到信號(hào)的大小，用適合的攝像頭進(jìn)行測量仍然更準(zhǔn)確。所述方法不僅可應(yīng)用在涉及染色體13、18、性染色體的其它病理學(xué)中，還可應(yīng)用在其它病理學(xué)中，其中出現(xiàn)染色體數(shù)目不平衡(單染色體、三體性染色體、四體性......、多體性)。需注意，熒光探針的原位雜交FISH技術(shù)已在已公布專利申請F(tuán)R2783253中描述的一種不同方法中實(shí)施過，所述專利申請是關(guān)于更準(zhǔn)確地檢測間期細(xì)胞核內(nèi)的染色體內(nèi)的不平衡，以檢測整個(gè)或部分染色體臂的遺傳物質(zhì)的遺失或增加(刪除、插入、擴(kuò)大、復(fù)制......)。在所述檢測方法中，染色體的長臂及短臂的兩各不同的特殊熒光團(tuán)標(biāo)注的兩探針，在所述同一染色體上發(fā)生雜交。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的一特別優(yōu)化實(shí)施例中，測量階段包括一獲取步驟，即在一確定的測量平面內(nèi)，獲得一定數(shù)量的區(qū)域，以便對于確定圖象的放大獲取至少預(yù)定數(shù)目的可分析細(xì)胞核(成百上千)。
另外，獲取階段還包括利用一窄通頻帶的連續(xù)光學(xué)過濾，捕獲對于各觀察區(qū)分別對應(yīng)于與眾多熒光染料波長相對應(yīng)的眾多平面的數(shù)個(gè)圖象(例如，藍(lán)色熒光的4.6-Diamidino-2-phénylindole(DAPI)，綠色熒光的熒光素isothiocyanate(FITC)，紅色熒光的Texas RedTM)，存儲(chǔ)所述獲得的圖象，并把所述獲得及存儲(chǔ)的圖象重疊在一起。
根據(jù)本發(fā)明的另一特征，它提出一種系統(tǒng)，以通過間期細(xì)胞核的熒光探針原位雜交，檢測染色體內(nèi)的不平衡，所述系統(tǒng)可用于實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法，它包括——用于對兩不同染色體實(shí)施熒光探針原位雜交的裝置，——用不同熒光染料顯現(xiàn)各探針的裝置，——測量分別對應(yīng)于如此顯現(xiàn)的各探針的強(qiáng)度信號(hào)的一裝置，所述測量一方面在對照細(xì)胞群體中、另一方面在所述待檢測細(xì)胞群體內(nèi)的一組細(xì)胞核進(jìn)行，——計(jì)算分別對應(yīng)于所述探針的所述信號(hào)之間的比的裝置，一方面需計(jì)算關(guān)于所述對照細(xì)胞群體的以提供一基準(zhǔn)比，另一方面需計(jì)算關(guān)于所述被檢測細(xì)胞群體的，——比較對應(yīng)于被檢測細(xì)胞群體的信號(hào)之間的比與基準(zhǔn)比的裝置，及——處理所述比較結(jié)果以檢測染色體間不平衡的裝置。
有利地是，圖象血細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置包括——應(yīng)用于細(xì)胞群體的多熒光顯微鏡裝置，所述細(xì)胞群體預(yù)先進(jìn)行了不同的熒光探針原位雜交，
——用于獲取由熒光顯微鏡裝置產(chǎn)生的所有圖象的裝置，——用于存儲(chǔ)所述所獲圖象的裝置，及——分析所述所獲取并存儲(chǔ)的圖象的裝置。
熒光顯微鏡裝置及圖象獲取裝置協(xié)作，以在一定測量平面內(nèi)，獲得一定數(shù)量的區(qū)域，以對于放大某一圖象可獲得至少預(yù)定數(shù)量的可分析細(xì)胞核。
在根據(jù)本發(fā)明的一檢測系統(tǒng)的最佳實(shí)施例中，所述檢測系統(tǒng)還包括一過濾裝置，所述過濾裝置與熒光顯微鏡裝置及獲取裝置協(xié)作，可獲得多個(gè)圖象，所述圖象分別對應(yīng)各區(qū)域里眾多平面，所述平面又和眾多熒光染料的波長相對應(yīng)(例DAPI，F(xiàn)ITC(綠色)，Texas Red(紅色))。
此外，有利地是，熒光顯微鏡裝置及獲取裝置可協(xié)作，以在同一研究平面內(nèi)，獲得對應(yīng)于對照細(xì)胞群體的圖象及對應(yīng)被檢測細(xì)胞群體的圖象。


本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)可在后文中參照附圖，以非限制性方式詳細(xì)描述一實(shí)施例中體現(xiàn)出來，附圖中——圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的檢測染色體不平衡的方法的主要步驟；——圖2簡略示出了根據(jù)本發(fā)明的一檢測系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)；及——圖3中的代表性方框圖示出了對由根據(jù)本發(fā)明的檢測系統(tǒng)所獲得的圖象實(shí)施的檢測及量化操作。
具體實(shí)施例方式
尤其如圖1所示，在實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的檢測方法的一實(shí)施例中，首先描述檢測及量化階段之前的初始準(zhǔn)備及雜交階段。
樣本準(zhǔn)備先準(zhǔn)備好目前來自羊水的待檢測樣本，如可在平板上作傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳分析，即指培養(yǎng)或直接分析采樣。但為提高對平板的自動(dòng)分析，推薦使用井式離心機(jī)——所述離心機(jī)可使平板精確展開(如細(xì)胞旋轉(zhuǎn)(cytospinTM))，以平坦地展開細(xì)胞。這可減少自動(dòng)讀取過程中在“焦點(diǎn)”外的細(xì)胞數(shù)量。有限的展開還可縮短圖象獲取時(shí)間。
培養(yǎng)的羊水樣本按傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷程式處理。要直接分析羊水，可在作完胃蛋白酶處理后，再用分解細(xì)胞團(tuán)的介質(zhì)處理。
展開還可利用一井式離心機(jī)實(shí)施。對照平板可根據(jù)相同程式，用正常羊水或正常纖維原細(xì)胞準(zhǔn)備。另外，還可分析血液樣本。若采樣來自母體外圍血液時(shí)，可預(yù)先作胎兒細(xì)胞檢測。
探針準(zhǔn)備染色體染色的原位雜交可按通常程式實(shí)施(Truong et al，1998)。先把平板在2SSC鹽水溶液中浸泡15分鐘，然后用PBS緩沖液沖洗，再放在0.01N(4μg/ml，SIGMA)HCI中10分鐘，作胃蛋白酶處理。用PBS溶液中止溶解5分鐘，再把平板放在Carnoy(乙醇/乙酸3∶1(v/v))中浸泡10分鐘，最后拿出試條晾干。
探針在10分鐘內(nèi)，在70攝氏度時(shí)，在PH值為7的70％的甲酰胺(FLUKA)/2SSC溶液中變性。目標(biāo)AND，即平板上的細(xì)胞核在3分鐘內(nèi)，在相同條件下改變性質(zhì)。再用2SSC溶液沖洗平板，用一系列酒精溶液脫水。探針雜交會(huì)在黑暗中37攝氏度時(shí)發(fā)生。雜交后的洗滌即放在72攝氏度的緩沖液2SSC中5分鐘。
若使用地高辛(digoxigénine)或生物素標(biāo)注的探針，探針的檢測是通過使用與不同熒光染料(綠及紅)搭配的抗體來實(shí)施。
若使用直接用熒光染料標(biāo)注的探針，平板放在DAPI(1μg/ml，分子探測器)中會(huì)立即染上顏色，若在p-phenyl-diamine(二元胺苯基)中則會(huì)顯現(xiàn)出匹配。
探針熒光信號(hào)的檢測及量化方法如圖2所示，在根據(jù)本發(fā)明的染色體間不平衡檢測系統(tǒng)中所實(shí)施的圖象細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置1包括有一熒光顯微鏡2的獲取部分10、一黑白冷卻(refroidie noir et blanc)攝像機(jī)CCD5——所述攝像機(jī)可允許40微秒到10秒的集成時(shí)間、可自動(dòng)改變由熒光試條4——所述熒光探針安放在燈與顯微鏡3之間，并可能在顯微鏡3、攝像機(jī)CCD5及X、Y型機(jī)動(dòng)樣本平板擱板13之間，所述平板擱板由裝置1自動(dòng)控制以便系統(tǒng)采樣——激勵(lì)并發(fā)射的光線光譜的一裝置(機(jī)動(dòng)過濾器支承輪或機(jī)動(dòng)過濾器支承架)、及一處理和控制部分14，所述部分由一計(jì)算機(jī)構(gòu)成，所述計(jì)算機(jī)尤其包括一圖象獲取卡。
熒光性測量分為兩步1)在所研究平板上確定一分析區(qū)域后，獲取并存儲(chǔ)圖象。
2)分析圖象，并利用分析圖象得出的數(shù)據(jù)。
第一步驟在于，在一確定表面內(nèi)，獲得多個(gè)給定數(shù)量的區(qū)域，利用40x放大物鏡，以得到500到1000個(gè)可分析的細(xì)胞核。利用選擇性干擾光學(xué)過濾器，用CCD攝像機(jī)獲取到圖象。把各區(qū)域中對應(yīng)不同熒光染料(藍(lán)、綠及紅)波長的三個(gè)圖象平面存儲(chǔ)并疊放在一起(如圖2所示)。確定基準(zhǔn)點(diǎn)，以避免被觀察區(qū)域處在焦點(diǎn)之外。因而可在相同條件下(尤其是相同的集成時(shí)間、相同的攝像機(jī)拍攝內(nèi)容)，分析被檢測的平板11及對照平板12。
包括細(xì)胞核檢測及信號(hào)量化的第二步驟中，如圖3所示，需進(jìn)行以下各階段1)分割各圖象，檢測待分析的細(xì)胞核，所述階段包括分離開細(xì)胞核團(tuán)，并根據(jù)尺寸及形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)排除假象(artifact)，這可在負(fù)染色平面內(nèi)設(shè)立起一層細(xì)胞核護(hù)罩(masque)，例如在DAPI中，在其中測量熒光性強(qiáng)度。
2)量化各細(xì)胞核內(nèi)的各熒光染料(紅及綠)的強(qiáng)度，所述強(qiáng)度對應(yīng)由各探針?biāo)l(fā)射的熒光，完全不必假設(shè)信號(hào)的形狀及位置。
3)量化各區(qū)域內(nèi)在細(xì)胞核外各顏色的背景級；確定最常見的噪聲級為參考值。
4)減去各探針核內(nèi)的背景級(參考值)。
5)計(jì)算各核根據(jù)基準(zhǔn)值校正過的綠/紅強(qiáng)度之比。
6)用圖形表示數(shù)據(jù)，例如柱形圖或“散點(diǎn)圖”(兩色彩強(qiáng)度值的二維式圖形)。
7)自動(dòng)確定通過簇分析——即分析雪點(diǎn)，確定這些雪點(diǎn)的重力中心——而選擇的一細(xì)胞核群體的熒光性之比的均方根偏差及平均值。
在相同條件下，用相同方式計(jì)算各樣本的熒光性之比。因此，若標(biāo)準(zhǔn)化的病人樣本的熒光性與對照樣本的熒光性之比為1.5，則可檢測出三體性染色體21。
當(dāng)然，本發(fā)明并不局限于上面所描述的實(shí)施例，可參照所述實(shí)施例延伸出許多構(gòu)型，但這并未超出本發(fā)明的范圍。因此，根據(jù)本發(fā)明的檢測方法可適用于其它染色體X、Y、13及18中，或其它不常見的反常病例中。
檢測系統(tǒng)的特征在于——圖象細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置還包括用于檢測細(xì)胞核及量化有眾多波長的熒光性信號(hào)的若干裝置；——裝配檢測及量化裝置是為了通過形狀、體積、熒光密度等多重標(biāo)準(zhǔn)——所述標(biāo)準(zhǔn)一般稱為形態(tài)、密度計(jì)量學(xué)標(biāo)準(zhǔn)——的分析，以分割細(xì)胞核，使得為測量平面的所有區(qū)域設(shè)立起一護(hù)罩。
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1.通過對間期細(xì)胞核作探針熒光原位雜交檢測染色體間的不平衡的方法，所述檢測方法包括以下階段——對兩個(gè)不同染色體作探針熒光原位雜交，——用不同熒光染料顯現(xiàn)各探針，——測量一組細(xì)胞核的分別對應(yīng)于所顯現(xiàn)的每一探針的強(qiáng)度信號(hào)，所述測量一方面在對照細(xì)胞群體內(nèi)進(jìn)行，另一方面在被檢測的細(xì)胞群體內(nèi)進(jìn)行，——計(jì)算分別對應(yīng)于所述探針的所述信號(hào)之間的比，所述計(jì)算一方面在所述對照細(xì)胞群體中進(jìn)行以提供一參考比，另一方面在所述被檢測的細(xì)胞群體中進(jìn)行，——比較對應(yīng)于被檢測細(xì)胞群體的信號(hào)之間的比與參考比，——處理所述比較結(jié)果，用于檢測染色體間的不平衡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，分別對應(yīng)于各探針的兩個(gè)信號(hào)的測量由自動(dòng)圖象細(xì)胞計(jì)數(shù)方法進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，兩探針分別用兩種不同的熒光染料來顯現(xiàn)(例如，一綠色熒光染料、一紅色熒光染料)。
4.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，各探針的強(qiáng)度信號(hào)在可由操作員確定的數(shù)目的核，如約幾百個(gè)，上測量。
5.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，測量階段包括第一獲取階段，在一確定的測量平面內(nèi)獲得一定數(shù)量的區(qū)域，以便對于給定圖象放大率獲取至少預(yù)定數(shù)目的可分析細(xì)胞核。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，獲取階段還包括利用連續(xù)光學(xué)過濾，對于各區(qū)域捕獲分別與對應(yīng)于多個(gè)熒光染料波長的多個(gè)平面相對應(yīng)的多個(gè)圖象(例如，負(fù)染色區(qū)為藍(lán)色，探針標(biāo)記為綠色、紅色)，存儲(chǔ)所述獲得的圖象，并將所述獲得及存儲(chǔ)的圖象重疊在一起。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，對照細(xì)胞群體和被檢測細(xì)胞群體的獲取階段在大致相同的獲取條件下實(shí)施。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，分別對應(yīng)于對照細(xì)胞群體及被檢測細(xì)胞群體的獲取在同一測量平面內(nèi)的兩個(gè)區(qū)域中實(shí)施。
9.根據(jù)權(quán)利要求5至8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，測量階段還包括檢測細(xì)胞核及量化熒光強(qiáng)度信號(hào)的第二步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，檢測及量化步驟包括對一個(gè)測量平面內(nèi)各區(qū)域中的細(xì)胞核進(jìn)行分割。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，細(xì)胞核分割包括分離開細(xì)胞核團(tuán)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其特征在于，細(xì)胞核分割包括根據(jù)尺寸及形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)排除假象。
13.根據(jù)權(quán)利要求9至12中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，檢測及量化步驟包括對于對應(yīng)于各探針的各種顏色量化結(jié)合到各細(xì)胞核內(nèi)的各熒光信號(hào)強(qiáng)度。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，檢測及量化步驟還包括對各顏色計(jì)算各區(qū)域內(nèi)在細(xì)胞核外的背景級。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，檢測及量化步驟還包括確定最常見的背景級作為噪聲參考值，并利用所述參考值校正各細(xì)胞核內(nèi)的已量化的熒光信號(hào)強(qiáng)度。
16.通過對間期細(xì)胞核作熒光探針原位雜交檢測染色體間不平衡的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)實(shí)施根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，該系統(tǒng)包括——用于對兩個(gè)不同染色體實(shí)施熒光探針原位雜交的裝置，——用不同熒光染料顯現(xiàn)各探針的裝置，——測量一組細(xì)胞核的分別對應(yīng)于所顯現(xiàn)的每一探針的強(qiáng)度信號(hào)的裝置，所述測量一方面在對照細(xì)胞群體中、另一方面在被檢測細(xì)胞群體中進(jìn)行，——計(jì)算分別對應(yīng)于所述探針的所述信號(hào)之間比的裝置，所述計(jì)算一方面在所述對照細(xì)胞群體上進(jìn)行以提供一參考比，另一方面在所述被檢測細(xì)胞群體上進(jìn)行，——比較對應(yīng)于被檢測細(xì)胞群體的信號(hào)之間的比與參考比的裝置，及——處理所述比較結(jié)果以檢測染色體間不平衡的裝置，如嵌合的情況。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的檢測系統(tǒng)，其特征在于，它包括一圖象細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置作為所述測量裝置。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述圖象細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置包括——用于細(xì)胞群體的熒光顯微鏡裝置，所述細(xì)胞群體預(yù)先被進(jìn)行了探針熒光原位雜交，——用于獲取由熒光顯微鏡裝置產(chǎn)生的圖象的裝置，——用于存儲(chǔ)所獲取的圖象的裝置，及——分析所述獲取的并存儲(chǔ)的圖象的裝置。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述熒光顯微鏡裝置及圖象獲取裝置協(xié)作，以在一確定的測量平面內(nèi)，獲得一定數(shù)量的區(qū)域，以對于給定圖象放大率獲得至少預(yù)定數(shù)量的可分析細(xì)胞核。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的檢測系統(tǒng)，其特征在于，它還包括過濾裝置，所述過濾裝置與所述熒光顯微鏡裝置及獲取裝置協(xié)作，用于獲得多個(gè)圖象，對于各區(qū)域，所述圖象分別對應(yīng)于多個(gè)平面，所述平面和多個(gè)熒光染料的波長相對應(yīng)(例如負(fù)染色區(qū)為DAPI(藍(lán)色)，探針為FITC(綠色)，Texas RedTM(紅色))。
21.根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的檢測系統(tǒng)，其特征在于，熒光顯微鏡裝置及獲取裝置協(xié)作，用于在同一研究平面內(nèi)獲得對應(yīng)于對照細(xì)胞群體的圖象和對應(yīng)于被檢測細(xì)胞群體的圖象。
22.根據(jù)權(quán)利要求17至21中任一項(xiàng)所述的檢測系統(tǒng)，其特征在于，圖象細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置還包括用于檢測細(xì)胞核及量化多個(gè)波長的熒光信號(hào)的多個(gè)裝置。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述檢測及量化裝置被配置為用于根據(jù)形態(tài)學(xué)測量和密度測量分析對細(xì)胞核進(jìn)行分割，以便為測量平面內(nèi)的一組區(qū)域建立起一護(hù)罩。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述檢測及量化裝置被配置為用于分割細(xì)胞核團(tuán)。
25.根據(jù)權(quán)利要求22至24中任一項(xiàng)所述的檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述檢測及量化裝置被配置為用于根據(jù)尺寸及形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)排除假象。
26.根據(jù)權(quán)利要求22至25中任一項(xiàng)所述的檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述檢測及量化裝置被配置為用于對于各顏色量化結(jié)合到各細(xì)胞核內(nèi)的熒光信號(hào)強(qiáng)度。
27.根據(jù)權(quán)利要求22至26中任一項(xiàng)所述的檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述檢測及量化裝置被配置為用于計(jì)算細(xì)胞核外各顏色的背景級。
28.根據(jù)權(quán)利要求22至27中任一項(xiàng)所述的檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述檢測及量化裝置被配置為用于確定最常見的背景級作為背景參考值，并從各核內(nèi)的已量化的強(qiáng)度中減去上述參考值。
29.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的染色體間檢測方法在在母體血液中流動(dòng)的胎兒細(xì)胞核上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過間期細(xì)胞核的熒光探針原位雜交，檢測染色體間不平衡的系統(tǒng)，所述檢測包括以下階段對兩不同染色體作探針熒光探針原位雜交；由不同熒光染料顯現(xiàn)各探針；測量細(xì)胞核組的分別對應(yīng)于所顯現(xiàn)探針的強(qiáng)度信號(hào)，一方面在對照細(xì)胞群體內(nèi)測量，另一方面在被檢測細(xì)胞群體內(nèi)測量；計(jì)算分別對應(yīng)于所述探針的所述信號(hào)之間的比，一方面需計(jì)算所述對照細(xì)胞群體的比，以提供一參考比，另一方面需計(jì)算所述被檢測細(xì)胞群體的比；比較對應(yīng)于被檢測細(xì)胞群體的信號(hào)之間的比與參考比；處理所述比較結(jié)果，以檢測染色體間的不平衡。
文檔編號(hào)G01N21/64GK1558955SQ02817247
公開日2004年12月29日 申請日期2002年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月3日
發(fā)明者弗朗索瓦絲·蘇薩利納, 巴納德·馬爾富瓦, 巴納德·迪特里約, 瑪麗－諾埃勒·吉里, 庫翁·特呂奧恩, 迪特里約, 馬爾富瓦, 弗朗索瓦絲 蘇薩利納, 特呂奧恩, 蛋＠鍘ぜ 申請人:伊姆斯塔圖像和模型化策略，分析和實(shí)現(xiàn), 國家科研中心, 居里研究所, 原子能委員會(huì), 伊姆斯塔圖像和模型化策略，分析和