專利名稱：根據(jù)瞬時(shí)電信號(hào)表征樣品中分子間相互作用和運(yùn)動(dòng)的方法和設(shè)備的制作方法
相關(guān)申請的交叉參考根據(jù)35U.S.C.§119(e)，本申請要求2000年10月20日申請的系列號(hào)為60/242,047的美國臨時(shí)申請的優(yōu)先權(quán)，以及2001年4月20日申請的系列號(hào)為60/285,578的美國臨時(shí)申請的優(yōu)先權(quán)；這兩篇申請并入本文作為參考。
背景技術(shù)：
有許多應(yīng)用是希望檢測和/或表征樣品中分子運(yùn)動(dòng)和/或相互作用，如在兩個(gè)或多個(gè)分子間是否存在結(jié)合作用(共價(jià)或非共價(jià))。這樣的應(yīng)用用于不同領(lǐng)域內(nèi)，包括研究和醫(yī)療，如診斷領(lǐng)域。例如，許多研究和臨床診斷方案是以檢測樣品中的分析物為基礎(chǔ)，使用能夠檢測和/或表征一種或多種分析物的存在和/或數(shù)量的機(jī)理，所述分析物是根據(jù)其與互補(bǔ)結(jié)合對成員的結(jié)合而被檢測出。
由于這種應(yīng)用對于廣泛的科目均有重要意義，已經(jīng)發(fā)展出大量的不同方案和方法來實(shí)行這種應(yīng)用。許多方案和方法使用可檢測的標(biāo)記，所述標(biāo)記可以反過來修飾目的分子的特征。其它方法使用間接的化學(xué)或物理測量手段來分析樣品，但是通常在這些方法中，要使用昂貴的復(fù)雜檢測設(shè)備，或者靈敏度非常有限。
因此，仍需要發(fā)展一種新的方法來表征樣品中的分子運(yùn)動(dòng)和/或相互作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了根據(jù)瞬時(shí)電信號(hào)來表征樣品中第一分子和第二固定化(immobilized)分子的方法和設(shè)備。在本方法中，樣品中第一分子相對于第二固定化分子的單向運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生了瞬時(shí)電信號(hào)，檢測這個(gè)電信號(hào)并將其與樣品中第一和第二分子的至少一個(gè)特性相聯(lián)系，如總電量，運(yùn)動(dòng)，速度，數(shù)量，結(jié)構(gòu)，或結(jié)合作用，其中在許多具體實(shí)施方式
中，將由第二分子(結(jié)合位點(diǎn))附近的第一分子的過量電荷所產(chǎn)生的瞬時(shí)電信號(hào)與樣品中的第一和第二分子之間發(fā)生的相互作用相聯(lián)系。本方法和設(shè)備可用于各種應(yīng)用，包括但不限于(1)檢測和/或表征聚合酶催化的模板依賴性引物延伸反應(yīng)，如，核酸測序，SNP檢測，基因表達(dá)圖譜，實(shí)時(shí)PCR等；(2)分析檢測應(yīng)用，如檢測樣品中的蛋白和/或核酸分析物；和(3)表征分子運(yùn)動(dòng)，如測量分子和/或離子的擴(kuò)散長度。


圖1.1和1.2顯示了產(chǎn)生本發(fā)明所利用的瞬時(shí)電信號(hào)的機(jī)理示意圖。
圖1.3(即1.3.a和1.3.b)；1.4(即1.4.a和1.4.b)和1.5(即1.5.a和1.5.b)提供了代表瞬時(shí)電信號(hào)的一些實(shí)例。
圖2.1顯示本發(fā)明的一種具體實(shí)施方式
的系統(tǒng)(即代表性的平面?zhèn)鞲衅飨到y(tǒng))。
圖2.2和2.3顯示使用本發(fā)明實(shí)施方式中的二重電極進(jìn)行的DNA聚合結(jié)果。
圖2.4提供根據(jù)本發(fā)明解釋瞬時(shí)電信號(hào)如何獲得關(guān)于樣品中A和B的定性/定量的信息的實(shí)例。
圖3顯示本發(fā)明在測序應(yīng)用中的示意圖。
圖4∶1到4∶3顯示根據(jù)本發(fā)明的SNP檢測方法示意圖。
圖5顯示可選擇的SNP檢測方法示意圖，其中含有目的SNP序列的PCR產(chǎn)物被檢測。
圖6顯示根據(jù)本發(fā)明的另一SNP檢測方法示意圖。
圖7顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)時(shí)PCR應(yīng)用示意圖。
圖8顯示根據(jù)本發(fā)明的微生物病原檢測方法示意圖。
圖9顯示根據(jù)本發(fā)明的抗體-抗原檢測應(yīng)用示意圖。
圖10顯示根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用試驗(yàn)示意圖。
圖11顯示根據(jù)本發(fā)明的配體-受體試驗(yàn)示意圖。
圖12顯示根據(jù)本發(fā)明的雜交試驗(yàn)示意圖。
圖13顯示根據(jù)本發(fā)明的代表性電極檢測部件示意圖。
圖14顯示本發(fā)明集成硅片裝置的放大圖。
圖15顯示適于檢測模板依賴性引物延伸反應(yīng)的裝置。
圖16顯示適于高處理量蛋白篩選的陣列(array)裝置。
圖17A和17B顯示下面實(shí)驗(yàn)部分中實(shí)施方式1中所用的樣機(jī)設(shè)備圖18A至18E和圖21顯示在下面實(shí)驗(yàn)部分所記載的測序試驗(yàn)的結(jié)果。
圖19A和19B顯示根據(jù)本發(fā)明的基因表達(dá)陣列分析試驗(yàn)的示意圖。
圖20顯示本發(fā)明的試驗(yàn)系統(tǒng)的噪音成份讀數(shù)。
圖22顯示本發(fā)明另一具有代表性的CMOS裝置示意圖。
名詞定義本文所用的術(shù)語“核酸”指由核苷酸如脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸構(gòu)成的大分子。
本文所用的術(shù)語“核糖核酸”和“RNA”指由核糖核苷酸構(gòu)成的大分子。
本文所用的術(shù)語“脫氧核糖核酸”和“DNA”指由脫氧核糖核苷酸構(gòu)成的大分子。
本文所用的術(shù)語“寡核苷酸”指長度約為10-100個(gè)核苷酸的單鏈核苷酸多體本文所用的術(shù)語“多核苷酸”指單鏈或雙鏈大分子，由核苷酸單體構(gòu)成，這些單體長度通常為大于100到約8000或更多個(gè)核苷酸。多核苷酸包括單鏈或多鏈構(gòu)型，其中的一條鏈或多條鏈可能或不可能彼此完全匹配。
“核苷酸”指核酸的亞單位，包括磷酸基團(tuán)，一個(gè)5碳糖和含氮堿基，以及這種亞單位的類似物。
本文所用術(shù)語“多肽”指在一個(gè)氨基酸的羧基基團(tuán)與另一氨基酸的氨基基團(tuán)之間形成酰胺鍵而生成的化合物。
本文所用的術(shù)語“寡肽”指具有少于約10個(gè)至20個(gè)殘基即氨基酸單體單元的肽。
本文所用的術(shù)語“多肽”指具有大于約10個(gè)至20個(gè)殘基的肽。
本文所用術(shù)語“蛋白”指具有大于約50個(gè)殘基的特定序列的多肽。
本文所用術(shù)語“陣列”指具有多個(gè)瞬時(shí)電信號(hào)檢測部件的基質(zhì)，該部件穩(wěn)定地連接在基質(zhì)的表面，其結(jié)合物質(zhì)(binding agent)可以多種不同模式空間地定位在基質(zhì)表面，通常彼此之間是流體分離的。
術(shù)語“結(jié)合物質(zhì)”指任何特異性結(jié)合對的成員的物質(zhì)，其中該物質(zhì)可包括肽，如蛋白或其片段；核酸，如寡核苷酸，多核苷酸；以及諸如此類。
術(shù)語“生物大分子”包括肽或多核苷酸，以及由氨基酸或核苷酸類似物或非核苷酸基團(tuán)構(gòu)成的化合物，或含有氨基酸或核苷酸類似物或非核苷酸基團(tuán)的化合物。這樣，該術(shù)語包括那些常規(guī)多核苷酸骨架被非天然存在的或合成的骨架所取代的化合物，以及那些一個(gè)或多個(gè)常規(guī)堿基被合成的能夠參與形成Watson-Crick型氫鍵的堿基所取代的核酸。
具體實(shí)施例方式
提供根據(jù)瞬時(shí)電信號(hào)表征樣品中第一分子和第二固定化分子的方法和裝置。在本方法中，檢測樣品中由于第一分子相對第二固定化分子的單向運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生(即引起)的瞬時(shí)電信號(hào)，并將該瞬時(shí)電信號(hào)與樣品中第一分子和第二分子的至少一種特征相聯(lián)系，如總電荷，運(yùn)動(dòng)，速度，數(shù)量，結(jié)構(gòu)或結(jié)合作用，在許多具體實(shí)施方式
中，將瞬時(shí)電信號(hào)與樣品中第一和第二分子間的相互作用相聯(lián)系，所述瞬時(shí)電信號(hào)是由臨近第二分子(結(jié)合位點(diǎn))的第一分子的過量電荷所產(chǎn)生。本方法和裝置可用于各種應(yīng)用，包括但不限于(1)檢測和/或表征聚合酶催化的模板依賴性引物延伸反應(yīng)，如用于核酸測序，SNP檢測，基因表達(dá)圖譜，實(shí)時(shí)PCR等；(2)分析檢測應(yīng)用，如樣品中的蛋白檢測和/或核酸分析；以及(3)分析分子運(yùn)動(dòng)，如測量分子和/或離子的擴(kuò)散長度。
在進(jìn)一步詳述本發(fā)明之前，應(yīng)該明白本發(fā)明不限于下面所述的特定具體實(shí)施方式
，因?yàn)榭蓪μ囟?b>具體實(shí)施方式
進(jìn)行各種改變，但是仍然屬于本發(fā)明所要求的范圍。還應(yīng)知道所用的術(shù)語是為了描述特定具體實(shí)施方式
，并非限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求書界定。
在說明書和權(quán)利要求書中，除非另有清楚的說明，單數(shù)形式的“一種”“一個(gè)”“該”均包括復(fù)數(shù)參照。除非另有說明，所用的所有技術(shù)性和科學(xué)性術(shù)語與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知的含義相同。
當(dāng)給定了數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)該理解，除非另有清楚的說明，在該范圍的上限和下限之間的相對于下限單位的十分之一間隔的每個(gè)居間值，以及任何其它已述的或在該范圍之內(nèi)的居間值，均落入本發(fā)明的范圍。這些小范圍的上限和下限可獨(dú)立地包括在這些小范圍之內(nèi)，也可經(jīng)過在規(guī)定范圍內(nèi)特定地排除極限后，包括在本發(fā)明中。在所述范圍包括一個(gè)或二個(gè)端值時(shí)，排除了該一個(gè)或二個(gè)端值的范圍也包括在本發(fā)明中。
除非另有說明，本文所用的所有技術(shù)性和科學(xué)性術(shù)語與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知的含義相同。盡管任何類似或等同于本文所述的方法，裝置和材料可在實(shí)踐中使用或試驗(yàn)本發(fā)明，但現(xiàn)在要描述的是優(yōu)選的方法，裝置和材料。
本文所提及的所有出版物均并入本文作為參考，用于描述及公開本發(fā)明的主要組成，這些組成在這些出版物中均有描述，所述組成可與本發(fā)明結(jié)合使用。
為進(jìn)一步描述本發(fā)明，首先，既科普地又以大量代表性應(yīng)用的術(shù)語形式來詳細(xì)描述本方法。然后，再詳細(xì)地說明實(shí)施本方法的裝置和系統(tǒng)。
方法如上所總結(jié)，本發(fā)明提供用于表征樣品中第一分子和第二固定化分子的方法。為實(shí)施本方法，用第一分子(典型地是多個(gè)相同的第一分子)相對于固定化第二分子(典型地是多個(gè)相同的固定化第二分子)在介質(zhì)中的運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的瞬時(shí)電信號(hào)來表征分子?！跋鄬τ凇笔侵浮俺蚧虮畴x”，這樣，本發(fā)明提供了基于檢測到的瞬時(shí)電信號(hào)基礎(chǔ)上的方法，所述電信號(hào)是由第一分子朝向或背離固定化的第二分子運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生。產(chǎn)生本表征方法所用的被檢測瞬時(shí)電信號(hào)的運(yùn)動(dòng)是單向的。而該運(yùn)動(dòng)可以線性形式，曲線或其它行進(jìn)途徑通過介質(zhì)，但運(yùn)動(dòng)絕不會(huì)向后。這樣，產(chǎn)生被檢測瞬時(shí)電信號(hào)的運(yùn)動(dòng)是第一分子朝向或背離固定化第二分子的單向運(yùn)動(dòng)。
由本發(fā)明表征的分子是存在于樣品介質(zhì)中。在許多具體實(shí)施方式
中，該介質(zhì)是流體，氣體或凝膠狀導(dǎo)電介質(zhì)，其中的分子具有有限的非零遷移率(mobility)，如流動(dòng)的水介質(zhì)，由水流體組份和一種或多種聚合增稠劑構(gòu)成的凝膠介質(zhì)等。
第一和第二分子可以是各種不同類型的分子，包括小分子分析物如半抗原、毒素、激素等，單體如氨基酸和核苷酸，大分子如多肽(如蛋白和其片段、配體、受體)，多糖，核酸如脫氧核糖核酸、核糖核酸，包括寡核苷酸，多核苷酸等。盡管不是所有的具體實(shí)施方式
，但在許多具體實(shí)施方式
中，該第一和第二分子是同類型的分子，如可以都為核酸或都為蛋白。在一些具體實(shí)施方式
中，第二分子是大分子而第一分子可以是也可以不是大分子。特定的第二或固定化目的分子包括但不限于核酸，如DNA或RNA寡-或多核苷酸，以及成分相同的雙鏈結(jié)構(gòu)；蛋白，如抗體或其結(jié)合片段；受體等。在許多實(shí)例中，第一和第二分子是離子，或至少包括離子化的部分，盡管介質(zhì)的總電荷為零，但該部分?jǐn)y帶局部電荷。
如上所述，本發(fā)明是表征樣品中第一和第二分子的方法。表征意味著測定與至少一種表征樣品中第一和第二分子的特征相關(guān)的信息，如分子的總電荷，分子的運(yùn)動(dòng)，分子的速度，分子的數(shù)量，分子的結(jié)構(gòu)，在分子間的結(jié)合作用，分子的解離等。在許多實(shí)施方式中，本方法是表征分子間相互作用的方法，即，分子間的結(jié)合作用(如分子間的共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合)或解離作用。
本發(fā)明的一個(gè)特點(diǎn)是通過以下所述來測定樣品中第一和第二分子的至少一種特征(a)首先檢測所述第一分子在所述導(dǎo)電介質(zhì)樣品內(nèi)相對于第二分子的運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生(即由之引起，因之而得)的瞬時(shí)電信號(hào)；然后(b)將檢測到的瞬時(shí)電信號(hào)與樣品中第一和第二分子的至少一種特征相聯(lián)系，如分子之間發(fā)生的結(jié)合作用，樣品中第一和第二分子的解離。瞬時(shí)電信號(hào)意味著非永久性的、可檢測的、由第一分子相對于第二分子在導(dǎo)電介質(zhì)中的運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的電參數(shù)。由于目的電信號(hào)是瞬時(shí)的，只是在有限時(shí)期內(nèi)存在。在許多實(shí)施方式中，這個(gè)時(shí)期通常約為1分鐘到1微秒，通常約5秒到約10毫秒。另外，該目的瞬時(shí)電信號(hào)并不是穩(wěn)定狀態(tài)的信號(hào)，而是隨時(shí)間改變。換言之，如上所詳述的用于檢測和/或表征第一分子相對于第二分子在導(dǎo)電介質(zhì)中的運(yùn)動(dòng)的、被檢測并利用的信號(hào)參數(shù)，是一種差動(dòng)信號(hào)或參數(shù)，如上所述，該信號(hào)或參數(shù)在檢測期間可被指定作為瞬時(shí)電標(biāo)記，所述的瞬時(shí)電標(biāo)記是由第一分子相對于第二分子在導(dǎo)電介質(zhì)中的運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生或?qū)е?。各種不同的可檢測瞬時(shí)電信號(hào)/參數(shù)都可用于本方法。非限制性地例舉這種信號(hào)，可包括但不限于電壓，電荷，電流，電阻等。如上所述，該信號(hào)是瞬時(shí)地測量并在測量期間內(nèi)隨時(shí)間改變。
本發(fā)明方法利用了瞬時(shí)電信號(hào)，該信號(hào)是由第一分子在樣品介質(zhì)中相對于第二固定化分子的單向運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生，參照圖1.1到圖1.5進(jìn)一步說明。圖1.1和1.2分別顯示當(dāng)?shù)诙肿涌梢苿?dòng)而第一分子固定時(shí)，在流體導(dǎo)電介質(zhì)中的第二分子A(實(shí)際上是多個(gè)第二分子A)和第一分子B(實(shí)際上是多個(gè)第一分子B)。J是B的凈電流強(qiáng)度(net current density)。當(dāng)A和B之間發(fā)生結(jié)合時(shí)，如果A和B在溶液中都是游離的，進(jìn)行凈運(yùn)動(dòng)(net movement)，所以J為0。(參見圖1.1)相反，當(dāng)A是固定的，由于B被A的結(jié)合位點(diǎn)捕獲而使得B本身也被固定，所以就產(chǎn)生B朝向A的擴(kuò)散梯度，這樣就獲得了非零J。(參見圖1.2)如果B有電荷(如B為dNTP離子)，J在介質(zhì)中產(chǎn)生瞬時(shí)電勢和瞬時(shí)電荷，這就產(chǎn)生了可檢測的“信號(hào)/參數(shù)”。這些可檢測的信號(hào)/參數(shù)是瞬時(shí)的，因?yàn)榭购怆x子最終會(huì)朝固定的電荷運(yùn)動(dòng)來屏蔽它，使體系回復(fù)平衡。圖1.3到1.5顯示這種現(xiàn)象所產(chǎn)生的一些電壓的實(shí)例。
通常，目的瞬時(shí)電信號(hào)或參數(shù)是通過監(jiān)測目的樣品介質(zhì)中的瞬時(shí)電信號(hào)來檢測的。目的樣品介質(zhì)通常具有指定的體積，含有第一分子和固定化第二分子。指定的體積可以不相同，但典型地約為5納升到2ml，通常約為5μl到0.1ml，更常用約10μl到0.05ml。特別地，如上所述，監(jiān)測含有第一和第二分子的指定體積的介質(zhì)內(nèi)的目的瞬時(shí)電信號(hào)。
為實(shí)施本方法，可監(jiān)測指定體積的介質(zhì)，以使用任何瞬時(shí)電信號(hào)檢測部件來檢測目的瞬時(shí)電信號(hào)，在許多實(shí)施方式中所用的檢測部件為電極檢測部件，該電極檢測部件包括至少一種工作電極。該工作電極表面上固定有第二分子。該電極可由任何常規(guī)材料制造，所述材料包括金屬、導(dǎo)電大分子、碳、硅、多聚硅等等。該電極上還可涂覆薄層絕緣體，如玻璃、石英等。任何方便的表面附著技術(shù)都可用于將第二分子固定在工作電極表面，根據(jù)表面和第二分子的特性，可采用不同的特定表面附著化學(xué)，其中具有代表性的表面附著技術(shù)包括共價(jià)附著，有時(shí)可通過連接基團(tuán)、非共價(jià)附著，如磁力(如在磁化工作電極上的順磁珠)等。在許多實(shí)施方式中，除了工作電極外，電極檢測還包括參比電極，其中參比電極可由各種不同材料制造，并以各種不同構(gòu)型存在。在一些實(shí)施方式中，電極檢測部件包括多個(gè)不同電極。電極檢測部件的電極可彼此相對構(gòu)型成各種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，只要它們能夠監(jiān)測樣品中由可移動(dòng)分子在樣品介質(zhì)中相對于固定分子的運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的瞬時(shí)電信號(hào)。電極檢測部件包括工作和參比電極，還有其它電極，這些電極可以或可以不具有相同實(shí)質(zhì)，如果不同，則與樣品接觸的表面積要相同。每個(gè)電極的表面積可以不同，典型地約為10cm2到1μm2，通常約4mm2到約0.01mm2。關(guān)于兩個(gè)電極具有實(shí)質(zhì)相同的表面積，如果二者的表面積之間相差低于10％，通常低于2％，則認(rèn)為這兩個(gè)電極的表面積實(shí)質(zhì)相同。
在許多實(shí)施方式中，在電極拓?fù)鋵W(xué)和傳感器中都使用噪音減小部件，其中電極陣列能夠從被檢測的瞬時(shí)電信號(hào)中去除不期望的噪音成分，來獲得去除了噪音的信號(hào)，如同下面更詳細(xì)的說明，然后該信號(hào)可用于表征步驟。例如，在許多實(shí)施方式中，使用了差異放大器，如差異電壓或電流放大器，其從工作和參比電極接收輸入信號(hào)，并提供相對而言或?qū)嵸|(zhì)上去除了噪音的輸出信號(hào)。一個(gè)詳細(xì)的代表性的本發(fā)明系統(tǒng)的實(shí)施方式如圖2.1所示。在圖2.1中，顯示的系統(tǒng)包括導(dǎo)電介質(zhì)樣品17的體積。在導(dǎo)電介質(zhì)溶液中存在著第一分子，其相對于，例如朝向固定化第二分子A運(yùn)動(dòng)。還顯示了電極檢測部件16，其由第一工作電極16a和第二參比電極16b構(gòu)成，其中固定化第二分子B是固定在第一電極16a的表面上。
在圖2.2到2.3中，顯示了圖2.1平面拓?fù)涞膬蓚€(gè)電極系統(tǒng)的實(shí)際結(jié)果。在圖2.2中，分子A(0.1pmol ssDNA)是未激活的(無引物)，這樣在酶的存在下，加入分子B(dNTP)不產(chǎn)生多聚化信號(hào)，但在圖2.3中，分子A是激活的(通過加入引物)，這就產(chǎn)生結(jié)合位點(diǎn)，從而產(chǎn)生可檢測瞬時(shí)電信號(hào)。
如圖2.1所示的系統(tǒng)及其電極檢測部件僅僅是本發(fā)明設(shè)備和系統(tǒng)的一個(gè)代表性實(shí)施方式。在本方法中所使用的電極檢測部件可選用各種不同形式，其中其它具有代表性的形式在下面詳細(xì)描述。
但是在許多實(shí)施方式中，實(shí)施本方法所用的裝置和儀器是這樣的裝置含有至少一個(gè)第一工作電極，該電極上固定有第二分子；一個(gè)驅(qū)動(dòng)器(如差異放大器，在與介質(zhì)接觸的工作和參比電極間產(chǎn)生電荷差異)，用于驅(qū)動(dòng)工作電極(以及任何該驅(qū)動(dòng)器上存在的其它電極)；以及一個(gè)信號(hào)處理器，用于評價(jià)來自工作電極的反應(yīng)并在其基礎(chǔ)上產(chǎn)生瞬時(shí)電信號(hào)。在許多實(shí)施方式中，該裝置還進(jìn)一步包括至少一個(gè)參比電極，信號(hào)處理過程可以評價(jià)來自工作和參比電極的反應(yīng)，并將其進(jìn)行比較來產(chǎn)生瞬時(shí)電信號(hào)。在許多實(shí)施方式中，該設(shè)備還進(jìn)一步包括一個(gè)容納介質(zhì)的工具，在該工具中一個(gè)或多個(gè)電極可與介質(zhì)容納工具中的介質(zhì)相接觸。
在操作中，瞬時(shí)電信號(hào)的檢測部件可以是“被動(dòng)的”或“主動(dòng)的”。被動(dòng)的檢測部件是僅僅被動(dòng)觀察或檢測介質(zhì)中瞬時(shí)電信號(hào)的部件，并不向介質(zhì)和/或檢測部件組分施加任何刺激。而主動(dòng)的檢測部件則向在檢測瞬時(shí)電信號(hào)過程中被檢測的介質(zhì)和/或檢測部件施加刺激。這種用于主動(dòng)檢測部件的目的刺激的實(shí)例包括，但不限于注入電流，電壓干擾，電化學(xué)干擾等。無論檢測部件是主動(dòng)的還是被動(dòng)的，都可以檢測由第一分子在介質(zhì)中相對于第二固定化分子的運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的瞬時(shí)電信號(hào)/參數(shù)。
在本方法中，如上所述檢測目的瞬時(shí)電信號(hào)之后，然后將被檢測的信號(hào)與表征樣品中第一和第二分子的至少一種特征相聯(lián)系，如上所述。換言之，評價(jià)被檢測的瞬時(shí)電信號(hào)以測定樣品中第一和第二分子的特性，如它們是否相互作用，如它們之間的結(jié)合或解離。這種測定可以是定性或者定量的，在一些實(shí)施方式中，被檢測的瞬時(shí)電信號(hào)數(shù)值與第一分子的數(shù)量或數(shù)目成比例，所述第一分子與樣品中的第二或固定分子相互作用。圖2.4顯示一些分析瞬時(shí)信號(hào)的實(shí)例。例如，圖2.4a顯示相互作用分子的數(shù)量如何影響觀察到的瞬時(shí)電信號(hào)。如此，可利用觀察到的瞬時(shí)電信號(hào)來確定相互作用分子的數(shù)量。圖2.4b顯示相互作用的動(dòng)力學(xué)如何影響觀察到的信號(hào)。這樣，可利用觀察到的信號(hào)來確定相互作用的動(dòng)力學(xué)。圖2.5c顯示分子的運(yùn)動(dòng)和擴(kuò)散如何影響被觀察的信號(hào)。這樣，可利用觀察到的信號(hào)來確定樣品中分子的運(yùn)動(dòng)和擴(kuò)散。可分析被檢測信號(hào)或傳感器檢測到的波形的時(shí)間和/或頻率。這個(gè)相關(guān)步驟提供關(guān)于被測樣品中第一和第二分子的至少一種特征的信息。
所獲的樣品中第一和第二分子的至少一種特征的信息可在大量不同應(yīng)用中以不同方式利用。例如，根據(jù)被測到的、由第一分子相對于第二分子的運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的瞬時(shí)電信號(hào)而被檢測出的第一和第二分子的相互作用可用于確定在介質(zhì)中是否存在目的分析物，所述確定可以是定性或定量的，由于在許多實(shí)施方式中被測信號(hào)的強(qiáng)度與樣品中分析物的數(shù)量成比例，所述分析物的運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生了被檢測的瞬時(shí)電信號(hào)。(參見如圖2.4)在一些實(shí)施方式中，被檢測的運(yùn)動(dòng)與結(jié)合作用，即，第一分子和第二固定分子之間的結(jié)合作用的發(fā)生相關(guān)。在其它實(shí)施方式中，被檢測的運(yùn)動(dòng)可用于獲得發(fā)生模板依賴性聚合反應(yīng)的信息，或更具體表征該反應(yīng)，如聚合酶介導(dǎo)的模板依賴性引物延伸反應(yīng)，其中固定化第二分子是模板/引物核酸復(fù)合體，而第一分子是核苷酸。在下面詳述這些代表性的本方法類別和發(fā)現(xiàn)可用的代表性應(yīng)用/方案。檢測/表征模板依賴性引物延伸反應(yīng)在許多實(shí)施方式中，使用本方法獲得的至少一種特征是測定由聚合酶介導(dǎo)的、第一個(gè)核苷酸分子和第二固定化模板/引物核酸復(fù)合體分子之間的模板依賴性引物延伸反應(yīng)。聚合酶介導(dǎo)的模板依賴性引物延伸反應(yīng)指聚合反應(yīng)，其中核苷酸在聚合酶催化的反應(yīng)中共價(jià)地連接到引物3’末端，所述引物含有與模板核酸雜交的核酸，其中與引物核酸末端共價(jià)地連接的特定核苷酸互補(bǔ)于模板核酸中相應(yīng)堿基，如A與T，C與G等。模板依賴性引物延伸反應(yīng)是本領(lǐng)域公知技術(shù)，具有代表性的實(shí)施方式包括USP4,683,202；4,683,195；4,800159；4,965,188和5,512,462中公開的實(shí)施方式，將這些文獻(xiàn)并入本文作為參考。正如本領(lǐng)域公知的，模板和引物核酸可以是RNA或DNA，核苷酸可以是核糖-或脫氧核糖核苷酸，聚合酶可選自大量不同的聚合酶，包括DNA聚合酶，RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶，其中具體成分的特定選擇標(biāo)準(zhǔn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
在一些實(shí)施方式中，第一分子是核苷酸，而固定化第二分子實(shí)際上是由雜交了引物的模板核酸構(gòu)成的復(fù)合體，所述引物含有核酸，如引物，或含有由于預(yù)先加入一種或多種核苷酸而至少部分地被延伸了的核酸的引物。在引物延伸反應(yīng)中，聚合酶，如聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶，催化核苷酸連接到固定化復(fù)合體核酸分子的引物核酸上。核苷酸在介質(zhì)中朝向固定化復(fù)合體的運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生可檢測的瞬時(shí)電信號(hào)，該信號(hào)是由積累的局部電荷所導(dǎo)致并與相互作用相關(guān)，即，與模板依賴性引物延伸反應(yīng)中核苷酸與引物的共價(jià)連接相關(guān)。如此，介質(zhì)中觀察到的瞬時(shí)電信號(hào)可指示在第一和第二分子之間是否發(fā)生相互作用，即，在介質(zhì)中是否發(fā)生了引物延伸反應(yīng)。換句話說，通過監(jiān)測介質(zhì)中的瞬時(shí)電信號(hào)并收集模板附近的瞬時(shí)局部電荷，我們可以了解在介質(zhì)中，特別是在與介質(zhì)接觸的固定化模板/引物復(fù)合體上，是否發(fā)生了模板依賴性引物延伸反應(yīng)。另外，根據(jù)特定的應(yīng)用方案，可以用特定序列來表征模板依賴性引物延伸反應(yīng)，其中不同的核苷酸被加入到引物核酸的3’末端。反應(yīng)速度根據(jù)不同的核苷酸而有所差異，即，反應(yīng)是核苷酸依賴性的，這樣不同核苷酸分子朝向模板的運(yùn)動(dòng)就要依賴于核苷酸朝模板方向的摻入，該特征可在觀察到的瞬時(shí)信號(hào)中檢測出來。
在一些實(shí)施方式中，在介質(zhì)中觀察到的瞬時(shí)電信號(hào)可用于確定在模板依賴性引物延伸反應(yīng)中是否有單個(gè)核苷酸加入到引物核酸的3’末端。在一些實(shí)施方式中，提供了一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)由介質(zhì)、電極檢測系統(tǒng)和固定化的模板核酸/引物核酸復(fù)合體構(gòu)成，在許多實(shí)施方式中該復(fù)合體固定在電極檢測部件的電極表面上。例如，在圖2.1所示的代表性系統(tǒng)中，在電極檢測部件16的電極16a表面上具有模板/引物復(fù)合體，該復(fù)合體表示為B。該固定化的模板/引物復(fù)合體可使用任何常規(guī)技術(shù)固定在電極的表面，如通過共價(jià)或非共價(jià)連接，使用磁珠作為連接子通過磁力連接等等。使用任何常規(guī)技術(shù)將電極16a例如加入或接觸到含有適當(dāng)核苷酸的介質(zhì)17，或?qū)⑦m當(dāng)?shù)暮塑账峒尤氲揭呀?jīng)與電極16a相接觸的介質(zhì)中，系統(tǒng)的介質(zhì)可容納核苷酸。如果核苷酸是如模板指令加入到引物核酸3’末端的正確核苷酸，在介質(zhì)中就產(chǎn)生了瞬時(shí)電信號(hào)和局部電荷。相反地，如果核苷酸不是正確的核苷酸，介質(zhì)中則不產(chǎn)生瞬時(shí)電信號(hào)。如此，檢測瞬時(shí)電信號(hào)可指示在加入的核苷酸和固定化引物/模板復(fù)合體的引物之間發(fā)生了引物延伸反應(yīng)。
上述檢測單個(gè)核苷酸加入到模板依賴性引物延伸反應(yīng)的方法可用于各種不同應(yīng)用。特定的代表性目的應(yīng)用包括核苷酸測序，單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測，微生物學(xué)如病原學(xué)檢測等。為進(jìn)一步說明，下面詳細(xì)介紹這些代表性應(yīng)用。
在核酸測序應(yīng)用中，上述技術(shù)方案可用于測定向引物核酸以每次一個(gè)的方式摻入的核苷酸，并從而測定固定化模板/引物核酸復(fù)合體中模板核酸的序列。在這些實(shí)施方式中，具有待測序列模板的固定化模板/引物復(fù)合體與連續(xù)的介質(zhì)相接觸，該介質(zhì)含有單獨(dú)的核苷酸或dNTP(如dCTP，dTTP，dATP，dGTP)(每次接觸之間都進(jìn)行充分清洗，以去除未結(jié)合的核苷酸)，然后測定每次接觸時(shí)產(chǎn)生的瞬時(shí)電信號(hào)，或沒有產(chǎn)生瞬時(shí)電信號(hào)。根據(jù)觀察到的瞬時(shí)電信號(hào)序列和對產(chǎn)生每個(gè)連續(xù)信號(hào)的連續(xù)介質(zhì)中特定dNTP內(nèi)容物的了解，可以測定固定復(fù)合體的模板序列。例如，當(dāng)模板核酸具有AGTC的序列時(shí)，含有模板的固定復(fù)合體首先與僅含有T的介質(zhì)相接觸。如果出現(xiàn)瞬時(shí)電信號(hào)，則表明T共價(jià)地連接到引物的3’末端，從而得知模板5’末端的第一個(gè)堿基為A。另一方面，如果該復(fù)合體首先與僅含有A的介質(zhì)相接觸，則觀察不到信號(hào)，就可得出結(jié)論模板5’末端的第一個(gè)堿基不是T。通過在測序方法的每個(gè)步驟中與合適的核苷酸相接觸，就可以根據(jù)觀察有無瞬時(shí)電信號(hào)以及信號(hào)的形式輕易地測定出模板的序列。在模板核酸中兩個(gè)相同堿基相互毗鄰的那些實(shí)施方式中，其指示的兩個(gè)互補(bǔ)核苷酸的摻入會(huì)產(chǎn)生不同的瞬時(shí)電信號(hào)，如在時(shí)間和數(shù)量上，與單個(gè)核苷酸摻入所產(chǎn)生的信號(hào)不同。如參見圖2.4。所以，可以輕松地測出序列中相同堿基二核苷酸的部分。以類似的方式，可通過恰當(dāng)?shù)亟忉屍洚a(chǎn)生的瞬時(shí)電信號(hào)來表明三個(gè)或更多相同堿基的序列。通過這種方式，可通過解釋一系列序列瞬時(shí)電信號(hào)而輕松地測定指定核酸的序列，所述信號(hào)是將含有待側(cè)序列模板核酸的復(fù)合體順次地與每種含有單獨(dú)dNTP的介質(zhì)相接觸而產(chǎn)生的。在這些實(shí)施方式中，本方法所用系統(tǒng)中，復(fù)合體的模板或引物可物理地連接到或固定到基質(zhì)上，如電極表面。
在上述各種單核苷酸摻入技術(shù)方案中，在一些實(shí)施方式中，固定化復(fù)合體與含有所有四種可能dNTP的介質(zhì)相接觸，在該實(shí)施方式中，產(chǎn)生的瞬時(shí)電信號(hào)根據(jù)摻入的核苷酸的不同而各不相同，因?yàn)檫@種核苷酸的摻入其本身對觀察到的瞬時(shí)電信號(hào)的作用獨(dú)一無二，由于每種核苷酸的調(diào)節(jié)分子朝向模板運(yùn)動(dòng)的聚合作用速度各不相同。例如，摻入dATP對觀察到的總信號(hào)產(chǎn)生了獨(dú)特的作用，而就其它三種核苷酸而言，每種核苷酸的摻入也對觀察到的總信號(hào)產(chǎn)生了類似的獨(dú)特作用。這樣，觀察的信號(hào)就要依賴于核苷酸摻入的序列，所以可用于直接閱讀模板鏈的序列，該鏈支配著核苷酸共價(jià)地連接到含有核酸的引物3’末端的順序。(這種測序方法也稱為“run-off”模式)。
本方法測定核酸序列的代表性測序方案圖解如圖3。在圖3中，首先獲得含有待測序核酸的樣品。該核酸先變性，然后在將適當(dāng)?shù)囊铩缗c通用序列雜交的引物，該引物在產(chǎn)生PCR產(chǎn)物過程中被導(dǎo)入PCR產(chǎn)物模板3’末端—與核酸雜交之前或之后，將核酸固定到本發(fā)明系統(tǒng)的電極上。在圖3中，獲得的復(fù)合體通過與基因特異性引物5’末端的共價(jià)連接而被固定到電極表面。然后如上所述，將所獲的固定化復(fù)合體核酸與反應(yīng)緩沖液，聚合酶以及一種或多種dNTP反應(yīng)。然后將觀察到的瞬時(shí)電信號(hào)用于測定模板PCR產(chǎn)物鏈的序列，所述瞬時(shí)電信號(hào)由一或多系列的瞬時(shí)電信號(hào)構(gòu)成，這依賴于所用的特定測序方案(如，將單個(gè)核苷酸的連續(xù)反應(yīng)緩沖液與復(fù)合體相接觸(即，單個(gè)核苷酸方法)，或?qū)в腥克姆N核苷酸的反應(yīng)緩沖液與固定化復(fù)合體相接觸(即“run-off”方法))。除PCR產(chǎn)物外，待測序的靶核酸還可以是直接分離自原始樣品的RNA。在一些實(shí)施方式中，分離自原始樣品的RNA與固定在電極表面的特異性引物相接觸。(例如參見圖3)然后如上所述，所獲的復(fù)合體與反應(yīng)緩沖液、聚合酶和dNTP相接觸。該方法還可改進(jìn)為將原始RNA轉(zhuǎn)換為cDNA，然后固定，與特異性引物相接觸以產(chǎn)生引物/模板復(fù)合體，然后再如上所述，與反應(yīng)緩沖液、聚合酶和dNTP相接觸。
本發(fā)明還可應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測。在這些實(shí)施方式中，分析樣品中是否存在SNP。該樣品可以是任何常規(guī)樣品，典型地是獲自待測是否存在SNP的宿主—如哺乳動(dòng)物宿主(包括但不限于寵物，家畜，人等)—的流體樣品，其中流體樣品可以是生物流體，組織樣品制備的流體，如細(xì)胞溶解液等，只要該樣品含有目的SNP即可，如果其中真的存在的話。
圖4.1到4.3提供三種代表性SNP檢測方案的示意圖。在圖4.1的實(shí)施方式中，首先制備待測的合適樣品。提取總RNA后，在如圖4.1所示的實(shí)施方式中，提取的RNA與固定的引物相接觸，該引物在SNP的特定可變核苷酸5’最末端位點(diǎn)與靶RNA雜交(即該引物是SNP特異性引物)。然后將獲得的固定化SNP特異性RNA復(fù)合體與反應(yīng)緩沖液、聚合酶和合適的dNTP相接觸，如果存在SNP，該dNTP將連接到引物3’末端，從而提供瞬時(shí)電信號(hào)。圖4.2提供了多種該方法。圖4.2顯示的方案不同于圖4.1所顯示的，提取的RNA首先處理成cDNA，如使用標(biāo)準(zhǔn)cDNA合成方法。將獲得的cDNA固定到電極上再變性。然后將SNP特異性引物雜交到固定的cDNA鏈上，以獲得固定的復(fù)合體，然后如上所述，將該復(fù)合體與反應(yīng)緩沖液、聚合酶和dNTP相接觸。圖4.3顯示用于高檢測量應(yīng)用的類似SNP檢測技術(shù)。圖5顯示各種上述SNP檢測技術(shù)，其中首先處理樣品以產(chǎn)生含有目的SNP的PCR產(chǎn)物，如果原始樣品中含有SNP的話。首先變性使用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)和適當(dāng)?shù)囊锼@得的該P(yáng)CR產(chǎn)物，所述引物例如在含有目的SNP的原始核酸序列的側(cè)面。然后將獲得的PCR產(chǎn)物固定到電極表面。在固定前或固定后，將PCR產(chǎn)物與SNP特異性引物雜交。再將獲得的固定化復(fù)合體與反應(yīng)緩沖液、聚合酶和dNTP相接觸，并將獲得的任何瞬時(shí)電信號(hào)或不存在電信號(hào)的現(xiàn)象與樣品中是否存在目的SNP相聯(lián)系。
上述SNP檢測技術(shù)在圖6中說明。在圖6中，首先制備固定的復(fù)合體，所述固定復(fù)合體包括有待檢測是否含有SNP的模板DNA鏈和與模板雜交的SNP特異性引物(即與模板雜交的引物，加入到該引物3’的下一核苷酸互補(bǔ)于SNP，如果存在SNP的話)。接下來，將多聚酶和核酸外切酶抗性dNTP—如硫代磷酸鹽修飾的核苷酸如2’-脫氧核苷5’α-[P-硫代](dNTsP)或boranophosphates(2’-脫氧核苷5’α-[P-borano]三磷酸酯)(dNbTP)等，其互補(bǔ)于目的SNP堿基—在引物延伸反應(yīng)條件下與復(fù)合體相接觸，這樣，當(dāng)存在SNP時(shí)，該核酸外切酶抗性dNTP就共價(jià)地連接到引物的3’末端。然后，將該系統(tǒng)與核酸外切酶接觸，該外切酶能夠從3’末端酶切，但不能切割核酸外切酶抗性dNTP。酶切導(dǎo)致核苷酸背離固定的復(fù)合體運(yùn)動(dòng)，并伴隨著瞬時(shí)電信號(hào)。這樣，如果未觀察到瞬時(shí)電信號(hào)就等于存在目的靶SNP，而觀察到瞬時(shí)電信號(hào)就等于不存在SNP。
在另一實(shí)施方式中，本方法可用于實(shí)施實(shí)時(shí)PCR，如圖7所示。將兩種引物中的一種固定到電極上，并將固定的引物與混合物中的模板、另一引物、酶和全部四種dNTP(即GTP，ATP，TTP和CTP)相接觸，就可以定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中被擴(kuò)增的靶物質(zhì)。當(dāng)加入核苷酸并延伸時(shí)，每個(gè)循環(huán)中的靜電反應(yīng)就產(chǎn)生了獨(dú)特的波形，該波形可用于評價(jià)/估測每個(gè)循環(huán)中分子的質(zhì)量。
在另一實(shí)施方式中，本方法可用于檢測樣品中微生物核酸，如病原體微生物物種的核酸，從而檢測出樣品中的微生物。該方法如圖8所示。在圖8所示的方法中，第一個(gè)步驟是提供具有固定化引物的系統(tǒng)，該引物可與待測的每種微生物物種中所發(fā)現(xiàn)的核酸結(jié)合。然后制備待測試的樣品，如來自宿主或疑似攜帶目的微生物物種患者的樣品，并在合適的雜交條件下，如嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與固定化引物接觸，以產(chǎn)生帶有目的微生物物種的復(fù)合體結(jié)構(gòu)。然后，將一種或多種dNTP，包括將要被摻入到引物中的dNTP(如果復(fù)合體存在的話)，與固定化的引物相接觸。如果樣品中存在病原體，將會(huì)形成復(fù)合體，并發(fā)生多聚作用，產(chǎn)生可檢測的瞬時(shí)電信號(hào)。但是，如果在測試的樣品中不存在病原體，就不會(huì)產(chǎn)生復(fù)合體，也不能觀察到瞬時(shí)電信號(hào)。
在基因表達(dá)圖譜中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明范圍。在這些應(yīng)用中，定性地或定量地，通常是定量地，測量樣品中多元表達(dá)基因的存在，如根據(jù)mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或與其數(shù)量成比例的其合成衍生物的存在而測量出，以獲得樣品的表達(dá)圖譜。多元意味著至少2個(gè)，通常至少5個(gè)，更通常至少10個(gè)，可被檢測出表達(dá)的不同基因的數(shù)目還可以更大，如約100個(gè)，約200個(gè)，約300個(gè)，約500個(gè)，約1000個(gè)，約2000個(gè)或更多，這要視特定的技術(shù)方案而定。本發(fā)明在基因表達(dá)圖譜方面的應(yīng)用中，可直接檢測樣品中多元mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，或檢測目的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的衍生物，如RNA或cDNA衍生物，例如cRNA，cDNA等，并用于推導(dǎo)基因表達(dá)圖譜。各種不同的表達(dá)圖譜技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，其中樣品中2個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)圖譜可通過直接察看mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，或來自原始mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cRNA，cDNA，擴(kuò)增DNA等進(jìn)行測定。
在本方法中，將帶有工作電極(該工作電極上帶有靶mRNA(或其核酸衍生物)的特異性引物)的電極檢測部件與待測圖譜的樣品相接觸，其中樣品的原始mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物已如上所述經(jīng)過處理，以產(chǎn)生其RNA或DNA衍生物。每個(gè)待測定表達(dá)的特定基因都使用不同的引物/電極部件。這樣，通過測定待測樣品中100個(gè)不同mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或其核酸衍生物的存在來確定樣品中100個(gè)不同基因的表達(dá)時(shí)，就使用100個(gè)不同的電極檢測部件，其中每個(gè)檢測部件至少含有一個(gè)工作電極，該電極表面上具有至少一個(gè)目的核酸的特異性引物。使用單個(gè)的電極檢測部件時(shí)，每個(gè)不同的部件可以連續(xù)地與樣品接觸，以產(chǎn)生固定的模板/引物結(jié)構(gòu)。或者，使用單個(gè)部件的復(fù)合陣列時(shí)，如存在于一個(gè)陣列上或其它集成裝置上，每個(gè)獨(dú)立的檢測部件都可以同時(shí)與樣品接觸。如果原始樣品表達(dá)目的基因，在檢測部件上就形成模板/引物復(fù)合體。然后，所獲的固定模板/引物結(jié)構(gòu)與反應(yīng)緩沖液、聚合酶和dNTP(通常是全部四種dNTP)接觸，監(jiān)測樣品中的瞬時(shí)電信號(hào)。以這種方法，可輕松地檢測出樣品中的多元基因。使用電極/引物結(jié)構(gòu)陣列，可高處理量地輕松完成基因表達(dá)圖譜。正如下面要詳細(xì)介紹的，在那些使用檢測部件陣列的實(shí)施方式中，通常每個(gè)檢測部件與分離的流體樣品接觸。圖19a和19b提供了兩個(gè)如上所述的代表性的基因表達(dá)圖譜技術(shù)示意圖。除上述應(yīng)用外，還可以例如將總RNA/cDNA與電極陣列上預(yù)先固定的基因特異性引物(探針)孵育。這些在目的堿基上與引物5’/3’特異性排序/延伸的探針在合適的雜交緩沖液中可與RNA/cDNA雜交。然后在逆轉(zhuǎn)錄酶/DNA聚合酶以及全部四種脫氧核苷酸的存在下，將所獲的模板/引物片段用作引物延伸反應(yīng)的底物。當(dāng)摻入核苷酸并進(jìn)行延長時(shí)，同一RNA/cDNA分子基團(tuán)的靜電反應(yīng)產(chǎn)生獨(dú)特的波形，根據(jù)該波形可以鑒定并評價(jià)基因表達(dá)圖譜的分子質(zhì)量。
在本方法實(shí)施過程中，采用標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶介導(dǎo)模板依賴性引物延伸反應(yīng)條件。如此，在本方法中，制備用于測定瞬時(shí)電信號(hào)的介質(zhì)，使其包含所有進(jìn)行所需反應(yīng)必備的組分，該組分至少包括(a)工作電極表面的引物/模板復(fù)合體；(b)dNTP(s)；(c)一定數(shù)量的反應(yīng)緩沖液；以及(d)聚合酶。下述指導(dǎo)基于制備50μl F1總體積反應(yīng)緩沖液。如此，當(dāng)制備不同數(shù)量的總反應(yīng)混合物時(shí)，下述特定數(shù)量可以成比例地改變，這些計(jì)算對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在制備反應(yīng)混合物過程中，工作電極上復(fù)合體結(jié)構(gòu)的數(shù)量典型地至少約為100個(gè)分子，通常至少約為107個(gè)分子，更通常為至少約109個(gè)分子或更多，但典型地不超過1011個(gè)分子，而通常也不超過1011個(gè)分子。反應(yīng)緩沖液中聚合酶的數(shù)量可以改變，但典型地約為1-100U，通常約為5-30U。反應(yīng)緩沖液中還含有一種或多種dNTP，如單一的dNTP，或dATP，dTTP，dCTP，dGTP每種各一定量。在許多實(shí)施方式中，反應(yīng)緩沖液中含有的總dNTP數(shù)量范圍約為1-500nmol，通常約30-50nmol，更常用約35-40nmol，每種特定類型dNTP的相對數(shù)量可相同或不同。反應(yīng)混合物中還含有一定數(shù)量的反應(yīng)緩沖液，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知那些適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)緩沖液。用于制備目的反應(yīng)混合物的反應(yīng)緩沖液數(shù)量典型地為約1mM-10mM，通常約為2mM-5mM。如上所述，上述的數(shù)量適用于1ml反應(yīng)，可以調(diào)整為任意的反應(yīng)體積。這樣的調(diào)整對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。在準(zhǔn)備反應(yīng)混合物過程中，各種組分可以任何順序進(jìn)行結(jié)合。制備反應(yīng)混合物之后，將反應(yīng)混合物處于足以進(jìn)行模板依賴性引物延伸反應(yīng)的條件下。該條件的特征典型地是在持續(xù)恒溫下維持反應(yīng)混合物一段時(shí)間使得反應(yīng)充分發(fā)生。本方法該過程中所維持的反應(yīng)混合物的溫度通常為約4-75℃，常用約為20-43℃，更常用25-37℃。本方法變性的步驟典型地從約1毫秒到約30分鐘，常用約2毫秒-約2分鐘，更常用約2毫秒-約3分鐘。
嚴(yán)謹(jǐn)型(stringent)雜交條件的一個(gè)實(shí)例為50℃或更高溫度雜交，0.1×SSC(15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉)。另一嚴(yán)謹(jǐn)型雜交條件是在42℃溶液中過夜孵育，所述溶液為50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5×Denhardt’s溶液，10％硫酸葡聚糖，和20μg/ml變性的、剪切的鮭魚精子DNA，然后在約65℃，用1×SSC在過濾器中清洗。嚴(yán)謹(jǐn)型雜交條件至少是和上述代表性條件同樣嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件，其中條件應(yīng)該與上述特定嚴(yán)謹(jǐn)型條件相比至少是80％嚴(yán)謹(jǐn)，典型地至少約為90％嚴(yán)謹(jǐn)。本領(lǐng)域公知的其它嚴(yán)謹(jǐn)型雜交條件也可用于鑒定本發(fā)明特定實(shí)施方式的核酸。
上述的反應(yīng)條件僅僅是代表性的適用于實(shí)施本方法的條件，僅僅是說明性目的。如此，并不能限制本發(fā)明的范圍。
上述根據(jù)本發(fā)明檢測模板依賴性引物延伸反應(yīng)的特定應(yīng)用僅僅是本發(fā)明可應(yīng)用的所有各種應(yīng)用的代表。
分析物檢測應(yīng)用除了檢測/表征模板依賴性引物延伸反應(yīng)，本方法還可用于分析物檢測應(yīng)用。在該應(yīng)用中，第一分子是目的分析物，其特異性地結(jié)合固定化第二分子，該應(yīng)用中是通過檢測介質(zhì)中的瞬時(shí)電信號(hào)來檢測這兩個(gè)分子間的結(jié)合作用，所述電信號(hào)由分析物第一分子朝向固定化第二分子進(jìn)行的運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生。由于結(jié)合作用和瞬時(shí)電信號(hào)只有當(dāng)目的分析物存在于被測樣品中時(shí)才會(huì)產(chǎn)生，缺乏目的分析物時(shí)并不產(chǎn)生，所以檢測介質(zhì)中瞬時(shí)電信號(hào)可直接知曉被測樣品中是否存在目的分析物。
在該應(yīng)用中，即使不是定量地，至少可以定性地檢測指定樣品中特定的一種或幾種分析物。在本發(fā)明的分析物檢測應(yīng)用中，將疑似含有目的分析物的樣品與帶有固定分子，如配體的電極接觸，所述配體可特異性地結(jié)合該分析物，監(jiān)測樣品介質(zhì)中的瞬時(shí)電信號(hào)。將樣品維持在合適的溫度，如約4-約30℃，通常約4-約25℃，并維持一定的時(shí)期，如約1min-約180min，這樣如果分析物存在于樣品中，那么將發(fā)生結(jié)合作用。如果目的分析物存在于樣品中，其朝向其固定的配體運(yùn)動(dòng)以與其結(jié)合，并產(chǎn)生瞬時(shí)電信號(hào)。如果不存在分析物，不產(chǎn)生瞬時(shí)電信號(hào)。如此，通過監(jiān)測樣品中是否存在瞬時(shí)電信號(hào)，就可以輕松的確定樣品中是否存在目的分析物。
可使用本方法檢測各種不同分析物，其中代表性的目的分析物包括但不限于多肽分析物，包括蛋白和其片段；核酸包括寡核苷酸和多核苷酸，DNA和RNA；多糖；激素；毒素等。引人注目的特定代表性分析物檢測應(yīng)用包括但不限于抗體-抗原結(jié)合作用檢測應(yīng)用；蛋白-蛋白相互作用；配體-受體應(yīng)用；以及核酸雜交應(yīng)用。每個(gè)代表性應(yīng)用均在下面更詳細(xì)地介紹。
圖9顯示根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行抗原檢測應(yīng)用的示意圖。在該代表性技術(shù)方案中，目的抗原的特異性抗體，或其結(jié)合片段被固定到電極表面。然后將固定的抗體與疑似含有目的抗原分析物的樣品接觸。檢測的瞬時(shí)電信號(hào)就表明樣品中目的抗原分析物的存在。
圖10顯示根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的蛋白-蛋白相互作用試驗(yàn)示意圖。在該應(yīng)用中，已知蛋白“餌(bait)”被固定到電極表面。然后將該電極與含有已知和/或未知蛋白的樣品接觸，通過檢測樣品中的瞬時(shí)電信號(hào)就可檢測出已知的固定餌蛋白與樣品中已知或未知的被捕獲蛋白之間的相互作用。
圖11顯示根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的配體-受體測定技術(shù)示意圖。在圖11所示的技術(shù)方案中，特異性結(jié)合目的受體的配體被固定到電極表面。然后將有待測定是否含有結(jié)合該配體的受體的樣品與該固定配體接觸。檢測接觸后獲得的瞬時(shí)電信號(hào)，并將其與被測樣品中的受體的存在相關(guān)聯(lián)。
圖12顯示根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的雜交試驗(yàn)示意圖，其中通過測定樣品中瞬時(shí)電信號(hào)來測定樣品中核酸分析物的存在，所述電信號(hào)是由核酸探針朝向與探針雜交的固定化核酸靶物質(zhì)的運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分析物檢測方法是以高處理量的形式進(jìn)行，其中可同時(shí)測定樣品中的多個(gè)(如5，10，25，50，100，500，1000，10000或更多)分析物。在這些實(shí)施方式中使用檢測部件陣列，每個(gè)部件均由特定分析物配體構(gòu)成，所述配體固定在電極表面。在這些實(shí)施方式中，在足以使分析物結(jié)合到其相應(yīng)的結(jié)合對成員配體上的條件下，使陣列與待測樣品接觸。通過監(jiān)測樣品中的瞬時(shí)電信號(hào)來檢測陣列表面上結(jié)合復(fù)合體的形成。在許多該陣列的實(shí)施方式中，每個(gè)不同配體/電極結(jié)構(gòu)具有其本身的分離樣品，這樣只有由分析物朝向單個(gè)電極的運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的電信號(hào)才能被觀察到。換言之，本發(fā)明陣列的每個(gè)獨(dú)立工作電極與流體分離的樣品接觸。本發(fā)明代表性陣列裝置在下面詳述。然后可由檢測到的瞬時(shí)電信號(hào)來推導(dǎo)樣品中分析物的存在。
使用本發(fā)明實(shí)施方式中陣列裝置的目的特定分析物檢測應(yīng)用包括雜交試驗(yàn)，其中使用了本發(fā)明的陣列核酸。在這些試驗(yàn)中，首先制備靶核酸樣品，其制備可包括從原始來源中分離mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，還可包括制備這種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酸衍生物以用作靶物質(zhì)。制備樣品后，在雜交條件下，將樣品與陣列相接觸，從而在與探針序列互補(bǔ)的靶核酸之間形成復(fù)合物，所述探針附著在陣列表面。然后可通過檢測每個(gè)典型地流體分離的、與每個(gè)單個(gè)檢測部件相接觸的樣品中的瞬時(shí)電信號(hào)，來檢測是否存在雜交復(fù)合物?？墒褂帽景l(fā)明陣列的目的特異性雜交試驗(yàn)包括基因發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)，差異基因表達(dá)分析試驗(yàn)；核酸測序試驗(yàn)等等。描述在各種應(yīng)用中使用陣列的方法的專利及專利申請包括5,143,854；5,288,644；5,324,633；5,432,049；5,470,710；5,492,806；5,503,980；5,510,270；5,525,464；5,547,839；5,580,732；5,661,028；5,800,992；將其并入本文作為參考。
當(dāng)陣列為多肽結(jié)合物質(zhì)陣列時(shí)，如蛋白陣列，特定的目的應(yīng)用包括分析物檢測/蛋白(proteomics)應(yīng)用，包括4,591,570；5,171,695；5,436,170；5,486,452；5,532,128；6,197,599中所述的，將其并入本文作為參考；還有出版的PCT申請WO99/39210；WO00/04823；WO00/04389；WO00/04390；WO00/54046；WO00/63701；WO01/14425；和WO01/40803；將其美國優(yōu)先權(quán)文件并入本文作為參考。
裝置本發(fā)明還提供用于實(shí)施上述方法的裝置。該裝置包括至少以下組分(1)電極檢測部件；和(2)輸出信號(hào)處理部件。這些部件均在下面詳細(xì)介紹。
本裝置的電極檢測部件包括至少一個(gè)其顯示表面上固定有分子(即第二分子)的工作電極。在許多實(shí)施方式中，該電極檢測部件包括兩個(gè)電極，其中一個(gè)顯示表面上固定有分子(如配體，模板/引物復(fù)合體等)。圖13顯示本發(fā)明簡易的電極檢測部件。在圖13中，傳感器裝置20包括輸出引線22和工作電極24a和參比電極24b。工作電極24a表面上具有固定化第二分子(未顯示)。將傳感器20浸入容器28中容納的樣品26后，使用電極傳感器部件20測定樣品中與工作電極24a上固定化第二分子特異性結(jié)合的分析物的運(yùn)動(dòng)，并產(chǎn)生輸出信號(hào)，通過輸出22將信號(hào)傳出傳感器，例如傳到生產(chǎn)信號(hào)處理部件。如圖所示，集成到傳感器部件上的是差異放大器29。盡管圖13顯示的是單個(gè)傳感器部件，但也可以采用這種電極傳感部件的陣列，例如用于高處理量地測定大量單獨(dú)的樣品，如可在微量滴定板的各孔中找到結(jié)果，如96或384孔板，其中電極傳感部件的陣列可包括單個(gè)傳感部件的相應(yīng)數(shù)目。
在另一實(shí)施方式中，電極傳感部件是集成裝置的一部分，該裝置進(jìn)一步包括樣品容納器具。在許多實(shí)施方式中，該集成的裝置被制成芯片的形式(如“芯片實(shí)驗(yàn)室”)或陣列結(jié)構(gòu)。圖14給出了代表性集成裝置的一部分，該裝置具有芯片或構(gòu)架。在圖14中，顯示了使用CMOS芯片的代表性集成裝置。電極陣列是通過板和/或焊球(球格柵排列包裝(ball grid array packaging)與CMOS芯片電子地相連。傳感器、差異放大器和信號(hào)途徑被嵌入CMOS芯片中，就可在板和或焊球上得到輸出信號(hào)。該電極陣列本身可被置于石英、玻璃或二氧化硅覆蓋的平板上?？墒褂萌魏紊虡I(yè)出售的CMOS過程制備CMOS芯片，考慮必要的性能和每個(gè)傳感器的面積，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖22在下面的實(shí)驗(yàn)部分進(jìn)一步介紹。
集成的陣列裝置如圖15。在圖15中，裝置40含有玻璃基質(zhì)41，在其上存在著第一平面電極42，該電極上固定有引物/模板復(fù)合體43(即平面工作電極)，玻璃基質(zhì)上還存在第二參比電極44。還顯示電極輸出引線46。圖15中顯示的由工作和參比電極構(gòu)成的電極傳感部件存在于陣列之上，該陣列具有多個(gè)這樣的傳感部件，其中每個(gè)傳感部件之間在陣列中均為流體地彼此分離，如，通過低隔斷或本領(lǐng)域公知的其它類型流體屏障。例如參見U.S.PatentNos.5,807,522和5,545,531，這些專利均公開了基質(zhì)表面的流體屏障(將上述專利以及WO 93/17126并入本文作為參考)。在圖15的電極傳感部件中，工作和參比電極可用于觀察由于工作電極表面上的聚合作用而產(chǎn)生的瞬時(shí)電壓，該瞬時(shí)電壓是用于檢測模板依賴性引物延伸反應(yīng)的瞬時(shí)電信號(hào)。
圖16顯示本發(fā)明陣列裝置的另一實(shí)施方式。在圖16的裝置中，陣列包括6個(gè)分離的電極傳感部件V1-V6，每個(gè)用于不同的受體。每個(gè)傳感部件是在陣列表面流體地彼此分離。傳感部件是位于硅基質(zhì)上。在陣列表面配體和受體結(jié)合就產(chǎn)生瞬時(shí)電勢，該信號(hào)可使用電極傳感部件檢測，并用于確定結(jié)合作用的發(fā)生。
還可有其它的裝置構(gòu)型，上述特定的裝置實(shí)施方式僅為說明之用。如上所述，單個(gè)電極傳感裝置和多元復(fù)合體、集成裝置如芯片和陣列裝置均包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
除了上述電極傳感部件之外，本裝置典型地進(jìn)一步含有信號(hào)處理部件，用于從觀察到的瞬時(shí)電信號(hào)中推導(dǎo)樣品中第一和第二分子的至少一個(gè)特征，即，用于將輸出電信號(hào)與樣品中第一和第二分子的至少一個(gè)特征相聯(lián)系。該信號(hào)處理部件典型地含有軟件部分和硬件部分，其中軟件部分是由記錄在計(jì)算機(jī)或處理器可讀儲(chǔ)存介質(zhì)上的適當(dāng)算法構(gòu)成。儲(chǔ)存介質(zhì)上的算法是用于閱讀觀察到的、由裝置的電極傳感部件給出的輸出瞬時(shí)電信號(hào)，并對其進(jìn)行處理，以得到至少一個(gè)期望特征的信息。記錄有算法的計(jì)算機(jī)或處理器可讀儲(chǔ)存介質(zhì)可為任何常規(guī)介質(zhì)，包括CD，DAT，軟盤，RAM，ROM等，所述介質(zhì)能夠被裝置的硬件部分閱讀。
上述集成的裝置可制成各種不同形式，所述形式包括自主式“芯片實(shí)驗(yàn)室”構(gòu)造，除了樣品介質(zhì)容納器具和上述的電極傳感部件之外，該構(gòu)造還含有各種流程、連接等，試劑端口、觀察窗等，都容納在顯微流體(microfluidic)裝置中。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知很多不同的顯微流體(microfluidic)裝置，可對這些裝置進(jìn)行修飾來獲得本發(fā)明的集成裝置。公開各種顯微流體(microfluidic)裝置和結(jié)構(gòu)的代表性美國專利包括但不限于U.S.Patent Nos.6,300,141；6,287,850；6,271,021；6,251,343；6,235,175；6,213,151；6,171,850；6,123,819；6,103,199；6,054,277；和5,976,336，將上述專利并入本文作為參考。
系統(tǒng)本發(fā)明還提供用于實(shí)施本方法的系統(tǒng)。該系統(tǒng)含有一個(gè)如上所述的裝置，以及導(dǎo)電介質(zhì)，如凝膠，氣態(tài)或流態(tài)導(dǎo)電介質(zhì)。另外，該系統(tǒng)還可包括實(shí)施本方法所需的任何試劑，如緩沖液，核苷酸，酶(如Klenow)等。
提供以下實(shí)施方式用作說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)I.DNA測序應(yīng)用A.材料和方法1.寡核苷酸的合成和純化合成寡核苷酸BMPUP(5’-BIOTIN-CGGCGATAAAGGCTATAACGG)(SEQ ID No.01)和MPBDOWN(5’-GTGGAACGCTTTGTCCGGGG)(SEQ IDNo.02)，并用MWG Biotech(High Points，NC，USA)進(jìn)行HPLC純化。
2.體外擴(kuò)增和模板制備使用BMPUP和MBPDOWN進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增pMBP載體的多克隆位點(diǎn)。生物素化的PCR產(chǎn)物被固定到抗生物素蛋白鏈菌素覆蓋的超順磁珠(Dynabeads M280 Streptavidin Dynal A.S.，Oslo，Norway)上。在0.10M NaOH中孵育固定化PCR產(chǎn)物3min，去除上清后得到單鏈DNA。在10mM三乙酸pH7.5，和20Mm乙酸鎂中，測序引物與固定化的ss-DNA鏈雜交。
3.電極實(shí)驗(yàn)中使用金覆蓋的電極。一個(gè)電極由鐵制成(一種磁性材料)，另一個(gè)由銅制成。
4.傳感器介紹測量固定化DNA離子的凈靜電荷的傳感器是簡易的差異電壓放大器。該放大器使用截?cái)嗥鞣€(wěn)定的(chopper-stabilized)操作放大器TLC2652A(如果需要大量成品的話)，在負(fù)反饋構(gòu)型下制造5.電荷測序首先，為固定DNA離子，將鐵電極浸入待用的(primed)并固定化的PCR溶液中。將永磁鐵置于鐵電極頂部以產(chǎn)生磁場來吸引順磁珠，該順磁珠上攜帶著DNA離子(圖17A)。一旦小珠吸附到電極表面(僅用幾秒鐘)，DNA離子就電子地相連到電極上。
然后，將鐵電極從PCR溶液中取出并在室溫下放入反應(yīng)緩沖液中(0.1M三乙酸(pH7.75)，0.5mM EDTA，5mM乙酸鎂，0.1％BSA，1MM dithrithreitol)。如果核苷酸被加入到反應(yīng)緩沖液中，聚合酶將會(huì)向電極上固定化的DNA離子中摻入正確的核苷酸，這(部分地)導(dǎo)致固定化DNA離子的去離子作用。這就導(dǎo)致電極上的靜電荷發(fā)生變化(也就是電荷測序信號(hào))。這個(gè)電荷測序信號(hào)含有靶DNA的遺傳密碼信息。
但遺憾的是，與系統(tǒng)的各種噪音相比，電荷測序信號(hào)太小，從而不能輕松地被收集。因此，將第二電極(由金覆蓋的銅制成)放入反應(yīng)緩沖液。該第二電極用于收集系統(tǒng)中的一般模式噪音(即，緩沖液中電極的一般電壓，背景噪音等)，然后從鐵電極得到的信號(hào)中減去這個(gè)噪音，得到不含噪音的電荷測序信號(hào)，用于閱讀遺傳密碼。參見圖17B。
B.初步結(jié)果1.背景噪音當(dāng)我們將各電極浸入緩沖液，可以從示波器上看到緩沖液的背景噪音加上放大器的噪音。應(yīng)該注意，需要一段時(shí)間(約10秒)才能獲得穩(wěn)定的背景噪音信號(hào)(圖20)。其原因是電極表面的DNA分子正在電離，該過程在鐵電極表面產(chǎn)生一些凈靜電荷(net static charge)。
2.單個(gè)核苷酸摻入在該情況下，只加入一種核苷酸(已知其會(huì)摻入到DNA)，并觀察電脈沖。該信號(hào)(差異放大器輸出)持續(xù)一段時(shí)間(3微秒)，當(dāng)沒有摻入位點(diǎn)時(shí)，該信號(hào)消失。
3.Run-off模式在這里，我們向緩沖液中加入所有的四種核苷酸。正如預(yù)期的，產(chǎn)生了一系列電脈沖(圖21)。所有的摻入在少于1秒的時(shí)間(400ms)內(nèi)發(fā)生。這被理論證明，因?yàn)楹塑账釗饺胨璧臅r(shí)間為幾微秒，而在此，我們使用的DNA分子約為300個(gè)堿基對。
II.300bp DNA片段的樣品電荷-測序延伸標(biāo)記。
在電荷檢測方法中，等位基因-特異性引物/探針被固定到電極或?qū)щ姳砻妫⑴ccDNA孵育以進(jìn)行分析。仔細(xì)清洗后，將帶有固定化ssDNA模板/引物的電極置于含有DNA聚合酶的溶液中。當(dāng)摻入dNTP并進(jìn)行延伸時(shí)，相同DNA分子的靜電反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生獨(dú)特的波形(標(biāo)記)，從中可定量/評價(jià)DNA分子的數(shù)目。
這種化學(xué)作用相對較簡單，因?yàn)槿芤褐兄皇褂昧艘环N酶，而且用于測量凈電荷改變的傳感器的概念也相對簡單。該傳感器還可用標(biāo)準(zhǔn)的CMOS技術(shù)制造，該技術(shù)使得平臺(tái)格外適于設(shè)計(jì)半導(dǎo)體芯片上的傳感器陣列，并可在最小投資下提高處理量，參照圖22。在圖22中，該傳感器(差異放大器)可輕松地在硅上生產(chǎn)(CMOS技術(shù))。用于固定的永磁體可造在芯片上的螺旋感應(yīng)器之外。應(yīng)用這個(gè)平臺(tái)可以生產(chǎn)出單個(gè)的小硅芯片對多個(gè)樣品進(jìn)行測序。為使DNA朝正確的傳感器運(yùn)動(dòng)，可使用可控水平電場來驅(qū)使DNA離子?；蛘?，可將樣品精確地置于正確位點(diǎn)上。
因?yàn)楣潭ɑ疍NA離子的電荷波動(dòng)，該檢測方法還可以是實(shí)時(shí)的，可用于閱讀遺傳密碼，一旦電極被放入含有聚合酶和核苷酸的溶液中，幾乎即刻就可發(fā)生。
該技術(shù)的其它優(yōu)點(diǎn)是可用于電子工程的趨勢改進(jìn)，一是改進(jìn)平臺(tái)設(shè)計(jì)，該設(shè)計(jì)均為電子的，且為芯片級(jí)的，二是可以改進(jìn)模式識(shí)別，模式識(shí)別是交流中常見問題。反應(yīng)的速度與今天的數(shù)據(jù)獲取系統(tǒng)(微秒，與毫微秒相比)相比相對較慢，有許多統(tǒng)計(jì)學(xué)信號(hào)處理方法可解釋該信號(hào)，并提取出信息。本發(fā)明的樣機(jī)建造于Stanford Center for Integrated Systems，并在StanfordGenome Technology Center進(jìn)行了測試，顯示由聚合作用所產(chǎn)生的信號(hào)已足夠高，可通過商業(yè)出售的電子部件輕松地獲取。該實(shí)驗(yàn)顯示即使沒有大量的最佳條件選配，本樣機(jī)的靈敏度與任何應(yīng)用中的光學(xué)檢測系統(tǒng)相同。這意味著電荷測序平臺(tái)是遺傳水平樣品的良好備選。
圖18A-18E顯示實(shí)際觀察到的電荷測序表達(dá)標(biāo)記實(shí)例。
III.基于電荷的檢測系統(tǒng)各種代表性應(yīng)用A.樣品制備
1.RNA抽提使用商業(yè)出售的RNA分離試劑盒提取RNA，該試劑盒是被設(shè)計(jì)成簡便、快速、可靠地從少量細(xì)胞中分離總RNA，如穿刺活檢，分類的細(xì)胞，顯微-全裂的組織，血液或可通過各種由Ambion，Qiagen，Promega等出售的總RNA分離試劑盒而獲得的細(xì)胞系。這些系統(tǒng)結(jié)合了一個(gè)旋轉(zhuǎn)柱和一步或二步RNA提取和結(jié)合方法。該方法通?？稍?小時(shí)或更短時(shí)間內(nèi)制備出待用的RNA。該試劑盒足以收集高質(zhì)量的總RNA用于后續(xù)的基因表達(dá)分析。方法原理通過向樣品中加入RNA抽提緩沖液從細(xì)胞中提取RNA。離心管(spin column)純化RNA，以小體積洗脫純RNA，通常5-10μl，以方便后續(xù)的操作。細(xì)胞樣品仔細(xì)地離心(多數(shù)為2000rpm或約400g離心)5分鐘并完全去除上清來收集細(xì)胞。向細(xì)胞沉淀中加入RNA抽提緩沖液。輕微渦旋來懸浮沉淀。組織樣品向組織樣品中加入200μl RNA抽提緩沖液。使用勻漿器，如Polytron儀器的玻璃-特氟隆勻漿器，在RNA抽提緩沖液中研磨組織，在冰上孵育試管20分鐘。約每10分鐘輕微渦旋試管，向試管中加入1體積(200ml)95-100％的乙醇。簡單混合。在冰上孵育10分鐘。將混合物轉(zhuǎn)移到離心管中，并將離心管置于2ml收集管中。微離心機(jī)中全速旋轉(zhuǎn)離心管和收集管1分鐘。加入200μl RNA抽提緩沖液，并重復(fù)如上所述的微離心機(jī)離心步驟。
將離心管轉(zhuǎn)移到新的1.5ml試管中。直接向離心管的隔膜加入10-20μlRNA抽提緩沖液，等待2分鐘。簡短地離心洗脫RNA。被洗脫的RNA現(xiàn)在可直接使用或保藏在-70℃待用。
2.制備cDNA并固定可在GeneBank(blast@nibi.nlm.nih.gov)中檢索某些基因的序列?？筛鶕?jù)出售商的指南(例如Ambion，Qiange，Promega等)從外周血、組織或細(xì)胞系制備總RNA?？墒褂肧uperScriptTM預(yù)擴(kuò)增系統(tǒng)(Life Technologies)合成DNA第一鏈。合成第一鏈?zhǔn)褂玫腞NA/引物混合物含有RNA和寡(dt)隨機(jī)引物或基因特異性引物。這些cDNA與預(yù)合成基因特異性的、已被固定到電極上的引物孵育，在20mM Tris-HCl(pH7.5)，8mM MgCl2或任何其它雜交緩沖液中進(jìn)行雜交，以用于后面的分析。
3.固定總RNA將預(yù)合成的基因特異性引物(探針)通過不同的固定技術(shù)固定到電極上。抽提出的總RNA與這些探針孵育，在20mM Tris-HCl(pH7.5)，8mM MgCl2或任何其它雜交緩沖液中進(jìn)行雜交，以進(jìn)行后面的分析。
B.測序單鏈DNA(ssDNA)與電極表面的預(yù)先固定的基因特異性引物(探針)孵育。這些探針是特異性排列/延伸引物，其3’端具有目的堿基或序列，用于在合適的雜交緩沖液中使DNA與ssDNA雜交。然后將所獲的固定化模板/引物復(fù)合體作為引物延伸反應(yīng)中的底物，將固定化復(fù)合體與DNA聚合酶和四種脫氧核苷酸，即ATP，GTP，CTP和TTP接觸。參見圖3。當(dāng)摻入核苷酸進(jìn)行延伸時(shí)，相同DNA分子的靜電反應(yīng)就會(huì)產(chǎn)生獨(dú)特的波形，波形對應(yīng)著聚合酶催化的每個(gè)核苷酸的摻入，從該波形可以檢定出每個(gè)摻入的dNTP模式。參見圖18A-E和21。
C.利用總RNA進(jìn)行SNP檢測總RNA與預(yù)先固定在兩個(gè)相同電極上的基因特異性引物(探針)一起孵育。這些探針是特異性排列/延伸引物，其5’端具有目的堿基，用于在合適的雜交緩沖液中與RNA雜交。然后將所獲的模板/引物核酸復(fù)合體或片段作為引物延伸反應(yīng)的底物，該反應(yīng)含有逆轉(zhuǎn)錄酶和特定脫氧核苷酸，如果模板是目的SNP，特定脫氧核苷酸就會(huì)共價(jià)地結(jié)合到引物核酸的3’末端。當(dāng)摻入核苷酸進(jìn)行延長時(shí)，相同RNA分子的靜電反應(yīng)可產(chǎn)生獨(dú)特的波形，從該波形可以確定SNP模式。例如參見圖4.1。
D.使用cDNA檢測SNP合成的cDNA與預(yù)先固定在兩個(gè)相同電極表面上的基因特異性引物(探針)孵育。這些探針是特異性排列/延伸引物，其3’端具有目的堿基，用于在20mM Tris-HCl(pH7.5)，8mM MgCl2或任何其它雜交緩沖液中與單鏈cDNA雜交。然后將所獲的模板/引物核酸復(fù)合體或片段作為引物延伸反應(yīng)的底物，該反應(yīng)含有逆轉(zhuǎn)錄酶和特定脫氧核苷酸，如果存在目的SNP，特定脫氧核苷酸就會(huì)摻入。當(dāng)摻入核苷酸進(jìn)行延長時(shí)，相同DNA分子的靜電反應(yīng)可產(chǎn)生獨(dú)特的波形，從該波形可以確定SNP模式。例如參見圖4.2。
E.使用等位基因特異性引物進(jìn)行SNP檢測將等位基因特異性引物的可能組合與預(yù)先固定在相同電極上的等位基因特異性引物(探針)孵育。這些探針是特異性排列/延伸引物，其3’或5’端具有目的堿基，可在適當(dāng)?shù)碾s交緩沖液中與目的DNA/RNA雜交。然后通過與酶和脫氧核苷酸相接觸，將所獲的模板/引物復(fù)合體核酸或片段作為引物延伸反應(yīng)的底物。當(dāng)摻入核苷酸進(jìn)行延長時(shí)，相同DNA/RNA分子的靜電反應(yīng)可產(chǎn)生獨(dú)特的波形，從該波形可以確定SNP模式。例如參見圖4.3。
F.使用PCR產(chǎn)物檢測SNP預(yù)先生物素化的PCR被固定到抗生物素蛋白鏈菌素覆蓋的超順磁珠DynabeadsTMM280-Streptavidin(Dynal A.S.，Oslo，Norway)上。固定化PCR產(chǎn)物在95℃，水中孵育3min后收集上清，獲得單鏈DNA片段。加入3’端具有目的堿基的特異性排列/延伸引物，使其在20mM Tris-HCl(pH7.5)，8mMMgCl2或任何其它雜交緩沖液中與單鏈DNA雜交。將這些與引物雜交的單鏈DNA分為兩等份，并固定到兩個(gè)不同的電極上。然后通過與聚合酶和特定脫氧核苷酸相接觸，將所獲的模板/引物復(fù)合體核酸或片段作為引物延伸反應(yīng)的底物。當(dāng)摻入核苷酸進(jìn)行延長時(shí)，相同DNA分子的靜電反應(yīng)可產(chǎn)生獨(dú)特的波形，從該波形可以確定SNP模式。例如參見圖5。
G.使用核酸外切酶/降解酶檢測SNP首先將靶核酸與固定在電極上的短寡核苷酸-即探針-雜交，使得該探針的3’或5’末端在目的多態(tài)性核苷酸之前至少還有一個(gè)核苷酸才終止，可檢測靶核酸序列中的多態(tài)性核苷酸的存在。然后，在合適的條件下進(jìn)行延伸反應(yīng)，核酸酶抗性核苷酸(Nuclease Resistant Mucleotide(NRN))，如三磷酸-修飾的核苷酸(2’-脫氧核苷-5’-α-[P-硫代]三磷酸)dNTPs或boranophosphatase(2’-脫氧核苷5’-α-[P-borano-]三磷酸)被摻入到探針的3’或5’末端，相應(yīng)于靶核酸的聚合位點(diǎn)。延伸反應(yīng)完成后，用核酸外切酶在合適的條件下消化雜交分子。在3’或5’端摻入了NRN的探針分子對于核酸酶的活性具有抗性，而3’或5’端未摻入NRN的分子則對核酸酶活性沒有抗性，從而被消化。當(dāng)發(fā)生消化時(shí)，相同DNA/RNA分子的靜電反應(yīng)可產(chǎn)生獨(dú)特的波形，從該波形可以確定SNP模式。例如參見圖6。
H.實(shí)時(shí)PCR先將兩種引物中的一種固定到電極上可以定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中擴(kuò)增的靶核酸。所獲的結(jié)構(gòu)與模板、另一引物、酶和所有四種dNTP接觸。當(dāng)摻入核苷酸進(jìn)行延長時(shí)，每一次循環(huán)中的靜電反應(yīng)可產(chǎn)生獨(dú)特的波形，從該波形可以評價(jià)/估計(jì)每個(gè)循環(huán)中分子的質(zhì)量。例如參見圖7。
I.病原體分類將待測病原體的總RNA/DNA或其擴(kuò)增核酸與存在于電極陣列上的預(yù)固定的病原體特異性引物(探針)相接觸。這些探針是特異性排列/延伸引物，其3’或5’端具有目的堿基，可在適當(dāng)?shù)碾s交緩沖液中與病原體DNA/RNA雜交(如果存在病原體DNA/RNA的話)。然后通過與合適的聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶和所有四種脫氧核苷酸相接觸，將所獲的模板/引物復(fù)合體核酸或片段作為引物延伸反應(yīng)的底物。當(dāng)摻入核苷酸進(jìn)行延長時(shí)，相同DNA/RNA分子的靜電反應(yīng)可產(chǎn)生獨(dú)特的波形，從該波形可以確定并評價(jià)病原體的存在。例如參見圖8。
J.抗原-抗體檢測將一組單或多克隆抗體預(yù)先固定在相同電極的表面。這些抗體與特定抗原具有親合性，然后在適當(dāng)?shù)木彌_液中，將抗體與不同抗原在流體環(huán)境中孵育。當(dāng)抗原和抗體間發(fā)生特異性反應(yīng)時(shí)，相同抗原/抗體分子的靜電反應(yīng)就會(huì)產(chǎn)生獨(dú)特的波形，從該波形可確定抗原/抗體相互作用的模式。例如參見圖9。
K.蛋白-蛋白相互作用將一組標(biāo)記的蛋白預(yù)先固定在相同電極的表面。這些標(biāo)記的蛋白與特定蛋白具有親合性，然后在適當(dāng)?shù)木彌_液中，將標(biāo)記蛋白與不同蛋白在流體環(huán)境中孵育。當(dāng)?shù)鞍组g發(fā)生特異性反應(yīng)時(shí)，相同蛋白-蛋白分子的靜電反應(yīng)就會(huì)產(chǎn)生獨(dú)特的波形，從該波形可確定蛋白-蛋白的相互作用模式。例如參見圖10。
L.配體和受體檢測將一組標(biāo)記的配體或受體預(yù)先固定在相同電極的表面。這些標(biāo)記的配體或受體與特定的配體或受體具有親合性，然后在適當(dāng)?shù)木彌_液中，將標(biāo)記的配體或受體與不同的配體或受體在流體環(huán)境中孵育。當(dāng)配體或受體間發(fā)生特異性反應(yīng)時(shí)，相同配體和受體分子的靜電反應(yīng)就會(huì)產(chǎn)生獨(dú)特的波形，從該波形可確定配體和受體的相互作用模式。例如參見圖11。
M.雜交將ssDNA固定到電極表面，使其接觸一組短的寡核苷酸探針，反復(fù)試驗(yàn)。當(dāng)發(fā)生特異性雜交時(shí)，結(jié)合作用會(huì)產(chǎn)生獨(dú)特的波形，從中可確定互補(bǔ)探針。參見圖12。
N.使用總RNA或cDNA進(jìn)行基因表達(dá)圖譜將總RNA或cDNA與多個(gè)存在于電極表面上的預(yù)固定基因特異性引物(探針)陣列一起孵育。陣列中的每個(gè)電極上存在著不同的基因特異性引物。該基因特異性引物是特異性排列/延伸引物，其5’或3’端具有目的堿基。在適當(dāng)?shù)碾s交緩沖液中，引物陣列與目的RNA雜交。然后通過與逆轉(zhuǎn)錄酶/DNA聚合酶和所有四種脫氧核苷酸相接觸，將所獲的模板/引物復(fù)合體核酸或片段作為引物延伸反應(yīng)的底物。當(dāng)摻入核苷酸進(jìn)行延長時(shí)，相同RNA/cDNA分子的靜電反應(yīng)可產(chǎn)生獨(dú)特的波形，從該波形可以確定并評價(jià)基因表達(dá)圖譜的分子質(zhì)量。例如參見圖19A和19B。
O.使用不同的固定技術(shù)將修飾的模板或寡核苷酸固定到不同的表面(由Au，Ti，Pt或任何其它導(dǎo)電材料制成的平板，針狀物或多孔板)，如抗生物素鏈菌素覆蓋的順磁珠，初級(jí)氨基基團(tuán)，末端磷酸，巰基硅烷(mercapto-silane)，環(huán)氧硅烷衍生物，異硫氰酸鹽，氨苯基或氨丙基衍生的聚賴氨酸，使用異雙功能交聯(lián)劑連接到硫修飾的DNA上，親和素直接定位等等；均屬本領(lǐng)域技術(shù)人員公知常識(shí)。
使用上述各種固定技術(shù)將預(yù)先合成的基因特異性引物(探針)固定到電極上。
將提取的總RNA，PCR產(chǎn)物，cDNA或基因組DNA在20mMTris-HCl(pH7.5)，8mM MgCl2或任何其它雜交緩沖液中與寡核苷酸孵育，使其雜交。然后在逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶存在下(根據(jù)所用的DNA或RNA和特定dNTP來決定使用何種酶)將雜交的模板/引物片段作為引物延伸反應(yīng)的底物。當(dāng)摻入核苷酸進(jìn)行延長時(shí)，相同DNA/RNA分子的靜電反應(yīng)可產(chǎn)生獨(dú)特的波形，從該波形可以確定本發(fā)明的表征中所用模式。例如參見圖19A和19B。
以上結(jié)果和討論說明了一種新的重要的方法來表征樣品中存在的分子。本發(fā)明的方法可用于各種應(yīng)用，包括檢測/表征模板依賴性引物延伸反應(yīng)和分析檢測應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括過程快，裝置簡單，投資低，還適于高處理量的形式。因此，本發(fā)明具有顯著的進(jìn)步。
本文引用的所有的出版物和專利申請均并入本文作為參考。對于任何出版物的引用均由于其先于本申請的申請日公開，而不應(yīng)解釋為本發(fā)明無權(quán)先于這些現(xiàn)有發(fā)明的出版物被授權(quán)。
為清楚地理解本發(fā)明，用例圖和實(shí)施方式詳細(xì)說明了本方法，但是在本發(fā)明的教導(dǎo)下進(jìn)行一些改變和修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，這些修飾和改變?nèi)詫儆诒景l(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.表征導(dǎo)電介質(zhì)樣品中第一分子X和第二固定化分子Y的方法，所述方法包括(a)提供含有所述固定化第二分子Y、所述導(dǎo)電介質(zhì)樣品、以及所述第一分子X的系統(tǒng)；(b)檢測由所述第一分子X在所述導(dǎo)電介質(zhì)樣品內(nèi)相對于所述固定化第二分子Y進(jìn)行的單向運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的瞬時(shí)電信號(hào)；以及(c)將所述檢測的瞬時(shí)電信號(hào)與樣品中所述第一分子X和所述第二分子Y的至少一種特征相聯(lián)系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種特征為運(yùn)動(dòng)、速度、數(shù)量、結(jié)構(gòu)、電荷或結(jié)合作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述運(yùn)動(dòng)是X朝向Y運(yùn)動(dòng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述運(yùn)動(dòng)是X背離Y運(yùn)動(dòng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述導(dǎo)電介質(zhì)樣品是流體介質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述導(dǎo)電介質(zhì)樣品是凝膠或氣態(tài)介質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述固定化的分子Y是大分子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述大分子是多肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述大分子是核酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述固定化第二分子Y是固定在第一工作電極的表面。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述瞬時(shí)電信號(hào)是使用所述第一工作電極和第二參比電極進(jìn)行測量。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述瞬時(shí)電信號(hào)是使用多個(gè)電極進(jìn)行測量，其中多個(gè)電極包括所述第一工作電極。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述瞬時(shí)電信號(hào)是電參數(shù)隨時(shí)間的變化。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述電參數(shù)是電壓。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中電參數(shù)是電流。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述電參數(shù)是積累的電荷。
17.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述電參數(shù)是所述介質(zhì)的阻抗。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第二固定化分子Y是固定在工作電極表面上的大分子，所述導(dǎo)電介質(zhì)樣品是流體介質(zhì)；所述瞬時(shí)電信號(hào)使用第一工作電極和第二參比電極進(jìn)行測量；所述運(yùn)動(dòng)是X朝向Y運(yùn)動(dòng)；所述至少一種特征是X和Y之間的結(jié)合作用。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述固定化的大分子是多肽。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述第一分子X是多肽。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中X和Y是蛋白質(zhì)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中X和Y是受體-配體對。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中X和Y是抗體-抗原對。
24.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述固定化的大分子是核酸。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述第一分子X是核酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述第一分子X是核苷酸。
27.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述方法是通過聚合酶催化模板依賴性引物延伸反應(yīng)，來檢測核苷酸與含有核酸的引物3’末端共價(jià)結(jié)合的方法。
28.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述方法是核酸測序方法。
29.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述方法是檢測樣品中核酸分析物的方法。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述核酸分析物包括SNP。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述方法定量地確定出所述樣品中所述核酸分析物的數(shù)量。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述方法是基因表達(dá)圖譜方法。
33.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述方法是PCR方法。
34.檢測介質(zhì)中發(fā)生聚合酶介導(dǎo)的模板依賴性引物延伸反應(yīng)的方法，所述方法包括(a)提供一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括固定化的由模板和引物核酸構(gòu)成的模板引物雙重核酸，該雙重核酸與所述介質(zhì)相接觸，其中所述介質(zhì)包括聚合酶以及至少一種核苷酸；(b)檢測所述介質(zhì)中所述至少一種核苷酸與所述引物核酸末端的共價(jià)結(jié)合所產(chǎn)生的瞬時(shí)電信號(hào)；以及(c)將所述檢測到的瞬時(shí)電信號(hào)與所述樣品中聚合酶介導(dǎo)的模板依賴性引物延伸反應(yīng)的發(fā)生相聯(lián)系。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述瞬時(shí)電信號(hào)是電參數(shù)隨時(shí)間的變化。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述被檢測的聚合酶介導(dǎo)的模板依賴性引物延伸反應(yīng)是在所述引物核酸3’末端共價(jià)地連接至少一個(gè)核苷酸。
37.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述雙重核酸被固定在第一工作電極的表面。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述瞬時(shí)電信號(hào)是使用所述第一工作電極和第二參比電極進(jìn)行測量。
39.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述瞬時(shí)電信號(hào)是使用多個(gè)電極進(jìn)行測量，所述多個(gè)電極包括所述第一工作電極。
40.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述介質(zhì)是水流體介質(zhì)。
41.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述介質(zhì)僅含有一種類型的核苷酸。
42.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述介質(zhì)含有至少兩種不同類型的核苷酸。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述介質(zhì)含有ATP，GTP，CTP和TTP。
44.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述方法是核酸測序方法。
45.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述方法是檢測核酸分析物的方法，所述方法還進(jìn)一步包括將聚合酶介導(dǎo)的模板依賴性引物延伸反應(yīng)的發(fā)生與所述介質(zhì)中所述核酸分析物的存在相聯(lián)系。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述核酸分析物是SNP。
47.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述核酸分析物是來自病原體有機(jī)體的核酸。
48.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述方法是基因表達(dá)圖譜方法。
49.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述方法是實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR反應(yīng)的方法。
50.測定核酸序列的方法，該方法包括(a)提供含有固定化模板引物雙重核酸的系統(tǒng)，該雙重核酸由所述核酸與引物核酸雜交而成，其中所述固定化的模板引物雙重核酸被固定在工作電極的表面，并與含有聚合酶和至少一種核苷酸的介質(zhì)相接觸；(b)檢測所述介質(zhì)中由至少一個(gè)核苷酸與所述模板核酸的末端共價(jià)連接所產(chǎn)生的瞬時(shí)電信號(hào)；以及(c)利用所述被檢測到的瞬時(shí)電信號(hào)來確定所述核酸的所述序列。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述方法包括制備所述模板引物雙重核酸，然后固定所述雙重核酸。
52.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述方法包括固定所述模板核酸，然后將固定的模板核酸與所述引物核酸雜交。
53.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述方法包括固定所述引物核酸，然后將固定的引物核酸與所述模板核酸雜交。
54.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述介質(zhì)含有一種單一類型的核苷酸，并且所述方法包括兩個(gè)或更多重復(fù)的所述步驟(a)和(b)，以產(chǎn)生多個(gè)瞬時(shí)電信號(hào)，從中可確定出所述核酸的所述序列。
55.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述介質(zhì)含有至少兩種不同核苷酸。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述介質(zhì)含有GTP，ATP，CTP和TTP，所述檢測步驟包括從檢測到的瞬時(shí)電信號(hào)中閱讀所述序列。
57.檢測介質(zhì)中第一分子和固定化第二分子之間發(fā)生結(jié)合作用的方法，所述方法包括(a)提供含有所述固定在工作電極表面的固定化第二分子的體系，并使其與含有所述第一分子的介質(zhì)相接觸；(b)檢測介質(zhì)中由所述第一分子和所述固定化第二分子之間的結(jié)合作用所產(chǎn)生的瞬時(shí)電信號(hào)；以及(c)將所述檢測到的瞬時(shí)電信號(hào)與所述第一和第二分子間發(fā)生的所述結(jié)合作用相關(guān)聯(lián)。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的方法，其中第一和第二分子是蛋白質(zhì)。
59.根據(jù)權(quán)利要求57的方法，其中所述第一和第二分子是受體-配體對。
60.根據(jù)權(quán)利要求57的方法，其中所述第一和第二分子是抗體-抗原對。
61.根據(jù)權(quán)利要求57的方法，其中所述第一和第一分子是核酸。
62.一種儀器，包括(a)一個(gè)介質(zhì)容納器具，該器具容納著帶有第一分子的介質(zhì)；(b)一個(gè)工作電極，其表面上固定有第二分子，其中所述表面與所述介質(zhì)相接觸；(c)一個(gè)驅(qū)動(dòng)器，用于驅(qū)動(dòng)所述工作電極；以及(e)一個(gè)信號(hào)處理器，用于獲得所述第一分子的響應(yīng)并從中產(chǎn)生瞬時(shí)電信號(hào)。
63.根據(jù)權(quán)利要求62的儀器，其中所述儀器進(jìn)一步包括一個(gè)與所述介質(zhì)相接觸的參比電極，并且所述信號(hào)處理器將所述工作電極和參比電極的響應(yīng)進(jìn)行比較以產(chǎn)生所述瞬時(shí)電信號(hào)。
64.根據(jù)權(quán)利要求63的儀器，其中所述驅(qū)動(dòng)器含有差異放大器，以在介質(zhì)中產(chǎn)生所述電極間的電荷差異。
65.根據(jù)權(quán)利要求63的儀器，其中所述工作電極和參比電極存在于半導(dǎo)體基質(zhì)的平坦表面上。
66.用于實(shí)施權(quán)利要求1的方法的裝置，所述裝置包括(a)一個(gè)瞬時(shí)電信號(hào)檢測部件，用于檢測由于所述第一分子X在導(dǎo)電介質(zhì)樣品中相對于所述固定化第二分子Y運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生的瞬時(shí)電信號(hào)；以及(b)計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，該介質(zhì)上記錄著算法，該算法將所述由第一分子X相對于所述固定化第二分子Y運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生的瞬時(shí)電信號(hào)與樣品中所述第一分子X和所述第二分子Y的至少一個(gè)特征相聯(lián)系。
67.根據(jù)權(quán)利要求66的裝置，其中所述至少一個(gè)特征是指運(yùn)動(dòng)，速度，數(shù)量，結(jié)構(gòu)，電荷或結(jié)合作用。
68.根據(jù)權(quán)利要求66的裝置，其中所述至少一個(gè)特征是指所述第一分子X和所述第二分子Y之間的結(jié)合作用。
69.根據(jù)權(quán)利要求66的裝置，其中所述瞬時(shí)電信號(hào)檢測部件含有至少一個(gè)工作電極。
70.根據(jù)權(quán)利要求69的裝置，其中所述瞬時(shí)電信號(hào)檢測部件含有至少一個(gè)工作電極和一個(gè)參比電極。
71.根據(jù)權(quán)利要求69的裝置，其中所述瞬時(shí)電信號(hào)檢測部件含有多個(gè)電極，其中一個(gè)是所述的至少一個(gè)工作電極。
72.根據(jù)權(quán)利要求66的裝置，其中所述裝置進(jìn)一步含有一個(gè)差異放大器。
73.根據(jù)權(quán)利要求72的裝置，其中所述差異放大器是差異電壓放大器。
74.根據(jù)權(quán)利要求72的裝置，其中所述差異放大器是差異電流放大器。
75.根據(jù)權(quán)利要求66的裝置，其中所述裝置進(jìn)一步含有一個(gè)樣品容納器具。
76.根據(jù)權(quán)利要求75的裝置，其中所述裝置是集成的裝置。
77.根據(jù)權(quán)利要求75的裝置，其中所述裝置含有至少兩個(gè)分別的樣品容納器具，每個(gè)器具內(nèi)都具有其本身的瞬時(shí)電信號(hào)檢測部件。
78.根據(jù)權(quán)利要求77的裝置，其中所述裝置具有芯片構(gòu)型。
79.根據(jù)權(quán)利要求77的裝置，其中所述裝置具有陣列構(gòu)型。
80.根據(jù)權(quán)利要求66的裝置，其中所述固定化第二分子Y是大分子。
81.根據(jù)權(quán)利要求80的裝置，其中所述大分子被固定在所述瞬時(shí)電信號(hào)檢測部件的工作電極部分的表面。
82.根據(jù)權(quán)利要求81的裝置，其中所述大分子是多肽。
83.根據(jù)權(quán)利要求81的裝置，其中所述大分子是核酸。
84.用于實(shí)施權(quán)利要求1的方法的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括(a)一個(gè)瞬時(shí)電信號(hào)檢測部件，用于檢測由于第一分子X在導(dǎo)電介質(zhì)樣品中相對于固定化第二分子Y運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生的瞬時(shí)電信號(hào)；(b)存在于計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上的算法，該算法將所述由第一分子X相對于所述固定化第二分子Y運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生的所述瞬時(shí)電信號(hào)與樣品中所述第一分子X和所述第二分子Y的至少一個(gè)特征相聯(lián)系；以及(c)導(dǎo)電介質(zhì)樣品，其中含有第一分子X，該第一分子X與所述固定化第二分子Y相接觸。
85.根據(jù)權(quán)利要求84的系統(tǒng)，其中所述的至少一個(gè)特征是指運(yùn)動(dòng)，速度，數(shù)量，結(jié)構(gòu)，電荷或結(jié)合作用。
86.根據(jù)權(quán)利要求84的系統(tǒng)，其中所述至少一個(gè)特征是指所述第一分子X和所述第二分子Y之間的結(jié)合作用。
87.根據(jù)權(quán)利要求84的系統(tǒng)，其中所述導(dǎo)電介質(zhì)樣品是流體介質(zhì)。
88.根據(jù)權(quán)利要求84的系統(tǒng)，其中所述導(dǎo)電介質(zhì)樣品是凝膠或氣態(tài)介質(zhì)。
89.根據(jù)權(quán)利要求84的系統(tǒng)，其中所述瞬時(shí)電信號(hào)檢測部件含有至少一個(gè)工作電極。
90.根據(jù)權(quán)利要求89的系統(tǒng)，其中所述瞬時(shí)電信號(hào)檢測部件進(jìn)一步含有一個(gè)參比電極。
91.根據(jù)權(quán)利要求89的系統(tǒng)，其中所述瞬時(shí)電信號(hào)檢測部件含有多個(gè)電極，其中所述多個(gè)電極含有所述的至少一個(gè)工作電極。
92.根據(jù)權(quán)利要求84的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)進(jìn)一步含有一個(gè)差異放大器。
93.根據(jù)權(quán)利要求92的系統(tǒng)，其中所述差異放大器是差異電壓放大器。
94.根據(jù)權(quán)利要求92的系統(tǒng)，其中所述差異放大器是差異電流放大器。
95.根據(jù)權(quán)利要求84的系統(tǒng)，其中所述固定化第二分子Y是大分子。
96.根據(jù)權(quán)利要求95的系統(tǒng)，其中所述大分子是多肽。
97.根據(jù)權(quán)利要求95的系統(tǒng)，其中所述大分子是核酸。
98.計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，該介質(zhì)上記錄著算法，該算法用于將所述由第一分子X在導(dǎo)電介質(zhì)中相對于固定化第二分子Y運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生的瞬時(shí)電信號(hào)與樣品中所述第一分子X和所述第二分子Y的至少一個(gè)特征相聯(lián)系。
99.根據(jù)權(quán)利要求98的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中所述至少一個(gè)特征是運(yùn)動(dòng)，速度，數(shù)量，結(jié)構(gòu)，電荷或結(jié)合作用。
100.根據(jù)權(quán)利要求98的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中所述至少一個(gè)特征是所述第一分子X和所述第二分子Y之間的結(jié)合作用。
101.根據(jù)權(quán)利要求98的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中所述固定化第二分子Y是大分子。
102.根據(jù)權(quán)利要求101的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中所述大分子是多肽。
103.根據(jù)權(quán)利要求102的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中所述第一分子X是多肽。
104.根據(jù)權(quán)利要求101的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中所述大分子是核酸。
105.根據(jù)權(quán)利要求104的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中所述第一分子X是核酸。
106.根據(jù)權(quán)利要求104的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中所述第一分子X是核苷酸。
107.根據(jù)權(quán)利要求106的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中所述算法提供所述核苷酸的鑒別。
108.根據(jù)權(quán)利要求106的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中所述算法提供所述固定化核酸的序列。
全文摘要
提供了檢測樣品中瞬時(shí)電信號(hào)的裝置。還提供了含有本裝置的系統(tǒng)。本裝置和系統(tǒng)可用于各種應(yīng)用，特別是用于表征樣品，更特別適于表征樣品中存在的分子。
文檔編號(hào)G01N33/542GK1481441SQ01820586
公開日2004年3月10日 申請日期2001年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月20日
發(fā)明者N·普曼德, A·阿西比, N 普曼德, 鞅 申請人:斯坦福大學(xué)受托管理委員會(huì)