專利名稱：有多個被標(biāo)記部分的信號增強(qiáng)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測測試液中分析物存在的方法和實施該方法的試劑盒。
一種檢測測試液中分析物存在的傳統(tǒng)方法包括用測試條捕獲分析物和用測試條檢測該分析物的存在。所述測試條有一個接觸測試液的接觸端和遠(yuǎn)離接觸端、固定有抗-分析物抗體(捕獲抗體)的捕獲區(qū)。
為了檢測分析物存在，將測試條接觸端接觸測試液。如果測試液中存在分析物，那么它將通過毛細(xì)管作用遷移至測試條捕獲區(qū)，在捕獲區(qū)被捕獲抗體捕獲。測試條捕獲區(qū)分析物的存在進(jìn)一步被標(biāo)記有如膠體金的抗-分析物抗體(檢測抗體)檢測。
這些測試條測試方法有一些優(yōu)點。它們操作簡單、便宜，不需要專門儀器，結(jié)果快速易得并且可視測。因此，這些測試方法特別適合用于醫(yī)師辦公室、家庭、偏遠(yuǎn)地區(qū)和沒有專門儀器的發(fā)展中國家。它們可用于例如檢測患者是否受到了致病微生物如沙眼衣原體的感染。
然而，使用這樣測試方法檢測分析物的靈敏性是較低的。所以，如果測試液中僅含有少量分析物，那么將不能檢測到。如果用該測試方法診斷患者是否患有特定疾病，當(dāng)患者不能被診斷出患有該疾病時，這尤其是一個缺點。當(dāng)患者沒有表現(xiàn)出癥狀時，情況更是如此，但是，當(dāng)表現(xiàn)出癥狀但需要確證這些癥狀由特定疾病或特定疾病勞損引起時，特定情況也是這樣。
WO 00/25135公開了一種檢測抗原的兩步法測試條檢測系統(tǒng)。該檢測系統(tǒng)使用一種抗-抗原生物素化抗體和一種膠體金標(biāo)記的抗-生物素抗體(抗生物素金綴合物)。第一步，將生物素化抗體和測試液混合，測試條膜末端浸入該混合物以便該含水混合物通過毛細(xì)管作用沿膜向上遷移?；旌衔镏信c生物素化抗體結(jié)合的抗原被固定在測試條捕獲區(qū)的抗-抗原抗體捕獲，從而形成一種含固定的抗-抗原抗體、抗原和生物素化抗體的復(fù)合物。第二步，將測試條浸入單獨的抗生物素金綴合物混懸液中?？股锼亟鹁Y合物通過毛細(xì)管作用沿膜向上遷移，并與在捕獲區(qū)和抗原一起被捕獲的生物素化抗體結(jié)合。然后通過檢測捕獲區(qū)的金標(biāo)記物來檢測出抗原。
盡管該兩步法系統(tǒng)可提供增強(qiáng)的靈敏度，但是人們?nèi)匀幌ＭM(jìn)一步提高分析物檢測的靈敏度。
因此，根據(jù)本發(fā)明第一方面，提供了一種檢測測試液中分析物存在的方法，該方法包括以下步驟a)提供一種色譜條，該條含有接觸測試液的接觸端和固定在色譜條上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲區(qū)的捕獲部分，該捕獲部分含有能結(jié)合(不是通過核酸堿基對相互作用)分析物或其衍生物的配體/抗-配體結(jié)合對中之一作為所述配體/抗-配體結(jié)合對中的另一個；b)將能結(jié)合分析物或其衍生物的靶向試劑與測試液接觸，使靶向試劑與測試液中的分析物或其衍生物結(jié)合，所述靶向試劑具有多個配體；c)將標(biāo)記物與靶向試劑中兩個或更多個配體中的每個配體結(jié)合；d)將色譜條的接觸端與測試液接觸，使結(jié)合了被標(biāo)記靶向試劑的分析物或其衍生物通過毛細(xì)管作用遷移至捕獲區(qū)被捕獲部分并被捕獲部分捕獲；和e)檢測捕獲區(qū)標(biāo)記物的存在。
根據(jù)本發(fā)明，靶向試劑在其接觸捕獲區(qū)之前先與標(biāo)記物結(jié)合形成了被標(biāo)記靶向試劑。這與WO 00/25135中的方法相反，其中生物素化抗體和抗-生物素金綴合物分別在兩步中通過毛細(xì)管作用沿測試條膜向上遷移。申請人出人意料地發(fā)現(xiàn)，使用本發(fā)明的方法檢測分析物的靈敏度高于WO00/25135中的兩步法。在最佳條件下，分析物檢測的靈敏度至少比使用兩步法檢測的靈敏度高一個數(shù)量級。
為了實施本發(fā)明第一方面的方法，靶向試劑和標(biāo)記物可僅僅是加入測試液中，然后使測試液與色譜條的接觸端接觸。這樣的方法比WO00/25135中公開的、需要兩次分別向上遷移的方法更容易操作。因此，可能更快得到結(jié)果，而分析物檢測的靈敏度更高。
這里使用的術(shù)語“色譜條”是指材料能通過毛細(xì)管作用轉(zhuǎn)運溶液的任何材料組成的多孔條。色譜條能吸收或不能吸收側(cè)流，但是優(yōu)選能吸收側(cè)流。術(shù)語“不能吸收側(cè)流”是指其中液體中溶解或分散的所有組分在側(cè)向能以基本相等的速率和相對未減少的流量轉(zhuǎn)運穿過膜，這與“能吸收側(cè)向流量”引起的一種或更多組分選擇性滯留相反。能吸收側(cè)向流量的材料包括紙、硝化纖維素和尼龍。優(yōu)選示例是硝化纖維素。
在靶向試劑加入(或以別的方式接觸)測試液之前，可通過將靶向試劑和標(biāo)記物預(yù)混合使標(biāo)記物與靶向試劑的配體結(jié)合。然而在某些情況下，優(yōu)選靶向試劑與標(biāo)記物沒有預(yù)混合，因為這樣的預(yù)混合會引起靶向試劑與標(biāo)記物的沉淀。因此，靶向試劑與標(biāo)記物可分別加入(或分別接觸)測試液。靶向試劑和標(biāo)記物可基本上同時或以任何順序加入(或接觸)測試液。
在測試液接觸色譜條的接觸端之前，測試液可與靶向試劑和標(biāo)記物預(yù)溫育，以保證形成復(fù)合物。最佳預(yù)溫育時間取決于反應(yīng)物的比率和色譜條的流速。在某些情況下，預(yù)溫育太長時間會減弱得到的檢測信號，甚至導(dǎo)致假陽性檢測信號。因此，對于使用的特定條件需要選擇最佳的預(yù)溫育時間。
可取的是，在標(biāo)記物與靶向試劑結(jié)合之前，將測試液與靶向試劑預(yù)溫育，以便使靶向試劑能在最佳結(jié)合條件下結(jié)合測試液中的分析物。
在本發(fā)明可選擇的方面，標(biāo)記物與靶向試劑的結(jié)合可發(fā)生在色譜條上。這可通過將標(biāo)記物和/或靶向試劑可釋放地固定在色譜條的接觸端和捕獲區(qū)之間的聯(lián)接區(qū)來完成。當(dāng)測試液通過毛細(xì)管作用遷移至捕獲區(qū)時，標(biāo)記物和/或靶向試劑被釋放至測試液中。如果是標(biāo)記物而非靶向試劑可釋放地固定，那么應(yīng)使靶向試劑接觸測試液以便測試液中的靶向試劑能結(jié)合標(biāo)記物，因為它們是可釋放地固定的。相似地，如果是靶向試劑而非標(biāo)記物是可釋放地固定的，那么則使標(biāo)記物接觸測試液。
因此，根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測測試液中分析物存在的方法，包括以下步驟a)提供了一種色譜條，含有
i)接觸測試液的接觸端；ii)固定在色譜條遠(yuǎn)離接觸端的捕獲區(qū)的捕獲部分，該捕獲部分含有能結(jié)合(不是通過核酸堿基對相互作用)分析物或其衍生物的配體/抗-配體結(jié)合對中之一作為所述配體/抗-配體結(jié)合對中的另一個；和iii)可釋放地固定在色譜條的接觸端與捕獲區(qū)之間聯(lián)接區(qū)的靶向試劑，該靶向試劑具有多個配體并能結(jié)合分析物或其衍生物。
b)將多個標(biāo)記物和測試液接觸；c)將色譜條接觸端接觸測試液，使測試液穿過聯(lián)接區(qū)遷移至捕獲區(qū)，從而靶向試劑從聯(lián)接區(qū)釋放出來，以便被釋放靶向試劑兩個或更多配體的每個配體被標(biāo)記物結(jié)合，和以便結(jié)合了標(biāo)記物的、被釋放的靶向試劑與測試液中分析物或其衍生物一起遷移至捕獲區(qū)和作為捕獲部分、分析物或其衍生物、靶向試劑和標(biāo)記物之間形成的復(fù)合物的一部分在捕獲區(qū)被捕獲；和d)檢測捕獲區(qū)標(biāo)記物的存在。
可選擇的，標(biāo)記物可釋放地固定在色譜條聯(lián)接區(qū)，和靶向試劑接觸測試液，或標(biāo)記物與靶向試劑都可釋放地固定在聯(lián)接區(qū)。
固定可僅僅是通過將標(biāo)記物和/或靶向試劑在色譜條上干燥來實現(xiàn)。將實施本發(fā)明中方法所必需的一些或全部反應(yīng)物可釋放地固定在色譜條上的一個優(yōu)點是，這些反應(yīng)物不需要分別加入測試液中，或分別由其它實施該方法所必需的組分?jǐn)y帶或包裝。
在本發(fā)明的其它方面，可取的是，在色譜條接觸端接觸測試液后將接觸端與含有被標(biāo)記靶向試劑的測試液接觸，或者在分析物或其衍生物通過毛細(xì)管作用遷移至捕獲區(qū)后將靶向試劑和標(biāo)記物與測試液接觸，因此，被標(biāo)記靶向試劑和分析物或其衍生物分別通過毛細(xì)管作用遷移至捕獲區(qū)。
這些方面的可能的優(yōu)點是，可減少任何非特異的標(biāo)記物與色譜條的結(jié)合，因為更多測試液(或含靶向試劑的溶液)穿過色譜條，因此沖洗色譜條。
在本發(fā)明的其它方面，當(dāng)分析物或其衍生物被捕獲部分捕獲后，可使被標(biāo)記靶向試劑直接與色譜條的捕獲區(qū)接觸。應(yīng)當(dāng)在靶向試劑接觸捕獲區(qū)之前(或者在例外的情況下同時)將標(biāo)記物與靶向試劑的配體結(jié)合。
因此，廣義上而言，本發(fā)明的檢測測試液中分析物存在的方法包括以下步驟a)提供了一種含有接觸測試液的接觸端和固定在色譜條捕獲區(qū)的捕獲部分的色譜條，該捕獲部分含有能結(jié)合(不是通過核酸堿基對相互作用)分析物或其衍生物的配體/抗-配體結(jié)合對中之一作為所述配體/抗-配體結(jié)合對中的另一個；b)將色譜條的接觸端與測試液接觸，使分析物或其衍生物通過毛細(xì)管作用遷移至捕獲區(qū)，和被捕獲部分捕獲；c)將被標(biāo)記靶向試劑與捕獲區(qū)接觸，該被標(biāo)記靶向試劑能結(jié)合分析物或其衍生物，使被標(biāo)記靶向試劑作為含有捕獲部分、分析物或其衍生物和被標(biāo)記靶向試劑復(fù)合物的一部分在捕獲區(qū)被捕獲，其中被標(biāo)記靶向試劑含有多個配體，其中兩個或多個配體中的每個配體與標(biāo)記物結(jié)合；和d)檢測捕獲區(qū)標(biāo)記物的存在。
在本發(fā)明一些方面和實施方案中，標(biāo)記物和/或靶向試劑可取是干燥形式，例如與測試液接觸的粉末或片狀。這樣做的優(yōu)點在于能減小實施本發(fā)明中方法的試劑盒的重量和尺寸，因為此時不需要包括單獨的標(biāo)記物和/或靶向試劑溶液。這使得本發(fā)明的試劑盒易于使用，并且如果該試劑盒需要運輸，尤其是到偏遠(yuǎn)地區(qū)的話，這一點尤為重要。其他優(yōu)點在于靶向試劑和/或標(biāo)記物的干燥形式更穩(wěn)定。這在難以冷凍或冷藏反應(yīng)物溶液、否則該反應(yīng)物溶液在室溫下不穩(wěn)定的地區(qū)實施本發(fā)明中方法尤為重要。
優(yōu)選靶向試劑至少有4個配體，更優(yōu)選至少6個配體。優(yōu)選靶向試劑不超過50個配體。最佳配體數(shù)目取決于靶向試劑本身。例如，對于含IgG的靶向試劑，優(yōu)選每分子IgG不超過20個配體。然而對于含IgM的靶向試劑，可使用較多配體。
申請人發(fā)現(xiàn)靶向試劑配體的最佳數(shù)目取決于色譜條的流速。一般來說，流速越快，每分子靶向試劑的配體數(shù)目越多。
膜的流速取決于膜孔的大小、結(jié)構(gòu)和表面活性劑處理。在未處理過的硝化纖維素膜上，孔的大小影響流速孔越大，流速越快。然而，后處理和阻滯性溶液(blocking solution)對流速也有顯著影響。不同溶液在膜上有不同流速，或者由于它們的粘度，或者由于粒子的含量。
這里所定義的快流速膜是指其中水通過毛細(xì)管作用以約70-80秒/40mm的速度遷移的膜?？炝魉倌さ膶嵗蠾hatman Purabind A-RP膜(孔徑8μm)-水流速＝80秒/40mm；和Whatman Purabind A-XP膜(孔徑12μm)-水流速＝70秒/40mm。慢流速膜的實例是Schleicher&SchuellAE99膜(孔徑8μm)-水流速＝130秒/40mm。
對于快流速膜而言，每分子靶向試劑約9-20個配體可得到最佳結(jié)果，優(yōu)選約14-18個。對于慢流速膜，每分子靶向試劑約6-12個配體可得到最佳結(jié)果，更優(yōu)選8-12個配體，再更優(yōu)選8-10個配體，最優(yōu)選8或9個配體。
申請人發(fā)現(xiàn)每分子靶向試劑的最佳配體數(shù)目取決于生物樣品的粘度。通常來講，樣品越粘，那么每分子靶向試劑的配體數(shù)目越少。例如，當(dāng)本發(fā)明中方法用于檢測CT時，典型的測試樣品是尿、子宮頸粘液或尿道粘液。由于這些樣品的粘度不同，因此使用的每分子靶向試劑最佳配體數(shù)目將取決于樣品溶液的粘度。
靶向試劑可含有單一或多于一個部分。例如靶向試劑可含有一個能結(jié)合分析物或其衍生物的主要部分，和一個能結(jié)合主要部分的輔助部分，該輔助部分具有多個配體。
優(yōu)選的配體包括生物素c能與抗-生物素抗體、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或其衍生物結(jié)合)、熒光素(能與抗-熒光素抗體結(jié)合)和DNP(能與抗-DNP抗體結(jié)合)。
靶向試劑的部分或每個部分優(yōu)選是抗體。這里所用的術(shù)語“抗體”是指任何能保持抗原結(jié)合活性的抗體或抗體片段(不管是天然的還是重組的)。這包括單克隆或多克隆抗體、單鏈抗體、單克隆或多克隆抗體的Fab碎片和嵌合抗體。
在一個優(yōu)選實施方案中，靶向試劑包括能結(jié)合分析物或其衍生物的初級抗體，和能結(jié)合初級抗體的二次抗體，該二次抗體與多個配體共價結(jié)合。優(yōu)選本實施方案是因為二次抗體能單獨制備和能與不同初級抗體一起使用來檢測不同分析物。
優(yōu)選多個標(biāo)記物至少與一個靶向試劑配體結(jié)合，因此進(jìn)一步增加了分析物檢測的靈敏度。
當(dāng)作為在捕獲部分、分析物或其衍生物、靶向試劑和標(biāo)記物之間形成的復(fù)合物的一部分時，任何一種可在色譜條上檢測該復(fù)合物的標(biāo)記物均可使用。優(yōu)選標(biāo)記物是肉眼可檢測的標(biāo)記物。適合的肉眼可檢測標(biāo)記物的實例包括織物染料和有色微粒如有色乳膠粒和金屬溶膠如膠體金或硒。優(yōu)選膠體金粒徑范圍約20-60nm，更優(yōu)選20-40nm。使用窄粒徑分布范圍23-31nm(30nm British Biocell International Limited)的膠體金或?qū)捔椒植挤秶?0-47nm(平均29-38nm)的膠體金可得到相似的分析靈敏度。
其它合適的標(biāo)記物的實例包括放射性標(biāo)記物、發(fā)光標(biāo)記物尤其是熒光素標(biāo)記物、和含有能與發(fā)色底物或可被酶轉(zhuǎn)化為發(fā)光物質(zhì)的底物反應(yīng)的酶的標(biāo)記物。尤其優(yōu)選化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，因為它們產(chǎn)生發(fā)光信號的強(qiáng)度比其它標(biāo)記物高，因而提高了分析物檢測的靈敏度。
每個標(biāo)記物可由標(biāo)記試劑提供。每種標(biāo)記試劑可包括單一或多于一個部分。例如，一種標(biāo)記試劑可包括能結(jié)合靶向試劑配體的主要部分；和能結(jié)合主要部分的被標(biāo)記輔助部分。
優(yōu)選標(biāo)記試劑的部分或每個部分是抗體。
在優(yōu)選實施方案中，標(biāo)記試劑含有一個能結(jié)合靶向試劑配體的初級抗體和能結(jié)合初級抗體的二次抗體，該二次抗體結(jié)合有標(biāo)記物。優(yōu)選該實施方案，因為二次抗體可單獨制備和與不同初級抗體一起使用來結(jié)合不同配體。
對于靶向試劑配體含生物素的實施方案，適合的標(biāo)記試劑包括以下i)一種被標(biāo)記的抗生物素抗體；ii)一種含有抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或其衍生物的被標(biāo)記部分，其中抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或其衍生物保持有生物素結(jié)合活性。
iii)一種保持有生物素結(jié)合活性的抗-生物素抗體，抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或其衍生物(主要部分)，和能結(jié)合主要部分的被標(biāo)記抗體(輔助部分)。
可優(yōu)選每個標(biāo)記試劑含有多個標(biāo)記物來進(jìn)一步提高檢測的靈敏度。這可通過將多個標(biāo)記物與每個標(biāo)記試劑共價結(jié)合來實現(xiàn)。可選擇的，如果標(biāo)記試劑含有多于一個部分，那么每個部分均可被標(biāo)記，如圖5C所示。
捕獲部分可含有單個或沒有共價結(jié)合在一起的多個部分。捕獲部分可含有能結(jié)合分析物或其衍生物的抗體。
在其它實施方案中，分析物可以是抗體，捕獲部分可是抗原。如果測試液中引起疾病的微生物抗原的量可能非常低時，那么在檢測個體是否感染致病微生物時，這樣的實施方案尤其有優(yōu)點。由個體對抗微生物感染抗原時產(chǎn)生的抗體可能以非常高的量存在，因此使抗體檢測成為一種更靈敏的診斷感染的方法。其實例是響應(yīng)HIV感染時產(chǎn)生的抗體。
分析物的衍生物可通過化學(xué)修飾分析物來得到，例如將分析物與能被捕獲部分結(jié)合的配體共價結(jié)合。在一個實施方案中，分析物可共價結(jié)合生物素形成分析物的衍生物，該分析物衍生物接著能被含有抗生物素抗體、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、或其生物素結(jié)合衍生物的捕獲部分捕獲?？蛇x擇地，可通過將衍生部分如抗體與能被捕獲部分結(jié)合的分析物非共價結(jié)合來形成分析物。
形成分析物衍生物的一個優(yōu)點在于分析物和被標(biāo)記靶向試劑可進(jìn)一步從色譜條上分開，因此減小或防止了任何位阻效應(yīng)，否則會在色譜條和被捕獲區(qū)捕獲的、含分析物的復(fù)合物之間產(chǎn)生位阻效應(yīng)。如果分析物衍生物含有能被這樣色譜條的捕獲部分結(jié)合的捕獲配體，那么分析物衍生物的捕獲也允許使用同樣的色譜條來捕獲不同分析物。
在優(yōu)選實施方案中，分析物衍生物含有多個捕獲配體，每個捕獲配體能被捕獲部分結(jié)合。多個捕獲配體的存在增加了分析物衍生物被捕獲部分捕獲的可能性。
圖6顯示了分析物被衍生部分結(jié)合的優(yōu)選實施方案中的實施例。注意到在該圖中，沒有顯示分析物與被標(biāo)記靶向部分的結(jié)合。
本發(fā)明中方法可用于檢測任何適合的分析物。實例包括感染性試劑的抗原或?qū)惯@些抗原產(chǎn)生的抗體、激素(如懷孕測試)、代謝物(如檢測代謝紊亂)、藥物(治療或違禁藥)、維生素、類固醇或應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的抗體。
優(yōu)選的感染性試劑的抗原或?qū)惯@些抗原產(chǎn)生的抗體的實例是乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、HBsAg的’a’抗原決定基、乙型肝炎’e’抗原(HbeAg)、抗HbeAg抗體、抗乙型肝炎核抗原抗體(如抗乙型肝炎核抗原IgG和IgM)、丙型肝炎病毒(HCV)抗原、抗HCV抗原抗體、HIV抗原(HIV1和HIV2)、抗HIV抗原抗體、沙眼衣原體抗原或淋病抗原。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了實施本發(fā)明中方法的試劑盒。
一種實施本發(fā)明中第一方面方法的試劑盒，包括i)色譜條，有接觸測試液的接觸端和固定在色譜條遠(yuǎn)離接觸端的捕獲區(qū)的捕獲部分，該捕獲部分含有能結(jié)合(不是通過核酸堿基對相互作用)分析物或其衍生物的配體/抗-配體結(jié)合對中之一作為所述配體/抗-配體結(jié)合對中的另一個；ii)從色譜條中分離出、能結(jié)合分析物或其衍生物的靶向試劑和多個標(biāo)記試劑，該靶向試劑具有多個配體，每個標(biāo)記試劑與靶向試劑的一個配體結(jié)合，每個標(biāo)記試劑具有一個標(biāo)記物。一種實施本發(fā)明中第二方面方法的試劑盒，包括i)色譜條，含有接觸測試液的接觸端和固定在色譜條遠(yuǎn)離接觸端的捕獲區(qū)的捕獲部分，該捕獲部分含有能結(jié)合(不同于通過核酸堿基對相互作用)分析物或其衍生物的配體/抗-配體結(jié)合對中之一作為所述配體/抗-配體結(jié)合對中的另一個；和可釋放地固定在色譜條接觸端和捕獲區(qū)之間的聯(lián)接區(qū)的靶向試劑，該靶向試劑具有多個配體和能結(jié)合分析物或其衍生物；和分離地ii)多個能結(jié)合靶向部分配體的標(biāo)記試劑，每個標(biāo)記試劑具有一個標(biāo)記物。
標(biāo)記試劑與靶向試劑一起可釋放地固定在色譜條的聯(lián)接區(qū)。可選擇地，標(biāo)記試劑而不是靶向試劑可釋放地固定在色譜條上。
當(dāng)試劑盒用于實施本發(fā)明第二方面的方法時，應(yīng)當(dāng)理解可釋放地將靶向試劑和標(biāo)記試劑固定在色譜條聯(lián)接區(qū)尤其有這樣的優(yōu)點所有檢測測試液中分析物存在的反應(yīng)物都存在于色譜條上c條件是選擇標(biāo)記試劑，使它不需要通過與另外的試劑進(jìn)一步反應(yīng)使捕獲區(qū)捕獲的復(fù)合物肉眼可見，除非這些另外的試劑也同樣可釋放地固定在色譜條上)。
在這樣的實施方案中，需要保證聯(lián)接區(qū)和捕獲區(qū)之間有足夠的距離，使得一旦它們被釋放到達(dá)捕獲區(qū)時，標(biāo)記試劑能結(jié)合靶向試劑?？蛇x擇的，聯(lián)接區(qū)應(yīng)浸入測試液中使靶向試劑被釋放出來和標(biāo)記試劑進(jìn)入測試液，因而在它們通過毛細(xì)管作用遷移至捕獲區(qū)之前能在測試液中互相結(jié)合。
當(dāng)靶向試劑和標(biāo)記試劑可釋放地固定在色譜條聯(lián)接區(qū)時，它們可以固定在聯(lián)接區(qū)的相同部分或聯(lián)接區(qū)內(nèi)的不同區(qū)域。當(dāng)靶向試劑和標(biāo)記試劑固定在聯(lián)接區(qū)同一部分時，它們可在聯(lián)接區(qū)相互散開或在不同層。
在一種方案中，可優(yōu)選標(biāo)記試劑直接固定在色譜條的聯(lián)接區(qū)，因此形成第一層，靶向試劑固定在第一層上，因此在第一層上形成第二層。這種方案的一種可能的優(yōu)點是預(yù)計靶向試劑能先于標(biāo)記試劑釋放至測試液中。如果懷疑標(biāo)記試劑會干擾靶向試劑與分析物或其衍生物的結(jié)合的話，這對于確保在捕獲區(qū)有效形成復(fù)合物是重要的。
當(dāng)靶向試劑和/或標(biāo)記試劑沒有固定在色譜條時，可優(yōu)選它們的干燥形式，例如粉末或片狀。
分析物檢測的靈敏度可取決于靶向試劑和標(biāo)記試劑的比率。因此，應(yīng)當(dāng)選擇能得到最佳結(jié)果的比率。
當(dāng)本發(fā)明中試劑盒含有由多于一個部分組成的靶向試劑時，在某些情況下，可取的是一個或更多部分可釋放地固定在色譜條上和一個或更多剩余部分從色譜條分離出來。同樣的，當(dāng)每個標(biāo)記試劑含有一個或更多部分時，在某些情況下，可取的是一個或更多部分可釋放地固定在色譜條上和一個或更多剩余部分從色譜條分離出來。
本發(fā)明中需要另外的試劑來檢測含有標(biāo)記試劑的被捕獲復(fù)合物的試劑盒c例如，那些其中標(biāo)記試劑含有能轉(zhuǎn)變發(fā)色底物的酶或能被酶轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)光產(chǎn)物的底物的試劑盒)優(yōu)選還含有檢測需要的試劑。
本發(fā)明中這些方面和實施方案中，其中靶向試劑和/或標(biāo)記物可釋放地固定在色譜條聯(lián)接區(qū)，通過毛細(xì)管作用到達(dá)捕獲區(qū)的測試液中標(biāo)記物和/或靶向試劑的濃度可能發(fā)生變化。這是因為測試液中靶向試劑和/或標(biāo)記物的濃度會隨著可釋放地固定的靶向試劑和/或標(biāo)記試劑釋放到測試液中直到聯(lián)接區(qū)沒有殘余試劑而上升或下降。
當(dāng)捕獲區(qū)靶向試劑和/或標(biāo)記物濃度增加時，可能會超過靶向試劑和/或標(biāo)記物在捕獲區(qū)最佳形成復(fù)合物的量。相反，當(dāng)靶向試劑和/或標(biāo)記物濃度降低時，捕獲區(qū)靶向試劑和/或標(biāo)記物的量可能不足。因此，當(dāng)色譜條接觸端接觸含有最佳靶向試劑和/或標(biāo)記物濃度的測試液時，在捕獲區(qū)捕獲的復(fù)合物總量可能少于捕獲的總量。因此檢測的靈敏度可能下降。
因而，優(yōu)選靶向試劑和/或標(biāo)記物沒有可釋放地固定在色譜條聯(lián)接區(qū)。
根據(jù)本發(fā)明還提供了本發(fā)明中檢測測試液中分析物存在的試劑盒的用途。
根據(jù)本發(fā)明還提供了檢測測試液中分析物存在的被標(biāo)記靶向試劑，該被標(biāo)記靶向試劑能結(jié)合分析物或其衍生物，而不是被分析物或其衍生物結(jié)合，其中被標(biāo)記靶向試劑具有多個配體，每個配體能被標(biāo)記物結(jié)合，可利用標(biāo)記物檢測被標(biāo)記靶向試劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供了本發(fā)明中檢測測試液中分析物存在的被標(biāo)記靶向試劑的用途。
參考圖1對本發(fā)明中的實施方案進(jìn)行說明。在以下討論中，初級抗體相當(dāng)于靶向試劑，半抗原相當(dāng)于靶向試劑的配體，標(biāo)記二次抗體相當(dāng)于標(biāo)記試劑，和捕獲抗體相當(dāng)于捕獲部分。
任一以膜為基礎(chǔ)的快速檢測法的主要缺點是，與酶聯(lián)免疫分析法(EIA)相比其靈敏度降低。這種靈敏度降低歸因于這樣一個事實快速檢測時，抗原抗體反應(yīng)必須在15-20分鐘內(nèi)完成，沒有輪流沖洗和溫育步驟帶來的優(yōu)點。另外，抗原抗體復(fù)合物用肉眼檢測出，而不是用酶促反應(yīng)放大信號。因有限樣品量及快速檢測法所固有的靈敏度下降的缺點必須以一種改進(jìn)的檢測系統(tǒng)來補償。
希望通過將半抗原如生物素或熒光素的多拷貝(N)，與能定向于被檢測分析物的初級抗體以化學(xué)方式結(jié)合來放大檢測信號。這與用標(biāo)記物如有色微粒(例如膠體金)標(biāo)記二次抗體(抗-半抗原)一起將檢測信號增強(qiáng)。
圖1顯示了沒有放大的直接檢測(現(xiàn)有技術(shù))和根據(jù)本發(fā)明有放大的間接檢測系統(tǒng)之間分析靈敏度的比較。
圖1中，被檢測分析物是CT-脂多糖(CT-LPS)。在現(xiàn)有技術(shù)沒有放大的檢測方法中(直接檢測，沒有根據(jù)本發(fā)明的信號增強(qiáng))，被標(biāo)記抗體定向于分析物上的特定抗原。圖1A顯示了連結(jié)膠體金的抗-LPS抗體，該抗體能與液態(tài)樣品中的分析物(如CT-LPS)上的特定抗原(如LPS)反應(yīng)并結(jié)合。當(dāng)與被標(biāo)記抗體結(jié)合時，為了檢測分析物，使用了固定的捕獲抗體。這在圖1A中作為能識別同一分析物上一種不同特定抗原的抗-LPS抗體來顯示。
CT-LPS分析物(如圖1A參考1顯示)是多聚的(multimeric)。它是從CT細(xì)菌中提取出來，例如通過清潔劑或熱處理。捕獲抗體和被標(biāo)記抗體與CT-LPS多聚物的不同部分結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明，對分析物特異的初級抗體不是直接標(biāo)記的c間接檢測)。初級抗體中含有半抗原尤其是生物素的多拷貝(優(yōu)選3-9)。初級抗體上的多個半抗原能被標(biāo)記了抗-半抗原的二次抗體定向。圖1B的例子是有膠體金標(biāo)記物的抗-生物素抗體。多個二次抗體可結(jié)合單個初級抗體，導(dǎo)致每個分析物結(jié)合標(biāo)記物數(shù)目放大。接著分析物和初級抗體c標(biāo)記有二次抗體)的綴合物被捕獲和以使用捕獲抗體的傳統(tǒng)方式檢測。
預(yù)期通?？赏ㄟ^將初級抗體和測試樣品(可能含有或不合分析物)首先反應(yīng)來實施根據(jù)本發(fā)明中這些實施方案的分析物檢測。一旦初級抗體和任何存在的分析物反應(yīng)，其緊接著會被二次抗體標(biāo)記。接著，任一分析物與初級抗體和二次抗體標(biāo)記物的綴合物能被捕獲抗體捕獲。
然而，抗體-抗原和抗體-半抗原反應(yīng)嚴(yán)格按照這個順序?qū)嵤┎⒉皇潜景l(fā)明根本原則所絕對必須的?，F(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)人員可理解為，在某種情況下，被標(biāo)記二次抗體與未標(biāo)記定向于分析物的初級抗體的反應(yīng)作為第一步反應(yīng)，下一步是綴合物與測試樣品中任一分析物反應(yīng)和捕獲被標(biāo)記分析物是可能的，甚至是優(yōu)選的。
同樣不排除以下可能性首先是捕獲抗體捕獲任一分析物，接下來實施初級抗體和二次抗體結(jié)合反應(yīng)(任何順序均是可理解的)，只要初級抗體和二次抗體在到達(dá)捕獲區(qū)之前相互結(jié)合。
可以理解，在某些情況下，把其中抗分析物抗體(或靶向試劑)有與存在于樣品中的任何分析物反應(yīng)的最佳條件(時間，溫度，試劑等)的反應(yīng)作為第一步反應(yīng)可能是一個優(yōu)點。尤其當(dāng)分析物以低濃度存在于樣品中或在某種程度上難以與初級抗體接近時的情況就是這樣。
在這種情況下，如果獲知檢測樣品中分析物的可能性，則可發(fā)現(xiàn)與初級抗體最佳可能結(jié)合條件。因此，可以理解，可能存在這樣一些條件，即它們可能促進(jìn)未標(biāo)記初級抗體與分析物的結(jié)合，勝于促進(jìn)被標(biāo)記初級抗體與分析物的結(jié)合(現(xiàn)有技術(shù)中直接標(biāo)記方法的情況就是這樣)。
而且，既然載有標(biāo)記物的二次抗體對初級抗體上半抗原的親和力可能非常高，因此使用相對較低濃度的被標(biāo)記抗體同時仍得到相對較高水平(放大的)標(biāo)記物粘附(通過粘附于分析物的初級抗體/二次抗體綴合物)的可行性是本發(fā)明另一個潛在的優(yōu)點。
申請人同樣認(rèn)識到，在現(xiàn)有技術(shù)直接標(biāo)記方法中，標(biāo)記物(例如有色微粒膠體金)可通過抗體以非常接近分析物目標(biāo)(如LPS)的方式被粘附。這在圖1A中已圖示了。例如，分析物和金微粒之間約12nm的間隔是可能的。相反，當(dāng)同時使用圖1中顯示的初級抗體類型和多個半抗原時，和使用抗-半抗原標(biāo)記的二次抗體時，增加分析物和標(biāo)記物之間的間隔是可能的。例如約24.2nm間隔是可能的。
因而，在本發(fā)明圖1B所示實施方案中，很可能信號放大(如信號增強(qiáng))不僅歸因于捕獲抗體捕獲了更多的有色微粒，而且歸因于當(dāng)金標(biāo)記的抗體與特定抗原的抗原決定基結(jié)合時，減少了受到的空間阻礙。換句話說，增加有色微粒和抗原位點之間的間隔將減少空間位阻和允許在捕獲區(qū)凝集更多的有色微粒。
通過本發(fā)明中方法和試劑盒得到的檢測靈敏度增強(qiáng)的其它可能的原因可能來源于由于靶向試劑中存在多個配體而引起的標(biāo)記物與靶向試劑結(jié)合可能性的增加。
在本發(fā)明的其他實施方案中，分析物可以是抗體，例如個體對抗感染性微生物如HIV的抗原時產(chǎn)生的抗體。在這樣的實施方案中，初級抗體c仍然具有半抗原如生物素或熒光素的多拷貝)定向于分析物抗體。和其它實施方案中描述的一樣，初級抗體上的多個半抗原能被標(biāo)記了抗-半抗原二次抗體定向，因此使每個分析物的標(biāo)記物數(shù)目放大。然而，為了捕獲分析物與初級抗體(標(biāo)記有二次抗體)的綴合物，使用了能通過分析物抗體定向的固定的捕獲抗原。
當(dāng)分析物是人抗體時，初級抗體可以是抗-人Fc抗體或抗-人抗體，如IgG、IgM或其片段。
圖5顯示了本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選實施方案。
應(yīng)當(dāng)注意，圖1和5中解釋的本發(fā)明實施方案是示意性的，在實際操作中，標(biāo)記物相對于其它組分可比顯示中的大很多，和每種標(biāo)記物可聯(lián)接多個部分。
現(xiàn)在僅以示例的方式，參照附圖對本發(fā)明實施方案進(jìn)行描述，其中圖1以圖方式顯示了傳統(tǒng)分析物檢測和根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的分析物檢測之間的比較；圖2以圖方式顯示了一種用于實施本發(fā)明中方法實施方案的色譜條；圖3顯示了使用傳統(tǒng)方法(直接檢測)和本發(fā)明中方法(間接方法)檢測沙眼衣原體得到的結(jié)果；圖4顯示了通過傳統(tǒng)方法(直接檢測)和本發(fā)明中方法(間接方法)檢測HBsAg得到的結(jié)果；圖5顯示了本發(fā)明中實施方案的實例；
圖6顯示了和分析物一起被捕獲部分(注意沒有顯示分析物與被標(biāo)記靶向試劑的結(jié)合)捕獲的衍生部分的實例；圖7顯示了使用間接方法和直接方法檢測分析物的靈敏度比較，和改變每抗-分析物抗體的配體數(shù)目對間接檢測的影響；圖8顯示了當(dāng)使用快流速測試條膜時，改變每抗-分析物抗體的配體數(shù)目對分析物檢測靈敏度的影響。
圖9顯示了一步和兩步檢測法檢測分析物的靈敏度比較。
圖10顯示了使用偶合了抗-分析物抗體的FITC分析物檢測的結(jié)果；和圖11顯示了本發(fā)明中方法和商業(yè)上可得到的檢測系統(tǒng)檢測HBsAg時的比較。
在以下實施例中，直接檢測指現(xiàn)有技術(shù)中與圖1A中描述相似的分析物檢測方法。間接檢測指使用本發(fā)明中方法的分析物檢測。使用方法的細(xì)節(jié)在每個實施例中給出。
實施例1 在檢測沙眼衣原體(CT)的測試條免疫分析法中使用偶合了生物素的抗-脂多糖(LPS)抗體的信號增強(qiáng)。
目的考察使用偶合了生物素的抗-LPS單克隆抗體(作為靶向試劑)和膠體金標(biāo)記的抗-生物素單克隆抗體(作為標(biāo)記試劑)檢測CT的靈敏度。
使用本發(fā)明中第二方面的方法進(jìn)行檢測，其中靶向試劑和標(biāo)記試劑可釋放地固定在色譜條上。
實驗步驟測試條設(shè)計見圖2，顯示了用于實施本發(fā)明中方法的色譜條示意圖。
圖2顯示A.聯(lián)接墊；B.讀數(shù)區(qū)(膜)；C.吸收墊；D.初級抗體＝偶合了生物素的抗-CT-LPS抗體(靶向試劑)；E.二次抗體＝抗生物素-金綴合物(標(biāo)記試劑)；F.特定抗體捕獲區(qū)；G對照抗體捕獲區(qū)。膜可以在A與B和B與C之間交迭。樣品流動用粗體箭頭表示。
捕獲區(qū)F在膜上固定了一種對抗特定種類CT-LPS抗原決定基的單克隆抗體(捕獲部分)。
根據(jù)本發(fā)明中方法間接檢測CT的檢測試劑(靶向試劑和標(biāo)記試劑)在聯(lián)接墊的D區(qū)和E區(qū)沉積的偶合了生物素的抗-CT-LPS單克隆抗體(靶向試劑)和偶合了膠體金的抗-生物素單克隆抗體(標(biāo)記試劑)。
使用傳統(tǒng)方法直接檢測CT的檢測試劑膠體金標(biāo)記的抗-CT-LPS單克隆抗體。
樣品制備待測分析物人尿液尿液2ml離心，去上清，用樣品緩沖液重新懸浮沉淀，100℃加熱15min。
樣品緩沖液含有鹽、清潔劑和阻滯劑(如BSA或奶粉)的標(biāo)準(zhǔn)樣品緩沖液。
樣品展開劑樣品提取物(100μl)加入聯(lián)接墊(A)，或?qū)⒙?lián)接墊浸入樣品提取物中。檢測試劑(D & E)溶解，并通過毛細(xì)管作用隨樣品流沿色譜條遷移。樣品中CT-LPS分子(分析物)被初級抗體(偶合了生物素的抗CT-LPS抗體)結(jié)合。二次抗體(抗-生物素-金)綴合初級抗體上的生物素。當(dāng)樣品進(jìn)入讀數(shù)區(qū)(B)和穿過固定有捕獲抗體(F)的區(qū)(捕獲區(qū))時，該復(fù)合物被捕獲。F區(qū)產(chǎn)生的顏色與樣品中CT-LPS的量成正比。
對照步驟作為直接檢測的對照，將抗-鼠-IgG抗體固定在G區(qū)。對于間接檢測，將抗生物素抗體固定在G區(qū)作為對照。
結(jié)果見圖3和表1，顯示了上述直接和間接檢測法的比較。表1和圖7中還顯示了每抗體生物素的分子比率對檢測靈敏度的影響。
表1直接和間接檢測法的比較，和每抗體生物素的分子比率對檢測靈敏度的影響(使用AE99膜，一種慢流速膜)。
*1μl含LPS 4.218ng。
檢測信號在1至5范圍內(nèi)，5是最強(qiáng)的。
表1中結(jié)果顯示(1)本發(fā)明中放大檢測法能檢測比直接檢測法中更低的CT-LPS濃度；(2)使用本發(fā)明中的檢測法放大(即增強(qiáng))了檢測信號。
實施例2 HBsAg檢測的鑒定快速檢測用于一些發(fā)展中國家篩選血液中HBsAg，尤其是用于血庫中，在那里篩選了太少的樣品以至于不能證明酶免疫分析(EIA)微量板或必要設(shè)備的大量花費是正當(dāng)?shù)?。發(fā)展中國家最常用的快速檢測HBsAg的測試是凝集、測試條和現(xiàn)場測試。凝集測試靈敏度低、相對不具有特異性、主觀和勞動量大?，F(xiàn)場測試需要多種試劑和不適于中等規(guī)模并需預(yù)篩選。另外，這些鑒定方法比標(biāo)準(zhǔn)EIA法昂貴得多。測試條也是商業(yè)上可得到的，它們中有一些效果很好。與EIA相比，這些快速檢測的靈敏度檢測限低一個數(shù)量級和導(dǎo)致檢測到較低百分比的感染HBV血液單位。EIA本身比基因組放大低3％靈敏度(表2)。
表2不同篩選鑒定檢測HBV感染的血液單位。
*100％相當(dāng)于EIA檢測HBsAg加上在EIA檢測顯陰性的血單位中用PCR檢測HBV的DNA。
在市場上可得到的檢測HBsAg的快速測試條檢測中，Abbott檢測似乎是最靈敏的(表3)，檢測限大約5ng/ml，而其它檢測在12-25ng/ml之間。
表3三種商業(yè)上可得到的HBsAg快速檢測的比較。
信號在1至5范圍內(nèi)，其中5是最強(qiáng)的。
目的考察使用偶合了生物素的抗-HBsAg單克隆抗體(靶向試劑)和膠體金標(biāo)記的抗-生物素單克隆抗體(標(biāo)記試劑)檢測HBsAg的靈敏度。使用本發(fā)明中第二方面方法進(jìn)行檢測，其中靶向試劑和標(biāo)記試劑可釋放地固定在色譜條上。
實驗步驟測試條設(shè)計見圖2捕獲線定向抗屬特異性HBsAg抗原決定基(所有HBsAg亞型都有的“a”抗原決定基)的多克隆抗體固定在膜上(捕獲部分)。
檢測直接膠體金標(biāo)記的抗-HBsAg的單克隆抗體用于傳統(tǒng)方法中的直接檢測。
間接使用偶合了生物素的抗-HBsAg單克隆抗體(靶向試劑)和膠體金標(biāo)記的抗-生物素單克隆抗體(標(biāo)記試劑)。
樣品50μl血清加入10μl濃度為2％的吐溫20。
展開樣品將樣品(60μl)加入容器中，測試條浸入溶液中。
對照過程固定抗-鼠-IgG抗體作為對照。
結(jié)果見圖4和表4。
表4使用Purabind A-XP膜(一種快流速膜)的直接檢測法(現(xiàn)有技術(shù))和間接檢測法(根據(jù)本發(fā)明信號增強(qiáng))的比較。
檢測信號在1-5范圍內(nèi)，5為最強(qiáng)。
使用本發(fā)明間接檢測方法可檢測到的分析物濃度比傳統(tǒng)直接檢測方法中的低。
對于那些在兩種方法(直接和間接)中都能檢測到分析物的濃度(≥1.56ng/ml)，使用間接檢測方法能得到比直接檢測方法更強(qiáng)的信號。
對于間接檢測方法，每分子抗體最佳生物素分子的數(shù)目為8或9。
雖然與直接檢測方法相比，間接檢測方法額外使用了一種抗體，但是其仍然是一步系統(tǒng)。
表4中結(jié)果也顯示，根據(jù)本發(fā)明的間接檢測方法比商業(yè)上可得到的快速檢測方法更靈敏。為了證實這一點，將使用本發(fā)明中方法檢測HBsAg的靈敏度直接與使用商業(yè)上可得到的Abbott檢測法的靈敏度進(jìn)行比較。
結(jié)果如表5和圖11中顯示。
表5本發(fā)明中方法和商業(yè)上可得的Abbott快速檢測法檢測HBsAg的比較。
信號在1-5范圍內(nèi)，5是最強(qiáng)的信號。
實施例1和2的討論和結(jié)論。
與現(xiàn)有技術(shù)中直接檢測系統(tǒng)相比，使用偶合了生物素的抗體和金標(biāo)記的抗-生物素抗體放大了檢測信號。
與使用現(xiàn)有的快速測試條測試法檢測HBsAg的靈敏度(Abbott檢測法約5ng/ml，其它檢測法約12-25ng/ml)相比，本發(fā)明中的檢測相對更靈敏，可檢測到0.38ng/ml。
靈敏度提高的程度取決于每抗-LPS或HBsAg抗體生物素的分子比率?？赏ㄟ^將每抗體生物素的分子數(shù)目從4增加到8或9來增強(qiáng)信號。當(dāng)抗-LPS或HBsAg單克隆抗體標(biāo)記了8或9個生物素時，CT-LPS的檢測靈敏度增加30倍，HBsAg的檢測靈敏度增加8倍。使用本發(fā)明中檢測方法檢測0.001μlCT-LPS時，可得到與使用現(xiàn)有技術(shù)中直接檢測法檢測0.03μlCT-LPS相同的信號強(qiáng)度(1)。增強(qiáng)30倍尤其令人驚訝，因為當(dāng)使用每抗體8或9個生物素時，估計分析物檢測的靈敏度最大增加8或9倍。
兩個使用本發(fā)明中方法可增加有色微粒凝集的可能解釋在以下給出(1)抗原特異性抗體上的生物素比率越高，捕獲的金微粒就越多。然而，每抗體超過一定數(shù)目的生物素分子時，生物素的可用性不會增加。相反，如果提供了過多的生物素，抗體對抗原的反應(yīng)性會降低。
(2)含有有色微粒的間接檢測將增加金微粒和抗原決定基之間的距離，并因此減少它們結(jié)合的空間位阻。
當(dāng)使用金標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白時，與使用金標(biāo)記的抗-生物素抗體的間接檢測法相比，使用本發(fā)明中間接法檢測分析物的靈敏度降低。這表示，如果標(biāo)記物和捕獲部分之間的距離太小或靶向和/或標(biāo)記試劑的適應(yīng)性不夠，檢測的靈敏度可能下降。
與有色微粒綴合的兩層抗體將進(jìn)一步增加有色微粒和抗原決定基之間的距離。
應(yīng)當(dāng)優(yōu)化用于被標(biāo)記抗-半抗原抗體的有色微粒的尺寸來得到最大信號。例如，30nm膠體金用于CT-LPS鑒定和HBsAg鑒定。
可使用其它配體，如FITC(參見實施例8)。
使用一種本發(fā)明中不同的間接方法重復(fù)實施例1和2中描述的實驗。不是將生物素化的抗-分析物抗體和抗-生物素金綴合物固定在色譜條上，而是在色譜條接觸端接觸混合溶液之前，將試劑與含有CT-LPS或HBsAg分析物的測試液混合。得到的結(jié)果與實施例1和2中得到的結(jié)果相似。這表示使用本發(fā)明中方法得到的分析物檢測靈敏度的提高不依賴于使用的試劑是固定在色譜條上，還是最初存在于測試液中。
實施例3 不同流速膜的最佳配體數(shù)目/每靶向試劑申請人發(fā)現(xiàn)，每抗-分析物抗體的最佳生物素數(shù)目取決于測試條膜的流速。對于慢流速膜(例如Schleicher & Schuell AE99膜，孔徑8μm)，每靶向試劑約6-12個配體可得到最佳結(jié)果，更優(yōu)選8-12個配體，甚至更優(yōu)選8-10個配體，最優(yōu)選8或9個配體。
表6和圖8中顯示了當(dāng)使用快流速膜(Whatman Purabind A-RP膜)時，每抗-分析物抗體生物素的數(shù)目對分析物檢測靈敏度的影響。通過將含有CT-LPS分析物的緩沖液與生物素化抗CT-LPS抗體和抗生物素金綴合物混合，然后用色譜條的接觸端接觸混合溶液，從而實施本發(fā)明中間接檢測方法。
表6不同流速膜的每靶向試劑最佳配體數(shù)目
*1μl含LPS 4.218ng。
信號在1-5范圍內(nèi)，5為最強(qiáng)信號。
當(dāng)只有0.003μlCT-LPS存在時，為了使用本發(fā)明中間接檢測方法能得到強(qiáng)度為1的信號，生物素化抗體應(yīng)當(dāng)含有14-18個生物素。因而，針對使用膜的流速，應(yīng)當(dāng)優(yōu)化每生物素化抗-LPS抗體的生物素數(shù)目。
實施例4 一步法和兩步法的比較在本實施例中，比較了使用一步檢測法(根據(jù)本發(fā)明第一方面的實施方案)和兩步檢測法(不是根據(jù)本發(fā)明)檢測CT-LPS分析物的靈敏度。
為了實施一步法和兩步法，使用了含有接觸端和測試條遠(yuǎn)離接觸端的捕獲區(qū)固定有抗體(捕獲抗體)的測試條(Purabind A-RP膜，一種快流速膜)。該捕獲抗體能結(jié)合CT-LPS分析物(抗-CT-LPS抗體)。使用一種含有每抗體14個生物素(靶向試劑)和金標(biāo)記抗-生物素抗體(標(biāo)記試劑)的生物素化抗-CT-LPS抗體來檢測CT-LPS分析物。
一步法如下進(jìn)行將含CT-LPS測試液與生物素化抗-CT-LPS抗體和抗-生物素-抗體-金綴合物混合，然后用測試條接觸端接觸混合溶液，使溶液通過毛細(xì)管作用到達(dá)捕獲區(qū)，在捕獲區(qū)檢測金標(biāo)記的存在。這樣，分析物、靶向試劑和標(biāo)記試劑在單一步驟中通過毛細(xì)管作用同時沿測試條向上。
兩步法如下進(jìn)行將50μl緩沖液與CT-LPS和生物素化抗-CT-LPS抗體混合，然后用測試條接觸端接觸混合溶液，使溶液通過毛細(xì)管作用到達(dá)捕獲區(qū)。然后，測試條接觸端接觸100μl抗-生物素-金綴合物的混懸液，使該混懸液通過毛細(xì)管作用遷移至捕獲區(qū)。然后，在捕獲區(qū)檢測金標(biāo)記物存在。這樣，靶向試劑和標(biāo)記試劑分別在兩個不同步驟中通過毛細(xì)管作用沿測試條向上。
表7和圖9顯示了一步法和兩步法分析比較的結(jié)果。
表7一步和兩步分析法的比較
*1μl含LPS 4.218ng。
信號在1至5范圍內(nèi)，5為最強(qiáng)信號。
表7和圖9的結(jié)果表明，使用一步CT-LPS檢測法檢測CT-LPS的靈敏度是兩步CT-LPS檢測法中的10倍(使用一步檢測法檢測0.003μlCT-LPS得到的信號強(qiáng)度與兩步檢測法檢測0.03μlCT-LPS得到的信號強(qiáng)度相同)。
申請人還發(fā)現(xiàn)，一步檢測法中測試條捕獲區(qū)產(chǎn)生的信號線的質(zhì)量和清晰度比兩步法中的高。
實施例8 使用FITC作為靶向試劑配體在本實施例中，又一次比較了直接和間接檢測法檢測分析物的靈敏度。然而，在間接檢測方法中使用的配體是異硫氰酸熒光素(FITC)而不是生物素。按照與實施例1中描述相似的方法進(jìn)行直接檢測法(現(xiàn)有技術(shù))。通過將含CT-LPS分析物的緩沖液與偶合抗-CT-LPS抗體的FITC和膠體金標(biāo)記的抗-FITC抗體混合來實施本發(fā)明的間接方法。然后，用色譜條接觸端接觸混合溶液。每抗-分析物抗體FITC配體的數(shù)目可以變化。表8和圖10中顯示了得到的結(jié)果，與實施例1得到的結(jié)果非常相似。每抗-CT-LPS抗體的最佳FITC數(shù)目大約為7-11。
表8使用FITC作為靶向試劑的配體(AE99膜)
*1μl含LPS 4.218ng。
信號在1-5范圍內(nèi)，5為最強(qiáng)信號。
這些結(jié)果證明，使用本發(fā)明間接方法得到的分析物檢測靈敏度的改善不局限于使用生物素。


圖1A)傳統(tǒng)分析物檢測(直接檢測)的示意圖。該圖顯示了CT細(xì)菌(1)被固定在固相(3)上的抗-LPS抗體(2)結(jié)合，和膠體金(5)標(biāo)記的抗-LPS抗體(4)結(jié)合CT細(xì)菌(1)。
B)根據(jù)本發(fā)明實施方案的分析物檢測的示意圖。該圖顯示CT細(xì)菌(6)被固定在固相(8)上的抗-LPS抗體(7)結(jié)合，和偶合了8個生物素(10)的抗-LPS抗體(9)(9)和(10)形成靶向試劑。每個生物素與膠體金(12)標(biāo)記的抗-生物素抗體(11)結(jié)合(11)和(12)形成標(biāo)記試劑。
圖5該圖顯示了本發(fā)明的不同實施方案A)被固定在固相(22)上的捕獲部分(21)捕獲的分析物(20)。靶向試劑的主要部分(23)例如抗-分析物鼠抗體與分析物(20)結(jié)合，和它本身被靶向試劑的輔助部分(24)例如抗-鼠抗體結(jié)合。輔助部分(24)包括多個配體(25)。配體被含有標(biāo)記物(27)的標(biāo)記試劑(26)例如綴合了有色微粒的抗配體抗體結(jié)合。
B)被固定在固相(32)上的捕獲部分(31)捕獲的分析物(30)。具有多個配體(34)的靶向試劑(33)例如抗-分析物抗體與分析物(30)結(jié)合，和它本身被標(biāo)記試劑的多個主要部分(35)例如抗-配體鼠抗體結(jié)合。每個主要部分(35)與含有標(biāo)記物(37)的標(biāo)記試劑的輔助部分(36)例如綴合了有色微粒的抗-鼠抗體結(jié)合。
C)被固定在固相(42)上的捕獲部分(41)捕獲的分析物(40)。具有多個配體(44)的靶向試劑(43)與分析物(40)結(jié)合，和它本身被標(biāo)記試劑的多個被標(biāo)記主要部分(45)結(jié)合。每個被標(biāo)記主要部分(45)與標(biāo)記試劑的被標(biāo)記輔助部分(46)結(jié)合。標(biāo)記物如(47)所示。
圖6該圖表示了本發(fā)明的另外的實施方案A)與衍生部分(112)結(jié)合的分析物(110)，該衍生部分具有多個配體(114)，配體被固定在色譜條(118)捕獲區(qū)的捕獲部分(116)捕獲。
B)與具有多個配體(124)的第一衍生部分(122)結(jié)合的分析物(120)。第二衍生部分(126)與第一衍生部分的配體結(jié)合。第二衍生部分被固定在色譜條(130)捕獲區(qū)的捕獲部分(128)捕獲。
C)與第一衍生部分(142)結(jié)合的分析物(140)。結(jié)合第一衍生部分的第二衍生部分(144)具有多個捕獲配體(146)。固定在色譜條(150)捕獲區(qū)的捕獲部分(148)結(jié)合捕獲配體之一。
權(quán)利要求
1.一種檢測測試液中分析物存在的方法，包括以下步驟a)提供一種色譜條，含有接觸測試液的接觸端和固定在色譜條捕獲區(qū)的捕獲部分，該捕獲部分含有能結(jié)合(不是通過核酸堿基對相互作用)分析物或其衍生物的配體/抗-配體結(jié)合對中之一作為所述配體/抗-配體結(jié)合對中的另一個；b)將色譜條接觸端與測試液接觸，使分析物或其衍生物通過毛細(xì)管作用遷移至捕獲區(qū)，被捕獲部分捕獲；c)將被標(biāo)記靶向試劑與捕獲區(qū)接觸，被標(biāo)記靶向試劑能結(jié)合分析物或其衍生物，因此使被標(biāo)記靶向試劑作為含捕獲部分、分析物或其衍生物和被標(biāo)記靶向試劑形成的復(fù)合物的一部分在捕獲區(qū)被捕獲，其中，被標(biāo)記靶向試劑含有多個配體，且其中兩個或更多配體的每個配體與標(biāo)記物結(jié)合；和d)檢測捕獲區(qū)標(biāo)記物的存在。
2.一種檢測測試液中存在分析物的方法，包括以下步驟a)提供一種色譜條，含有接觸測試液的接觸端和固定在色譜條上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲區(qū)的捕獲部分，該捕獲部分含有能結(jié)合(不是通過核酸堿基對相互作用)分析物或其衍生物的配體/抗-配體結(jié)合對中之一作為所述配體/抗-配體結(jié)合對中的另一個；b)將能結(jié)合分析物或其衍生物的靶向試劑與測試液接觸，使靶向試劑與測試液中的分析物或其衍生物結(jié)合，靶向試劑具有多個配體；c)將標(biāo)記物與靶向試劑中兩個或更多配體的每個配體結(jié)合；d)將色譜條接觸端與測試液接觸，使結(jié)合了被標(biāo)記靶向試劑的分析物或其衍生物通過毛細(xì)管作用遷移至捕獲區(qū)，被捕獲部分捕獲；和e)檢測捕獲區(qū)標(biāo)記物的存在。
3.一種檢測測試液中分析物存在的方法，包括以下步驟a)提供一種色譜條，含有i)接觸測試液的接觸端；ii)固定在色譜條遠(yuǎn)離接觸端的捕獲區(qū)的捕獲部分，該捕獲部分含有能結(jié)合(不是通過核酸堿基對相互作用)分析物或其衍生物的配體/抗-配體結(jié)合對中之一作為所述配體/抗-配體結(jié)合對中的另一個；和iii)可釋放地固定在色譜條的接觸端與捕獲區(qū)之間聯(lián)接區(qū)的靶向試劑，該靶向試劑具有多個配體并能結(jié)合分析物或其衍生物。b)將多個標(biāo)記物和測試液接觸；c)將色譜條接觸端接觸測試液，使測試液穿過聯(lián)接區(qū)遷移至捕獲區(qū)，從而使靶向試劑從聯(lián)接區(qū)釋放出來，以便使被釋放靶向試劑的兩個或更多配體的每個配體被標(biāo)記物結(jié)合，和以便使結(jié)合了標(biāo)記物的、被釋放的靶向試劑與測試液中分析物或其衍生物一起遷移至捕獲區(qū)，并作為捕獲部分、分析物或其衍生物、靶向試劑和標(biāo)記物之間形成的復(fù)合物的一部分在捕獲區(qū)被捕獲；和d)檢測捕獲區(qū)標(biāo)記物的存在。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于標(biāo)記物可釋放地固定在色譜條聯(lián)接區(qū)，以便使標(biāo)記物在遷移至捕獲區(qū)時與測試液接觸，因而釋放標(biāo)記物使它們與釋放出的靶向試劑結(jié)合。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于是標(biāo)記物而不是靶向試劑可釋放地固定在色譜條上，并且是靶向試劑而不是標(biāo)記物在步驟(b)中與測試液接觸。
6.一種檢測測試液中分析物存在的方法，包括以下步驟a)提供一種色譜條，含有接觸測試液的接觸端和固定在色譜條上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲區(qū)的捕獲部分，該捕獲部分含有能結(jié)合(不是通過核酸堿基對相互作用)分析物或其衍生物的配體/抗-配體結(jié)合對中之一作為所述配體/抗-配體結(jié)合對中的另一個；b)將色譜條與測試液接觸，使分析物或其衍生物通過毛細(xì)管作用遷移至捕獲區(qū)并被捕獲部分捕獲；c)兩者選一(i)將能結(jié)合分析物或其衍生物的靶向試劑與測試液接觸，該靶向試劑具有多個配體，標(biāo)記物和靶向試劑的兩個或更多配體的每個配體結(jié)合，和將色譜條接觸端與測試液接觸，使測試液中被標(biāo)記靶向試劑通過毛細(xì)管作用遷移至捕獲區(qū)并與被捕獲區(qū)捕獲的分析物或其衍生物結(jié)合；或(ii)將色譜條接觸端與含有能結(jié)合分析物或其衍生物的靶向試劑的溶液接觸，該靶向試劑具有多個配體，標(biāo)記物與兩個或更多配體的每個配體結(jié)合，使溶液中被標(biāo)記靶向試劑通過毛細(xì)管作用遷移至捕獲區(qū)，并與被捕獲區(qū)捕獲的分析物或其衍生物結(jié)合；和d)檢測捕獲區(qū)標(biāo)記物的存在。
7.一種測試測試液中分析物存在的方法，包括以下步驟a)提供了一種含有接觸測試液的接觸端和固定在色譜條捕獲區(qū)的捕獲部分的色譜條，該捕獲部分含有能結(jié)合(不是通過核酸堿基對相互作用)分析物或其衍生物的配體/抗-配體結(jié)合對中之一作為所述配體/抗-配體結(jié)合對中的另一個；b)將色譜條的接觸端與測試液接觸，使分析物或其衍生物通過毛細(xì)管作用遷移至捕獲區(qū)，并被捕獲部分捕獲；c)將能結(jié)合分析物或其衍生物的靶向試劑與捕獲部分接觸，使靶向試劑與在捕獲部分捕獲的分析物或其衍生物結(jié)合，該靶向試劑具有多個配體，標(biāo)記物與該靶向試劑的兩個或更多配體的每個配體結(jié)合；和d)檢測捕獲區(qū)標(biāo)記物的存在。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2、6或7所述的方法，其特征在于標(biāo)記物和靶向試劑配體的結(jié)合是在測試液中進(jìn)行的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8中所述的方法，其特征在于標(biāo)記物由標(biāo)記試劑提供的，該標(biāo)記試劑在與該靶向試劑接觸測試液基本相同的時間單獨加入測試液中。
10.根據(jù)權(quán)利要求8中所述的方法，其特征在于靶向試劑在與標(biāo)記物結(jié)合之前與測試液一起預(yù)溫育。
11.根據(jù)前面任一權(quán)利要求中所述的方法，其特征在于多個標(biāo)記物與靶向試劑中至少一個配體結(jié)合。
12.一種檢測測試液中分析物存在的試劑盒，包括i)如權(quán)利要求2所述的色譜條；ii)與色譜條分開的、能結(jié)合分析物或其衍生物的靶向試劑，該靶向試劑具有多個配體，多個標(biāo)記試劑中的每個結(jié)合靶向部分的一個配體，每個標(biāo)記試劑具有一個標(biāo)記物。
13.一種檢測測試液中分析物存在的試劑盒，包括i)如權(quán)利要求3所述的色譜條；ii)能結(jié)合靶向部分一個配體的多個標(biāo)記試劑，每個標(biāo)記試劑具有一個標(biāo)記物。
14.一種檢測測試液中分析物存在的試劑盒，包括i)如權(quán)利要求2或3所述的色譜條；和可釋放地固定在色譜條接觸端和捕獲區(qū)之間的聯(lián)接區(qū)的標(biāo)記試劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于被標(biāo)記靶向試劑是干燥形式。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于標(biāo)記試劑是干燥形式，或根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，當(dāng)靶向試劑與測試條分離時，其中的靶向試劑是干燥形式。
17.根據(jù)權(quán)利要求12至16任一所述的試劑盒，其特征在于靶向試劑含有偶合了多個配體的抗體。
18.根據(jù)權(quán)利要求12至16任一所述的試劑盒，其特征在于靶向試劑含有能結(jié)合分析物或其衍生物的主要部分；和能結(jié)合主要部分的輔助部分，該輔助部分偶合了多個配體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的試劑盒，其特征在于，靶向試劑的主要部分和/或輔助部分是抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求12至19任一所述的試劑盒，其特征在于每個標(biāo)記試劑含有一個被標(biāo)記抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求12至19任一所述的試劑盒，其特征在于每個標(biāo)記試劑含有能結(jié)合靶向試劑配體的主要部分，和能結(jié)合主要部分的被標(biāo)記輔助部分。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其特征在于標(biāo)記試劑的主要部分和/或輔助部分是抗體。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的試劑盒，其特征在于標(biāo)記試劑的主要部分是被標(biāo)記的。
24.根據(jù)權(quán)利要求12至23任一所述的試劑盒，其特征在于標(biāo)記包括肉眼可檢測的標(biāo)記物優(yōu)選有色微粒，或發(fā)光標(biāo)記物，優(yōu)選熒光標(biāo)記物。
25.根據(jù)權(quán)利要求12至24任一所述的試劑盒，其特征在于標(biāo)記物含有能將底物轉(zhuǎn)化為有色或發(fā)光產(chǎn)物優(yōu)選熒光素產(chǎn)物的酶。
26.根據(jù)權(quán)利要求12至25任一所述的試劑盒，其特征在于分析物是CT分析物或HBsAg。
27.根據(jù)權(quán)利要求12至26中任一所述的試劑盒在檢測測試液中分析物存在中的用途。
28.根據(jù)權(quán)利要求1至11任一所述的方法，其特征在于分析物是CT分析物或HBsAg。
29.用于檢測測試液中分析物存在的被標(biāo)記靶向試劑，該被標(biāo)記靶向試劑能結(jié)合分析物或其衍生物，但是不被分析物或其衍生物結(jié)合，其中被標(biāo)記靶向試劑具有多個配體，每種配體能被標(biāo)記物結(jié)合，可利用標(biāo)記物檢測被標(biāo)記靶向試劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的靶向試劑，其特征在于該靶向試劑具有約6-50個配體。
31.根據(jù)權(quán)利要求29或30的靶向試劑在檢測測試液中分析物存在中的用途。
全文摘要
描述了一種檢測分析物的測試條測試法。在優(yōu)選實施方案中，一種能結(jié)合分析物的多生物素化抗體與膠體金標(biāo)記的抗－生物素抗體結(jié)合，和隨被認(rèn)為含分析物的測試液一起通過毛細(xì)管作用沿測試條向上。在分析物、生物素化抗－分析物抗體和膠體金標(biāo)記的抗－生物素抗體之間形成的復(fù)合物在測試條捕獲區(qū)被捕獲。捕獲區(qū)膠體金標(biāo)記物的存在表明測試液中分析物的存在。使用這樣方法檢測分析物的靈敏度比類似方法高一個數(shù)量級，類似方法中與分析物結(jié)合的生物素化抗－分析物抗體在第一步中通過毛細(xì)管作用沿測試條向上，和在另一個步驟中，膠體金標(biāo)記的抗生物素抗體通過毛細(xì)管作用沿測試條向上。同樣還描述了實施本發(fā)明中測試方法的試劑盒。
文檔編號G01N33/558GK1500212SQ01822390
公開日2004年5月26日 申請日期2001年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月30日
發(fā)明者海倫·李, 海倫 李, 阿納斯塔索瓦 迪內(nèi)瓦, 黃凌, 胡, 瑪格達(dá)·阿納斯塔索瓦·迪內(nèi)瓦, 向·云·胡 申請人:海倫·李, 海倫 李