專利名稱：馬疫錐蟲抗原片檢測試劑及其制備與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫診斷領(lǐng)域，涉及系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的臨床診斷，更具體地說，涉及馬疫錐蟲抗原片，及其制備以及應用該檢測試劑臨床檢測SLE的高度特異性抗體抗雙鏈脫氧核糖核酸(ds-DNA)抗體的存在。
抗雙鏈脫氧核糖核酸(ds-DNA)抗體是SLE高度特異抗體，在其它情況下很少能檢測到，并與SLE疾病活動性密切相關(guān)，被公認為診斷SLE的指標之一?？筪s-DNA抗體不僅對于SLE的診斷和鑒別診斷有重要意義，而且對于監(jiān)視治療和病情追蹤以及判定預后等亦有重要意義。間接免疫熒光法(IIF)為目前臨床常規(guī)檢測抗ds-DNA抗體最常用的方法。1964年Beck等證明錐蟲類(單細胞)的核和動基體為純ds-DNA，不含組蛋白等其它成份。1975年Aarden等報告用短膜蟲(Crithidia Lucilia,CL)培養(yǎng)片，1978年Konice等報告采用感染馬疫錐蟲(Trypaonsoma Epuiperdum,TE)的大鼠血涂片作為抗原底物，采用IIF法測定抗ds-DNA抗體。
抗DNA抗體可大體分為與天然(雙鏈)DNA反應的抗體和與變性(單鏈)DNA反應的抗體兩種。
抗雙鏈DNA(ds-DNA)抗體主要見于SLE，陽性率在40％左右，以上為活動期患者，而在非SLE患者和正常人則多為陰性。有時其它結(jié)締組織病患者抗ds-DNA也可為陽性，如干燥綜合征(SS)、藥物性狼瘡(DIL)、混合性結(jié)締組織病(MCTD)等，但陽性率低，一般＜1O％，抗體滴度也較低，且此類病人一般認為是SLE重疊綜合征。由于抗ds-DNA抗體對SLE具有高度特異性，因此是目前公認的SLE血清特異性抗體，被列為SLE診斷標準之一?？筪s-DNA抗體在SLE的發(fā)病機理中起重要作用SLE并發(fā)的腎炎(狼瘡性腎炎)是由抗DNA抗體介導的一種免疫復合物病?？筪s-DNA抗體亦可形成多種冷沉淀而致血管炎。該抗體的存在易引起SLE腎炎和典型的蝶形紅斑?？筪s-DNA抗體與SLE疾病活動性關(guān)系密切，其抗體滴度多與SLE疾病的活動性而升降，活動期增高，緩解期降低甚至轉(zhuǎn)陰。因此，抗ds-DNA抗體對SLE疾病活動期的判斷和藥物療效觀察很有幫助。
抗單鏈DNA(SS-DNA)抗體雙鏈DNA變性時，雙鏈斷開即成單鏈DNA(SS-DNA)?？筍S-DNA可存在于多種自身免疫性疾病中，包括SLE、DIL、MCTD、SS、PSS(硬皮病)、PM/DM(皮肌炎或多發(fā)性肌炎)；也可存在于一些非自身免疫性疾病，如慢性活動性肝炎、細菌和病毒感染。因此，抗SS-DNA抗體對疾病診斷缺乏特異性，在臨床上無實用價值。
抗ds-DNA抗體的檢測方法很多，目前臨床常規(guī)檢測廣泛應用的方法有間接免疫熒光法(IIF)、放射免疫分析法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等。
IIF可分為馬疫錐蟲法(TE-IIF)和短膜蟲法(CL-IIF)兩種。是目前國內(nèi)外臨床常規(guī)檢測抗ds-DNA抗體最常用的方法。IIF法具有特異性強、敏感性高、結(jié)果可靠、重復性好等優(yōu)點；此外，該法實驗要求的條件低、操做簡便、價格便宜、易于推廣。有關(guān)資料顯示IIF法和Farr法比較，兩者符合率達90％，IIF法敏感性略遜于Farr法，但特異性高，無假陽性反應；TE-IIF法和CL-IIF法兩者符合率為88.70％；TE-IIF法在檢測抗ds-DNA抗體同時，可利用抗原基質(zhì)片中鼠白細胞檢測ANA，發(fā)現(xiàn)測得結(jié)果與常規(guī)的鼠肝冰凍切片法的結(jié)果有良好的可比性(r=0.9265,p＜0.01)兩者核型和滴度基本相符。IIF法存在的問題是抗原基質(zhì)片制備困難。馬疫錐蟲法需在小鼠傳代。使用不便；短膜蟲法需培養(yǎng)及蟲和傳代保存，長期長傳代，操作不當，易于污染。另有文獻報告CL動基體含組蛋白，可與待測血清中抗組蛋白抗體交叉反應而致假陽性。
RIA(Farr法)Farr法測定的重復性好，可定量，敏感性較IIF法略高，但特異性差，需儀器設備，要求的實驗室條件較高，并存在同位素污染及假陽性問題。Farr法則定抗ds-DNA抗體，在7％的正常人中呈假陽性反應，并在非SLE的結(jié)締組織病中也呈低滴度的陽性反應，這可能與國內(nèi)生產(chǎn)的檢測藥盒中的抗原ds-DNA不夠純有關(guān)。文獻報告Ids-DNA中含ss-DNA 1％引起的假陽性就達6％。此外標記ds-DNA有時與非抗體蛋白[低密度脂蛋白和(或)補體成份]結(jié)合，亦可引起假陽性結(jié)果。
ELLSA不需特殊設備(同位素測定儀，熒光顯微鏡等)，但操作繁鎖，較IIF未見有更多的優(yōu)點。ELISA法中存在的主要問題是，同F(xiàn)arr法一樣，如人工純化的ds-DNA抗原不純，易引起假陽性反應；此外DNA抗原不易吸附于固相載體上，即ds-DNA抗原包被困難。采取預包被措施易引入產(chǎn)生非特異反應的物質(zhì)或造成ds-DNA變性、解鏈。以上結(jié)果都可致假陽性結(jié)果，影響該法特異性。附表IIF法和Farr法檢測抗ds-DNA抗體比較(北京協(xié)和醫(yī)院資料)IE-IIF法 CL-IIF法 Farr法SLE 51.2％ 46.9％62.0％SLE活動期 100％93.6％67.7％SLE非活動期 9.5％3.0％ 29.1％結(jié)締組織病(非SLE) 3.0％2.7％ 20.2％
非結(jié)締組織病01.8％12.9％正常人 007.0％本發(fā)明的目的之一是研制檢測抗ds-DNA抗體檢測試劑馬疫錐蟲抗原片。
本發(fā)明的另一目的是提供了利用馬疫錐蟲抗原(TE)體檢測抗ds-DNA，為SLE疾病的診斷提供重要指標。
本發(fā)明是如下所述實現(xiàn)的馬疫錐蟲抗原片制備1、馬疫錐蟲繁殖將馬疫錐蟲菌株從液氮中取出，溶化后將其接種于小鼠腹部皮下，感染2-4日，從小白鼠尾部取血置玻片上，顯微鏡下觀察，高倍鏡下每視野達30-40條馬疫錐蟲時即可制片。
2、馬疫錐蟲抗原片制備從感染的小白鼠眼眶部取血。加入添加適量抗凝劑的玻璃試管中，用毛細玻璃管取血，在玻片上涂成直徑0.5cm×0.5cm大小圓點，每張片涂十孔，自然晾干，加入干燥劑置錫鉑紙包裝袋中，用熱合器封袋，置-20℃冰箱中保存待用。
3、馬疫錐蟲抗原片鑒定A、DNA抑制試驗將已知強陽性反應的病人血清與雙鏈DNA(小牛胸腺DNA、按0.1-0.3mg/ml不同濃度配制)相互作用30-45分鐘，然后用該血清作用底物，繼用羊或兔抗人IgG熒光標記抗體染色鏡檢，同時用該病人的陽性血清對照。
B、RNA抑制試驗將已知強陽性血清與RNA(1mg/mL)相互作用30-45分鐘，然后用該血清作用底物，繼用羊或兔抗人IgG熒光標記抗體染色鏡檢，同時做陽性對照。
C、DNA酶消化試驗將DNA酶(0.1mG/ml)與抗原底物分別作用1、2、4、6小時，然后洗去DNA酶，再加已知的強陽性血清，繼用羊或兔抗人IgG熒光標記抗體染色鏡檢，同時做陽性對照。
D、RNA酶消化試驗將RNA酶(1mg/ml,0.5mg/ml不同濃度)與底物分別作用1、2、4、6小時，然后洗去RNA酶，再加已知的強陽性血清，繼用羊或兔抗人IgG熒光標記抗體染色鏡檢，同時做陽性對照。
E、對照試驗
用DNA陽性血清和DNA陰性血清分別加在已制備好了的抗原片上，反應30分鐘后，加羊或兔抗人IgG熒光標記抗體再反應30分鐘后，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，陽性血清下的馬疫錐蟲動基體和核均有特異性熒光染色，陰性血清則無特異性熒光。
二、TE抗原片檢測ds-DNA抗體馬疫錐蟲(TE)是一種致馬類性病(馬媾疫)的錐蟲，對人類和其它家畜無致病作用。TE的核(Nuclear)和動基體(Kinetoplast)為不含組蛋白亦無單鏈DNA的純ds-DNA抗原，抗原性純一、特異，不需要復雜的分離提純，故為檢測抗ds-DNA抗體具有高度特異性的天然底物。采用感染TE的小鼠血涂片作抗原底物，IIT法檢測抗ds-DNA抗體，陽性時可見到TE核及動基體發(fā)出特異性熒光。陰性時TE核及動基體均不發(fā)熒光，但蟲體輪子廓隱約可見。
TE抗原片中含有鼠血中的白細胞，IIF檢測抗ds-DNA抗體的同時，亦可檢測抗核抗體(ANA)。陽性結(jié)果核型觀察略遜于鼠肝冰凍切片法，但也可用做ANA定性過篩檢測。
(一)操作1、將TE抗原片從鋁箔包裝袋取出后立即用電風扇吹干。將抗原片置蒸餾水中30秒-1分鐘，溶解掉鼠血中紅細胞，待干。
2、將被檢血清用0.01mol/L pH7.4 PBS 1∶5稀釋后，滴加于抗原上。
3、置濕盒37℃溫育30分鐘。
4、繼用同一PBS搖床上洗滌三次，每次5分鐘。
5、風干后滴加最適工作濃度羊或兔抗人IgG熒光標記抗體于抗原模上。同上法溫育、洗滌、風干。
6、用PH7.4緩沖甘油封片，最后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。
(二)結(jié)果1、抗ds-DNA抗體陽性TE核及動基體發(fā)出亮綠色特異性熒光。TE核較大，動基體較小，成對出現(xiàn)，較易辨認。核和動基體之間及周邊有蟲體輪廓隱約可見。對于抗ds-DNA抗體陽性血清，可用PBS做倍比稀釋再進行檢測抗體滴度。以能顯示TE動基體熒光的最高稀釋度為抗體滴度。
2、抗ds-DNA抗體陰性TE和動基體均不發(fā)熒光，但蟲體輪廓隱約可見。
3、ANA陽性TE抗原片中鼠血白細胞發(fā)出亮綠色特異性熒光，而且可分辨不同的核型，與鼠肝冰凍切片法所見酷似。兩者核型和抗體滴度基本相符。
(三)注意事項1、每次實驗應設陽性對照和陰性對照。
2、TE抗原片置-20℃保存，有效期至少一年，應避免反復凍融。短期內(nèi)使用可置4℃冰箱保存。
3、TE-IIF檢測抗ds-DNA抗體，陽性時TE核和動基體應同時發(fā)特異性熒光。如出現(xiàn)TE核或動基件單獨發(fā)特異性熒光這兩種少見情況，報告結(jié)果時應慎重，應結(jié)合ANA、放免法(Farr氏法)實驗結(jié)果及臨床表現(xiàn)報告，如相符合(ANA陽性多為均質(zhì)型、Farr氏法結(jié)合率＞20％)亦可報告為TE-IIF陽性否則應復查，查找實驗原因。PBS偏酸時可出現(xiàn)此種假陽性反應，還應排除熒光抗體稀釋度不適造成的非特異性熒光干擾。
(四)臨床意義抗ds-DNA抗體是SLE的高度特異性抗體，是SLE診斷指標之一?；顒悠赟LE，特別是腎型活動SLE抗ds-DNA抗體為100％陽性，非腎型活動期SLE患者抗ds-DNA抗體陽性率80％左右；而非活動期SLE病人，抗ds-DNA抗體陽性率30％以下。其它結(jié)締組織病則陽性率很低(＜10％)。抗ds-DNA抗體滴度的升降與SLE疾病的活動程度相關(guān)。因此，抗ds-DNA抗體檢測可監(jiān)示SLE病情變化、療效等。
本發(fā)明建立的TE-IIF檢測抗ds-DNA抗體的方法，特異性強，重復性好，結(jié)果穩(wěn)定可靠，方法要求條件低，操作簡便易于推廣。本發(fā)明制備的TE抗原基質(zhì)片技術(shù)方法穩(wěn)定，抗原片質(zhì)量穩(wěn)定可靠，使用方便。


如下圖1應用馬疫錐蟲抗原片檢測抗dsDNA抗體陽性(低倍鏡)；圖2應用馬疫錐蟲抗原片檢測抗dsDNA抗體陽(高倍鏡)。
權(quán)利要求
1.一種抗ds-DNA檢測試劑馬疫錐蟲抗原片其特征在于由下列步驟制備的A．馬疫錐蟲的繁殖；B．制備馬疫錐蟲抗原片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗原片，其中步驟A包括將馬疫錐蟲菌株接種于小白鼠腹部皮下，感染2-4日后，從小白鼠尾部取血置玻片上，顯微鏡下觀察，高倍鏡下每視野達30-40條馬疫錐蟲時即可使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗原片，其中步驟B包括從感染的小白鼠眼眶部取血，加入到添加了抗凝劑的試管中，用毛細血管從中取血，在玻片上涂成圓點，自然晾干，加入有干燥劑的錫鉑紙包裝袋中，用熱合器封袋，置于-20℃冰箱中保存待用。
4.一種抗ds-DNA的檢測方法，其特征在于將被檢血清滴加于權(quán)利要求1所述的抗原片試劑的抗原孔上，37℃溫育30分鐘，用PBS搖體洗滌三次，每次5分鐘，風干后滴加羊或兔抗人IgG熒光標記抗體于抗原片上，同上法溫度、洗滌、風干，用PH7.4緩沖甘油封片，用熒光顯微鏡觀察。
全文摘要
抗雙鏈脫氧核糖核酸(ds－DNA)抗體是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)高度特異性抗體,并與SLE疾病活動性密切相關(guān)。本發(fā)明研制了檢測抗ds－DNA抗體檢測試劑馬疫錐蟲(TE)抗原片,以及利用該試劑建立了間接免疫熒光法(TE－ⅡF)檢測抗ds－DNA抗體的方法,該方法特異性強,重復性好,結(jié)果穩(wěn)定可靠。
文檔編號G01N33/558GK1312470SQ01109088
公開日2001年9月12日 申請日期2001年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月28日
發(fā)明者王慧珍, 李永哲, 崔京濤 申請人:王慧珍, 李永哲, 崔京濤