專利名稱：相位/光強復(fù)合型生物分子相互作用實時檢測方法及系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及用來實現(xiàn)檢測兩個以上生物分子如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、受體-配體、核酸-蛋白質(zhì)、生物-蛋白質(zhì)和核酸-核酸等之間相互作用狀況的方法及用該方法的設(shè)備。
利用表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance，簡稱SPR)原理，構(gòu)建生物分子相互作用實時檢測分析系統(tǒng)，實現(xiàn)對生物分子相互作用的監(jiān)測和分析，有兩條技術(shù)途徑一條是基于SPR原理的光強檢測方法，即通過探測生物分子相互作用時引起反射光的光強變化，獲取有關(guān)生物信息。瑞典發(fā)瑪西亞生物技術(shù)有限公司(Pharmacia Biatech)的BIAtite和Biacore 1000，2000，3000等系列產(chǎn)品就是采用這種方法，其檢測原理如

圖1所示，由半導(dǎo)體激光器1發(fā)出的激光以臨界角透過棱鏡2、墊補層3(其作用是消除棱鏡2與玻璃基片4之間的氣隙)和玻璃基片4，射到玻璃基片4與透明生物傳感層6的界面上，產(chǎn)生反射，反射光的強度基本上等于入射光的強度。但是，在玻璃基片4上鍍一層50nm厚的金膜5之后，入射光的一部分能量就會和金膜表面的自由電子作用，激起共振，沿共振波傳播方向衰減，從而引起反射光的強度在一特定的角度方向上大大減弱，甚至消失，反射光消失時光的入射角度稱為共振角。共振角隨傳感層表面的折射率發(fā)生變化，折射率又隨從樣品槽7中流過的樣品里的生物分子與傳感層上固定的生物分子作用情況發(fā)生變化，即隨生物分子相互作用的強弱、多少和快慢而變化。反射光由光電探測器8接收，轉(zhuǎn)換成電信號，而后由計算機讀入處理，可從中得到有關(guān)生物信息。另一條是基于SPR原理的相位檢測法，即通過探測生物分子相互作用時引起的反射光的相位變化，獲取有關(guān)生物信息。本發(fā)明人的“生物分子相互作用實時相位檢測分析方法及其系統(tǒng)”(申請?zhí)?9107780.6)就是采用這種方法，其檢測原理如圖2所示。由橫向塞曼激光器9發(fā)出的“尾光”通過檢偏器19后被光電探測器18接收，轉(zhuǎn)換成電信號，作為參考信號輸入雙向差動數(shù)字鑒相相位卡20。由橫向塞曼激光器輸出端發(fā)出的激光從梯形棱鏡10的一個腰面射入，射到底面與金膜11的界面上，金膜11下覆蓋耦聯(lián)層12和配體分子13，入射光從該界面反射，透過另一腰面后又通過檢偏器16，被光電探測器17接收，轉(zhuǎn)換成電信號，作為測量信號輸入雙向差動數(shù)字鑒相相位卡20。相位卡20對輸入的參考信號與測量信號進行差動數(shù)字鑒相，得到相位差數(shù)據(jù)，由計算機21讀入，進行基于相位的處理和分析，獲得有關(guān)生物信息。
上述這兩種方法都可以進行檢測生物分子間的相互作用，分析分子間如何結(jié)合和分離，強度多少和速度是多少，是否有空間異位效應(yīng)等。光強檢測法是通過探測光強的變化來反映傳感層表面折射率的變化情況，即生物分子相互作用的強弱、多少和快慢情況，折射率變化與作用狀況對應(yīng)，結(jié)構(gòu)簡單，但光源光強會波動，光強是直流信號，處理電路會有直流漂移，它們都影響測量精度，且分辨率有限，要提高分辨率會導(dǎo)致電路太復(fù)雜。相位檢測法是通過探測相位變化來反映傳感層表面引起的光程變化，即生物分子相互作用的強弱，多少和速率的狀況，光程(相位)變化與作用狀況對應(yīng)。同時，相位信號是交流信號，比前者穩(wěn)定。可是，這兩種方法都存在不足，前者對結(jié)合的強弱和變化最為敏感，后者對結(jié)合的速率與多少更為敏感。因此，在面對不同的生物分子相互作用時，兩種不同的方法都有可能丟失一些很有意義的生物信息。
本發(fā)明的目的在于克服上述每種方法的局限性，提供一種新的生物分子相互作用實時檢測方法及其用于該方法的生物分子相互作用實時檢測系統(tǒng)。使其同時具有上述兩種方法的優(yōu)點，即不僅可以通過檢測反射光的光強變化，而且可以通過檢測反射光的相位變化，由此得到生物分子之間的多種信息，更重要的是得到生物分子的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系及其功能特征等。而且具有靈敏度高，結(jié)構(gòu)簡單，容易實現(xiàn)的優(yōu)點。
本發(fā)明提出一種采用相位/光強復(fù)合型測量的生物分子相互作用實時檢測方法，包括以下步驟1)由橫向塞曼激光器全反射端透過的“尾光”，通過檢偏器后被光電探測器接收，轉(zhuǎn)換成電信號，作為相位檢測的參考信號輸入差動數(shù)字鑒相相位卡；2)由橫向塞曼激光器輸出端發(fā)出的激光從等腰梯形/三角形棱鏡的一個腰面射入，射到該棱鏡的底面與與鍍在其底面的覆蓋有生物傳感層的金膜的界面上，入射光從該界面反射后透過該棱鏡的另一個腰面，射到析光鏡上，一部分反射，另一部分透過；3)該反射部分被光電探測器接收，轉(zhuǎn)換成電信號，作為光強檢測法信號輸入前置處理電路，該透過部分在通過檢偏器后被光電探測器接收，轉(zhuǎn)換成電信號，作為相位檢測的測量信號輸入雙向差動數(shù)字鑒相相位卡；4)所說的前置處理電路對輸入信號進行處理，得到數(shù)字光強變化數(shù)據(jù)，所說的相位卡對輸入的測量與參考兩路信號進行處理，得到數(shù)字相位變化數(shù)據(jù)，兩種數(shù)據(jù)由計算機讀入，用預(yù)先編制的軟件分別進行基于光強和相位的處理和分析，更進一步對兩種數(shù)據(jù)進行綜合分析和比較。
本發(fā)明提出一種采用上述檢測方法的生物分子相互作用實時相位/光強復(fù)合檢測分析系統(tǒng)，由生物傳感單元、輸樣單元和信號處理單元三大部分組成，其特征在于，所說的生物傳感單元由等腰梯形/三角形棱鏡和鍍在其底面的金膜、覆蓋在金膜上的生物傳感層，以及置于其下的樣品槽構(gòu)成的傳感器的核心部件；置于該棱鏡一側(cè)的橫向塞曼激光器及設(shè)置在該激光器的全反射端的檢偏器、探測器構(gòu)成參考臂，置于該棱鏡另一側(cè)的輸出光軸上的析光鏡，置于析光鏡的透射光路上的檢偏器和一個光電探測器及置于析光鏡的反射光路上的另一個光電探測器構(gòu)成測量臂，所說的射到析光鏡上的光，一部分反射后被探測器接收，轉(zhuǎn)換成光強法檢測信號，另一部分透過，經(jīng)檢偏器后被光電探測器接收，轉(zhuǎn)換成相位檢測的測量信號；所說的信號處理單元由雙向差動數(shù)字鑒相相位卡、前置處理電路、計算機及存儲在其中的預(yù)先編制的軟件組成。
本發(fā)明所說的橫向塞曼激光器的頻差可在30～500KHz之間，所說的梯形棱鏡底面鍍的金膜厚度可在30～50nm之間，所說的生物傳感層可由依次覆蓋在該金膜上的共價固定的嗜水性高分子基體層和配體生物分子層構(gòu)成；所說的梯形棱鏡與光電探測器之間的檢偏器，橫向塞曼激光器與光電探測器之間的檢偏器可安裝在與光軸成45°夾角的位置上，所說的析光鏡是相位/光強復(fù)合型生物分子相互作用實時檢測的關(guān)鍵元件，它將激光器發(fā)出的光分成兩路，實現(xiàn)一路檢測光強變化，而另一路檢測相位變化，并置于反射光路中梯形棱鏡與檢偏器之間與光軸成22.5°夾角的位置上。
上述系統(tǒng)中的雙向差動數(shù)字鑒相相位卡，是在現(xiàn)場可編程陣列器件中，通過編程實現(xiàn)的一塊電路板；所說的前置處理電路是由一片12位A/D和一片雙向存儲體器件組成的一塊電路板；這兩塊電路板插入計算機的通用插槽中。
本發(fā)明的方法及其用于該方法的系統(tǒng)的工作原理為由橫向塞曼激光器的全反射面透過的“尾光”經(jīng)檢偏器后被光電探測器接收，轉(zhuǎn)換成電信號，作為相位檢測的參考信號輸入雙向差動數(shù)字鑒相相位卡。由橫向塞曼激光器的輸出端發(fā)出的激光從梯形棱鏡10的一個腰面上射入，射到底面與金膜的表面上，金膜上覆蓋耦聯(lián)層，耦聯(lián)層上耦聯(lián)配體。入射光從該界面反射，透過另一腰面射到析光鏡上，一部分反射后被光電探測器按收，轉(zhuǎn)換成電信號，輸入前置處理電路，經(jīng)處理后得到數(shù)字光強變化數(shù)據(jù)，另一部分透過析光鏡，經(jīng)過檢偏器后被光電探測器接收，轉(zhuǎn)換成電信號，作為相位檢測的測量信號輸入雙向差動數(shù)字鑒相相位卡。相位卡對輸入的測量與參考兩路信號進行差動數(shù)字鑒相，得到數(shù)字相位差數(shù)據(jù)。樣品從樣品槽中流過，受體與配體結(jié)合，結(jié)合的強度、多少和速度不一，前置處理電路得到的數(shù)字光強變化數(shù)據(jù)和相位卡得到的數(shù)字相位差數(shù)據(jù)隨之變。計算機實時從前置處理電路中讀取光強變化數(shù)據(jù)和從相位卡中讀取相位差數(shù)據(jù)，可分別進行基于光強和相位的數(shù)據(jù)處理和分析，對兩種數(shù)據(jù)進行綜合分析和比較，得到生物分子相互作用的各種信息，甚至還可能發(fā)現(xiàn)新的信息。
本發(fā)明的突出特點在于其一，它能同時通過探測發(fā)生在金膜表面上的生物分子相互作用時引起反射光的相位和光強變化，經(jīng)鑒相處理得到數(shù)字相位差數(shù)據(jù)，和經(jīng)前置處理電路后得到數(shù)字光強度變化數(shù)據(jù)，再由計算機讀入這兩種數(shù)據(jù)。
其二，本發(fā)明用預(yù)先編制的軟件首次同時進行基于相位和光強的處理分析；更重要的是對這兩種數(shù)據(jù)進行綜合分析和比較，得到比較全面的有關(guān)生物信息。例如比較光強和相位變化曲線的上升或下降的斜率以及高度，得到空間耦聯(lián)結(jié)構(gòu)變化和信號傳導(dǎo)特征，尤其是得到生物分子的結(jié)構(gòu)、功能之間的關(guān)系及其功能特征等。
其三，本發(fā)明僅采用一光學(xué)元件析光鏡，將激光器發(fā)出的光分成兩路，一路檢測光強變化，而另一路檢測相位變化，實現(xiàn)了相位/光強復(fù)合型生物分子相互作用實時檢測，具有靈敏度高，結(jié)構(gòu)簡單，容易實現(xiàn)的優(yōu)點。
其四，本發(fā)明可以實現(xiàn)實時檢測生物分子的相互作用，得到生物分子間如何結(jié)合和解離，結(jié)合和解離的強度和速度大小，是否存在空間異位效應(yīng)等住處，而且可進行綜合分析，得到空間耦聯(lián)結(jié)構(gòu)變化，信號傳導(dǎo)特征、抗原決定族圖示分析以及結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系等許多信息。
附圖簡要說明圖1為已有的一種光強檢測法生物分子相互作用檢測原理示意圖。
圖2為已知的一種相位檢測法生物分子相互作用檢測原理示意圖。
圖3為本發(fā)明的相位/光強復(fù)合型生物分子相互作用檢測系統(tǒng)示意圖。
圖4為本發(fā)明的計算機進行相位和光強信號綜合分析的流程圖。
下面結(jié)合附圖，對采用本發(fā)明的SPR相位/光強檢測方法的生物分子相互作用實時檢測分析系統(tǒng)的實施例進行說明。
本實施例由基于相位/光強檢測的SPR生物傳感單元、取樣單元和信號處理單元三大部分組成，如圖3所示。其中，相位/光強檢測SPR生物傳感單元包括橫向塞曼激光器9、檢偏器16、19，探測器17、18、23，析光鏡22，由梯形棱鏡10和鍍在其底面上的金膜11、覆蓋在金膜11上的耦聯(lián)層12和耦聯(lián)在耦聯(lián)層上的配體13，以及置于其下的樣品槽15構(gòu)成的傳感器的核心部件，輸樣單元包括通過單向閥20、22相連的選樣器25，輸樣器27；信號處理單元包括前置處理電路24、雙向差動數(shù)字鑒相相位卡20和計算機21。
本實施例的工作原理為選樣器25在計算機控制下選定所需的樣品，打開閥門26。接著，輸樣器27在計算機的控制下將樣品吸入。樣品吸入后，閥門26關(guān)閉，閥門28打開，輸樣器27緩緩將樣品輸送到樣品槽中(選樣器25和輸樣器27作為本發(fā)明人的前一申請專利內(nèi)容，這里不贅述)。由橫向塞曼激光器9輸出端發(fā)出的激光透過梯形棱鏡10的一個腰面，射到梯形棱鏡10的底面與金膜11的界面上，并從該界面反射，透過梯形棱鏡10的另一腰面，射到析光鏡22上。入射光一部分經(jīng)析光鏡22反射后被光電探測器23接收，轉(zhuǎn)換成電信號，另一部分透過析光鏡22，又通過檢偏器16后被光電探測器17接收，轉(zhuǎn)換成電信號。當樣品流過樣品槽15，樣品中的受體分子14與傳感層上的配體分子13結(jié)合，反射光的光強和相位都發(fā)生變化，探測器23探測光強變化，輸入前置處理電路24實時處理，得到數(shù)字光強變化數(shù)據(jù)，探測器16探測相位變化，作為相位檢測的測量信號輸入雙向差動數(shù)字鑒相相位卡20。由橫向塞曼激光器9的全反射面透過的“尾光”經(jīng)檢偏器19后被光電探測器18接收，轉(zhuǎn)換成電信號，作為相位檢測的參考信號輸入到雙向差動數(shù)字鑒相相位卡20。相位卡20實時對同時到達的測量信號和參考信號進行處理，得到數(shù)字相位差數(shù)據(jù)。
計算機21讀入數(shù)字光強變化數(shù)據(jù)和數(shù)字相位差數(shù)據(jù)，可由預(yù)先編制并存儲在計算機中的軟件程序分別進行處理和分析，更進一步對兩種數(shù)據(jù)進行綜合分析和比較。其處理步驟如圖4所示，包括1)計算機讀取相位與光強處理數(shù)據(jù)或?qū)?yīng)曲線的數(shù)據(jù)；2)先比較結(jié)合速率或曲線上升斜率；3)接著比較平衡狀態(tài)或曲線平衡的幅值；4)再比較解脫速率或曲線下降斜率；5)還要綜合分析比較結(jié)果；6)最后給出所對應(yīng)的生物學(xué)意義。
通過分析，可以得到更詳細的生物分子間如何結(jié)合和解離，結(jié)合和解離的強度和速度是多少，是否存在空間異位效應(yīng)，空間耦聯(lián)的結(jié)構(gòu)變化，信號傳導(dǎo)特征以及結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系等許多生物信息，還可能獲得未發(fā)現(xiàn)的信息，可用以指導(dǎo)新的探索。
權(quán)利要求
1.一種相位/光強復(fù)合型生物分子相互作用實時檢測方法，包括以下步驟1)由橫向塞曼激光器全反射端透過的“尾光”，通過檢偏器后被光電探測器接收，轉(zhuǎn)換成電信號，作為相位檢測的參考信號輸入差動數(shù)字鑒相相位卡；2)由橫向塞曼激光器輸出端發(fā)出的激光從等腰梯形/三角形棱鏡的一個腰面射入，射到該棱鏡的底面與鍍在其底面的覆蓋有生物傳感層的金膜的界面上，入射光從該界面反射后透過該棱鏡的另一個腰面，射到析光鏡上，一部分反射，另一部分透過；3)該反射部分被光電探測器接收，轉(zhuǎn)換成電信號，作為光強檢測法信號輸入前置處理電路，該透過部分在通過檢偏器后被光電探測器接收，轉(zhuǎn)換成電信號，作為相位檢測的測量信號輸入雙向差動數(shù)字鑒相相位卡；4)所說的前置處理電路對輸入信號進行處理，得到數(shù)字光強變化數(shù)據(jù)，所說的相位卡對輸入的測量與參考兩路信號進行處理，得到數(shù)字相位變化數(shù)據(jù)，兩種數(shù)據(jù)由計算機讀入，用預(yù)先編制的軟件分別進行基于光強和相位的處理和分析，更進一步對兩種數(shù)據(jù)進行綜合分析和比較。
2.一種采用如權(quán)利要求1所述的檢測方法的檢測分析系統(tǒng)，由生物傳感單元、輸樣單元和信號處理單元三大部分組成，所說的生物傳感單元由等腰梯形/三角形梭鏡和鍍在其底面的金膜、覆蓋在金膜上的生物傳感層，以及置于其下的樣品槽構(gòu)成的傳感器的核心部件；其特征在于，置于該棱鏡一側(cè)的橫向塞曼激光器及設(shè)置在該激光器的全反射端的檢偏器、探測器構(gòu)成參考臂，置于該棱鏡另一側(cè)的輸出光軸上的析光鏡，置于析光鏡的透射光路上的檢偏器和一個光電探測器及置于析光鏡的反射光路上的另一個光電探測器構(gòu)成測量臂，所說的射到析光鏡上的光，一部分反射后被探測器接收，轉(zhuǎn)換成光強法檢測信號，另一部分透過，經(jīng)檢偏器后被光電探測器接收，轉(zhuǎn)換成相位檢測的測量信號；所說的信號處理單元由雙向差動數(shù)字鑒相相位卡、前置處理電路、計算機及存儲在其中的預(yù)先編制的軟件組成。
3.如權(quán)利要求2所述的的檢測分析系統(tǒng)，其特征在于，所說的橫向塞曼激光器的頻差在30～500KHz之間。
4.如權(quán)利要求2所述的的檢測分析系統(tǒng)，其特征在于，所說的梯形棱鏡底面鍍的金膜厚度在30～50nm之間。
5.如權(quán)利要求2所述的的檢測分析系統(tǒng)，其特征在于，所說的生物傳感層可由依次覆蓋在該金膜上的共價固定的嗜水性高分子基體層和配體生物分子層構(gòu)成。
6.如權(quán)利要求2所述的的檢測分析系統(tǒng)，其特征在于，所說的梯形棱鏡與光電探測器之間的檢偏器，橫向塞曼激光器與光電探測器之間的檢偏器安裝在與光軸成45°夾角的位置上。
7.如權(quán)利要求2所述的的檢測分析系統(tǒng)，其特征在于，所說的析光鏡置于反射光路中梯形棱鏡與檢偏器之間與光軸成22.5°夾角的位置上。
8.如權(quán)利要求2所述的的檢測分析系統(tǒng)，其特征在于，上述系統(tǒng)中的雙向差動數(shù)字鑒相相位卡，是在現(xiàn)場可編程陣列器件中，通過編程實現(xiàn)的一塊電路板；所說的前置處理電路是由一片12位A/D和一片雙向存儲體器件組成的一塊電路板；這兩塊電路板插入計算機的通用插槽中。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,由生物傳感單元、輸樣單元和信號處理單元三大部分組成,其特點是采用一光學(xué)元件析光鏡,將激光器發(fā)出的光分成兩路,一路檢測光強變化,而另一路檢測相位變化,實現(xiàn)了相位/光強復(fù)合型生物分子相互作用實時檢測,由此得到生物分子之間的多種信息,尤其是得到生物分子的結(jié)構(gòu)、功能之間的關(guān)系及其功能特征等。而且具有靈敏度高,結(jié)構(gòu)簡單,容易實現(xiàn)的優(yōu)點。
文檔編號G01N21/17GK1272624SQ0010913
公開日2000年11月8日 申請日期2000年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月9日
發(fā)明者余興龍 申請人:清華大學(xué)