專利名稱：用于產前診斷的蛋白質芯片及制造方法
技術領域：
本發(fā)明用于產前診斷的蛋白質芯片及制造方法，涉及生物芯片技術。蛋白質芯片是一種在固態(tài)基底上有序排布的蛋白質或多肽陣列，以實現對蛋白質進行并行檢測、識別、鑒定和診斷的器件?？蓱糜谏飳W、醫(yī)學及其相關領域。
背景技術：
弓形蟲(Toxoplasma)、風疹(Rubella)、巨細胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)、單純皰疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV，1型和/或2型)是對孕婦進行產前檢查的五項重要指標，簡稱ToRCH。ToRCH是一組廣泛傳播的病原微生物，孕婦由于內分泌的改變和免疫力下降，易發(fā)生原發(fā)感染和復發(fā)感染，并可通過胎盤、產道或母乳傳染給胎兒或新生兒。胎兒感染可導致流產、早產、死胎或胎兒生長遲緩和畸形；新生兒感染可造成智力障礙以及癱瘓、失明、失聰等嚴重后遺癥。其中，子宮內弓形蟲感染可導致新生兒嚴重的中樞神經系統疾病和視覺障礙；風疹感染可導致胎兒死亡或先天性白內障、心臟病、青光眼、耳聾等；CMV感染可誘導肝炎、肺炎或單核細胞增多癥等；HSV感染后雖然通常臨床癥狀不明顯，可是對新生兒或免疫能力不足者可致命。因此五項若在孕期感染，只其中一項即可使胎兒產生嚴重缺陷。ToRCH診斷對于了解孕婦的免疫力和胎兒的健康狀況有著積極的作用，是孕婦必檢的項目之一。
目前臨床上進行ToRCH診斷的方法主要是用酶聯免疫分析技術(Enzyme-Linked Immunoassay，EIA)的方法檢測血清中上述各項的抗體(IgG或IgM)。具體地說，當檢測IgG時，酶標板上包被該項目相應的抗原，與血清中相應的IgG孵育結合，然后加入酶標二抗，最后加入底物顯色，與陰性對照比色以判斷結果；當檢測IgM時，酶標板上包被該項目相應的二抗，與血清中相應的IgM孵育結合，然后依次加入抗原、酶標抗體，最后加入底物顯色，與陰性對照比色以判斷結果。
ToRCH的ELISA試劑盒，目前有兩種，一種是逐項進行檢查，也就是分別需要10個試劑盒將所有的IgM和IgM檢測完畢，每次反應只能檢測一個指標，速度慢，效率低；另一種試劑盒將五項IgG或IgM的指標混合在一起，只要最終比色超過陰性對照，就判斷為感染，但無法確定哪一項指標異常，如果需要確診，還要重新逐項檢測。因此ELISA方法進行ToRCH診斷費時費力，另外，其靈敏度也有局限，實驗中所用底物也是劇毒化學品，對實驗人員造成威脅。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于把ToRCH五項指標的抗原同時點陣于一張玻璃片上，僅僅通過一次反應即可得到多種指標的逐項反應結果，因而大大提高檢測的速度和效率。
本發(fā)明采用了以下兩項專利的技術用于免疫分析的蛋白質芯片(申請?zhí)?1105795.5)；多樣品微陣列生物芯片(申請?zhí)?1112783.X)。利用高速全自動點樣機器人把ToRCH五項指標的抗原以及陽性對照、陰性對照點陣于多樣品微陣列生物芯片的同一個腔室內，蛋白質通過化學鍵連接于固相載體(經戊二醛活化的玻璃)上而被固定，多樣品微陣列生物芯片的每一個腔室均點陣了上述五項指標的抗原。
ToRCH五項指標分別為弓形蟲、風疹、巨細胞病毒、單純皰疹病(1型和2型)；在固相載體上點陣的抗原為純化的上述寄生蟲或病毒的特征性抗原。陰性對照采用牛血清白蛋白(Bovine SerumAlbumin，BSA)，陽性對照采用人類免疫球蛋白G或M(IgG/IgM)，將病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的抗體分別與固定在芯片上的相對應的抗原結合，洗去未結合的其他物質后，加入熒光標記的二抗，在測血清IgG的腔室里，二抗采用抗IgG二抗，在測血清IgM的腔室里，采用抗IgM二抗。洗去未結合的二抗，樣品點的熒光強度與血清中抗體濃度大小成正比。用這種蛋白質芯片可以分別檢測到血清中針對ToRCH五項指標的IgG和IgM。
用于產前診斷的蛋白質芯片的制造方法(1)根據樣品數目選擇合適的多樣品微陣列生物芯片，確定每個樣品對應的檢測IgG和IgM的腔室，作好記號，并確定點陣的排列方式和點樣位置；(2)點樣針從多孔板取出蛋白質樣品(各項指標的抗原)后直接高密度點印于醛基化的玻璃片上；(3)室溫過夜或37℃溫育1小時，使蛋白質的氨基和玻璃片上的醛基發(fā)生縮合反應，以固定樣品；(4)利用制作蛋白質芯片的常規(guī)方法封閉、洗滌、干燥、包裝、保存。
用于產前診斷的蛋白質芯片的使用方法(1)在點好樣的芯片上滴加病人血清樣品，37℃溫育1小時，使抗原抗體充分反應；(2)用低濃度鈉離子鹽為主的洗脫液洗去多余樣品，室溫晾干；(3)加封阻液封阻并再次洗凈晾干；(4)滴加以封阻液稀釋過的熒光標記二抗，在測血清IgG的腔室里，二抗采用抗IgG二抗，在測血清IgM的腔室里，采用抗IgM二抗；(5)37℃避光溫育30分鐘。洗凈并室溫晾干；(6)反應結束后，對芯片進行讀取和分析。
由于采用了多樣品微陣列生物芯片技術，可以同時檢測多個人份的ToRCH指標。
本發(fā)明實現了把ToRCH五項指標的抗原同時點陣于一張玻璃片上，僅僅通過一次反應即可得到多種指標的逐項反應結果，因而大大提高了檢測的速度和效率；靈敏度比傳統方法提高了約5-10倍；秉承了傳統ELISA方法的高度特異性，檢測結果穩(wěn)定，可靠性高；工藝簡單，操作安全，不僅效率高而且降低了成本，從而使診斷費用降低，實用性強。


圖1用本發(fā)明可分別檢測到血清中針對ToRCH五項指標的IgG和IgM原理圖。
圖2多樣品微陣列生物芯片外觀圖。
圖3點樣陣列圖。
圖4該病人風疹感染圖示。
圖5該病人CMV急性感染圖示。
具體實施例方式
如圖1用本發(fā)明可分別檢測到血清中針對ToRCH五項指標的IgG和IgM原理圖，圖2多樣品微陣列生物芯片外觀圖，圖3點樣陣列圖所示，用于產前診斷的蛋白質芯片，是將純化的弓形蟲、風疹、巨細胞病毒、單純皰疹病毒(包括1型和2型)五項指標的特征性抗原以及陽性對照、陰性對照點陣于多樣品微陣列生物芯片的同一個腔室內，蛋白質通過化學鍵連接于固相載體上而被固定，多樣品微陣列生物芯片的每一個腔室均點陣了上述五項指標的抗原。其中，陰性對照采用牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)，陽性對照采用人類免疫球蛋白G或M(IgG/IgM)。
如圖1，將病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的被測抗體分別與固定在芯片上的相對應的固相抗原結合，洗去未結合的其他物質后，加入熒光標記的二抗，在測血清IgG的腔室里，二抗采用抗IgG二抗，在測血清IgM的腔室里，采用抗IgM二抗；洗去未結合的二抗，樣品點的熒光強度與血清中抗體濃度大小成正比。
本發(fā)明用于產前診斷的蛋白質芯片的制造方法(1)根據樣品數目選擇合適的多樣品微陣列生物芯片，確定每個樣品對應的檢測IgG和IgM的腔室，作好記號，并確定點陣的排列方式和點樣位置；(2)點樣針從多孔板取出蛋白質樣品(各項指標的抗原)后直接高密度點印于醛基化的玻璃片上；(3)室溫過夜或37℃溫育1小時，使蛋白質的氨基和玻璃片上的醛基發(fā)生縮合反應，以固定樣品；(4)利用制作蛋白質芯片的常規(guī)方法封閉、洗滌、干燥、包裝、保存。
用于產前診斷的蛋白質芯片的使用方法(1)在點好樣的芯片上滴加病人血清樣品，37℃溫育1小時，使抗原抗體充分反應；(2)用低濃度鈉離子鹽為主的洗脫液洗去多余樣品，室溫晾干；(3)加封阻液封阻并再次洗凈晾干；(4)滴加以封阻液稀釋過的熒光標記二抗，在測血清IgG的腔室里，二抗采用抗IgG二抗，在測血清IgM的腔室里，采用抗IgM二抗；(5)37℃避光溫育30分鐘，洗凈并室溫晾干；(6)反應結束后，利用專業(yè)的芯片掃描分析儀進行結果的判讀和分析。
本實施例采用1×2的微陣列生物芯片，外觀如圖2所示，對某病人進行ToRCH檢查，在兩個腔室內同時按圖3點樣，檢測后該病人風疹抗體IgG陽性，如圖4所示，表明該病人曾經感染過風疹；CMV抗體IgM陽性，如圖5所示，表明該病人處于CMV急性感染期。
使用本發(fā)明進行檢測，具有省時、省力，準確度高的特點。
權利要求
1.一種用于產前診斷的蛋白質芯片，其特征在于將弓形蟲、風疹、巨細胞病毒、單純皰疹病毒五項指標的抗原以及陽性對照、陰性對照點陣于多樣品微陣列生物芯片的同一個腔室內，蛋白質通過化學鍵連接于固相載體上而被固定，多樣品微陣列生物芯片的每一個腔室均點陣了上述五項指標的抗原。
2.根據權利要求1所述的用于產前診斷的蛋白質芯片，其特征在于所述在固相載體上點陣的抗原為純化的上述寄生蟲或病毒的特征性抗原。
3.根據權利要求1、2所述的用于產前診斷的蛋白質芯片，其特征在于陰性對照采用牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)，陽性對照采用人類免疫球蛋白G或M(IgG/IgM)。
4.用于產前診斷的蛋白質芯片的用途，其特征在于將病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的抗體分別與固定在芯片上的相對應的抗原結合，洗去未結合的其他物質后，加入熒光標記的二抗，在測血清IgG的腔室里，二抗采用抗IgG二抗，在測血清IgM的腔室里，采用抗IgM二抗；洗去未結合的二抗，樣品點的熒光強度與血清中抗體濃度大小成正比。
5.用于產前診斷的蛋白質芯片的制造方法，其特征在于(1)根據樣品數目選擇合適的多樣品微陣列生物芯片，確定每個樣品對應的檢測IgG和IgM的腔室，作好記號，并確定點陣的排列方式和點樣位置；(2)點樣針從多孔板取出蛋白質樣品(各項指標的抗原)后直接高密度點印于醛基化的玻璃片上；(3)室溫過夜或37℃溫育1小時，使蛋白質的氨基和玻璃片上的醛基發(fā)生縮合反應，以固定樣品；(4)利用制作蛋白質芯片的常規(guī)方法封閉、洗滌、干燥、包裝、保存。
6.用于產前診斷的蛋白質芯片的使用方法，其特征在于(1)在點好樣的芯片上滴加病人血清樣品，37℃溫育1小時，使抗原抗體充分反應；(2)用低濃度鈉離子鹽為主的洗脫液洗去多余樣品，室溫晾干；(3)加封阻液封阻并再次洗凈晾干；(4)滴加以封阻液稀釋過的熒光標記二抗，在測血清IgG的腔室里，二抗采用抗IgG二抗，在測血清IgM的腔室里，采用抗IgM二抗；(5)37℃避光溫育30分鐘，洗凈并室溫晾干；(6)反應結束后，對芯片進行讀取和分析。
全文摘要
本發(fā)明用于產前診斷的蛋白質芯片及制造方法,涉及生物芯片技術,蛋白質芯片是一種在固態(tài)基底上有序排布的蛋白質或多肽陣列,以實現對蛋白質進行并行檢測、識別、鑒定和診斷的器件。本發(fā)明用于產前診斷的蛋白質芯片,是將弓形蟲、風疹、巨細胞病毒、單純皰疹病毒(1型和2型)五項指標的抗原以及陽性對照、陰性對照點陣于多樣品微陣列生物芯片的同一個腔室內,蛋白質通過化學鍵連接于固相載體上而被固定,多樣品微陣列生物芯片的每一個腔室均點陣了上述五項指標的抗原。本發(fā)明實現了把ToRCH五項指標的抗原同時點陣于一張玻璃片上,僅通過一次反應即可得到多種指標的逐項反應結果,大大提高了檢測速度、效率和靈敏度;檢測結果穩(wěn)定、可靠;操作安全。
文檔編號G01N33/68GK1330271SQ0112611
公開日2002年1月9日 申請日期2001年7月12日 優(yōu)先權日2001年7月12日
發(fā)明者張濤, 李賓, 彭永濟, 任一萍, 葛海鵬, 鄧富橋 申請人:上海晶泰生物技術有限公司