專利名稱：基于納米光纖探針的單細胞檢測儀及其探針制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及電學及光學技術在生物領域的應用，特別是一種單細胞檢測儀及其探針的制作方法。
背景技術：
近年來，隨著細胞生理研究的逐漸深入，科學家們發(fā)現(xiàn)，即使是同樣的遺傳物質(zhì)，同樣的周邊環(huán)境，這些細胞還是會朝著不同的方向發(fā)展，有時還會生成不同的功能。單個細胞看似相同，但其化學成分和應激反應卻十分不同，而且單個細胞的變化還關系到癌癥，神經(jīng)疾病等重大疾病。植物和動物的單細胞生物過程也遠遠沒有完全揭示。因此單細胞分析是理解和破譯許多關鍵的生命進程的重要手段。但是單細胞的尺寸非常小，其內(nèi)含的化學成分也是超微量的，而當前的分析方法Western blot,則需要通過破碎數(shù)以百萬計的細胞來實現(xiàn)細胞內(nèi)生化指標的檢測，所以傳統(tǒng)分析方法不足以發(fā)現(xiàn)單個細胞水平上的差異。不僅如此，傳統(tǒng)方法多為定點檢測，無法實現(xiàn)實時監(jiān)測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的就是提供一種基于納米光纖探針的單細胞檢測儀，它可以通過光電兩種信號對細胞及亞細胞進行檢測，提高細胞檢測的時間和空間分辨率。本發(fā)明的該目的是通過這樣的技術方案實現(xiàn)的，它包括有納米探針、光源單元、微操系統(tǒng)、電學檢測單元、細胞定位系統(tǒng)、光子探測單元和數(shù)據(jù)采集及分析單元，納米探針最內(nèi)層為光纖層，在光纖層外壁包裹有納米環(huán)電極層，在納米環(huán)電極層外壁包裹有絕緣層；
光源單元，用于生成波長和強度均可調(diào)的光線，并通過光纖層發(fā)射至待測細胞；
微操系統(tǒng)，用于移動納米探針，納米探針安裝在微操系統(tǒng)的動力輸出端；
電學檢測單元，包括有信號發(fā)生器和檢測信號接收與分析器，電學檢測單元的信號發(fā)生器通過納米環(huán)電極層與電學檢測單元的檢測信號接收與分析器；信號發(fā)生器產(chǎn)生激勵電信號至納米環(huán)電極，再進入待測細胞，其電活性組分所產(chǎn)生的反饋電信號，檢測信號接收與分析器接收并分析檢測細胞中的電活性組分后反饋的電信號；
細胞定位系統(tǒng)，包括有用于承載待測細胞的載臺和用于移動及定位待測細胞的移動載臺定位裝置；
光子探測單元，包括有用于接收通過待測細胞光信號的傳感器和檢測裝置，傳感器接收到的信號通過濾波器和倒置顯微鏡發(fā)送至檢測裝置，檢測裝置用于檢測光信號的強度；數(shù)據(jù)采集及分析單元，控制微操系統(tǒng)和細胞定位系統(tǒng)，接收并分析電學檢測單元和光子探測單元的數(shù)據(jù)信號。本發(fā)明的另一個目的就是提供一種基于納米光纖探針的單細胞檢測儀的探針制作方法，它可以制備出支持光電兩種信號傳輸?shù)募{米級探針，制備的探針可以向細胞發(fā)射光和電信號，接收細胞反饋的光和電信號，為細胞檢測分析提供原始數(shù)據(jù)。本發(fā)明的該目的是通過這樣的技術方案實現(xiàn)的，具體步驟如下:1)采用激光加熱的方法將多模光纖拉制成納米探針；
2)在納米探針的側(cè)壁濺射上金涂層作為納米環(huán)電極層；
3)在納米環(huán)電極層的外壁通過2-烯丙基苯酚和苯酚的共聚反應形成一層絕緣層；
4)對步驟3)處理后得到的樣品通過聚焦離子束進行處理。進一步，在步驟4)后進行以下處理:
5)在絕緣層外壁濺射上金涂層作為外納米環(huán)電極層I;
6)在外納米環(huán)電極層I的外壁通過2-烯丙基苯酚和苯酚的共聚反應形成外絕緣層
I ；
7)在絕緣層I外壁濺射上金涂層作為外納米環(huán)電極層II；
8)在外納米環(huán)電極層II的外壁通過2-烯丙基苯酚和苯酚的共聚反應形成外絕緣層II。由于采用了上述技術方案，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點:
本發(fā)明具有高靈敏度，可以實現(xiàn)單細胞級別的檢測，相比于傳統(tǒng)的需要粉碎數(shù)以百萬計的細胞的檢測手段，需要的細胞樣品量大大減少，提高了早期疾病檢測的成功率。由于可以進行活體細胞的檢測，避免了細胞處理過程中假象的產(chǎn)生，其數(shù)據(jù)可靠度比破碎細胞樣品更高。不僅如此檢測儀可以提供單個細胞的數(shù)據(jù)，從而得出整個細胞群體的反應曲線，而不僅是一個平均值，能更好的分析數(shù)據(jù)。相對于傳統(tǒng)手段中的單靶標物檢測，多個靶標物實時光電檢測的實現(xiàn)，更是可以明確細胞傳導過程中多個生物因子的相互作用及關聯(lián)，對解析疾病機理有重大作用。本發(fā)明首次實現(xiàn)的亞細胞級別的藥物刺激和藥效檢測對了解病理以及提高藥物作用都有極大的推動。通過本發(fā)明，可實現(xiàn)實際意義上的單細胞檢測，并極大的提高了時空分辨率和可檢測的靶標物范圍，實時檢測分析單細胞內(nèi)的生物化學機制。并可以在同一個探針上，實現(xiàn)亞細胞級別藥物刺激/釋放，以及光學信號和電學信號的同步檢測，由此極大的推動的單細胞檢測技術的發(fā)展。本發(fā)明的其他優(yōu)點、目標和特征在某種程度上將在隨后的說明書中進行闡述，并且在某種程度上，基于對下文的考察研究對本領域技術人員而言將是顯而易見的，或者可以從本發(fā)明的實踐中得到教導。本發(fā)明的目標和其他優(yōu)點可以通過下面的說明書和權利要求書來實現(xiàn)和獲得。


本發(fā)明的

如下。圖1為本發(fā)明的結(jié)構示意 圖2為探針制作流程示意 圖3為探針的結(jié)構示意 圖4為實施例1的實驗結(jié)果曲線 圖5為實施例2的實驗結(jié)果示意 圖6為實施例3的實驗結(jié)果曲線圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
工作時，將對檢測靶標具特異性的生物分子如反應酶涂在納米探針上，納米探針的針端部插入待測細胞，反應酶與細胞內(nèi)對應物質(zhì)發(fā)生反應，反應后可產(chǎn)生的熒光分子，通過對熒光產(chǎn)物的光學分析就可以得到對應物質(zhì)的含量。檢測儀的光源單元將光信號發(fā)送至納米探針的光纖，光信號通過光纖進入細胞內(nèi)，光子探測單元采集穿過細胞的光信號，并對光信號的強度進行檢測。激勵電信號通過納米環(huán)電極進入待測細胞，待測細胞中的電活性組分所產(chǎn)生的電信號再由納米環(huán)電極接收并傳送至電學檢測單元分析與處理。例如，光電倍增管可用于光子探測單元，檢測的光信號通過合適的濾波器傳送到光電倍增管，光電倍增管的輸出信號將由電腦上的數(shù)據(jù)卡實時采集與分析。同時，激勵電信號通過納米環(huán)電極進入待測細胞，待測細胞中的電活性組分所產(chǎn)生的電信號再由納米環(huán)電極接收并傳送至電學檢測單元分析與處理。例如，恒電位儀可用作電學檢測單元產(chǎn)生功能激勵電信號，接受并分析待測細胞中的電活性組分所產(chǎn)生的電信號。基于納米光纖探針的單細胞檢測儀的探針制作方法，具體步驟為:
1)采用激光加熱的方法將直徑為400微米的多模光纖拉制成納米探針；
2)在納米探針的側(cè)壁濺射上5-100納米厚的金涂層作為納米環(huán)電極層；
3)在納米環(huán)電極層的外壁通過2-烯丙基苯酚和苯酚的共聚反應形成一層絕緣層；
4)對步驟3)處理后得到的樣品通過聚焦離子束進行處理。實施例1:
本發(fā)明開發(fā)了一個基于乳酸脫氫酶的光纖納米傳感器以實現(xiàn)單個癌細胞的乳酸分析。先在納米探針上修飾一層聚合物刷以利于增加乳酸脫氫酶納米光纖傳感器的納米尖端上的固定量，該脫氫酶在促進乳酸的轉(zhuǎn)換的同時所產(chǎn)生的熒光副產(chǎn)品NADH，可用于測定乳酸濃度。該納米光纖傳感器可實現(xiàn)高空間分辨率，低背景干擾，寬動態(tài)范圍(0.06-3mM)適合單細胞乳酸分泌的生理范圍。該傳感器成功地檢測了細胞外乳酸的擴散曲線，并可以明確區(qū)分不同細胞如兩種乳腺癌細胞的乳酸分泌水平，如圖4所示，圖4中左圖為修飾了聚合物刷的的納米探針的乳酸檢測標準曲線；右圖為單細胞外乳酸的檢測結(jié)果MCF-7乳腺癌細胞(η = 5)和MCF-7/HER2細胞(η=5)。誤差棒代表標準偏差。這種納米傳感器不僅可以探測單個細胞的化學組分，還可以用于檢測單個活細胞中的蛋白表達水平，從而提供了一個具有潛質(zhì)的高靈敏度癌癥檢測手段。該傳感器在評估代謝藥物對癌細胞的新陳代謝和生存的影響這個方面也具有極大潛力。實施例2:
本發(fā)明的單細胞檢測儀不僅可以用于動物細胞的研究，由于其納米級別的探針，還適用于真菌及細菌的單細胞檢測，只需將納米探針精準的刺入真菌細胞菌絲的不同亞細胞位點。如圖5所示，在不同的菌絲位點，所測量到的熒光強度十分不同，跨越幾個數(shù)量級，圖5為單個真菌細胞中亞細胞級別的熒光檢測，菌絲中亞細胞位點(I 一 6 )的熒光強弱相差很大。這個初步結(jié)果表明亞細胞位點的熒光信號極有可能與新層代謝的關鍵部位有關。更深入的單細胞分析在揭示細胞中真菌毒素合成中的關鍵部位和關鍵基因，酶的單細胞異質(zhì)性以及真菌毒素細胞間擴散感染機制方面有很大的潛力。實施例3:
探針結(jié)合了納米環(huán)電極和光纖傳感器，可以同時實時檢測高空間分辨率的電學和光學信號。圖6為同步光電檢測PC12細胞中的鈣離子水平變化及多巴胺釋放。(a)源于多巴胺釋放的典型電流響應和(C)鈣離子熒光信號；(b，d)為相對應的統(tǒng)計分析結(jié)果(N = 10)。a:神經(jīng)生長因子停藥后24小時A，b:在含100ng/mL的NGF的培養(yǎng)液體中分化3天，c:停藥后的細胞在添加了 150 μ M L-DOPA中培養(yǎng)液中孵育60分鐘。箭頭表示的高鉀溶液加入的時間點。誤差棒代表標準偏差；林和*表示P〈0.01和P〈0.05。如圖6的a和c所示，在退化的PC12細胞中，不僅鈣內(nèi)流顯著減少的，多巴胺分泌相比于分化的PC12神經(jīng)細胞也減少很多。而當退化的PC12細胞在添加了 IOOuM L-DOPA的培養(yǎng)液中孵化I小時后，多巴胺的釋放量比之前明顯回復，證明了 L-DOPA可在一定層度上挽救胞吐變性的神經(jīng)元功能，但不能完全恢復。然而，L-DOPA治療無法顯著地提高鈣離子內(nèi)流。同步光電檢測得到的數(shù)據(jù)表明L-DOPA的功能只是增加多巴胺在囊泡中的含量；當施加相同的刺激，釋放多巴胺的量增加，但不會影響鈣的信號。同步檢測的數(shù)據(jù)有效的幫助我們實時了解多種細胞信號，并對不同信號之間的關聯(lián)進行研究。這種方法不僅在生理過程的動態(tài)研究中有重要的應用，并為解開各種信號轉(zhuǎn)導通路的相互作用提供了機會。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本技術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。
權利要求
1.一種基于納米光纖探針的單細胞檢測儀，其特征在于:所述檢測儀包括有納米探針、光源單元、微操系統(tǒng)、電學檢測單元、細胞定位系統(tǒng)、光子探測單元和數(shù)據(jù)采集及分析單元，納米探針最內(nèi)層為光纖層，在光纖層外壁包裹有納米環(huán)電極層，在納米環(huán)電極層外壁包裹有絕緣層； 光源單元，用于生成波長和強度均可調(diào)的光線，并通過光纖層發(fā)射至待測細胞； 微操系統(tǒng)，用于移動納米探針，納米探針安裝在微操系統(tǒng)的動力輸出端； 電學檢測單元，包括有信號發(fā)生器和檢測信號接收與分析器，電學檢測單元的信號發(fā)生器通過納米環(huán)電極層與電學檢測單元的檢測信號接收與分析器； 細胞定位系統(tǒng)，包括有用于承載待測細胞的載臺和用于移動及定位待測細胞的移動載臺定位裝置； 光子探測單元，包括有用于接收通過待測細胞光信號的傳感器和檢測裝置，傳感器接收到的信號通過濾波器和倒置顯微鏡發(fā)送至檢測裝置，檢測裝置用于檢測光信號的強度；數(shù)據(jù)采集及分析單元，控制微操系統(tǒng)和細胞定位系統(tǒng)，接收并分析電學檢測單元和光子探測單元的數(shù)據(jù)信號。
2.如權利要求1所述的基于納米光纖探針的單細胞檢測儀，其特征在于:所述納米探針為一個。
3.如權利要求1所述的基于納米光纖探針的單細胞檢測儀，其特征在于:所述納米探針為多個，多個納米探針固定一起作為一個探針組，并安裝在微操系統(tǒng)的動力輸出端，電學檢測單元包括有多組信號發(fā)射、接收端，每組信號發(fā)射、接收端均與一個納米探針相對應，每個納米探針均由光源單元提供光信號。
4.如權利要求1所述的基于納米光纖探針的單細胞檢測儀，其特征在于:所述納米探針絕緣層外壁還包裹有外納米環(huán)電極層I，在外納米環(huán)電極層I的外壁包裹有外絕緣層I，我外絕緣層I的外壁包裹有外`納米環(huán)電極層II，納米環(huán)電極層II的外壁包裹有外絕緣層II，外納米環(huán)電極層I和外納米環(huán)電極層II均與電學檢測單元的信號發(fā)射端信號接收端連接。
5.如權利要求1所述的檢測儀的探針制作方法，其特征在于，具體步驟如下: 1)采用激光加熱的方法將多模光纖拉制成納米探針； 2)在納米探針的側(cè)壁濺射上金涂層作為納米環(huán)電極層； 3)在納米環(huán)電極層的外壁通過2-烯丙基苯酚和苯酚的共聚反應形成一層絕緣層； 4)對步驟3)處理后得到的樣品通過聚焦離子束進行處理。
6.如權利要求5所述的基于納米光纖探針的單細胞檢測儀的探針制作方法，其特征在于，在步驟4)后進行以下處理: 5)在絕緣層外壁濺射上金涂層作為外納米環(huán)電極層I; 6)在外納米環(huán)電極層I的外壁通過2-烯丙基苯酚和苯酚的共聚反應形成外絕緣層I ； 7)在絕緣層I外壁濺射上金涂層作為外納米環(huán)電極層II； 8)在外納米環(huán)電極層II的外壁通過2-烯丙基苯酚和苯酚的共聚反應形成外絕緣層 II。
全文摘要
一種基于納米光纖探針的單細胞檢測儀，包括有納米探針、光源單元、微操系統(tǒng)、電學檢測單元、細胞定位系統(tǒng)和光子探測單元，納米探針最內(nèi)層為光纖層，在光纖層外壁包裹有納米環(huán)電極層，在納米環(huán)電極層外壁包裹有絕緣層?；诩{米光纖探針的單細胞檢測儀的探針制作方法，包括有拉制、濺射、絕緣層制作和聚焦離子束切割四個步驟。本發(fā)明具有高靈敏度，可以實現(xiàn)單細胞級別的檢測，相比于傳統(tǒng)的需要粉碎數(shù)以百萬計的細胞的檢測手段，需要的細胞樣品量大大減少，提高了早期疾病檢測的成功率。它可以進行活體細胞的檢測，避免了細胞處理過程中假象的產(chǎn)生。極大的提高了時空分辨率和可檢測的靶標物范圍，實時檢測分析單細胞內(nèi)的生物化學機制。
文檔編號B82Y15/00GK103105353SQ20131005240
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月18日 優(yōu)先權日2013年2月18日
發(fā)明者李長明, 鄭昕婷 申請人:西南大學