專利名稱：用于生物材料標(biāo)記的稀土納米粒子、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可用于生物材料標(biāo)記的稀土納米粒子材料、其制備方法及用途。具體地講，本發(fā)明涉及一種可用于生物材料標(biāo)記的、被聚合物包被的稀土納米粒子材料、其制備方法及用途。
生物材料如DNA、多肽、蛋白質(zhì)、細胞及組織等本身缺少可以用來進行檢測的性質(zhì)。在生命科學(xué)研究或臨床診斷中常需要對這些材料進行標(biāo)記，以使其具有放射性、熒光或化學(xué)發(fā)光等性質(zhì)。熒光標(biāo)記法是目前普遍采用的一種方法。目前，常用的熒光材料主要是有機染料，如異硫氰基熒光素(FITC)、四乙基羅丹明(RB 200)等。有機染料熒光光譜的缺點是激發(fā)峰比較窄，斯托克斯位移小，發(fā)光時間短，易于光漂白，這使得有機熒光標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用受到很大限制。
目前，有許多報道利用熒光微球作為抗體(抗原)分子的熒光標(biāo)記物。例如，用二萘嵌苯微球(0.8-1μm)作為熒光標(biāo)記物，與抗體相連后溶于水溶液中，可以定量檢測抗原的濃度。而量子點納米微球由于其量子限制效應(yīng)，具有光譜激發(fā)峰寬、發(fā)射峰窄、發(fā)光時間不易被光漂白等特點，適合作為一種理想的熒光標(biāo)記材料。Chan和Marcel報道了分別將不同的量子點納米微球用于生物分子的標(biāo)記。但是，由于制備量子點納米微球的條件很苛刻，且成本昂貴，使它的應(yīng)用程度也受到了很大的限制。
美國專利US5,990,479中提出了用一種納米晶半導(dǎo)體來作為熒光探針。其所采用的半導(dǎo)體為MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe和HgTe等。
眾所周知，稀土類固體材料熒光強度高，熒光壽命長(很多材料的壽命可達到毫秒到分鐘數(shù)量級)，斯托克斯位移大，且品種繁多，合成方法簡便，成本低廉，是一類使用范圍極廣的熒光材料。但是，目前稀土材料通常是由高溫合成的，多為塊狀材料。其中某些成分溶于水，如其硼酸鹽、鋁酸鹽等，在水溶液中應(yīng)用時會導(dǎo)致這些磷光體部分溶解于水而失去發(fā)出熒光的特性，因此不宜直接作為生物材料的熒光標(biāo)記物。同時，還存在無機的稀土材料與生物材料連接強度問題，以及連接后如何保持生物材料的活性問題。
與US5,990,479半導(dǎo)體納米熒光探針不同，本發(fā)明提出一種稀土或摻雜稀土的納米粒子作為生物材料的熒光探針。其發(fā)光機理與稀土的f層電子的形變有關(guān)。
本發(fā)明的目的就是提供一種可應(yīng)用于水溶液中的、與生物材料連接較好的標(biāo)記生物材料的稀土納米粒子。
本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述稀土納米粒子的方法。
本發(fā)明還有一個目的是將上述的稀土納米粒子應(yīng)用于生物材料的檢測。
在本發(fā)明中，可用作類熒光探針的稀土納米粒子可以是一種稀土或者幾種稀土組成的混合物，也可以是稀土摻雜于其它非稀土元素中所形成的混合物，如摻雜于硫化物、磷酸鹽、鋁酸鹽、硼酸鹽等物質(zhì)中。具體地說，本發(fā)明的稀土納米粒子的成分可以選自下列各復(fù)合物質(zhì)中的一種或數(shù)種SrAl2O4Eu2+；SrAl2O4Eu2++Dy3+；Y2O3Eu3+；CaSEu3+；CaSEu3++X，其中X＝Tm3+、Y3+或Al3+；ZnSY，其中Y＝Eu3+、Mn2+、Cu2+、Ag+和/或Au+；Gd2O3Eu3+；La2O3Eu3+；MgB5O10Ce3++Gd3+；SrB4O7Sm2+和/或Gd3(PO4)2Eu3+。在上述各表達式中，Mn+表示摻雜的稀土。
本發(fā)明稀土粒子具有很強的熒光強度，其形狀可以是球形、棒狀、立方體、長方體或者前幾種的任意組合形狀。粒徑大小可在3納米到400納米之間，適宜的粒徑大小在5-100納米之間。最佳的范圍是經(jīng)下面包被處理后，粒子的大小在5-100納米之間。熒光納米粒子粒徑分布比較窄，粒徑分布在±20％內(nèi)，最好在±15％之內(nèi)。
本發(fā)明中，為使稀土納米粒子熒光材料不被所應(yīng)用體系中的溶液腐蝕或溶解，從而導(dǎo)致熒光強度下降，應(yīng)當(dāng)對稀土納米粒子材料進行包被。即在所說的稀土納米粒子的表面被包被上一層聚合物膜或無機物膜，以保護稀土納米粒子。
包被的方法基本上有三種有機單體聚合法、有機硅烷水解法以及吸附法。
利用有機單體聚合法所得的聚合物膜的表面需經(jīng)功能化處理，使不同的功能基團如氨基、羧基、羥基、醛基和/或環(huán)氧基等連接于粒子的表面，從而使包覆后的稀土納米粒子可以與生物材料進行有效地連接。
有機單體聚合法的包被層是由下列各種單體中的一種或多種組分組成的總的有機單體通過懸浮聚合而得1.包覆單體分子中僅含有一個可以進行自由基聚合的碳-碳雙鍵；2.交聯(lián)劑分子中含有2個或2個以上的可以進行自由基聚合的碳-碳雙鍵。加入交聯(lián)劑的目的是使得表面包被層中含有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但該單體的加入是任選的；3.功能化試劑分子中同時含可以進行自由基聚合的碳-碳雙鍵以及功能化基團。這些功能化基團可以是氨基、羧基、羥基、醛基或環(huán)氧基等。通過這些功能基團，稀土納米熒光探針可以方便地與生物材料連接；4.偶聯(lián)劑一端含有強極性的磷酰氧基團，跟稀土具有強的絡(luò)合作用，而另一端含有長鏈及可以與其它單體共聚的雙鍵。由于稀土納米粒子的表面極性強，而聚合物的極性較弱，為了使聚合物能夠完全包覆于稀土納米粒子的表面，還可以加入上述偶聯(lián)劑。這樣，前面所述的聚合單體如包覆單體、交聯(lián)劑、功能化試劑等可以先吸附于微粒表面，再進行聚合，結(jié)果是可以得到分布均勻的聚合物包覆層。而純的聚合單體則很少形成新的聚合物顆粒。
在本發(fā)明中，包覆單體通常選自下列組中的一種或多種丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸-2-羥乙酯、丙烯酸-2-羥乙酯、乙二醇單環(huán)氧丙烯酸酯、乙二醇單丙烯酸酯、三乙二醇二丙烯酸酯、乙二醇二丙烯酸酯和苯乙烯等。
本發(fā)明的交聯(lián)劑通常選自下列組中的一種或多種二乙烯苯、乙二醇二丙烯酸酯、二乙二醇二丙烯酸酯、三乙二醇二丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三丙烯酸酯、季戊四醇二丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯等。
本發(fā)明的功能化試劑通常選自下列組中的一種或多種丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯醛、丙烯酰胺、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-醛基丙基三乙氧基硅烷、3-胺基丙基三乙氧基硅烷、3-巰基丙基三乙氧基硅烷、甲基丙烯酸-2-羥乙酯、丙烯酸-2-羥乙酯、甲基丙烯酸-2-胺乙酯、乙二醇雙還氧單丙烯酸酯、3-環(huán)氧基丙基三乙基硅烷等。
本發(fā)明所選的偶聯(lián)劑可以是磷酸雙-(三羥甲基丙烷二丙烯酸酯)、磷酸雙-(甲基丙烯酸-2-羥乙酯)和/或磷酸雙-(季戊四醇三丙烯酸酯)等。
除了上述采用聚合方法在稀土納米粒子上包被聚合物層外，另一種在稀土納米粒子上進行包被的方法是有機硅烷水解法。該方法首先用硅酸烷基酯在稀土納米粒子上經(jīng)水解形成二氧化硅層，然后再用有機硅烷如三乙氧基-3-氨基丙基硅烷、三乙氧基-3-醛基丙基硅烷、三乙氧基-3-巰基丙基硅烷和/或四乙氧基硅烷等進行功能化處理，以便包被后的稀土納米粒子與生物材料繼續(xù)更好地連接。
另外，還可以直接在稀土納米粒子表面上吸附氨基葡聚糖、聚甲基丙烯酸、環(huán)氧葡聚糖和/或磷脂等，形成包被層。
采用有機單體聚合法制備用于標(biāo)記生物材料的稀土納米粒子時，主要包括如下步驟(1)制備粒徑在3-400nm之間的稀土納米粒子；(2)將步驟(1)制備的稀土粒子加入到有機溶劑中；(3)在步驟(2)所得的混合物中加入總的有機單體和聚合引發(fā)劑，進行懸浮聚合，使得稀土納米粒子表面包覆一層聚合物膜。
本發(fā)明步驟(1)中的3-400nm之間的稀土納米粒子可以利用多種制備納米粒子方法制得，例如溶膠-凝膠法、沉淀法、燃燒法、水熱法、高溫沉淀法、微波法等。為了獲得最強的熒光強度，制得的納米粒子在較高的溫度下加熱使納米粒子晶格排列整齊。為了獲得較窄的粒徑范圍的粒子，可以對所得的微粒進行粒度分級。
本發(fā)明所涉及的聚合反應(yīng)通常在有機溶劑中通過懸浮聚合完成。步驟(2)所選用的有機溶劑可以為甲苯、二甲苯和/或四氫呋喃等。
為了使步驟(1)中制得的顆粒在上述有機溶劑中充分分散，通常還要加入表面活性劑。表面活性劑可以是非離子表面活性劑和/或陰離子表面活性劑，如烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10，OP-15)、十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉等。表面活性劑在有機溶劑中的含量為0～5體積％，優(yōu)選的含量為0.1～5體積％。
在上述制備過程的步驟(3)中，由于稀土納米粒子的表面極性強，而聚合物的極性較弱，為使聚合物完全包覆于稀土微粒表面，可以加入偶聯(lián)劑。所加的偶聯(lián)劑可以是磷酸雙-(三羥甲基丙烷二丙烯酸酯)、磷酸雙-(甲基丙烯酸2-羥乙酯)和/或磷酸雙-(季戊四醇三丙烯酸酯)等。
步驟(3)的包覆是通過聚合反應(yīng)形成一層聚合物包被層進行的，它比較適合于含有水溶性組分的稀土納米微粒。在該步驟中，加入合適的包覆單體以及交聯(lián)劑、功能化試劑與偶聯(lián)劑，使各單體分散到稀土納米顆粒的表面。然后在攪拌下，加入引發(fā)劑并提高反應(yīng)溫度，使各單體在稀土納米粒子的表面聚合形成一層親水的薄膜。該薄膜的厚度不宜太厚，實際上越薄越好，只要能形成連續(xù)的覆蓋層即可。如果包被層太厚，將導(dǎo)致包被后的粒子體積過大，不利于與生物材料的結(jié)合。包覆的厚度可以通過調(diào)節(jié)稀土納米粒子與包覆單體的量來調(diào)節(jié)。反應(yīng)完畢后充分洗滌微粒，除去未反應(yīng)的物質(zhì)和表面活性劑，將其分散在磷酸鹽緩沖溶液中待用。
本發(fā)明中，納米粒子包覆時各種試劑的用量可根據(jù)使用要求來改變。參與反應(yīng)的總的有機單體(包括包覆單體、交聯(lián)劑、功能化試劑、偶聯(lián)劑的總和)與稀土熒光微粒的質(zhì)量比為1∶300～1∶1范圍內(nèi)。各種組分在總有機單體中的含量為包覆單體為5～80體積％；功能化試劑為5～40體積％；交聯(lián)劑為0～80體積％；偶聯(lián)劑0～10體積％。另外，還需加入1～5體積％的引發(fā)劑。優(yōu)選的各組分的含量為包覆單體5～80體積％，功能化試劑5～40體積％，交聯(lián)劑5～80體積％，偶聯(lián)劑1～10體積％，引發(fā)劑1～5體積％。
適合于步驟(3)中形成聚合物包被層的單體優(yōu)選是那些帶有功能基團的單體，例如丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯醛、甲基丙烯酸-2-羥乙酯、乙二醇單環(huán)氧丙烯酸酯、乙二醇二丙烯酸酯、二乙二醇單丙烯酸酯、三乙二醇二丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三丙烯酸酯、季戊四醇二丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、苯乙烯、二乙烯苯等。這些單體可以單獨使用，也可以混合使用，最好與交聯(lián)劑配合使用。
實際上，對于水中不易溶解的稀土納米粒子，這些稀土納米粒子在水中保存時熒光不會下降。利用吸附法進行包被時，可以直接將稀土納米粒子分散在的氨基葡聚糖(Aminodextron)或聚甲基丙烯酸等的水溶液中，通過物理吸附使顆粒的表面能被包被上一層聚合物膜。這層膜具有非常好的親水性，可以與生物分子通過物理吸附或化學(xué)反應(yīng)連接。
按本發(fā)明方法制得的被聚合物包被的稀土納米粒子，可以用作標(biāo)記生物材料的稀土納米熒光探針?？捎脕順?biāo)記的生物材料包括DNA、多肽、蛋白質(zhì)(酶、抗體、抗原等)、細胞等。用本發(fā)明方法制備的稀土納米粒子作熒光探針，合成方法簡便，是理想的生物材料的標(biāo)記物，可廣泛用于生命科學(xué)研究中的多種生物材料的標(biāo)記、臨床診斷中的免疫分析、DNA檢測、以及生物芯片中的熒光探針。
本發(fā)明稀土納米粒子與生物材料連接的方法是，將經(jīng)包覆及功能化的稀土納米粒子分散在磷酸鹽溶液中(w/w，5％)，加入待標(biāo)記的生物材料，如DNA，多肽，蛋白質(zhì)、細胞和組織等。當(dāng)環(huán)氧基與生物分子連接時反應(yīng)液應(yīng)控制在微堿性；羧基與生物分子連接時加入活化試劑1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺；醛基與生物分子連接時，反應(yīng)后生成的西夫堿不夠穩(wěn)定，需加入硼氰化鈉還原后反應(yīng)生成穩(wěn)定的仲胺；氨基與生物分子連接時，先加入戊二醛反應(yīng)生成醛基，再與生物分子連接。所有反應(yīng)緩慢攪拌數(shù)小時，離心，用磷酸鹽緩沖溶液洗滌數(shù)次，得到熒光稀土納米納米粒子標(biāo)記的生物分子。這些標(biāo)記的生物分子，通過熒光分光光度計測定光的強度或用激光共聚焦掃描顯微鏡得到熒光圖像，可用于生命科學(xué)研究、臨床疾病檢測、DNA芯片、蛋白質(zhì)芯片等研究領(lǐng)域。
在本發(fā)明中，稀土納米粒子用聚合物包覆及功能化修飾后，可較好地分散于水溶液中，不易沉淀與相互絮凝，包覆及修飾過程不會導(dǎo)致熒光強度的顯著下降。這樣處理后的稀土納米粒子能與生物材料進行較好地連接，同時生物材料的生物活性也不會顯著下降，從而可用作生物材料如蛋白質(zhì)、多肽、DNA、細胞及組織等的熒光探針。
下面結(jié)合附圖，用實施例來進一步說明本發(fā)明。但應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例不是對本發(fā)明范圍的限制，它們只是用來進行說明的。


圖1是稀土納米粒子CaSEu3+的電鏡照片；圖2是稀土納米粒子CaSEu3+的熒光光譜圖；圖3是包被前后稀土納米粒子SrAlO4Eu2+的熒光光譜圖(A)包被前；(B)包被后；圖4是Scanner Array 4000掃描的熒光圖像；圖5是稀土納米粒子的熒光強度與待測抗原的濃度關(guān)系。
實施例1納米粒子CaSEu3+的制備制備粒度為15納米左右的CaSEu3+粒子，制備方法如下將1.3875gCaCl2(0.0125mol)溶解于250ml無水乙醇中，再加入Eu(NO)3(0.111g)和0.027g組氨酸，超聲30min，得到儲備液a。稱取0.24g Na2S溶解于250ml的無水乙醇中，超聲30min，得到儲備液b。將儲備液a 50ml放入三口燒瓶中，通氮氣將燒瓶口密閉后用磁力攪拌器快速攪拌溶液，用注射器將儲備液b快速注入三口燒瓶中，3小時后停止反應(yīng)。離心后，去掉上清液體，用去離子水洗滌固體3次，再用無水乙醇洗滌3次。將固體真空下進行干燥后，放在675℃下將樣品灼燒3h，并通氮氣保護。待樣品冷卻到室溫后，就得到粒徑在15納米左右的稀土粒子，納米粒子的掃描電鏡圖見附圖1，熒光光譜圖見圖2。實施例2納米粒子SrAlO4Eu2+的制備制備納米級的稀土微粒SrAlO4Eu2+，參加反應(yīng)化合物的配比是，SrCO3∶Al2O3∶Eu2O3＝1∶1∶0.005，加入適量的1mol/l硝酸使固體粉末恰好溶解，然后與1mol/l的尿素溶液混合后，直接移入已預(yù)先加熱到500℃的馬弗爐中。待樣品燃燒后，可獲得白色泡沫狀長余輝納米材料，粒徑大小在10-15納米。實施例3納米粒子CaSEu3++Sr2+的制備制備粒度為10納米左右的CaSEu3++Sr2+粒子，制備方法如下將0.712g CaCl2和0.625g SrCl2溶解于250ml無水乙醇中，再加入Eu(NO)3(0.111g)和2.5ml巰基乙酸，超聲30min，得到儲備液a。稱取0.25g Na2S溶解于250ml的無水乙醇中，超聲30min，得到儲備液b。將儲備液a 50ml放入三口燒瓶中，通氮氣將燒瓶口密閉后用磁力攪拌器快速攪拌溶液，用注射器將儲備液b快速注入三口燒瓶中，3小時后停止反應(yīng)。離心后，去掉上清液體，用去離子水洗滌固體3次，再用無水乙醇洗滌3次。將固體真空下進行干燥后，放在675℃下將樣品灼燒3h，并通氮氣和氫氣的混合氣體(95/5，V/V)保護。待樣品冷卻到室溫后，就得到粒徑在10nm左右的稀土粒子。實施例4納米粒子ZnSEu3+的制備稀土納米粒子ZnSEu3+0.25M的制備方法如下將4.3ml的1mol/l(在0.01mol/l的溶液中)ZnSO4和1.76ml的0.05mol/l的Eu(NO3)3快速注入到35.6ml的0.25mol/l組氨酸的Tris(1mol/l)溶液中，同時在溶液中通氮氣，并且快速攪拌溶液20min后，加入4.4ml的1mol/l的Na2S溶液，溶液在室溫下反應(yīng)60min。將0℃的無水乙醇逐滴滴加到反應(yīng)液中，直到溶液中出現(xiàn)白色的ZnSEu3+時停止滴加乙醇；在離心機上將反應(yīng)溶液離心，去掉上清液，將白色沉淀物重新溶解到1mol/l Tris溶液中，重復(fù)以上操作兩次，然后將得到的固體在真空中室溫過夜干燥。得到的納米粒子直徑在10nm左右。實施例5稀土納米粒子SrAl2O4Eu2+的包被方法一用硅酸乙酯試劑將納米粒子SrAl2O4Eu2+表面包覆一層SiO2薄膜，然后應(yīng)用多種硅烷化試劑使其連接上親水性官能團。具體方法如下將70mg SrAl2O4Eu2+加到50ml異丙醇中，再加入1.6ml 50％的NH3·H2O和1.5ml水，超聲20min，使納米粒子均勻地分散到溶液中。然后將反應(yīng)液放入40℃的水浴中，并加入160μl Si(OC2H5)4，反應(yīng)1h后，再補加100μl 3-氨基丙基三乙基硅烷，繼續(xù)反應(yīng)40min。然后將納米粒子離心，用等體積的無水乙醇洗滌三遍后，用水洗滌兩遍，再用無水乙醇洗滌兩遍，然后在80℃真空干燥6h，包覆完畢。實施例6稀土納米粒子SrAl2O4Eu2+的包被方法二稱取100mg稀土納米粒子SrAl2O4Eu2+加入到20ml甲苯中并加入0.1g十二烷基苯磺酸鈉，用瑪瑙研缽研磨后將顆粒SrAl2O4Eu2+充分分散到甲苯中，加入400μl甲基丙烯酸和150μl三羥甲基三丙烷三丙烯酸酯和5mg過氧化苯甲酰，80℃下反應(yīng)10-12小時后，離心后去除甲苯，分別用20ml無水乙醇和去離子水洗滌后，將稀土粒子分散到2ml磷酸緩沖溶液中待用。這樣，稀土粒子表面包有一層聚合物膜，可以防止稀土粒子溶解于水而失去熒光。同時，表面含有羧基，可以與生物材料連接。包被前后的熒光光譜圖見附圖4，包被前后的熒光變化不大。實施例7抗體免疫球蛋白IgG與表面包覆聚合物的稀土粒子偶聯(lián)取500μl實施例6中溶液加入500μl 2.4mg/ml的免疫球蛋白IgG和10mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺，室溫下緩慢攪拌反應(yīng)24小時。然后，4000r/min下離心5分鐘，去掉上層清液，再用磷酸緩沖溶液(PBS)洗滌二次后，加入1000ml PBS待用。實施例8制備可以固定抗體的基體以及在免疫分析方面的應(yīng)用在抗體固定于玻璃板以前，需要將玻璃表面處理。首先清洗玻璃片，將玻璃片(25mm×75mm)在洗液中浸泡2小時，用大量去離子水沖洗后N2吹干。接著將它們再依次放入正己烷、丙酮和無水乙醇中各超聲15分鐘后，放在80℃的烘箱中烘5分鐘后立即使用。然后玻璃表面進行硅烷化反應(yīng)固定上氨基基團。將3-氨丙基三甲氧基硅烷溶于二甲苯并加入催化劑量的二異丙基乙基胺。微機械手將硅烷化試劑在玻璃片點成陣列形狀，每個點大約皮升量級，大小為300μm，點與點之間的距離為800μm。最后將玻璃片80℃放置過夜，用乙酸乙酯沖洗后并晾干立即使用。最后將玻璃片固定的NH2通過希夫堿反應(yīng)變成醛基。將氨基化的玻璃浸泡到5％的戊二醛PBS中5小時，用去離子水沖洗后在氮氣流下吹干。這樣玻璃片表面帶有醛基，可以固定抗體。
免疫分析步驟免抗反應(yīng)采用傳統(tǒng)的抗體-夾心式反應(yīng)。免疫分析實驗步驟如下所示，前五步操作步驟與酶聯(lián)免疫分析步驟基本相似。●將100μl的1.2mg/ml兔抗人免疫球蛋白IgG碳酸鈉緩沖液(PH9.6A280/1.44＝1mg IgG/ml)，均勻涂在玻璃片上，在37℃下反應(yīng)2小時，注意在反應(yīng)過程中不要使玻璃片上的液體變干?！裼昧姿猁}洗滌液(PBS-T，PBS中含0.05％Tween20)洗滌玻璃片，每次洗滌5分鐘，洗滌三次?！駥⒉Ａ?％牛血清白蛋白的硼酸溶液中，37℃下反應(yīng)1小時，此步驟對消除抗原在玻璃片上的非特異性吸附是很有必要的，最后將玻璃片用PBS-T洗滌三次后在氮氣下吹干待用?！袢嗣庖咔虻鞍譏gG，羊免疫球蛋白IgG為待測抗原，將100μl的待測抗原溶液涂在玻璃片上，37℃下反應(yīng)1小時?！裼肞BS-T洗滌三次，每次5分鐘，用N2吹干玻璃片吹干待用?！駥晒鈽?biāo)記的免抗人免疫球蛋白IgG 100μl涂在玻璃片上，37℃下反應(yīng)2小時后，用PBS-T洗滌二次，再用去離子水洗滌一次，用氮氣來吹干玻璃片，然后用Scanner Array 4000熒光成像。用激光器為激發(fā)光源，Scanner Array 4000掃描玻璃片得到的稀土微粒的熒光圖像，見附圖4，其熒光強度是經(jīng)Array 4000軟件處理過的，是一個相對強度。隨著抗原濃度的增加，熒光強度也隨著增加，見附圖5，說明抗體標(biāo)記上稀土顆后，其特異性識別抗原的能力沒有消失。
權(quán)利要求
1.一種用于標(biāo)記生物材料的稀土納米粒子，該粒子的粒徑在3nm-400nm之間，它能與所說的生物材料相連接，而且在激發(fā)時能夠發(fā)出熒光，其特征在于，所說粒子的成分是選自下列各復(fù)合物質(zhì)中的一種或數(shù)種SrAl2O4Eu2+；SrAl2O4Eu2++Dy3+；Y2O3Eu3+；CaSEu3+；CaSEu3++X，其中X＝Tm3+、Y3+或Al3+；ZnSY，其中Y＝Eu2+、Mn2+、Cu2+、Ag+和/或Au+；Gd2O3Eu3+；La2O3Eu3+；MgB5O10Ce3++Gd3+；SrB4O7Sm2+和/或Gd3(PO4)2Eu3+。
2.如權(quán)利要求1所說的稀土納米粒子，其特征在于，所說的稀土粒子的表面被包被上一層聚合物膜或無機物膜。
3.如權(quán)利要求2所說的稀土納米粒子，其特征在于，所說的包被后的稀土納米粒子的粒徑在5-100nm之間。
4.如權(quán)利要求2所說的稀土納米粒子，其特征在于，所說的稀土粒子的表面被包被上一層聚合物膜，且該聚合物膜的表面帶有如下的功能基團氨基、羧基、羥基、醛基和/或環(huán)氧基。
5.如權(quán)利要求4所說的稀土納米粒子，其特征在于，所說的稀土納米粒子表面包被層中含有一種或多種包覆單體以及一種或多種功能化試劑的聚合物，其中所說的包覆單體包括丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸-2-羥乙酯、丙烯酸-2-羥乙酯、乙二醇單環(huán)氧丙烯酸酯、乙二醇單丙烯酸酯、三乙二醇二丙烯酸酯、乙二醇二丙烯酸酯和苯乙烯；所說的功能化試劑包括丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯醛、丙烯酰胺、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-醛基丙基三乙氧基硅烷、3-胺基丙基三乙氧基硅烷、3-巰基丙基三乙氧基硅烷、甲基丙烯酸-2-羥乙酯、丙烯酸-2-羥乙酯、甲基丙烯酸-2-胺乙酯、乙二醇雙還氧單丙烯酸酯和3-環(huán)氧基丙基三乙基硅烷。
6.如權(quán)利要求5所說的稀土納米粒子，其特征在于，在所說的稀土粒子的表面包被層中還含有磷酸雙-(三羥甲基丙烷二丙烯酸酯)、磷酸雙-(甲基丙烯酸2-羥乙酯)和/或磷酸雙-(季戊四醇三丙烯酸酯)。
7.一種制備用于標(biāo)記生物材料的稀土納米粒子的方法，它包括如下步驟(1)制備粒徑在3-400nm之間的稀土納米粒子；(2)將步驟(1)制備的稀土納米粒子加入到有機溶劑中；(3)在步驟(2)所得的混合物中加入包覆單體、功能化試劑和聚合引發(fā)劑，進行懸浮聚合，使得稀土表面包被一層聚合物膜。
8.如權(quán)利要求7所說的方法，其特征在于，在步驟(2)中還加入表面活性劑，使得稀土納米粒子充分分散在有機溶劑中。
9.如權(quán)利要求7或8所說的方法，其特征在于，在步驟(3)的聚合反應(yīng)中加入磷酸雙-(三羥甲基丙烷二丙烯酸酯)、磷酸雙-(甲基丙烯酸2-羥乙酯)和/或磷酸雙-(季戊四醇三丙烯酸酯)作偶聯(lián)劑。
10.一種制備用于標(biāo)記生物材料的稀土納米粒子的方法，它包括如下步驟(1)制備粒徑在3-400nm之間的稀土納米粒子；(2)將步驟(1)制得的稀土納米粒子加入到硅酸烷基酯中，并使硅酸烷基酯發(fā)生水解，在稀土納米粒子的表面上形成二氧化硅膜；(3)在步驟(2)所得的物質(zhì)中加入有機硅烷，使得所說二氧化硅膜功能化。
11.一種制備用于標(biāo)記生物材料的稀土納米粒子的方法，它包括如下步驟(1)制備粒徑在3-400nm之間的稀土納米粒子；(2)將步驟(1)制得的稀土納米粒子加入到氨基葡聚糖、聚甲基丙烯酸、環(huán)氧葡聚糖和/或磷脂溶液中，使其吸附在稀土納米粒子表面上并形成包被層。
12.如權(quán)利要求1～6之一所說的稀土納米粒子在標(biāo)記生物材料方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于標(biāo)記生物材料的稀土納米粒子。該粒子的粒徑在3nm－400nm之間,它能與所說的生物材料相連接,而且在激發(fā)時能夠發(fā)出熒光。該粒子的成分是選自下列各復(fù)合物質(zhì)中的一種或數(shù)種:SrAl
文檔編號G01N33/532GK1378083SQ0110955
公開日2002年11月6日 申請日期2001年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月30日
發(fā)明者孫寶全, 衣光舜, 陳德樸, 趙淑英, 周玉祥, 程京 申請人:清華大學(xué)