基于激光誘導熒光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方法
【專利摘要】一種應用范圍廣泛、分析快速簡便以及利于環(huán)保的基于激光誘導熒光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方法。技術方案是：其特征在于包括下列步驟：（1）通過泵輸送被測水樣溶液；（2）水樣溶液流經(jīng)過濾柱；（3）流經(jīng)過濾柱后的水樣進入熒光池；（4）利用高頻的脈沖激發(fā)光源-深紫外激光二極管泵浦固體激光器產(chǎn)生連續(xù)波段的光源，照射熒光池，利用在熒光池探測一側的光譜分光器件-光柵進行空間分光，色散后形成λ1-λ2的光譜帶；（5）位于探測窗口處的CCD光電探測器同時采集λ1-λ2的光譜數(shù)據(jù)，通過內部轉變和時間序列積分得到波長-光強二維光譜；（6）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)經(jīng)過海洋細菌熒光識別模式計算分析海洋細菌豐度和多樣性。
【專利說明】基于激光誘導熒光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方 法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于海洋細菌原位豐度和多樣性檢測方法領域，尤其是一種應用范圍廣 泛、分析快速簡便以及利于環(huán)保的基于激光誘導熒光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測 方法。本方法利用激光誘導熒光過程產(chǎn)生的熒光光譜與各種海洋細菌本身具有的"特征光 譜"的光學特性一即各種海洋細菌在激光誘導熒光過程中產(chǎn)生的熒光光譜在不同波段上進 行比對，結合海洋細菌熒光識別模式，分析海洋細菌豐度和多樣性。

【背景技術】
[0002] 海洋細菌是海洋生態(tài)系統(tǒng)的的重要組成部分。對海洋環(huán)境中細菌的研究不僅是 目前生命科學前沿的領域之一，也是對海洋生態(tài)系統(tǒng)結構研究的重要組成部分。海洋細菌 參與降解各種海洋污染物和毒物的過程，有助于保持海洋生態(tài)系的平衡和促進海洋自凈能 力；海洋細菌是產(chǎn)生新抗菌素、氨基酸、維生素和其他生理活性物質的重要生產(chǎn)者；細菌參 與海洋的沉積成巖作用，如參與硫礦和深海錳結核的形成等；在海洋成油、成氣的過程中， 細菌起著重要作用；海水具有殺菌效果，是由于海洋細菌的拮抗和溶菌作用，致使陸源致 病菌迅速死亡；海洋細菌可直接作為海洋經(jīng)濟動物的餌料；細菌參與對各種海洋物質的腐 蝕、變性、污穢和破壞過程；某些海洋細菌是人體或海洋生物的致病菌；在特定條件下，海 洋細菌代謝產(chǎn)物的積累會毒化養(yǎng)殖環(huán)境，如氨和硫化氫的積累危害生物養(yǎng)殖；也可以利用 細菌的代謝活動來改善被毒化的養(yǎng)殖環(huán)境，如氨的氧化等，因此對海洋細菌豐度和多樣性 檢測方法研究，對于進一步了解海洋細菌的生態(tài)結構以及在海洋碳循環(huán)中的作用具有相當 重要的意義。
[0003] 在研究方法上，目前主要采用海洋現(xiàn)場采樣，實驗室分離培養(yǎng)、基因測序的方法以 及熒光顯微鏡技術來觀察和研究海洋細菌的多樣性。熒光檢測技術由于其具有較高的靈敏 度在細菌研究中一直處于相當重要的位置。目前常用的熒光檢測技術在細菌中的應用主要 有熒光顯微技術、流式細胞熒光計數(shù)法、ATP熒光快速檢測法以及熒光蛋白標記等等。由于 這些技術存在需要對樣品進行采集和制片，進樣要求嚴格，需要制作熒光標記物等缺陷，很 難應用在海洋現(xiàn)場對細菌進行檢測。同時熒光顯微鏡技術和平板培養(yǎng)法研究證明，在大洋 環(huán)境中，只有少量的海洋細菌能通過傳統(tǒng)的固定平板技術形成菌落，一些細菌處于活的非 可培養(yǎng)狀態(tài)，應用常規(guī)的分離培養(yǎng)方法無法全面反映海洋細菌資源狀態(tài)以及生態(tài)功能，很 難全面了解細菌的豐度和多樣性及其生態(tài)學意義和在海洋碳循環(huán)中的作用。
[0004] 另外方法采用現(xiàn)場取樣后到實驗室分析的模式，即不能實現(xiàn)現(xiàn)場、實時測量的方 式，樣品運輸過程以及處理過程易引入其他干擾物質，影響分析的準確性。海洋細菌豐度和 多樣性檢測涉及一定的環(huán)境條件以及復雜的過程，因此這個過程不可能保證不會出現(xiàn)二次 受污的可能性，最重要的是由于海洋細菌的難培養(yǎng)性以及對高氧環(huán)境的不適應性，加上實 驗室環(huán)境與海洋環(huán)境之間差別較大，導致測量結果與實際情況之間有很大的差別，其結果 的準確性和可靠性受到質疑。
[0005] 上述方法不同程度存在著以下缺陷：1、必須在實驗室中完成，應用不能現(xiàn)場實時， 范圍受到限制。2、分析持續(xù)時間長，至少需要幾天時間。3、分析過程繁雜，條件苛刻、能耗 大，對實驗人員的技術水平要求高。
[0006] 由于海洋環(huán)境的特殊性以及海洋細菌的不可培養(yǎng)性，采取現(xiàn)場檢測可以更為真實 地反映海洋細菌的狀況。而熒光測量具有快速、便捷、連續(xù)測量、不需要培養(yǎng)等優(yōu)勢，可以更 好地對細菌進行現(xiàn)場測量。
[0007] 近年來，激光誘導突光（laser induced fluorescence,LIF)檢測法作為一種新型 的高靈敏度檢測方式，近年來得到了快速發(fā)展和廣泛的應用，是迄今為止靈敏度最高的光 學檢測方法，激光誘導熒光檢測技術的靈敏度比普通熒光高1-3個數(shù)量級，其對熒光物質 的檢測限可以達到年nmo 1數(shù)量級，在適當?shù)臈l件下甚至可以實現(xiàn)單分子檢測，由于其具有 靈敏度高、快速、便捷、連續(xù)測量、不需要培養(yǎng)等優(yōu)勢，因此，采用原位激光誘導熒光技術可 以較好地對海洋細菌的豐度和多樣性進行檢測，可以作為海洋細菌豐度和多樣性原位檢測 的一種重要方法。


【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明提供了一種應用范圍廣泛、分析快速簡便以及利于環(huán)保的基于激光誘導熒 光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方法。該方法將激光誘導熒光技術與細菌體內熒光 物質的不同種類、含量以及比例有機地結合起來，建立基于激光誘導熒光的海洋細菌豐度 和多樣性檢測模式，為現(xiàn)場、快速監(jiān)測海洋細菌豐度和多樣性提供了手段。
[0009] 為了達到解決上述技術問題的目的，本發(fā)明采用如下技術方案： 一種基于激光誘導熒光的海洋細菌原位豐度和多樣性檢測方法，其特征在于本發(fā)明的 方法步驟如下： (1) 通過泵輸送被測水樣溶液； (2) 水樣溶液在泵的作用下，流經(jīng)過濾柱，過濾柱內部填充氧化鎂負載鈷鐵金屬磁性納 米材料，并且具有控溫裝置，由于水體中含有粒徑較大浮游植物，因此通過過濾柱可以過濾 掉粒徑大的浮游植物； (3) 流經(jīng)過濾柱后的水樣，進入熒光池，熒光池的窗口材料，靠近激發(fā)光源側的采用納 米金剛石材料，主要消除水體拉曼散射，靠近探測窗口一側的采用貼有薄膜材料-石墨烯 的硅玻璃，主要消除水體的熒光散射； (4) 利用高頻的脈沖激發(fā)光源-深紫外激光二極管泵浦固體激光器產(chǎn)生連續(xù)波段的光 源，照射熒光池，利用在熒光池探測一側的光譜分光器件-光柵進行空間分光，色散后形成 入「入 2的光譜帶； (5) 位于探測窗口處的C⑶光電探測器同時采集的光譜數(shù)據(jù)，通過內部轉變和 時間序列積分得到波長-光強二維光譜； (6) 首先，針對水體中微微型藻類可能帶來的檢測誤差，利用高頻的脈沖激發(fā)光源，激 發(fā)采用400nm，發(fā)射采用685nm，CCD光電探測器采集光譜數(shù)據(jù)，作為水體藻類影響因子； (7) 其次，針對水體中CD0M的影響，根據(jù)CD0M有著自己的特征熒光(激發(fā)340/發(fā)射 430)，同樣利用利用高頻的脈沖激發(fā)光源，激發(fā)采用340nm，發(fā)射采用430nm，(XD光電探測 器采集光譜數(shù)據(jù)，作為水體CD0M影響因子； (8) 最后，利用高頻的脈沖激發(fā)光源-深紫外激光二極管泵浦固體激光器產(chǎn)生連續(xù) 波段的光源275-450nm，照射熒光池，利用在熒光池探測一側的光譜分光器件-光柵進行 空間分光，色散后收集280-535nm的光譜帶，位于探測窗口處的CCD光電探測器同時采集 280-535nm的光譜數(shù)據(jù)，通過內部轉變和時間序列積分得到波長-光強二維光譜； (9) 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中采用建立的海洋細菌多樣性熒光識別模式，經(jīng)過海洋細菌熒光識 別模式計算分析海洋細菌豐度和多樣性。
[0010] 在本發(fā)明中，還具有以下技術特征：水樣流量為5. 0-10. Oml/min。
[0011] 在本發(fā)明中，還具有以下技術特征：過濾柱內部填充氧化鎂負載鈷鐵金屬磁性納 米材料，控溫裝置的溫度范圍10-15 °C。
[0012] 在本發(fā)明中，還具有以下技術特征：利用高頻的脈沖激發(fā)光源-深紫外激光二 極管泵浦固體激光器，具有體積小、無需水冷、波動噪音小、供電簡單等特征，高頻范圍 100-150KHZ。另外采用連續(xù)激發(fā)式脈沖激發(fā)光源，在一定程度上提高了測量精度，同時采用 深紫外激發(fā)可以激發(fā)細菌體內典型的熒光物質，不需要進行染色等步驟。
[0013] 在本發(fā)明中，還具有以下技術特征：所述的建立的海洋細菌多樣性熒光識別模式 是基于細菌體內含有一些可以激發(fā)產(chǎn)生熒光的成分，采用激光誘導熒光方法檢測海洋細菌 的過程當中，都會發(fā)出"特征光譜"，這些成分的不同類別、含量或比例的不同，導致熒光峰 出現(xiàn)較大的差別，通過對熒光信號的采集和分析，采用主成分熒光矩陣的方法對細菌多樣 性進行鑒別，同時考慮到環(huán)境因素如藻類、CDOM、以及無機顆粒對熒光有可能產(chǎn)生影響，采 用主成分熒光光譜分析方法，建立海洋細菌多樣性熒光識別模式。
[0014] 在本發(fā)明中，還具有以下技術特征：泵為蠕動泵，管路采用聚四氟乙烯材料制成。
[0015] 在本發(fā)明中，還具有以下技術特征：CCD探測元件采用美國海洋光學背照式二維 面陣CCD光譜儀。
[0016] 在本發(fā)明中，還具有以下技術特征：微型計算機數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)中采用海洋細 菌多樣性熒光識別模式，該模型針對藻類以及CDOM等影響因子具有很好的修正作用，可以 消除這些影響因子對計算分析海洋細菌豐度和多樣性的影響。
[0017] 本發(fā)明的效果是： 本發(fā)明采用激光誘導熒光方法檢測海洋細菌豐度和多樣性，是目前海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān) 測系統(tǒng)中的重要組成部分，方法利用海洋細菌體內熒光物質都會發(fā)出"特征光譜"的現(xiàn)象， 通過激光誘導熒光技術與細菌體內熒光物質的不同種類、含量以及比例有機地結合起來， 通過分光系統(tǒng)得到以波長為橫坐標和以光譜序列為縱坐標的平面色散圖，導入CCD探測元 件，光信號經(jīng)光電探測處理轉換為電信號輸出，輸出電信號經(jīng)微弱信號放大電路進行轉換， 放大到一定電壓幅度送數(shù)據(jù)處理部分的A/D轉換通道進行量化，時間序列積分處理后得到 全譜。
[0018] 通過時間序列積分處理后得到的全譜，根據(jù)各種細菌體內熒光物質的"特征光 譜"，經(jīng)經(jīng)海洋細菌多樣性熒光識別模式軟件對全譜進行分析得到海洋細菌豐度和多樣性。
[0019] 本發(fā)明利用激光誘導熒光方法檢測海洋細菌豐度和多樣性，方法能夠準確、連續(xù)、 快速的分析測試海洋細菌豐度和多樣性，可在惡劣的環(huán)境中長期可靠工作。
[0020] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步的說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1是本發(fā)明方法工作原理流程圖； 圖2是本發(fā)明方法所采用的檢測裝置結構示意圖； 圖3是海洋細菌多樣性的激光誘導熒光識別模式圖。
[0022] 圖中標號說明：1.水樣；2.水樣泵；3.脈沖激發(fā)光源；4.納米金剛石；5.熒光 池；6.石墨烯的硅玻璃；7. (XD光電探測器；8.控制部分；9.數(shù)據(jù)處理部分；10.廢液收 集；11.過濾柱；12.譜分光器件。

【具體實施方式】
[0023] 參見圖1、圖2， 本發(fā)明的方法步驟如下： (1) 通過泵2輸送被測水樣溶液； (2) 水樣溶液在泵2的作用下，流經(jīng)過濾柱11，過濾柱11內部填充氧化鎂負載鈷鐵金 屬磁性納米材料，并且具有控溫裝置，由于水體中含有粒徑較大浮游植物，因此通過過濾柱 可以過濾掉粒徑大的浮游植物； (3 )流經(jīng)過濾柱后的水樣，進入熒光池5，熒光池的窗口材料，靠近激發(fā)光源側的采用納 米金剛石4材料，主要消除水體拉曼散射，靠近探測窗口一側的采用貼有薄膜材料-石墨烯 的硅玻璃6,主要消除水體的熒光散射； (4) 利用ΙΟΟΚΗζ的脈沖激發(fā)光源3-深紫外激光二極管泵浦固體激光器產(chǎn)生連續(xù)波段 的光源，照射熒光池5,利用在熒光池探測一側的光譜分光器件-光柵進行空間分光，色散 后形成λ 1- λ 2的光譜帶； (5) 位于探測窗口處的C⑶光電探測器7同時采集λ 1-λ 2的光譜數(shù)據(jù)，通過內部轉 變和時間序列積分得到波長-光強二維光譜； (6) 首先，針對水體中微微型藻類可能帶來的檢測誤差，利用ΙΟΟΚΗζ的脈沖激發(fā)光源 3,激發(fā)采用400nm，發(fā)射采用685nm，CCD光電探測器7采集光譜數(shù)據(jù)，作為水體藻類影響因 子； (7) 其次，針對水體中CD0M的影響，根據(jù)CD0M有著自己的特征熒光(激發(fā)340/發(fā)射 430)，同樣利用利用ΙΟΟΚΗζ的脈沖激發(fā)光源3,激發(fā)采用340nm，發(fā)射采用430nm，C⑶光電 探測器7采集光譜數(shù)據(jù)，作為水體CD0M影響因子； (8) 最后，利用ΙΟΟΚΗζ的脈沖激發(fā)光源3-深紫外激光二極管泵浦固體激光器產(chǎn)生連續(xù) 波段的光源275-450nm，照射熒光池，利用在熒光池5探測一側的光譜分光器件12-光柵進 行空間分光，色散后收集280-535nm的光譜帶，位于探測窗口處的CCD光電探測器7同時采 集280-535nm的光譜數(shù)據(jù)，通過內部轉變和時間序列積分得到波長-光強二維光譜； (9) 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中采用建立的海洋細菌多樣性熒光識別模式，經(jīng)過海洋細菌熒光識 別模式計算分析海洋細菌豐度和多樣性。
[0024] 所述方法水樣流量為5. 0-10. 0ml/min。
[0025] 所述方法過濾柱內部填充氧化鎂負載鈷鐵金屬磁性納米材料，并且具有控溫裝 置，溫度范圍l〇_15°C。
[0026] 所述方法利用ΙΟΟΚΗζ的脈沖激發(fā)光源-深紫外激光二極管泵浦固體激光器，具有 體積小、無需水冷、波動噪音小、供電簡單等特征，另外采用連續(xù)激發(fā)式ΙΟΟΚΗζ脈沖激發(fā)光 源，在一定程度上提高了測量精度，同時采用深紫外激發(fā)可以激發(fā)細菌體內典型的熒光物 質，不需要進行染色等步驟。
[0027] 所述方法熒光池的窗口材料，靠近激發(fā)光源側的采用納米金剛石材料，主要消除 水體拉曼散射，靠近探測窗口一側的采用貼有薄膜材料-石墨烯的硅玻璃，主要消除水體 的熒光散射。
[0028] 所述的建立的海洋細菌多樣性熒光識別模式是基于細菌體內含有一些可以激發(fā) 產(chǎn)生熒光的成分，采用激光誘導熒光方法檢測海洋細菌的過程當中，都會發(fā)出"特征光譜"， 這些成分的不同類別、含量或比例的不同，導致熒光峰出現(xiàn)較大的差別，通過對熒光信號的 采集和分析，采用主成分熒光矩陣的方法對細菌多樣性進行鑒別，同時考慮到環(huán)境因素如 藻類、CD0M、以及無機顆粒對熒光有可能產(chǎn)生影響，采用主成分熒光光譜分析方法，建立海 洋細菌多樣性熒光識別模式。
[0029] 所述方法泵為蠕動泵，管路采用聚四氟乙烯材料制成。
[0030] 所述方法CCD探測元件采用美國海洋光學背照式二維面陣CCD光譜儀。
[0031] 所述方法微型計算機數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)中采用海洋細菌多樣性熒光識別模式，該 模型針對藻類以及⑶0M等影響因子具有很好的修正作用，可以消除這些影響因子對計算 分析海洋細菌豐度和多樣性的影響。
[0032] 本發(fā)明的工作原理是： 采用激光誘導熒光方法對細菌類別進行鑒別，主要因為細菌體內含有一些可以激發(fā)產(chǎn) 生熒光的成分，如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、DNA，RNA，NADH，NADPH，F(xiàn)AD以及胞外酶等，這 些成分的不同類別、含量或比例的不同，導致熒光峰出現(xiàn)較大的差別。這些物質的激發(fā)波長 范圍從250-450nm，而產(chǎn)生熒光的發(fā)射波長最大峰值出現(xiàn)在280-540nm之間。
[0033] 海洋細菌體內外不同熒光目標物的最大激發(fā)波長和發(fā)射波長，如表1 : 表1 :突光目標物光學特征

【權利要求】
1. 一種基于激光誘導熒光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方法，其特征在于包括 下列步驟： (1) 通過泵輸送被測水樣溶液； (2) 水樣溶液在泵的作用下，流經(jīng)過濾柱，過濾柱內部填充氧化鎂負載鈷鐵金屬磁性納 米材料，并且具有控溫裝置，由于水體中含有粒徑較大浮游植物，因此通過過濾柱可以過濾 掉粒徑大的浮游植物； (3) 流經(jīng)過濾柱后的水樣，進入熒光池，熒光池的窗口材料，靠近激發(fā)光源側的采用納 米金剛石材料，主要消除水體拉曼散射，靠近探測窗口一側的采用貼有薄膜材料-石墨烯 的硅玻璃，主要消除水體的熒光散射； (4) 利用高頻的脈沖激發(fā)光源-深紫外激光二極管泵浦固體激光器產(chǎn)生連續(xù)波段的光 源，照射熒光池，利用在熒光池探測一側的光譜分光器件-光柵進行空間分光，色散后形成 λ「入2的光譜帶； (5) 位于探測窗口處的C⑶光電探測器同時采集的光譜數(shù)據(jù)，通過內部轉變和 時間序列積分得到波長-光強二維光譜； (6) 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中采用建立的海洋細菌多樣性熒光識別模式，經(jīng)過海洋細菌熒光識 別模式計算分析海洋細菌豐度和多樣性。
2. 根據(jù)權利要求1所述的基于激光誘導熒光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方 法，其特征在于所述高頻的脈沖激發(fā)光源，激發(fā)采用400nm，發(fā)射采用685nm，CCD光電探測 器采集光譜數(shù)據(jù)，作為水體藻類影響因子； 所述高頻的脈沖激發(fā)光源，激發(fā)采用340nm，發(fā)射采用430nm，CCD光電探測器采集光譜 數(shù)據(jù)，作為水體CDOM影響因子； 所述高頻的脈沖激發(fā)光源-深紫外激光二極管泵浦固體激光器產(chǎn)生連續(xù)波段的光源 275-450nm，照射熒光池，利用在熒光池探測一側的光譜分光器件-光柵進行空間分光，色 散后收集280-535nm的光譜帶，位于探測窗口處的(XD光電探測器同時采集280-535nm的 光譜數(shù)據(jù)，通過內部轉變和時間序列積分得到波長-光強二維光譜。
3. 根據(jù)權利要求1所述的基于激光誘導熒光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方 法，其特征在于所述的水樣流量為5. 0-10. Oml/min。
4. 根據(jù)權利要求1所述的基于激光誘導熒光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方 法，其特征在于所述過濾柱內部填充氧化鎂負載鈷鐵金屬磁性納米材料，控溫裝置的溫度 范圍 10-15°C。
5. 根據(jù)權利要求1所述的基于激光誘導熒光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測 方法，所述的利用高頻的脈沖激發(fā)光源-深紫外激光二極管泵浦固體激光器的高頻范圍 100-150KHZ。
6. 根據(jù)權利要求1所述的建立的海洋細菌多樣性熒光識別模式是基于細菌體內含有 一些可以激發(fā)產(chǎn)生熒光的成分，采用激光誘導熒光方法檢測海洋細菌的過程當中，都會發(fā) 出"特征光譜"，這些成分的不同類別、含量或比例的不同，導致熒光峰出現(xiàn)較大的差別，通 過對熒光信號的采集和分析，采用主成分熒光矩陣的方法對細菌多樣性進行鑒別，同時考 慮到環(huán)境因素如藻類、CDOM、以及無機顆粒對熒光有可能產(chǎn)生影響，采用主成分熒光光譜分 析方法，建立海洋細菌多樣性熒光識別模式。
7. 根據(jù)權利要求1所述的基于激光誘導熒光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方 法，其特征在于所述的泵為蠕動泵，管路采用聚四氟乙烯材料制成。
8. 根據(jù)權利要求1所述的基于激光誘導熒光的海洋細菌原位豐度和多樣性的檢測方 法，其技術特征在于CCD探測元件采用美國海洋光學背照式二維面陣CCD光譜儀。
【文檔編號】G01N21/64GK104089937SQ201410344857
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月21日 優(yōu)先權日:2014年7月21日
【發(fā)明者】張穎, 王昭玉, 張述偉, 褚東志, 任國興, 孔祥峰, 鄒研, 尤小華, 吳寧, 吳丙偉, 高楊, 王茜, 石小梅, 劉東彥, 郭翠蓮, 張穎穎, 范萍萍, 呂靖, 張國華, 曹璐, 張婷, 曹煊, 程巖, 劉巖, 侯廣利 申請人:山東省科學院海洋儀器儀表研究所